一种产D-阿拉伯糖醇的菌株及其应用的制作方法

本发明涉及一种产d-阿拉伯糖醇的菌株及其应用，尤其是在生产d-阿拉伯糖醇中的应用，属于生物技术领域。

背景技术：

d-阿拉伯糖醇是一种重要的戊糖醇，在自然界中主要存在于地衣类和蘑菇类中，具有与蔗糖相似的甜味，具有较低的卡路里含量，可抑制致龋菌的生长和产酸。d-阿拉伯糖醇由于溶解吸热可在口腔中产生明显的清凉感，可以成为木糖醇和其他抗龋齿多元醇如山梨醇和赤藓糖醇的潜在替代品。同时，d-阿拉伯糖醇可作为通过血脑屏障的运输介质，作为药物中间体用于一些药物合成。因此，d-阿拉伯糖醇在糖尿病患者用品，口腔保健和制药工业中具有较大应用前景。d-阿拉伯糖醇已被列入美国能源部推荐的12种生物基化合物(c3-c6化合物)之一，已被指定为工业生物技术进一步研究和开发的首选目标。因此，提高d-阿拉伯糖醇产量在工业生产中具有重要意义。

随着科技进步，d-阿拉伯糖醇新的功能被陆续开发，市场需求逐年增大，主要生产方法有提取法、化学合成法和生物法。由于自然状态下d-阿拉伯糖醇含量很低，致使提取难度增大，提取效率低，而且底物昂贵，导致提取成本增加。目前，国内外d-阿拉伯糖醇的工业化生产主要采用化学合成法，该方法直接，副产物少，提取简单，但是生产过程复杂，能耗大，底物昂贵，污染较严重。鉴于上述两种方法存在的缺点，人们将目光集中在生物发酵法，该方法工艺简单，生产成本低，反应条件温和，可通过菌种改良和工艺优化提高产量。因此，获得一株优良高效的d-阿拉伯糖醇生产菌株至关重要。

技术实现要素：

[技术问题]

本发明所要解决的技术问题是提高微生物生产d-阿拉伯糖醇的产量。

[技术方案]

本发明提供了一株产d-阿拉伯糖醇的近平滑假丝酵母菌(candidaparapsilosis)sk26.002a6及应用该菌生产d-阿拉伯糖醇的方法。

所述近平滑假丝酵母菌(candidaparapsilosis)sk26.002a6已于2019年7月4日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址中国武汉，武汉大学，保藏编号cctccno:m2019518。所述近平滑假丝酵母sk26.002a6菌株能以高浓度葡萄糖(200-500g/l)为原料发酵生产d-阿拉伯糖醇，对葡萄糖的耐受能力高于诱变前的近平滑假丝酵母对葡萄糖的耐受能力：100-300g/l。

所述近平滑假丝酵母sk26.002a6可用于发酵生产d-阿拉伯糖醇。可采用如下步骤来生产d-阿拉伯糖醇：

(1)菌种活化

将低温保藏的近平滑假丝酵母sk26.002a6在固体培养基上进行活化；

(2)种子培养

将活化后的菌株利用液体培养基进行培养，获得种子培养液；

(3)发酵培养

将种子培养液接种到发酵培养基中，利用近平滑假丝酵母sk26.002a6发酵合成d-阿拉伯糖醇；所述发酵培养基的配方是(g/l)：葡萄糖200-500，酵母提取物5-40，cacl20-0.2g/l，尿素0-25g/l，fecl3·6h2o0-0.2g/l，nacl20-0.05g/l，k2hpo4·3h2o0-0.15g/l，ph4.0-6.0；发酵条件是30-37℃、160-200rpm振荡培养48-120h。将种子培养液接种到发酵培养基中时，以2-8％(v/v)接种量将上述(2)中种子培养液接种于发酵培养基中。

在本发明的一种实施方式中，菌种活化时采用的固体培养基的配方可以是(g/l)：葡萄糖5-20，酵母提取物5-20，琼脂20，ph4.0-6.0。活化培养时，可以从低温保藏的含有菌株的甘油管中挑取菌液于制成平板的固体培养基上划线，于30-37℃培养箱里倒置培养12-24h。

在本发明的一种实施方式中，种子培养时采用的种子培养基的配方可以是(g/l)：葡萄糖5-20，酵母提取物5-20，ph4.0-6.0。种子培养条件可以是于30-37℃、160-200rpm振荡培养12-24h。

在本发明的一种实施方式中，发酵培养基配方为：葡萄糖400g/l，酵母提取物5g/l，尿素25g/l，fecl3·6h2o0.05g/l，nacl20.05g/l，cacl20.01g/l，k2hpo4·3h2o0.15g/l。

[有益效果]

本发明提供的d-阿拉伯糖醇生产菌株近平滑假丝酵母菌(candidaparapsilosis)sk26.002a6，在以葡萄糖为碳源的发酵培养基中经48-120h的发酵，葡萄糖基本消耗完，发酵液中的d-阿拉伯糖醇浓度达到30-120g/l。可以看出，本发明提供的利用近平滑假丝酵母菌sk26.002a6生产d-阿拉伯糖醇的方法非常高效，适于进行大规模生产d-阿拉伯糖醇。

本发明利用近平滑假丝酵母菌(candidaparapsilosis)sk26.002a6生产的d-阿拉伯糖醇安全可靠，是一种很有市场潜力的功能性产品，在食品、医药、化工等行业具有广泛应用前景。

生物材料保藏

一株d-阿拉伯糖醇生产菌株，其分类命名为近平滑假丝酵母菌(candidaparapsilosis)sk26.002a6，已于2019年7月19日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址中国武汉，武汉大学，保藏编号cctccno:m2019518。

附图说明

图1出发菌株的细胞形态，放大倍数×400。

图2近平滑假丝酵母菌sk26.002a6的细胞形态，放大倍数×400。

具体实施方式

平板培养基(g/l)：葡萄糖5-20，酵母提取物5-20，琼脂20，ph4.0-6.0。

种子培养基(g/l)：葡萄糖5-20，酵母提取物5-20，ph4.0-6.0。

发酵培养基(g/l)：葡萄糖200-500，酵母提取物10-40，cacl20-0.2，fecl3·6h2o0-0.2，ph4.0-6.0。

利用hplc检测发酵液中的d-阿拉伯糖醇含量的方法：发酵结束后，收集发酵液于8000rpm下离心10min，得到含d-阿拉伯糖醇的上清液。上清液经0.22μm微孔滤膜过滤后采用hplc检测上清液中d-阿拉伯糖醇含量。色谱条件：液相色谱柱为shodexasahipaknhp-504e，流动相为70％乙腈；流速为1ml/min；柱温为30℃；进样量为10μl。

实施例1：出发菌株的artp诱变处理及高产d-阿拉伯糖醇的菌株的筛选

将出发菌株近平滑假丝酵母(candidaparapsilosis)sk26.002接种至种子培养基，于200rpm，30℃培养21h。取1ml菌液于1.5ml离心管中，12000rpm离心5min，弃上清液，并用1ml0.9％的无菌生理盐水重悬菌体，再次离心洗涤菌体后制成菌悬液。然后取10μl该菌悬液均匀涂布于金属载片表面，将载片置于artp诱变系统中，用无菌镊子将载片依次放到对应凹槽内，设定等离子体诱变时间为140s，样品处理完毕后，用无菌镊子将载片移至装有1ml无菌生理盐水的1.5ml离心管中，然后在振荡器上震荡均匀。将新的菌悬液梯度稀释后涂布于平板，30℃恒温静置培养48h。由于d-阿拉伯糖醇生产与菌体生长呈偶联关系，平板培养基上菌落越大，说明这个单菌落的菌株产d-阿拉伯糖醇的能力越强。因此，挑选生长较大的饱满光滑的单菌落于种子培养基中，30℃、200rpm培养21h，然后按4％(v/v)接种量转接至发酵培养基中进行发酵，发酵条件是30-37℃、160-200rpm，发酵时间是48-120h，利用hplc检测发酵液中的d-阿拉伯糖醇含量，获得一株d-阿拉伯糖醇产量提高的菌株，命名为近平滑假丝酵母菌sk26.002a6。

等离子体诱变条件：采用99.99％以上高纯氦气作为气源，电源功率为100w，氦气流量为10l/min，等离子体发射源与样品间距离为2mm。

实施例2：诱变前后菌株d-阿拉伯糖醇产量比较

用接种环从甘油管保藏菌液中分别沾取一环出发菌株sk26.002菌液、突变菌株sk26.002a6菌液，分别平板培养基上划线，于30℃培养箱里倒置培养24h。分别挑取生长良好的出发菌株sk26.002单菌落、突变菌株sk26.002a6单菌落，分别接种于种子培养基中，30℃，200rpm培养21h，然后以4％接种量将种子液分别接种于装有50ml发酵培养基的250ml锥形瓶中，30℃，200rpm培养72h。发酵结束后，收集菌液于8000rpm下离心10min，得到含d-阿拉伯糖醇的上清液。上清液经0.22μm微孔滤膜过滤后采用hplc检测上清液中d-阿拉伯糖醇含量。色谱条件：液相色谱柱为shodexasahipaknhp-504e，流动相为70％乙腈；流速为1ml/min；柱温为30℃；进样量为10μl。

结果表明，出发菌株sk26.002和突变菌株近平滑假丝酵母sk26.002a6的d-阿拉伯糖醇产量分别为21.38g/l和42.92g/l，突变菌株的d-阿拉伯糖醇产量较出发菌株提高了100.7％。同时，诱变后菌株的细胞形态发生改变，出发菌株与突变菌株经种子培养基培养24h后，突变菌株细胞更大(如图1、图2所示)，这使得出发菌株与突变菌株经发酵培养基培养72h后，突变体的od600值较出发菌株提高了67.2％(出发菌株的od600值为28.14，突变菌株的od600值为47.04)，这可能是导致突变后产量提高的原因之一。因此，突变菌株sk26.002a6可作为一株良好的工业生产菌株。

实施例3：诱变前后菌株碳源利用模式比较

分别以葡萄糖、果糖、蔗糖、半乳糖、麦芽糖、淀粉、乳糖、甘油和木糖为碳源，比较了出发菌株和近平滑假丝酵母突变株sk26.002a6的碳源利用模式。

制备分别含上述碳源100g/l和酵母提取物20g/l的培养基，并将其以10ml的等分试样分装在20×200mm试管中，分别接种各自的种子培养物，并在30℃，200rpm下培养48h。通过测量细胞生长和产物形成来分析诱变前后菌株的碳源利用模式。

结果表明，突变株和出发菌株均具有利用葡萄糖、果糖、蔗糖、半乳糖、麦芽糖、淀粉、乳糖或甘油生长的能力，也都没有利用木糖的能力(表1)。这表明诱变并没有改变菌株的碳源利用模式。但以上述各碳源作为底物时，近平滑假丝酵母突变株sk26.002a6通常生长得比出发菌株更好，这可能是近平滑假丝酵母突变株sk26.002a6在突变后形态变大和产量提高的原因。

此外，如表1所示，碳源种类影响多元醇的生产，以葡萄糖、果糖或蔗糖作为底物时，发现近平滑假丝酵母突变株sk26.002a6具有较高的d-阿拉伯糖醇和甘油浓度，以及较低的乙醇浓度。这表明突变改变了菌株的代谢网络。同时，表1结果证明葡萄糖是突变体a6生产d-阿拉伯糖醇的适宜碳源。

表1近平滑假丝酵母突变株sk26.002a6和出发菌株的碳源利用模式

实施例4：突变菌株sk26.002a6的葡萄糖耐受性

用接种环从甘油管保藏菌液中沾取一环菌液于平板培养基上划线，在30℃培养箱里倒置培养24h。挑取生长良好的单菌落一环接种于种子培养基中，30℃，200rpm培养21h，然后以4％接种量将种子液接种于装有50ml葡萄糖浓度为200-500g/l发酵培养基的250ml锥形瓶中，30℃，200rpm培养72h。培养结束后，测定细胞生物量和d-阿拉伯糖醇产量，结果显示当葡萄糖浓度为200、300、400和500g/l时，菌体od600值分别为26.72、39.04、44.08和35.76，d-阿拉伯糖醇产量分别为21.05、30.97、42.92和34.87g/l，结果表明突变菌株在高浓度葡萄糖下仍能较好生长，并能以高浓度葡萄糖为底物发酵生产d-阿拉伯糖醇。底物葡萄糖浓度对d-阿拉伯糖醇的合成有着重要影响，近平滑假丝酵母合成多元醇需要高渗环境为前提，只有在高渗环境下，多元醇合成途径才会被激活。而过高的渗透压又会抑制酵母细胞的生长，对多元醇的合成产生消极影响。能够耐受高浓葡萄糖的酵母才有可能合成d-阿拉伯糖醇，才有可能使用廉价的高糖浓度的废弃物或下脚料(比如甘蔗渣汁等)来合成d-阿拉伯糖醇。

实施例5：突变菌株sk26.002a6的d-阿拉伯糖醇发酵培养基优化

针对突变菌株sk26.002a6发酵生产d-阿拉伯糖醇的培养基成分，分别对氮源种类及浓度，金属离子种类及浓度进行优化。其他培养条件参照实施例4，通过单因素实验和正交实验优化后，优选发酵培养基配方为：葡萄糖400g/l，酵母提取物5g/l，尿素25g/l，fecl3·6h2o0.05g/l，nacl20.05g/l，cacl20.01g/l，k2hpo4·3h2o0.15g/l。优化后，d-阿拉伯糖醇产量由优化前42.92g/l提高到87.61g/l，产量提高了104.1％。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。