一种氯氮平衍生物及其制备方法与氯氮平检测试剂与流程

文档序号:20359834发布日期:2020-04-10 23:36阅读:来源:国知局

技术特征:

1.一种氯氮平衍生物,其特征在于,其结构式如式ⅰ所示:

式ⅰ。

2.一种如权利要求1所述的氯氮平衍生物的合成方法,其特征在于,所述合成方法的具体路线如下所示:

3.一种氯氮平均相酶免疫检测试剂,其特征在于,由r1试剂与r2试剂组成,所述r1试剂包含抗氯氮平特异性抗体1与r1缓冲液,所述r2试剂包含氯氮平葡萄糖-6-磷酸脱氢酶标记偶联物与r2缓冲液;所述抗氯氮平特异性抗体1为氯氮平人转铁蛋白免疫原免疫实验动物后生产得到的抗体;所述的氯氮平人转铁蛋白免疫原,由权利要求1所述的氯氮平衍生物与人转铁蛋白偶联而成,其结构式如式ⅱ所示:

式ⅱ;

所述的实验动物为家兔、山羊、小鼠、绵羊、豚鼠或马中的任意一种;

所述的r1缓冲液含有酶底物、辅酶、牛血清白蛋白及tris缓冲液,所述的酶底物为葡萄糖-6-磷酸,所述的辅酶为烟酰胺腺嘌呤二核苷酸氧化型;

所述的氯氮平葡萄糖-6-磷酸脱氢酶标记偶联物由权利要求1所述的氯氮平衍生物与葡萄糖-6-磷酸脱氢酶偶联而成;其结构式如式ⅲ所示:

式ⅲ;

所述的r2缓冲液为含有牛血清白蛋白的tris缓冲液。

4.一种如权利要求3所述的氯氮平均相酶免疫检测试剂的制备方法,其特征在于,所述的制备方法包含以下步骤:

(1)将0.25%牛血清白蛋白、50mmol/l葡萄糖-6-磷酸及50mmol/l烟酰胺腺嘌呤二核苷酸氧化型依次加入50mmol/ltris缓冲液中搅拌溶解制成r1缓冲液,再将抗氯氮平特异性抗体1以1∶500-1∶5000的体积比加入到上述r1缓冲液中混匀,再用6mol/l的盐酸调节ph至8.0,制成r1试剂;

(2)将0.25%牛血清白蛋白加入100mmol/ltris缓冲液中搅拌溶解制成r2缓冲液,再将氯氮平葡萄糖-6-磷酸脱氢酶标记偶联物以1∶1000-1∶8000的体积比加入到上述r2缓冲液中混匀,再用6mol/l的盐酸调节ph至7.6,制成r2试剂;

所述抗氯氮平特异性抗体1的制备方法,包含以下步骤:

a.将氯氮平人转铁蛋白免疫原用pbs缓冲液稀释至2.0-5.0mg/ml,得到抗原溶液,然后将2.0-5.0ml所述抗原溶液与等量弗氏完全佐剂混合,对实验动物进行注射;

b.1-4周后,再用2.0-5.0ml相同的抗原溶液与等量弗氏不完全佐剂混合,对上述实验动物注射一次,之后每隔1-4周注射一次,共计注射3-8次;

c.对免疫后的实验动物取血,分离纯化抗血清,得到抗氯氮平特异性抗体1;

所述的氯氮平人转铁蛋白免疫原的制备方法,包含以下步骤:

a.称取2.0-5.0g磷酸二氢钾、3.0-6.0g磷酸氢二钠、7.5-15.0g氯化钠、1.0-2.5g氯化镁,共同溶解于1.0-2.5l去离子水中,调节ph至7.8-8.3,制成缓冲溶液a;

b.称取3.0-6.0mg人转铁蛋白,0-8℃下溶解于3.0-6.0ml上述缓冲溶液a中,制成人转铁蛋白载体溶液;

c.称取3.0-8.0mg权利要求1所述的氯氮平衍生物,0-8℃下溶解于300-800μl上述缓冲溶液a中,制成氯氮平衍生物溶液a;

d.当上述氯氮平衍生物溶液a刚变澄清时,将其逐滴加入上述人转铁蛋白载体溶液中,然后将此混合溶液在-18~-2℃下搅拌3-10小时;

e.将反应结束后的上述混合溶液用上述缓冲溶液a进行透析,透析后所得溶液即为氯氮平人转铁蛋白免疫原溶液,在氯氮平人转铁蛋白免疫原溶液中加入质量分数0.05-0.20%的硫柳汞,于-20℃下储存;

所述的氯氮平葡萄糖-6-磷酸脱氢酶标记偶联物的制备方法,包含以下步骤:

a.称取1.0-3.0g磷酸二氢钾、1.0-5.0g磷酸氢二钠、7.5-15.0g氯化钠、1.0-3.0g氯化镁,共同溶解于1.0-2.5l去离子水中,调节ph至7.8-8.3,制成缓冲溶液b;

b.称取3.0-6.0mg葡萄糖-6-磷酸脱氢酶,0-8℃下溶解于3.0-6.0ml上述缓冲溶液b中,制成葡萄糖-6-磷酸脱氢酶溶液;

c.称取3.0-8.0mg权利要求1所述的氯氮平衍生物,0-8℃下溶解于300-800μl上述缓冲溶液b中,制成氯氮平衍生物溶液b;

d.当上述氯氮平衍生物溶液b刚变澄清时,将其逐滴加入上述葡萄糖-6-磷酸脱氢酶溶液中,然后将此混合溶液在-18~-2℃下搅拌3-10小时;

e.将反应结束后的上述混合溶液用上述缓冲溶液b进行透析,透析后所得溶液即为氯氮平葡萄糖-6-磷酸脱氢酶标记偶联物溶液,在氯氮平葡萄糖-6-磷酸脱氢酶标记偶联物溶液中加入质量分数0.5-1.0%的bsa和质量分数0.05-0.20%的硫柳汞,于0~8℃下储存。

5.一种如权利要求3所述的氯氮平均相酶免疫检测试剂的使用方法,其特征在于,包括以下操作步骤:

(1)在全自动生化分析仪中加入校准品、r1试剂,混匀,37℃温育3-5分钟;加入r2试剂,混匀,37℃恒温5-10分钟后,340nm主波长/405nm次波长进行检测,连续监测3分钟内的吸光度变化率,由全自动生化分析仪制作校准曲线;

(2)在全自动生化分析仪中加入待测样本、r1试剂,混匀,37℃温育3-5分钟;加入r2试剂,混匀,37℃恒温5-10分钟后,340nm主波长/405nm次波长进行检测,连续监测3分钟内的吸光度变化率,由全自动生化分析仪根据步骤(一)中制作的校准曲线自动计算待测样本中氯氮平的含量;

所述试剂r1与试剂r2按1:1~4:1的体积比使用;所述的待测样本为血清、血浆、尿液、唾液、组织液或脑脊液中的任意一种。

6.一种氯氮平elisa检测试剂,其特征在于,该检测试剂含有:抗氯氮平特异性抗体2、氯氮平辣根过氧化物酶标记偶联物及反应底物;

所述抗氯氮平特异性抗体2为氯氮平人甲状腺球蛋白免疫原免疫实验动物后生产得到的抗体;所述的氯氮平人甲状腺球蛋白免疫原,由权利要求1所述的氯氮平衍生物与人甲状腺球蛋白偶联而成,其结构式如式ⅳ所示:

式ⅳ;

所述的实验动物为家兔、山羊、小鼠、绵羊、豚鼠或马中的任意一种;

所述的氯氮平辣根过氧化物酶标记偶联物由权利要求1所述的氯氮平衍生物与辣根过氧化物酶偶联而成;其结构式如式ⅴ所示:

式ⅴ;

所述的反应底物为3,3',5,5'-四甲基联苯胺;

所述抗氯氮平特异性抗体2的制备方法,包含以下步骤:

a.将氯氮平人甲状腺球蛋白免疫原用pbs缓冲液稀释至2.0-5.0mg/ml,得到抗原溶液,然后将2.0-5.0ml所述抗原溶液与等量弗氏完全佐剂混合,对实验动物进行注射;

b.1-4周后,再用2.0-5.0ml相同的抗原溶液与等量弗氏不完全佐剂混合,对上述实验动物注射一次,之后每隔1-4周注射一次,共计注射3-8次;

c.对免疫后的实验动物取血,分离纯化抗血清,得到抗氯氮平特异性抗体2;

所述的氯氮平人甲状腺球蛋白免疫原的制备方法,包含以下步骤:

a.称取2.0-5.0g磷酸二氢钾、3.0-6.0g磷酸氢二钠、7.5-15.0g氯化钠、1.0-2.5g氯化镁,共同溶解于1.0-2.5l去离子水中,调节ph至7.8-8.3,制成缓冲溶液c;

b.称取3.0-6.0mg人甲状腺球蛋白,0-8℃下溶解于3.0-6.0ml上述缓冲溶液c中,制成人甲状腺球蛋白载体溶液;

c.称取3.0-8.0mg权利要求1所述的氯氮平衍生物,0-8℃下溶解于300-800μl上述缓冲溶液c中,制成氯氮平衍生物溶液c;

d.当上述氯氮平衍生物溶液c刚变澄清时,将其逐滴加入上述人甲状腺球蛋白载体溶液中,然后将此混合溶液在-18~-2℃下搅拌3-10小时;

e.将反应结束后的上述混合溶液用上述缓冲溶液c进行透析,透析后所得溶液即为氯氮平人甲状腺球蛋白免疫原溶液,在氯氮平人甲状腺球蛋白免疫原溶液中加入质量分数0.05-0.20%的硫柳汞,于-20℃下储存;

所述的氯氮平辣根过氧化物酶标记偶联物的制备方法,包含以下步骤:

a.称取1.0-3.0g磷酸二氢钾、1.0-5.0g磷酸氢二钠、7.5-15.0g氯化钠、1.0-3.0g氯化镁,共同溶解于1.0-2.5l去离子水中,调节ph至7.8-8.3,制成缓冲溶液d;

b.称取3.0-6.0mg辣根过氧化物酶,0-8℃下溶解于3.0-6.0ml上述缓冲溶液d中,制成辣根过氧化物酶溶液;

c.称取3.0-8.0mg权利要求1所述的氯氮平衍生物,0-8℃下溶解于300-800μl上述缓冲溶液b中,制成氯氮平衍生物溶液d;

d.当上述氯氮平衍生物溶液d刚变澄清时,将其逐滴加入上述辣根过氧化物酶溶液中,然后将此混合溶液在-18~-2℃下搅拌3-10小时;

e.将反应结束后的上述混合溶液用上述缓冲溶液d进行透析,透析后所得溶液即为氯氮平辣根过氧化物酶标记偶联物溶液,在氯氮平辣根过氧化物酶标记偶联物溶液中加入质量分数0.5-1.0%的bsa和质量分数0.05-0.20%的硫柳汞,于0~8℃下储存。

7.一种如权利要求6所述的氯氮平elisa检测试剂的使用方法,其特征在于,包括以下操作步骤:

(a)将抗氯氮平特异性抗体2用磷酸盐缓冲液按1∶1000-1∶20000的比例进行稀释,制成抗体溶液,将抗体溶液按100μl/孔的用量包被在96孔酶联板上,4℃过夜;

(b)用磷酸盐缓冲液洗涤3次后,加入200μl/孔的0.5%的牛血清白蛋白溶液,4℃封闭过夜,磷酸盐缓冲液洗涤3次;

(c)加入20μl/孔的校准品及待测样本;

(d)加入100μl/孔工作浓度的氯氮平辣根过氧化物酶标记偶联物;

(e)室温下孵育30分钟,磷酸盐缓冲液洗板5次;

(f)每孔加入100μl的3,3',5,5'-四甲基联苯胺,室温孵育30分钟;

(g)每孔加入100μl的浓度为2mol/l的硫酸,终止反应;

(h)使用酶标仪测定450nm波长的吸光值;

(i)根据不同浓度校准品的吸光值制作校准曲线,并根据校准曲线与待测样本的吸光值计算待测样本中氯氮平的含量;

所述的待测样本为血清、血浆、尿液、唾液、组织液或脑脊液中的任意一种。

8.一种氯氮平胶乳增强免疫比浊检测试剂,其特征在于,包括:l1试剂与l2试剂;

所述l1试剂由氯氮平-人纤维蛋白原偶联物和l1缓冲液组成,所述l2试剂由抗氯氮平特异性抗体3包被的胶乳颗粒和l2缓冲液组成;

所述的氯氮平-人纤维蛋白原偶联物由权利要求1所述的氯氮平衍生物与人纤维蛋白原偶联而成,其结构式如式ⅵ所示:

式ⅵ;

所述l1缓冲液为含有牛血清白蛋白、氯化钠、吐温-20、丙三醇、乙二胺四乙酸、peg-8000、乙基汞硫代硫酸钠的tirs-hcl缓冲液;

所述的抗氯氮平特异性抗体3为氯氮平人血清白蛋白免疫原免疫实验动物后生产得到的抗体;所述的氯氮平人血清白蛋白免疫原,由权利要求1所述的氯氮平衍生物与人血清白蛋白偶联而成,其结构式如式ⅶ所示:

式ⅶ;

所述的实验动物为家兔、山羊、小鼠、绵羊、豚鼠或马中的任意一种;

所述胶乳颗粒为表面带有羧基、氨基、羟基、酰肼基或氯甲基修饰的聚苯乙烯胶乳颗粒,直径范围为50-450nm;

所述l2缓冲液为含有牛血清白蛋白、氯化钠、吐温-20、丙三醇、乙二胺四乙酸二钠、tritonx-100、乙基汞硫代硫酸钠的硼酸盐缓冲液。

9.一种如权利要求8所述的氯氮平胶乳增强免疫比浊检测试剂的制备方法,其特征在于,所述的制备方法包含以下步骤:

(1)将浓度为0.05-2mg/ml的氯氮平-人纤维蛋白原偶联物溶解于浓度为10-100mmol/l、ph值为7.0-8.0的tirs-hcl缓冲液中,然后添加质量分数为0.1%-2.0%的牛血清白蛋白、0.25%-1.0%的氯化钠、0.1%-0.5%的吐温-20、1.0%-5.0%的丙三醇、0.1%-1.0%的乙二胺四乙酸、1.0%-5.0%的peg-8000以及0.01%-0.1%的乙基汞硫代硫酸钠,搅拌均匀,调节ph=7.5,制成l1试剂;

(2)将质量分数为0.05-1.0%的抗氯氮平特异性抗体3包被的胶乳颗粒加入浓度为20-100mmol/l的硼酸盐缓冲液中,然后添加质量分数为0.1%-2.5%的牛血清白蛋白、0.25%-1.0%的氯化钠、0.1%-0.5%的吐温-20、1.0%-5.0%的丙三醇、0.1%-1.0%的乙二胺四乙酸二钠、0.1-1.0%的tritonx-100以及0.01%-0.1%的乙基汞硫代硫酸钠,搅拌均匀,制成l2试剂;

所述的氯氮平-人纤维蛋白原偶联物的制备方法,包含以下步骤:

a.称取2.0-5.0g磷酸二氢钾、3.0-6.0g磷酸氢二钠、7.5-15.0g氯化钠、1.0-2.5g氯化镁,共同溶解于1.0-2.5l去离子水中,调节ph至7.8-8.3,制成缓冲溶液e;

b.称取3.0-6.0mg人纤维蛋白原,0-8℃下溶解于3.0-6.0ml上述缓冲溶液e中,制成人纤维蛋白原载体溶液;

c.称取3.0-8.0mg权利要求1所述的氯氮平衍生物,0-8℃下溶解于300-800μl上述缓冲溶液e中,制成氯氮平衍生物溶液e;

d.当上述氯氮平衍生物溶液e刚变澄清时,将其逐滴加入上述人纤维蛋白原载体溶液中,然后将此混合溶液在-18~-2℃下搅拌3-10小时;

e.将反应结束后的上述混合溶液用上述缓冲溶液e进行透析,透析后所得溶液即为氯氮平-人纤维蛋白原偶联物溶液,在氯氮平-人纤维蛋白原偶联物溶液中加入质量分数0.05-0.20%的硫柳汞,于-20℃下储存;

所述的抗氯氮平特异性抗体3包被的胶乳颗粒的制备方法,包含以下步骤:

a.将0.5-1.5mg直径为50-450nm的聚苯乙烯胶乳颗粒加入1.5-4.5ml、0.08mol/l、ph=6.2的mes缓冲液中,然后加入5.0mg碳二亚胺与2.5mgn-羟基琥珀酰亚胺,在37℃下搅拌1小时,15000r/min离心15分钟后去除上清液,然后用15ml浓度为0.1mol/l、ph=8.2的磷酸盐缓冲液将沉淀物重悬,制成胶乳颗粒溶液;

b.将0.5-1.5mg抗氯氮平特异性抗体3用1.5-4.5ml、0.1mol/l、ph=8.2的硼酸盐缓冲液稀释后,立即加入到上述胶乳颗粒溶液中,在37℃下振荡反应12小时,然后加入1.0-3.0ml、0.1mol/l、ph=8.5的甘氨酸缓冲液搅拌2小时,反应结束后加入0.5-1.5mg牛血清白蛋白,搅拌均匀后室温静置12小时,然后9000r/mim离心15分钟,去除上清液,再将沉淀物用10ml、50mmol/l、ph=8.0的tris-hcl缓冲液洗涤3次,最后用25ml、50mmol/l、ph=8.5的甘氨酸缓冲液将沉淀物重悬,即为抗氯氮平特异性抗体3包被的胶乳颗粒悬浊液;

所述抗氯氮平特异性抗体3的制备方法,包含以下步骤:

a.将氯氮平人血清白蛋白免疫原用pbs缓冲液稀释至2.0-5.0mg/ml,得到抗原溶液,然后将2.0-5.0ml所述抗原溶液与等量弗氏完全佐剂混合,对实验动物进行注射;

b.1-4周后,再用2.0-5.0ml相同的抗原溶液与等量弗氏不完全佐剂混合,对上述实验动物注射一次,之后每隔1-4周注射一次,共计注射3-8次;

c.对免疫后的实验动物取血,分离纯化抗血清,得到抗氯氮平特异性抗体3;

所述的氯氮平人血清白蛋白免疫原的制备方法,包含以下步骤:

a.称取2.0-5.0g磷酸二氢钾、3.0-6.0g磷酸氢二钠、7.5-15.0g氯化钠、1.0-2.5g氯化镁,共同溶解于1.0-2.5l去离子水中,调节ph至7.8-8.3,制成缓冲溶液f;

b.称取3.0-6.0mg人血清白蛋白,0-8℃下溶解于3.0-6.0ml上述缓冲溶液f中,制成人血清白蛋白载体溶液;

c.称取3.0-8.0mg权利要求1所述的氯氮平衍生物,0-8℃下溶解于300-800μl上述缓冲溶液f中,制成氯氮平衍生物溶液f;

d.当上述氯氮平衍生物溶液f刚变澄清时,将其逐滴加入上述人血清白蛋白载体溶液中,然后将此混合溶液在-18~-2℃下搅拌3-10小时;

e.将反应结束后的上述混合溶液用上述缓冲溶液f进行透析,透析后所得溶液即为氯氮平人血清白蛋白免疫原溶液,在氯氮平人血清白蛋白免疫原溶液中加入质量分数0.05-0.20%的硫柳汞,于-20℃下储存。

10.根据权利要求5或7中任一项所述的校准品,其特征在于,所述校准品是由浓度分别为0ng/ml、100ng/ml、200ng/ml、400ng/ml、800ng/ml、1600ng/ml的氯氮平,质量分数为0.1-1.0%的氯化钠、0.2-2.0%的牛血清白蛋白、0.25-1.5%的乙二胺四乙酸、0.01%-0.1%的乙基汞硫代硫酸钠,50mmol/lph=7.2的tris-hcl缓冲液组成的一组校准品。


技术总结
本发明公开了一种用于人体生物样本中氯氮平含量检测的氯氮平衍生物及其制备方法。使用该氯氮平衍生物获得了3种高免疫原性的氯氮平免疫原与相应的3种抗氯氮平特异性抗体以及3种氯氮平酶标偶联物,并制备出了3种灵敏度高、特异性强、检测效果好的氯氮平免疫学检验试剂。本发明还提供了3种氯氮平免疫检验试剂的制备方法及相应的使用方法。本发明提供的3种氯氮平免疫检测方法操作方便、检测快速、结果准确、灵敏度高、特异性强,能够对人体血液样本中的氯氮平含量进行定量检测。克服了现有技术中氯氮平检测方法存在的操作复杂、自动化程度低等缺陷,能有效指导临床个体化合理用药。

技术研发人员:张小可;蔡江丽;虞留明
受保护的技术使用者:苏州博源医疗科技有限公司
技术研发日:2019.12.18
技术公布日:2020.04.10
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