1.一种氯氮平衍生物,其特征在于,其结构式如式ⅰ所示:
式ⅰ。
2.一种如权利要求1所述的氯氮平衍生物的合成方法,其特征在于,所述合成方法的具体路线如下所示:
3.一种氯氮平均相酶免疫检测试剂,其特征在于,由r1试剂与r2试剂组成,所述r1试剂包含抗氯氮平特异性抗体1与r1缓冲液,所述r2试剂包含氯氮平葡萄糖-6-磷酸脱氢酶标记偶联物与r2缓冲液;所述抗氯氮平特异性抗体1为氯氮平人转铁蛋白免疫原免疫实验动物后生产得到的抗体;所述的氯氮平人转铁蛋白免疫原,由权利要求1所述的氯氮平衍生物与人转铁蛋白偶联而成,其结构式如式ⅱ所示:
式ⅱ;
所述的实验动物为家兔、山羊、小鼠、绵羊、豚鼠或马中的任意一种;
所述的r1缓冲液含有酶底物、辅酶、牛血清白蛋白及tris缓冲液,所述的酶底物为葡萄糖-6-磷酸,所述的辅酶为烟酰胺腺嘌呤二核苷酸氧化型;
所述的氯氮平葡萄糖-6-磷酸脱氢酶标记偶联物由权利要求1所述的氯氮平衍生物与葡萄糖-6-磷酸脱氢酶偶联而成;其结构式如式ⅲ所示:
式ⅲ;
所述的r2缓冲液为含有牛血清白蛋白的tris缓冲液。
4.一种如权利要求3所述的氯氮平均相酶免疫检测试剂的制备方法,其特征在于,所述的制备方法包含以下步骤:
(1)将0.25%牛血清白蛋白、50mmol/l葡萄糖-6-磷酸及50mmol/l烟酰胺腺嘌呤二核苷酸氧化型依次加入50mmol/ltris缓冲液中搅拌溶解制成r1缓冲液,再将抗氯氮平特异性抗体1以1∶500-1∶5000的体积比加入到上述r1缓冲液中混匀,再用6mol/l的盐酸调节ph至8.0,制成r1试剂;
(2)将0.25%牛血清白蛋白加入100mmol/ltris缓冲液中搅拌溶解制成r2缓冲液,再将氯氮平葡萄糖-6-磷酸脱氢酶标记偶联物以1∶1000-1∶8000的体积比加入到上述r2缓冲液中混匀,再用6mol/l的盐酸调节ph至7.6,制成r2试剂;
所述抗氯氮平特异性抗体1的制备方法,包含以下步骤:
a.将氯氮平人转铁蛋白免疫原用pbs缓冲液稀释至2.0-5.0mg/ml,得到抗原溶液,然后将2.0-5.0ml所述抗原溶液与等量弗氏完全佐剂混合,对实验动物进行注射;
b.1-4周后,再用2.0-5.0ml相同的抗原溶液与等量弗氏不完全佐剂混合,对上述实验动物注射一次,之后每隔1-4周注射一次,共计注射3-8次;
c.对免疫后的实验动物取血,分离纯化抗血清,得到抗氯氮平特异性抗体1;
所述的氯氮平人转铁蛋白免疫原的制备方法,包含以下步骤:
a.称取2.0-5.0g磷酸二氢钾、3.0-6.0g磷酸氢二钠、7.5-15.0g氯化钠、1.0-2.5g氯化镁,共同溶解于1.0-2.5l去离子水中,调节ph至7.8-8.3,制成缓冲溶液a;
b.称取3.0-6.0mg人转铁蛋白,0-8℃下溶解于3.0-6.0ml上述缓冲溶液a中,制成人转铁蛋白载体溶液;
c.称取3.0-8.0mg权利要求1所述的氯氮平衍生物,0-8℃下溶解于300-800μl上述缓冲溶液a中,制成氯氮平衍生物溶液a;
d.当上述氯氮平衍生物溶液a刚变澄清时,将其逐滴加入上述人转铁蛋白载体溶液中,然后将此混合溶液在-18~-2℃下搅拌3-10小时;
e.将反应结束后的上述混合溶液用上述缓冲溶液a进行透析,透析后所得溶液即为氯氮平人转铁蛋白免疫原溶液,在氯氮平人转铁蛋白免疫原溶液中加入质量分数0.05-0.20%的硫柳汞,于-20℃下储存;
所述的氯氮平葡萄糖-6-磷酸脱氢酶标记偶联物的制备方法,包含以下步骤:
a.称取1.0-3.0g磷酸二氢钾、1.0-5.0g磷酸氢二钠、7.5-15.0g氯化钠、1.0-3.0g氯化镁,共同溶解于1.0-2.5l去离子水中,调节ph至7.8-8.3,制成缓冲溶液b;
b.称取3.0-6.0mg葡萄糖-6-磷酸脱氢酶,0-8℃下溶解于3.0-6.0ml上述缓冲溶液b中,制成葡萄糖-6-磷酸脱氢酶溶液;
c.称取3.0-8.0mg权利要求1所述的氯氮平衍生物,0-8℃下溶解于300-800μl上述缓冲溶液b中,制成氯氮平衍生物溶液b;
d.当上述氯氮平衍生物溶液b刚变澄清时,将其逐滴加入上述葡萄糖-6-磷酸脱氢酶溶液中,然后将此混合溶液在-18~-2℃下搅拌3-10小时;
e.将反应结束后的上述混合溶液用上述缓冲溶液b进行透析,透析后所得溶液即为氯氮平葡萄糖-6-磷酸脱氢酶标记偶联物溶液,在氯氮平葡萄糖-6-磷酸脱氢酶标记偶联物溶液中加入质量分数0.5-1.0%的bsa和质量分数0.05-0.20%的硫柳汞,于0~8℃下储存。
5.一种如权利要求3所述的氯氮平均相酶免疫检测试剂的使用方法,其特征在于,包括以下操作步骤:
(1)在全自动生化分析仪中加入校准品、r1试剂,混匀,37℃温育3-5分钟;加入r2试剂,混匀,37℃恒温5-10分钟后,340nm主波长/405nm次波长进行检测,连续监测3分钟内的吸光度变化率,由全自动生化分析仪制作校准曲线;
(2)在全自动生化分析仪中加入待测样本、r1试剂,混匀,37℃温育3-5分钟;加入r2试剂,混匀,37℃恒温5-10分钟后,340nm主波长/405nm次波长进行检测,连续监测3分钟内的吸光度变化率,由全自动生化分析仪根据步骤(一)中制作的校准曲线自动计算待测样本中氯氮平的含量;
所述试剂r1与试剂r2按1:1~4:1的体积比使用;所述的待测样本为血清、血浆、尿液、唾液、组织液或脑脊液中的任意一种。
6.一种氯氮平elisa检测试剂,其特征在于,该检测试剂含有:抗氯氮平特异性抗体2、氯氮平辣根过氧化物酶标记偶联物及反应底物;
所述抗氯氮平特异性抗体2为氯氮平人甲状腺球蛋白免疫原免疫实验动物后生产得到的抗体;所述的氯氮平人甲状腺球蛋白免疫原,由权利要求1所述的氯氮平衍生物与人甲状腺球蛋白偶联而成,其结构式如式ⅳ所示:
式ⅳ;
所述的实验动物为家兔、山羊、小鼠、绵羊、豚鼠或马中的任意一种;
所述的氯氮平辣根过氧化物酶标记偶联物由权利要求1所述的氯氮平衍生物与辣根过氧化物酶偶联而成;其结构式如式ⅴ所示:
式ⅴ;
所述的反应底物为3,3',5,5'-四甲基联苯胺;
所述抗氯氮平特异性抗体2的制备方法,包含以下步骤:
a.将氯氮平人甲状腺球蛋白免疫原用pbs缓冲液稀释至2.0-5.0mg/ml,得到抗原溶液,然后将2.0-5.0ml所述抗原溶液与等量弗氏完全佐剂混合,对实验动物进行注射;
b.1-4周后,再用2.0-5.0ml相同的抗原溶液与等量弗氏不完全佐剂混合,对上述实验动物注射一次,之后每隔1-4周注射一次,共计注射3-8次;
c.对免疫后的实验动物取血,分离纯化抗血清,得到抗氯氮平特异性抗体2;
所述的氯氮平人甲状腺球蛋白免疫原的制备方法,包含以下步骤:
a.称取2.0-5.0g磷酸二氢钾、3.0-6.0g磷酸氢二钠、7.5-15.0g氯化钠、1.0-2.5g氯化镁,共同溶解于1.0-2.5l去离子水中,调节ph至7.8-8.3,制成缓冲溶液c;
b.称取3.0-6.0mg人甲状腺球蛋白,0-8℃下溶解于3.0-6.0ml上述缓冲溶液c中,制成人甲状腺球蛋白载体溶液;
c.称取3.0-8.0mg权利要求1所述的氯氮平衍生物,0-8℃下溶解于300-800μl上述缓冲溶液c中,制成氯氮平衍生物溶液c;
d.当上述氯氮平衍生物溶液c刚变澄清时,将其逐滴加入上述人甲状腺球蛋白载体溶液中,然后将此混合溶液在-18~-2℃下搅拌3-10小时;
e.将反应结束后的上述混合溶液用上述缓冲溶液c进行透析,透析后所得溶液即为氯氮平人甲状腺球蛋白免疫原溶液,在氯氮平人甲状腺球蛋白免疫原溶液中加入质量分数0.05-0.20%的硫柳汞,于-20℃下储存;
所述的氯氮平辣根过氧化物酶标记偶联物的制备方法,包含以下步骤:
a.称取1.0-3.0g磷酸二氢钾、1.0-5.0g磷酸氢二钠、7.5-15.0g氯化钠、1.0-3.0g氯化镁,共同溶解于1.0-2.5l去离子水中,调节ph至7.8-8.3,制成缓冲溶液d;
b.称取3.0-6.0mg辣根过氧化物酶,0-8℃下溶解于3.0-6.0ml上述缓冲溶液d中,制成辣根过氧化物酶溶液;
c.称取3.0-8.0mg权利要求1所述的氯氮平衍生物,0-8℃下溶解于300-800μl上述缓冲溶液b中,制成氯氮平衍生物溶液d;
d.当上述氯氮平衍生物溶液d刚变澄清时,将其逐滴加入上述辣根过氧化物酶溶液中,然后将此混合溶液在-18~-2℃下搅拌3-10小时;
e.将反应结束后的上述混合溶液用上述缓冲溶液d进行透析,透析后所得溶液即为氯氮平辣根过氧化物酶标记偶联物溶液,在氯氮平辣根过氧化物酶标记偶联物溶液中加入质量分数0.5-1.0%的bsa和质量分数0.05-0.20%的硫柳汞,于0~8℃下储存。
7.一种如权利要求6所述的氯氮平elisa检测试剂的使用方法,其特征在于,包括以下操作步骤:
(a)将抗氯氮平特异性抗体2用磷酸盐缓冲液按1∶1000-1∶20000的比例进行稀释,制成抗体溶液,将抗体溶液按100μl/孔的用量包被在96孔酶联板上,4℃过夜;
(b)用磷酸盐缓冲液洗涤3次后,加入200μl/孔的0.5%的牛血清白蛋白溶液,4℃封闭过夜,磷酸盐缓冲液洗涤3次;
(c)加入20μl/孔的校准品及待测样本;
(d)加入100μl/孔工作浓度的氯氮平辣根过氧化物酶标记偶联物;
(e)室温下孵育30分钟,磷酸盐缓冲液洗板5次;
(f)每孔加入100μl的3,3',5,5'-四甲基联苯胺,室温孵育30分钟;
(g)每孔加入100μl的浓度为2mol/l的硫酸,终止反应;
(h)使用酶标仪测定450nm波长的吸光值;
(i)根据不同浓度校准品的吸光值制作校准曲线,并根据校准曲线与待测样本的吸光值计算待测样本中氯氮平的含量;
所述的待测样本为血清、血浆、尿液、唾液、组织液或脑脊液中的任意一种。
8.一种氯氮平胶乳增强免疫比浊检测试剂,其特征在于,包括:l1试剂与l2试剂;
所述l1试剂由氯氮平-人纤维蛋白原偶联物和l1缓冲液组成,所述l2试剂由抗氯氮平特异性抗体3包被的胶乳颗粒和l2缓冲液组成;
所述的氯氮平-人纤维蛋白原偶联物由权利要求1所述的氯氮平衍生物与人纤维蛋白原偶联而成,其结构式如式ⅵ所示:
式ⅵ;
所述l1缓冲液为含有牛血清白蛋白、氯化钠、吐温-20、丙三醇、乙二胺四乙酸、peg-8000、乙基汞硫代硫酸钠的tirs-hcl缓冲液;
所述的抗氯氮平特异性抗体3为氯氮平人血清白蛋白免疫原免疫实验动物后生产得到的抗体;所述的氯氮平人血清白蛋白免疫原,由权利要求1所述的氯氮平衍生物与人血清白蛋白偶联而成,其结构式如式ⅶ所示:
式ⅶ;
所述的实验动物为家兔、山羊、小鼠、绵羊、豚鼠或马中的任意一种;
所述胶乳颗粒为表面带有羧基、氨基、羟基、酰肼基或氯甲基修饰的聚苯乙烯胶乳颗粒,直径范围为50-450nm;
所述l2缓冲液为含有牛血清白蛋白、氯化钠、吐温-20、丙三醇、乙二胺四乙酸二钠、tritonx-100、乙基汞硫代硫酸钠的硼酸盐缓冲液。
9.一种如权利要求8所述的氯氮平胶乳增强免疫比浊检测试剂的制备方法,其特征在于,所述的制备方法包含以下步骤:
(1)将浓度为0.05-2mg/ml的氯氮平-人纤维蛋白原偶联物溶解于浓度为10-100mmol/l、ph值为7.0-8.0的tirs-hcl缓冲液中,然后添加质量分数为0.1%-2.0%的牛血清白蛋白、0.25%-1.0%的氯化钠、0.1%-0.5%的吐温-20、1.0%-5.0%的丙三醇、0.1%-1.0%的乙二胺四乙酸、1.0%-5.0%的peg-8000以及0.01%-0.1%的乙基汞硫代硫酸钠,搅拌均匀,调节ph=7.5,制成l1试剂;
(2)将质量分数为0.05-1.0%的抗氯氮平特异性抗体3包被的胶乳颗粒加入浓度为20-100mmol/l的硼酸盐缓冲液中,然后添加质量分数为0.1%-2.5%的牛血清白蛋白、0.25%-1.0%的氯化钠、0.1%-0.5%的吐温-20、1.0%-5.0%的丙三醇、0.1%-1.0%的乙二胺四乙酸二钠、0.1-1.0%的tritonx-100以及0.01%-0.1%的乙基汞硫代硫酸钠,搅拌均匀,制成l2试剂;
所述的氯氮平-人纤维蛋白原偶联物的制备方法,包含以下步骤:
a.称取2.0-5.0g磷酸二氢钾、3.0-6.0g磷酸氢二钠、7.5-15.0g氯化钠、1.0-2.5g氯化镁,共同溶解于1.0-2.5l去离子水中,调节ph至7.8-8.3,制成缓冲溶液e;
b.称取3.0-6.0mg人纤维蛋白原,0-8℃下溶解于3.0-6.0ml上述缓冲溶液e中,制成人纤维蛋白原载体溶液;
c.称取3.0-8.0mg权利要求1所述的氯氮平衍生物,0-8℃下溶解于300-800μl上述缓冲溶液e中,制成氯氮平衍生物溶液e;
d.当上述氯氮平衍生物溶液e刚变澄清时,将其逐滴加入上述人纤维蛋白原载体溶液中,然后将此混合溶液在-18~-2℃下搅拌3-10小时;
e.将反应结束后的上述混合溶液用上述缓冲溶液e进行透析,透析后所得溶液即为氯氮平-人纤维蛋白原偶联物溶液,在氯氮平-人纤维蛋白原偶联物溶液中加入质量分数0.05-0.20%的硫柳汞,于-20℃下储存;
所述的抗氯氮平特异性抗体3包被的胶乳颗粒的制备方法,包含以下步骤:
a.将0.5-1.5mg直径为50-450nm的聚苯乙烯胶乳颗粒加入1.5-4.5ml、0.08mol/l、ph=6.2的mes缓冲液中,然后加入5.0mg碳二亚胺与2.5mgn-羟基琥珀酰亚胺,在37℃下搅拌1小时,15000r/min离心15分钟后去除上清液,然后用15ml浓度为0.1mol/l、ph=8.2的磷酸盐缓冲液将沉淀物重悬,制成胶乳颗粒溶液;
b.将0.5-1.5mg抗氯氮平特异性抗体3用1.5-4.5ml、0.1mol/l、ph=8.2的硼酸盐缓冲液稀释后,立即加入到上述胶乳颗粒溶液中,在37℃下振荡反应12小时,然后加入1.0-3.0ml、0.1mol/l、ph=8.5的甘氨酸缓冲液搅拌2小时,反应结束后加入0.5-1.5mg牛血清白蛋白,搅拌均匀后室温静置12小时,然后9000r/mim离心15分钟,去除上清液,再将沉淀物用10ml、50mmol/l、ph=8.0的tris-hcl缓冲液洗涤3次,最后用25ml、50mmol/l、ph=8.5的甘氨酸缓冲液将沉淀物重悬,即为抗氯氮平特异性抗体3包被的胶乳颗粒悬浊液;
所述抗氯氮平特异性抗体3的制备方法,包含以下步骤:
a.将氯氮平人血清白蛋白免疫原用pbs缓冲液稀释至2.0-5.0mg/ml,得到抗原溶液,然后将2.0-5.0ml所述抗原溶液与等量弗氏完全佐剂混合,对实验动物进行注射;
b.1-4周后,再用2.0-5.0ml相同的抗原溶液与等量弗氏不完全佐剂混合,对上述实验动物注射一次,之后每隔1-4周注射一次,共计注射3-8次;
c.对免疫后的实验动物取血,分离纯化抗血清,得到抗氯氮平特异性抗体3;
所述的氯氮平人血清白蛋白免疫原的制备方法,包含以下步骤:
a.称取2.0-5.0g磷酸二氢钾、3.0-6.0g磷酸氢二钠、7.5-15.0g氯化钠、1.0-2.5g氯化镁,共同溶解于1.0-2.5l去离子水中,调节ph至7.8-8.3,制成缓冲溶液f;
b.称取3.0-6.0mg人血清白蛋白,0-8℃下溶解于3.0-6.0ml上述缓冲溶液f中,制成人血清白蛋白载体溶液;
c.称取3.0-8.0mg权利要求1所述的氯氮平衍生物,0-8℃下溶解于300-800μl上述缓冲溶液f中,制成氯氮平衍生物溶液f;
d.当上述氯氮平衍生物溶液f刚变澄清时,将其逐滴加入上述人血清白蛋白载体溶液中,然后将此混合溶液在-18~-2℃下搅拌3-10小时;
e.将反应结束后的上述混合溶液用上述缓冲溶液f进行透析,透析后所得溶液即为氯氮平人血清白蛋白免疫原溶液,在氯氮平人血清白蛋白免疫原溶液中加入质量分数0.05-0.20%的硫柳汞,于-20℃下储存。
10.根据权利要求5或7中任一项所述的校准品,其特征在于,所述校准品是由浓度分别为0ng/ml、100ng/ml、200ng/ml、400ng/ml、800ng/ml、1600ng/ml的氯氮平,质量分数为0.1-1.0%的氯化钠、0.2-2.0%的牛血清白蛋白、0.25-1.5%的乙二胺四乙酸、0.01%-0.1%的乙基汞硫代硫酸钠,50mmol/lph=7.2的tris-hcl缓冲液组成的一组校准品。