丙硫菌唑高效降解菌W313、菌剂及应用的制作方法

本发明涉及生物技术领域，尤其是涉及一种丙硫菌唑高效降解菌w313、菌剂及应用。

背景技术：

我国是世界上第一农药生产和使用大国，每年化学防治面积70亿亩，农药年使用量达200多万。其中，丙硫菌唑是由拜耳公司开发的一种新型广谱三唑硫酮类杀菌剂，用于防治由子囊菌、担子菌以及半知菌引起的病害，其作用机理是抑制真菌甾醇的前体——羊毛甾醇或2,4-亚甲基二氢羊毛甾醇14位上的脱甲基化作用，即脱甲基化抑制剂。在作物和土壤中的主要代谢物为其脱硫产物脱硫丙硫菌唑。其对人体具有较高的生殖毒性和发育毒性，并对胚胎具有严重致畸性。

丙硫菌唑在背负式手动喷雾场景下使用，施药量按0.2kgai/ha计，目标作物为小麦等中等高度作物时，在缺少丙硫菌唑转化为脱硫丙硫菌唑转化率的情况下，按丙硫菌唑全部转化为脱硫丙硫菌唑评估，其对施用人员的健康风险为不可接受。因此，环境中丙硫菌唑的残留问题亟待解决。

有鉴于此，特提出本发明。

技术实现要素：

本发明的第一目的在于提供一株丙硫菌唑高效降解菌w313，分类命名为假单胞菌(pseudomonassp.)，于2019年09月11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmccno.18486。

本发明的第二目的在于提供一种菌剂，该菌剂包含所述丙硫菌唑高效降解菌w313和任选的辅料。

本发明的第三目的在于提供一种丙硫菌唑水解酶，该丙硫菌唑水解酶从所述丙硫菌唑高效降解菌w313中分离得到。

本发明的第四目的在于提供所述丙硫菌唑高效降解菌w313、所述菌剂和所述丙硫菌唑水解酶的应用。

为解决上述技术问题，本发明特采用如下技术方案：

根据本发明的一个方面，本发明提供了一株丙硫菌唑高效降解菌w313，分类命名为假单胞菌(pseudomonassp.)，于2019年09月11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmccno.18486。

根据本发明的另一个方面，本发明还提供了一种菌剂，所述菌剂包含所述丙硫菌唑高效降解菌w313。

根据本发明的另一个方面，本发明还提供了一种丙硫菌唑水解酶，所述丙硫菌唑水解酶从所述丙硫菌唑高效降解菌w313中分离得到。

根据本发明的另一个方面，本发明还提供了一种丙硫菌唑水解酶的生产方法，包括使用所述丙硫菌唑高效降解菌w313发酵生产所述丙硫菌唑水解酶。

根据本发明的另一个方面，本发明还提供了一种丙硫菌唑高效降解菌w313的胞内总蛋白提取物。

根据本发明的另一个方面，本发明还提供了一种降解丙硫菌唑的方法，包括使用所述丙硫菌唑高效降解菌w313、所述菌剂、所述丙硫菌唑水解酶或所述胞内总蛋白提取物降解丙硫菌唑。

根据本发明的另一个方面，本发明还提供了所述丙硫菌唑高效降解菌w313、所述菌剂、所述丙硫菌唑水解酶、所述丙硫菌唑水解酶的生产方法或所述胞内总蛋白提取物在制备降解丙硫菌唑的产品中的应用。

根据本发明的另一个方面，本发明还提供了一种降解丙硫菌唑的产品，该产品包括所述丙硫菌唑高效降解菌w313、所述菌剂、所述丙硫菌唑水解酶或所述胞内总蛋白提取物。

根据本发明的另一个方面，本发明还提供了所述丙硫菌唑高效降解菌w313、所述菌剂、所述丙硫菌唑水解酶、所述丙硫菌唑水解酶的生产方法或所述胞内总蛋白提取物在制备降解农药的产品中的应用。

根据本发明的另一个方面，本发明还提供了一种降解农药的产品，该产品包括所述丙硫菌唑高效降解菌w313、所述菌剂、所述丙硫菌唑水解酶或所述胞内总蛋白提取物。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明提供的丙硫菌唑高效降解菌w313从活性污泥中筛出，是一株假单胞属(pseudomonas)菌的新种，能够在丙硫菌唑浓度为200mg/l的培养基上正常生长，对丙硫菌唑耐受性较高。当丙硫菌唑高效降解菌w313以丙硫菌唑为唯一碳源时，培养48h后丙硫菌唑的降解率可达61％，说明该菌具有较好的丙硫菌唑降解活性。分离丙硫菌唑高效降解菌w313胞内总蛋白发现60h后胞内总蛋白丙硫菌唑水解酶酶活可达到2.32u/mg总蛋白，说明丙硫菌唑高效降解菌w313具有产丙硫菌唑水解酶活性。

基于上述丙硫菌唑高效降解菌w313的有益效果，本发明还提供了包含丙硫菌唑高效降解菌w313的菌剂，丙硫菌唑高效降解菌w313的胞内总蛋白提取物和丙硫菌唑水解酶以及他们的应用，这些基于丙硫菌唑高效降解菌w313的产品和应用具有丙硫菌唑高效降解菌w313的有益效果。尤其是将丙硫菌唑高效降解菌w313以及其相关的产品和应用其的方法应用于降解丙硫菌唑和制备降解农药的产品，能够有效的消除环境中的丙硫菌唑污染和含有丙硫菌唑的农药的农残，去除效果好且去除过程无二次污染，是一种理想的清除环境中农药残留的方法。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明提供的w313菌株的菌落形态；

图2为本发明提供的w313菌株革兰氏染色；

图3为本发明提供的w313菌株的系统发育树；

图4为以丙硫菌唑为唯一碳源培养的w313菌株，丙硫菌唑浓度为20ppm；

图5为以丙硫菌唑为唯一碳源培养的w313菌株，丙硫菌唑浓度为200ppm；

图6为本发明提供的w313菌株的生长降解曲线。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

根据本发明的一个方面，本发明提供了一株丙硫菌唑高效降解菌w313(以下简称w313菌株)。本发明的菌株的保藏日期为2019年09月11；保藏编号为cgmccno.18486；分类命名为假单胞菌(pseudomonassp.)，保藏单位名称为：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编：100101。

本发明提供的w313菌株从活性污泥中筛出，在无机盐培养基上菌落生长较慢，30℃条件下培养2d后，菌落直径2～3mm，菌落形态不一，边缘不齐，扁平湿润，呈灰绿色；该菌株在以丙硫菌唑为唯一碳源的培养基中生长，对丙硫菌唑的耐受性及利用率较高，最高能在丙硫菌唑浓度为700mg/l的培养基上正常生长，说明该菌的丙硫菌唑耐受性较高。

本发明提供的w313菌株的rdna内转录间隔区(its)序列如seqidno.1所示，与已知的pseudomonasaeruginosastrain和pseudomonasotitidisstrain的its序列相似性均在90％之上，结合其形态学特征，确定它是一株假单胞菌新种，将其归入假单胞属(pseudomonas)。

将本发明提供的w313菌株接种于以丙硫菌唑为唯一碳源的液体培养基中，研究其对培养基中丙硫菌唑的利用率，结果表明：w313菌株在以丙硫菌唑为碳源的液体培养基(ph6.4)中，在30℃、180rpm/min条件下进行液体发酵，其中丙硫菌唑浓度为20mg/l，每天取样测试丙硫菌唑含量变化。生长经过20h的延滞期进入对数生长期，20h后，菌株进入稳定生长期，菌株在20～40h处于丙硫菌唑降解的延滞期；40h后丙硫菌唑浓度迅速下降，48h降解率达61％，表明该菌具有较好的丙硫菌唑降解活性。

取本发明提供的w313菌株胞内总蛋白样品液，以每分钟降解1μmol的丙硫菌唑所需的酶量定义为1个酶活力单位，发现60h后胞内总蛋白丙硫菌唑水解酶酶活可达到2.32u/mg总蛋白，说明w313菌株具有产丙硫菌唑水解酶活性。

综上，本发明提供的w313菌株是一株假单胞属(pseudomonas)菌株的新菌种，具有丙硫菌唑耐受性较高，具有较好的丙硫菌唑降解活性和具有产丙硫菌唑水解酶活性的有益效果。

基于上述本发明提供的w313菌株，本发明还提供了一种包含上述w313菌株的菌剂，该菌剂和上述w313菌株基于相同的发明构思，因此具有上述w313菌株的所有有益效果，在此不再赘述。

本发明提供的菌剂中还可以包括其他种类的微生物，以和w313菌株共同作为活性物质，例如还可以含有对有机磷类或菊酯类农药的高效降解菌株，本发明对此不作限制。

本发明提供的菌剂中除去作为活性成分的微生物还可以包括任选的辅料，所述任选的指的是菌剂中可以含有辅料，也可以不含有辅料。辅料指的是不影响菌剂中的微生物的生理生化活性，同时能够改善菌剂性能的成分。辅料的实例包括但不限于干燥剂、ph调节剂、分散剂和营养物质等。辅料还可以包括用于吸附微生物的载体，载体的实例包括但不限于碳酸钙、沸石、蒙脱石、稻壳、硅藻土、聚乙烯醇、聚乙二醇和聚氨酯等。辅料还可以包括用于为菌剂中的微生物提供营养的物质，提供营养的物质的实例包括但不限于氮源、碳源、微量元素、氨基酸和微生物等。

基于本发明提供的w313菌株具有产丙硫菌唑水解酶活性的特点，本发明还提供了一种丙硫菌唑水解酶，丙硫菌唑水解酶是从w313菌株中分离得到的能够有效的水解丙硫菌唑的水解酶。相应的，本发明还提供了w313菌株的胞内总蛋白提取物，该胞内总蛋白提取物由于含有丙硫菌唑的水解酶，因此也具有水解丙硫菌唑的效果。

本发明还提供了丙硫菌唑水解酶的生产方法，该方法通过w313菌株发酵生产所述丙硫菌唑水解酶。丙硫菌唑高效降解菌w313的发酵可以采用本领域常规的微生物的培养方法，例如假单胞属微生物的发酵方法，然后获得w313菌株的胞内总蛋白提取物，即可以获得丙硫菌唑水解酶。

基于本发明提供的w313菌株具有丙硫菌唑耐受性和降解活性，本发明还提供了一种降解丙硫菌唑的方法，该方法使用所述w313菌株、所述菌剂、所述丙硫菌唑水解酶或w313菌株的胞内总蛋白提取物降解丙硫菌唑。本发明提供的降解丙硫菌唑的方法是一种生物修复(bioremediation)方法，生物修复是一种利用细菌等活体生物及其产生的降解酶，来有效的去除环境中的各种污染物的生物学手段。本发明提供的降解丙硫菌唑的方法可以用于降解以丙硫菌唑作为主要活性成分的农药，是一种理想的去除环境中农药残留的方法，具有高效，无二次污染的有益效果。

本发明还提供了w313菌株、包含w313菌株的菌剂、丙硫菌唑水解酶、w313菌株的胞内总蛋白提取物或丙硫菌唑水解酶的生产方法在制备降解丙硫菌唑的产品中的应用和在制备降解农药的产品中的应用。w313菌株、包含其的菌剂、丙硫菌唑水解酶和w313菌株的胞内总蛋白提取物均具有降解丙硫菌唑的功能，因此可以作为活性成分用于制备降解丙硫菌唑的产品和用于制备降解农药的产品。丙硫菌唑水解酶的生产方法可以用于生产丙硫菌唑水解酶，因此可以作为降解丙硫菌唑的产品和降解农药的产品中的生产步骤中的一个环节。

将w313菌株和其相关的产品用于制备降解丙硫菌唑的产品，不仅可以用于去除以丙硫菌唑作为主要活性成分的农药的残留，还可以用于研究丙硫菌唑的代谢，有利于对丙硫菌唑的进一步研究。将w313菌株和其相关的产品用于制备降解农药的产品，有利于开发出一种利用生物修复的手段去除农药残留的产品，实现有效的去除农残的同时又不造成环境二次污染的有益效果。

本发明还提供了一种降解丙硫菌唑的产品和一种降解农药的产品，分别独立的包含w313菌株、含有w313菌株的菌剂、丙硫菌唑水解酶或w313菌株的胞内总蛋白提取物。上述产品因以w313菌株或以和其相关的产品作为主要活性成分，因此具有他们所有的有益效果，在此不再赘述。

本发明提供的降解农药的产品利用生物学手段降解农药，去除效果好，同时避免降解农药的过程中产生二次污染，是一种理想的清除环境中农药残留的产品，在环境修复方面的独特优势，缓解了农药残留的问题。

下面结合优选实施例进一步说明本发明的技术方案和有益效果。

实施例1

菌株的分离筛选：从含丙硫菌唑的某农药厂废水处理池中采集活性污泥，采用连续富集培养法每次取5ml培养液至以丙硫菌唑为唯一碳源的100ml无机盐液体培养基中(k2hpo4·3h2o1.00g/l、mgso4·7h2o2.00g/l、caso40.40g/l、nacl0.50g/l、feso4·7h2o0.01g/l、(nh4)2so41.00g/l)，30℃恒温培养箱中培养48h；将在含有700mg/l丙硫菌唑无机盐培养基中的培养液划线接种在固体培养基上，分离纯化，获得一株丙硫菌唑高效降解菌，命名为w313，保存于斜面上。

实施例2w313菌株的鉴定

1.形态学鉴定：菌株的形态学初步鉴定依据《细菌鉴定手册》；如图1所示，w313菌株在无机盐培养基上菌落生长较慢，菌落表面扁平湿润，呈灰绿色；w313菌株可在以丙硫菌唑为唯一碳源的培养基中生长，对丙硫菌唑的耐受性及利用率较高，表明其具有较高的丙硫菌唑降解活性。w313菌株的革兰氏染色结果如图2所示。

2.菌株分子生物学鉴定：w313菌株的dna提取、pcr扩增及扩增产物的序列分析：将培养4d的新鲜菌体作为dna提取材料，采用尿素提取法提取w313菌株基因组dna，0.8％琼脂糖凝胶电泳检测纯度；以上述提取的总dna为模板，用引物its1/its4进行pcr；pcr产物送至上海生工生物工程有限公司进行测序，测序结果如下：

5’-catgcaagtcgagcggatgagtggagcttgctccatgattcagcggcggacgggtgagtaatgcctaggaatctgcctggtagtgggggataacgtttcgaaaggaacgctaataccgcatacgtcctacgggagaaagtgggggatcttcggacctcacgctatcagatgagcctaggtcggattagctagttggtggggtaatggcccaccaaggcgacgatccgtaactggtctgagaggatgatcagtcacactggaactgagacacggtccagactcctacgggaggcagcagtggggaatattggacaatgggcgaaagcctgatccagccatgccgcgtgtgtgaagaaggtcttcggattgtaaagcactttaagttgggaggaagggcagtaagttaataccttgctgttttgacgttaccaacagaataagcaccggctaacttcgtgccagcagccgcggtaatacgaagggtgcaagcgttaatcggaattactgggcgtaaagcgcgcgtaggtggttcagcaagttggatgtgaaagccccgggctcaacctgggaattgcatccaaaactactgagctagagtacggtagagggtggtggaatttcctgtgtagcggtgaaatgcgtagatataggaaggaacaccagtggcgaaggcgaccacctggactgatactgacactgaggtgcgaaagcgtggggagcaaacaggattagataccctggtagtccacgccgtaaacgatgtcgactagccgttgggatccttgagatcttagtggcgcagctaacgcgataagtcgaccgcctggggagtacggccgcaaggttaaaactcaatgaattgacgggggcccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgaagcaacgcgaagaaccttacctgggcttg-3’(seqidno.1)

在genbank数据库中进行同源性比对，发现w313菌株与已知的pseudomonasaeruginosastrain和pseudomonasotitidisstrain的its序列相似性均在90％之上，结果如图3所示。

结合其形态学特征，确定它是一株假单胞菌新种，将其归入假单胞属(pseudomonas)，命名为w313。

实施例3

w313菌株在平板上对丙硫菌唑的耐受性测试：

将w313菌株接种在以丙硫菌唑为唯一营养源的固体平板上，其中丙硫菌唑浓度分别为10mg/l、50mg/l、100mg/l、200mg/l，结果表明w313菌株在丙硫菌唑浓度为200mg/l的培养基上正常生长，结果如图4和图5所示，图4中丙硫菌唑浓度为20ppm，图5中丙硫菌唑浓度为200ppm，说明该菌的丙硫菌唑耐受性较高。

实施例4

液体培养基中丙硫菌唑的降解率测试：

将w313菌株接种于200ml发酵培养基(配方：葡萄糖5g/l、丙硫菌唑20mg/l、mgso4·7h2o0.5g/l、kcl0.5g/l、feso4·7h2o0.01g/l、k2hpo41g/l)中，30℃，180rpm，摇床培养；利用hplc测定丙硫菌唑含量。

丙硫菌唑标准曲线的制作：分别吸取适量5000ppm的丙硫菌唑标准溶液，用甲醇梯度稀释至丙硫菌唑终浓度为10ppm、5ppm、2ppm、1ppm、0.5ppm的标准样；每个样品测定其吸收峰值，分别为144.6、68.5、27.4、12.9和7.1，标准曲线方程为y＝14.497x-1.538；r²＝0.9993。

hplc检测条件：tc-c18色谱柱，4.6×250mm，5μm；柱温：30℃；紫外波长：270nm；流速：1.0ml/min；进样量：20μl；流动相：乙腈：磷酸缓冲液＝65:35(v/v)。实验结果如图6所示，生长经过20h的延滞期进入对数生长期，20h后，菌株进入稳定生长期，菌株在20～40h处于丙硫菌唑降解的延滞期；40h后丙硫菌唑浓度迅速下降，72h降解率达67％，表明w313菌株具有较好的丙硫菌唑降解活性。

实施例5

丙硫菌唑水解酶活的测定：将w313菌株接种于200ml发酵培养基(配方：葡萄糖5g/l、丙硫菌唑20mg/l、mgso4·7h2o0.5g/l、kcl0.5g/l、feso4·7h2o0.01g/l、k2hpo41g/l)中，30℃，180rpm，摇床培养60h，过滤收集菌体，并用去离子水漂洗两次，用ph7.4的pbs缓冲液漂洗一次；每克湿菌体加入10ml4℃预冷的缓冲液，冰浴中超声波破碎菌体1h，每超声5秒暂停10秒；取出后12000rpm离心10min，取上清即为w313菌株的胞内总蛋白样品液。

酶催化反应体系为800μl，先取500μl0.1mol·l^-1ph7.4的tris-hcl缓冲液、60μl0.1mol·l^-1的nacl溶液、40μl50ppm的丙硫菌唑溶液于1.5ml离心管中混匀，30℃预热5min；加入200μl粗蛋白样品液，30℃预热5min，此时酶催化反应被启动，置于30℃水浴锅中计时；分别在0min、10min、30min取反应液，加入10μl浓盐酸终止酶系反应；在该条件下，每分钟降解1μmol的丙硫菌唑所需的酶量定义为1个酶活力单位；用hplc测定样品中丙硫菌唑的含量变化，结果表明w313发酵60h后胞内总蛋白丙硫菌唑水解酶酶活可达到2.32u/mg总蛋白；由此表明本发明的w313具有产丙硫菌唑水解酶活性。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

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<110>安徽农业大学

<120>丙硫菌唑高效降解菌w313、菌剂及应用

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<213>假单胞菌（pseudomonassp.）

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