PRL基因5’调控区位点与鸡种睾丸性状相关性的检测方法及应用与流程

本发明涉及生物基因领域和动物学领域，尤其涉及一种prl基因5’调控区24bpindel位点与鸡种睾丸性状相关性的检测方法及应用。

背景技术：

催乳素(prolactin，prl)是垂体前叶嗜酸细胞分泌的多肽类激素，是生长激素基因家族的重要成员，对机体生长发育、内分泌与代谢、繁殖与免疫等过程具有重要的调节作用(bole-feysot等，1998；gorrin等，2002；jiang等，2005；liang等，2006)。禽类prl多态性及其多态性与母禽繁殖性能的相关性已有大量研究，特别是prl基因5’调控区24bpindel位点(i58724210d)多态性与母禽繁殖性能如就巢行为等的相关性已得到广泛关注(jiang等，2005；liang等，2006；xu等，2011)。但该位点与地方鸡种睾丸性状的相关性还未见有报道。

睾丸是雄性动物重要的生殖器官，具有产生精子和分泌雄激素的功能。在优质鸡育种中，睾丸性状不仅仅是蛋鸡的重要经济性状，更是肉鸡选育的一个重要经济性状(顾敏清，2008；orlu等，2009；sarabia等，2013)。种公鸡睾丸大小和重量与精子、精液的数量和质量有直接联系，对鸡群受精率的高低和维持很重要，而且繁殖后期种公鸡的繁殖机能逐渐减退，精液品质大幅下降，从而缩短种公鸡的使用寿命。同时鸡睾丸作为优质鸡消费副产品有着重要的医药及经济价值，我国广东、福建、台湾等地消费者有着食用鸡鹅等禽类睾丸的习惯，目前市场售价可达100元/kg，一只公鸡的睾丸按20g计算，附加值达2元，如果能提高公鸡睾丸的重量则意味着可以提高公鸡的附加值。申请者在早期研究中发现地方鸡种睾丸性状在群体中的变异系数高达80％以上(周敏等，2019)。而评价睾丸生长发育的指标如左右两侧的睾丸重、睾丸指数、睾丸总重是屠宰性状，如直接选择这些指标，在现场育种中必须进行大量的屠宰后通过同胞值进行选择，该方法成本高，工作繁琐。随着分子遗传标记辅助选择在育种中的应用，候选基因法是家鸡进行睾丸性状分子选育行之有效、易于操作的方法。本专利以prl基因5’调控区24bpindel位点为候选标记检测该位点在地方鸡种宁都黄公鸡中的多态性并分析其与睾丸性状的关系，以便为地方鸡种品种选育及标记辅助选择提供依据。

技术实现要素：

为了克服上述缺陷，本发明提供一种利用检测鸡种prl基因5’调控区24bpindel位点的多态性与睾丸形状相关性的关系，并利用这种关系和方法作为鸡种品种选育和标记的的手段。

为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案为：一种prl基因5’调控区24bpindel位点与鸡种睾丸性状相关性的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)提取待检测鸡种的基因组dna；

(2)采用pcr反应扩增扩增prl基因5’调控区24bpindel位点上下游130bp或154bp片段；

(3)将得到的pcr产物直接电泳分型；

(4)采用sas9.0glm程序进行统计分析prl基因5’调控区24bpindel位点基因型与睾丸性状的相关性。

步骤(1)，在翅下静脉采血1～2ml，用2％edta抗凝，-20℃保存备用。所采血样用常规的酚/氯仿抽提法提取基因组dna，并稀释成100ng/μl备用。

步骤(2)从ncbi上下载鸡prl基因组序列(genbank登录号：nc_006089)，应用genetool软件设计上下游引物，引物序列：f:5’-tttaatattggtgggtgaagagaca-3’，r:5’-atgccactgatcctcgaaaactc-3’，扩增prl基因5’调控区24bpindel(i59724210d)位点上下游130bp或154bp片段。引物由湖南擎科生物有限公司合成。

步骤(3)，pcr反应体系为(10μl)：2×pcrmix5μl，上下游引物各0.2μl，dna模板0.6μl，ddh2o4μl。pcr反应程序为：95℃预变性3min；95℃变性20s，54℃退火20s，72℃延伸20s，35个循环；后延伸72℃5min。反应结束后prl基因取所有扩增产物用3.0％琼脂糖凝胶电泳判断基因型。

步骤(4)中采用sas9.0glm程序进行统计分析，构建模型如下：yij＝μ+gi+eij。其中yij为性状表型值，μ为该性状的总体均值，gi为基因型效应值，eij为随机残差效应。

prl基因5’调控区24bpindel位点基因型在检测鸡种睾丸性状相关性中的应用。

所述应用具体为通过鸡种prl基因5’调控区24bpindel位点为候选标记，分析其基因型与睾丸性状的关系，从而对鸡种品种进行选育。

相对于现有技术，本发明是采用一种检测鸡种prl基因5’调控区24bpindel位点的多态性与睾丸性状相关性的关系，并利用这种关系和方法作为鸡种品种选育和标记的的手段。这种选育方法相较于现在的屠宰选育，不仅成本低、操作简便，并且结果准确。本方法简单易行，可重复性强，在普通实验室即可进行。

附图说明

图1prl基因5’调控区24bpindel位点的酶切结果；其中：m是ds2000dnamarker；5：di型；1-4、6-9：dd型；10：ii型。

具体实施方式

为了阐述本发明的技术方案和技术目的，下面具体实施方式对本发明做进一步介绍。

1材料与方法

1.1试验材料、指标测定及样品采集

试验鸡群由江西南师科技有限公司提供，饲养时间为2018年4月-2018年8月，鸡苗数为700羽，饲养模式为种公鸡笼养模式，按照肉种鸡常规免疫程序进行统一免疫，其它均按照常规方法进行饲养管理。在出生第一天戴上翅号，第5周戴上脚号。饲养至16周龄进行屠宰。指标测定有活体质量、左侧睾丸质量、右侧睾丸质量、睾丸总质量与睾丸指数。其中睾丸指数为(睾丸质量/活体质量)×100.去除死亡、逃逸、以及明显错误与重复数据，最后得到的试验公鸡499只。指标测定参照ny/t823—2004《家禽生产性能名词术语和度量统计方法》规定的方法。在翅下静脉采血1～2ml，用2％edta抗凝，-20℃保存备用。所采血样用常规的酚/氯仿抽提法提取基因组dna，并稀释成100ng/μl备用。

1.2引物设计与合成

从ncbi上下载鸡prl基因组序列(genbank登录号：nc_006089)，应用genetool软件设计上下游引物，引物序列：f:5’-tttaatattggtgggtgaagagaca-3’，r:5’-atgccactgatcctcgaaaactc-3’，扩增prl基因5’调控区24bpindel(i59724210d)位点上下游130bp或154bp片段。引物由湖南擎科生物有限公司合成。

pcr反应体系为(10μl)：2×pcrmix5μl，上下游引物各0.2μl，dna模板0.6μl，ddh2o4μl。pcr反应程序为：95℃预变性3min；95℃变性20s，54℃退火20s，72℃延伸20s，35个循环；后延伸72℃5min。反应结束后prl基因取所有扩增产物用3.0％琼脂糖凝胶电泳判断基因型。

1.3统计分析

由于所观察群体拥有相同的遗传背景，均为16w公鸡，且在饲养标准相同条件下饲养，所以标记与睾丸性状间的关联分析采用sas9.0glm程序进行统计分析，构建模型如下：yij＝μ+gi+eij。其中yij为性状表型值，μ为该性状的总体均值，gi为基因型效应值，eij为随机残差效应。

2结果与分析

prl基因5’调控区24bpindel(i59724210d)位点不同基因型与睾丸性状的相关性见表1。从表1可以看出，在所测定的6个性状中，不同基因型间的睾丸性状存在显著差异(p<0.05)，dd型个体的16w总睾丸质量、16w睾丸总质量指数、16w左侧睾丸质量、16w左侧睾丸指数极显著高于di型个体(p<0.01)，dd型个体的16w右侧睾丸质量与16w右侧睾丸指数显著高于di个体(p<0.05)，6个指标与ii型个体差异不显著。

表1位点24bpindel(i59724210d)基因型与笼养宁都黄公鸡睾丸性状的相关性

可根据上述获得的相关性分析结果，针对数据优异的基因型鸡种进行筛选育种。

以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。