金黄色葡萄球菌及耐甲氧西林金黄色葡萄球菌耐药基因mecA检测试剂盒及其应用的制作方法

本发明涉及生物检测
技术领域：
，具体涉及一种基于rna恒温扩增-金探针层析技术联合检测金黄色葡萄球菌及耐甲氧西林金黄色葡萄球菌耐药基因meca核酸的试剂盒及其应用。
背景技术：
：金黄色葡萄球菌(staphylococcusaureus，sa)为革兰氏阳性菌，直径约0.5-1.5μm，呈葡萄串状排列，无鞭毛，无芽孢。人类是金黄色葡萄球菌的天然宿主。30％-50％的健康成年人都有金黄色葡萄球菌定植，并且其中10％-20％是持续性定植。金黄色葡萄球菌是医学上重要的致病菌，其分布广泛，感染类型多样，耐药率高，特别是耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(meticillin-resistantstaphylococcusaureus，mrsa)的感染呈多重耐药，病死率较高，已成为临床抗感染治疗的难点。鼻腔、呼吸道、烧伤创面、器官切口乃至正常皮肤都有可能存在金黄色葡萄球菌的定植，可引起局部化脓感染，也可引起肺炎、伪膜性肠炎、心包炎等，甚至严重到败血症、脓毒症等全身感染。在医院内，烧伤或icu病房物体和病人可能是金黄色葡萄球菌储菌库，成为流行意义上的传染源。被金黄色葡萄球菌定植后，感染的风险会不断提高。i型糖尿病患者、静脉内给药患者，血液透析患者、手术患者、获得性免疫缺陷综合征患者中的定植比例较高。金黄色葡萄球菌1961年由英国的jevons首次报道，从发现至今感染几乎遍及全球，已成为院内感染的重要病原菌之一，仅次于大肠杆菌。2010年chinet耐药监测结果显示：mrsa检出率较高，在金黄色葡萄球菌中，其平均检出率为51.7％。近年来有多个地区的报道称，社区获得性耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(community-acquiredmrsa，ca-mrsa)已成为引起年轻健康人群侵袭性和致命感染的原因。2011年，中国卫生部医政司1月17日也下发了“多重耐药菌医院感染预防与控制技术指南”，其中，首当其冲的就是mrsa的防控。mrsa检测的方法主要有：(1)苯唑西林—盐平板筛选法、纸条扩散法和e实验：使用自动分析仪检测mrsa，方法简单，但因其存在一定偏差，对敏感性与已知菌株不同者需用其他方法重新鉴定。(2)采用分子生物学方法检测：核酸分子杂交技术，运用从mrsa菌株中克隆出来的抗药基因作为探针进行分析，能够比传统方法更快速准确地得到结果。(3)pcr方法：通过直接检测细菌染色体上的meca基因来确定被检细菌是否为耐甲氧西林菌株，不受药敏实验条件的制约，并且编码pbp2a的meca基因只存在mrsa中，因而特异性很高。传统培养分离虽然准确度高，但往往耗时较长，容易延误治疗；pcr法一般需要复杂的dna提取过程和特殊的pcr扩增条件及专门的实验区域，因此它们的广泛应用受到了限制。技术实现要素：鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种基于rna恒温扩增-金探针层析技术联合检测金黄色葡萄球菌及耐甲氧西林金黄色葡萄球菌耐药基因meca核酸的试剂盒及其应用。该试剂盒通过将采集的样本经细胞裂解液裂解后释放病原体核酸，然后在逆转录酶和t7rna聚合酶的作用下，经过逆转录和转录过程，实现病原体核酸片段的扩增。扩增后的rna产物被检测液中的特异探针识别捕获，形成rna扩增产物---特异探针---金探针复合物，该复合物通过侧向流层析在nc膜上被固定形成可见的条带，实现病原体核酸的检测。因此，本发明没有复杂的rna提取过程，也不需要特殊的仪器，基于rna分子易降解的特点，本发明在实际检测中不易污染，具有灵敏度高、特异性强以及操作简单的优势，使金黄色葡萄球菌及耐甲氧西林金黄色葡萄球菌耐药基因meca核酸检测得到广泛应用成为一种可能。为了实现上述目标，本发明采用如下技术方案：第一方面，提供一种基于rna恒温扩增-金探针层析技术联合检测金黄色葡萄球菌及耐甲氧西林金黄色葡萄球菌耐药基因meca核酸的试剂盒，包括：1)扩增反应液：含40mmtris-hcl(ph8.0)，12mmmgcl2，70mmkcl，15％dmso，5mmdtt，每种dntp各1mm，每种ntp各2mm，扩增引物各0.2μm；其中扩增引物包括三对：金黄色葡萄球菌、甲氧西林耐药基因meca、和人内参基因，具体扩增引物如下：(1)金黄色葡萄球菌(nuc基因一段保守区域)的扩增引物：sa-r引物(5’-3’)：taatacgactcactatagggagacgctttaattaatgtcgc；sa-f引物(5’-3’)：caaatgcatcacaaacag；(2)甲氧西林耐药基因(meca基因一段保守区域)的扩增引物：meca-r引物(5’-3’)：taatacgactcactatagggagatgaagcaaccatcgttac；meca-f引物(5’-3’)：ctacaatgccaaaatctc；(3)内参基因(人18srrna一段保守序列)的扩增引物：内参-r引物(5’-3’)：taatacgactcactatagggagagcaactttaatatacgct；内参-f引物(5’-3’)：aggccctgtaattggaat；2)扩增酶：包含三种，逆转录酶(如amv或m-mlv)、t7rna聚合酶和rnaseh；3)细胞裂解液(购至美国signosis公司，货号cl-0001)：可以裂解细胞，释放核酸；4)检测液：包含胶体金颗粒标记的核酸探针(金探针)、每个指标的特异探针、c线显色探针，每个指标特异探针有两种，分别为ces系列和les系列，其中ces系列和les系列又可以设计多条，具体如下：(1)金黄色葡萄球菌特异探针：sa-ces1(5’-3’)：ataacggcgtaaatagttttacttggctacgtagctacgt；sa-ces2(5’-3’)：aagtggttctgaagatttttacttggctacgtagctacgt；sa-les1(5’-3’)：ccaacagtatatagtgtttttacagtacagcctgacacctagct；sa-les2(5’-3’)：caacttcaactaaaaatttttacagtacagcctgacacctagct；sa-les3(5’-3’)：attacataaagaaccttttttacagtacagcctgacacctagct；(2)耐甲氧西林基因特异探针：meca-ces1(5’-3’)：aggtaaagtgtatgattttttagtcgtattagtagca；meca-ces2(5’-3’)：gagctatatgagaacgtttttagtcgtattagtagca；meca-les1(5’-3’)：gtaataaaaaatacgatttttacagtacagcctgacacctagct；meca-les2(5’-3’)：tatagatgaataacaatttttacagtacagcctgacacctagct；meca-les3(5’-3’)：aacagtgaagcaatcctttttacagtacagcctgacacctagct；(3)内参特异探针：内参-ces1(5’-3’)：gagtccactttaaatcttttgcttgtacatcggatgac；内参-ces2(5’-3’)：ctttaacgaggatccattttgcttgtacatcggatgac；内参-les1(5’-3’)：ttggagggcaagtctgtttttacagtacagcctgacacctagct；内参-les2(5’-3’)：gtgccagcagccgcggtttttacagtacagcctgacacctagct；内参-les3(5’-3’)：taattccagctccaattttttacagtacagcctgacacctagct；(4)c线显色探针(5’-3’)ctcactacagcatagcgagctttttacagtacagcctgacacctagct(5)金探针金探针5’端被巯基化修饰，所述序列为：5’-catactctgtctacgtactggtagctatcaattttagctaggtgtcaggctgtactgt-3’5)检测卡：所用试纸条被固定于pvc底板上，从左往右依次是样品垫、nc膜、吸水纸；nc膜上有c线(质控线)和三条t线(检测线)，从样品垫到吸水纸方向分别为meca-t、sa-t、内参-t和c线(如图3)；meca-t处包被meca被探针、sa-t处包被sa包被探针、内参-t处包被内参包被探针、c线处包被c线包被探针，具体序列为：meca包被探针(5’-3’)：tgctactaatacgactatttttgctactaatacgacta；sa包被探针(5’-3’)：acgtagctacgtagccaagtttttacgtagctacgtagccaagt；内参包被探针(5’-3’)：gtcatccgatgtacaagcttttgtcatccgatgtacaagc；c线包被探针(5’-3’)：agctcgctatgctgtagtgagttttagctcgctatgctgtagtgag。本发明提供利用上述基于rna恒温扩增-金探针层析技术联合检测金黄色葡萄球菌及耐甲氧西林金黄色葡萄球菌耐药基因meca核酸的试剂盒检测金黄色葡萄球菌及耐甲氧西林金黄色葡萄球菌耐药基因meca核酸的方法，包括如下步骤：(1)rna恒温扩增本发明检测指标有三个：金黄色葡萄球菌、甲氧西林耐药基因meca和人内参基因。针对每个指标设计一对(f/r引物)扩增引物，其中r引物5’端带有t7rna聚合酶启动子。本发明在同一扩增管内实现各个指标核酸的扩增，具体如下：扩增时，在带有t7启动子的r引物和逆转录酶的作用下，将待测rna转化为rna-cdna杂合体；扩增酶中的rnaseh消化rna-cdna中的rna，得到单链cdna；在f引物和反转录酶的dna聚合酶功能的作用下合成第二链，形成带有t7启动子的双链dna；带有t7启动子的双链dna在t7rna聚合酶的作用下转录生成rna分子产物。转录的rna分子产物可以进入循环扩增过程，首先f引物会结合转录的rna分子产物，在逆转录酶的作用下将转录的rna转化为rna:cdna杂合体；扩增酶中的rnaseh消化rna:cdna中的rna，得到单链cdna；接着r引物会结合到单链cdna上，在反转录酶的dna聚合酶功能的作用下合成第二链，再次富集合成更多的带有t7启动子的双链dna分子，为t7rna聚合酶提供更多的转录模板，进而在t7rna聚合酶的作用下转录生成大量的rna分子产物(如图1)。本发明设计人内参基因检测的目的是为了监测样本采集的有效性、扩增体系的有效性。当样本采集合格时样本中一定会含有人脱落细胞，在检测时一定会被检测到，样本检测阴性时内参应该为阳性，否则整个检测需要重新采样进行重测。(2)金探针层析a，设计特异探针、金探针、c线显色探针和包被探针特异探针：每个指标特异探针包括两种，ces系列和les系列，每种探针可以设计多条。其中ces探针包含两个部分，一端可以和扩增的rna产物特异性结合，另一端可以和包被在nc膜上的包被探针结合，起到固定扩增产物rna的作用，这两个部分用4～5个t链接。每条les探针也包含两个部分，一端可以和扩增的rna产物特异性结合，另一端可以巯基化探针结合，这两个部分用4～5个t链接。金探针：金探针5’端被巯基化修饰，巯基基团可以和胶体金颗粒形成共价键，被标记到胶体金颗粒上。金探针可以和特异探针les的一端结合。包被探针：包被探针被固定在nc膜上，可以和特异探针ces的一端结合，起到固定的作用。包被探针含有两个拷贝，每个拷贝之间用4～5个t连接。c线显色探针：包含两个部分，之间用4～5个t链接。该探针一端可以和金探针结合，另一端可以和包被在nc膜上的c线包被探针结合。在层析时，无论有无rna扩增产物，c线显色探针都可以形成“c线显色探针---金探针”复合物，该复合物在层析时可以被nc膜上的c线包被探针捕获拦截，形成肉眼可见的条带。该探针可以质控试纸条和检测液的质量，层析过程无误。所述特异探针在设计时必须要求同种指标不同探针之间无交叉，ces系列同放大探针以及包被探针无交叉，以保证检测的特异性。所述特异探针的ces系列和les系列设计多条的目的是为了提高多生物素放大步骤的灵敏度，从而提高检测体系的灵敏度。b，试纸条检测所用试纸条都有检测线和质控线，所述检测线包括在meca-t、sa-t、内参-t，其中meca-t处包被的meca包被探针能够特异性结合耐甲氧西林meca基因ces系列探针的一端；sa-t处包被的sa包被探针能够特异性结合金黄色葡萄球菌ces系列探针的一端；内参-t处包被的内参包被探针能够特异性结合内参ces系列探针的一端。所述质控线(c线)上包被c线包被探针，能特异性结合c线显色探针。将特异探针ces、特异探针les、金探针和待测核酸特异扩增产物杂交后滴在试纸条上层析，检测线显色表示有待测核酸存在，质控线显色表示检测有效(如图2)。结合上述原理，对本发明利用上述试剂盒的方法的工作过程介绍如下：(1)样本核酸提取采集疑似sa或mrsa感染患者的痰液样本，使用细胞裂解液裂解的方法释放rna分子。(2)rna恒温扩增向17μl的含有sa、meca及人内参基因扩增引物的扩增反应液中加入2μl核酸提取物，95℃加热2min，42℃预热2min，再加入1μl扩增酶，42℃恒温扩增45min。待测样本中若有sa或mrsa，扩增时指标rna分子会进行大量扩增富集。(3)试纸条层析a，预杂交将rna恒温扩增产物与检测液(包括特异探针、金探针以及c线显色探针)混合，42℃预杂交10min。扩增出的rna分子与特异探针(包括ces系列探针与les系列探针)互补配对结合。ces系列探针一端同rna分子杂交互补配对，另一端同nc膜上的包被探针结合；les系列探针一端同rna分子杂交互补配对，另一端可以与金探针互补配对结合，当有扩增产物时可以形成“ces探针-rna分子-les探针-金探针复合物”。b，层析检测将预杂交产物滴在试纸条样品垫处，预杂交液会沿着nc膜向吸水纸方向层析，当有待测rna扩增产物时，“ces探针-rna分子-les探针-金探针复合物”就会形成，在层析时会被nc膜上包被的包被探针拦截，形成肉眼可见的条带，此为阳性(如图4)。若无待测rna产物扩增，“ces探针-rna分子-les探针-金探针复合物”就不会形成，胶体金颗粒就不能在t线处聚集，就不会形成肉眼可见的条带，此为阴性(如图4)。无论有无待测rna产物扩增，c线显色探针都可以形成“c线显色探针---金探针”复合物，该复合物在层析时会沿着nc膜向前流动，当到达c线时，与c线处包被的序列结合，从而滞留在c线处，形成肉眼可见的有色条带，此为实验结果有效(如图4)。第二方面，提供上述基于rna恒温扩增-金探针层析技术联合检测金黄色葡萄球菌及耐甲氧西林金黄色葡萄球菌耐药基因meca核酸的试剂盒在制备金黄色葡萄球菌及耐甲氧西林金黄色葡萄球菌耐药基因meca检测试剂中的应用。本发明和现有技术相比较，具有如下有益效果：1、本发明通过rna恒温扩增的方法扩增目标病原体核酸时，所扩增出的核酸产物为rna，rna在自然环境中容易降解，相比较于pcr的方法扩增出dna更容易起到防止污染的效果。在扩增rna时，整个反应都在42℃环境中进行，即使是一个水浴锅都能实现扩增反应，最大限度的降低了实验仪器的要求。2、本发明在设计时引入的特异探针ces和特异探针les有桥分子成分的作用，两种探针成功的将金标探针待测核酸扩增片段串联结合到一块，实现扩增核酸片段的特异检测。正是这种两套探针的使用，使得其中任何一套探针和待测核酸扩增片段杂交失败，都不能够被成功的固定在nc膜上，也就出现不了阳性检测结果，保证了检测的特异性。本发明试剂盒对表4所列的36种其它微生物的检测结果都为阴性，证明本发明试剂盒与其它微生物之间没有交叉反应。其中每套探针都可以设计两条以上，这样的设计又有利于提高试纸条的灵敏度。本发明试剂盒对武汉大学中南医院来源的已知浓度的sa及mrsa病原菌的最低检测限分别为1.4×10cfu/ml、1.6×10cfu/ml。对于317份诊断结果均与呼吸道感染相关临床样本的sa及mrsa病原菌检测灵敏度、特异性高于某商品化检测sa及mrsa荧光定量pcr试剂盒。3、本发明采用rna恒温扩增技术和试纸条层析技术，即应用了rna恒温扩增对仪器要求低的特点，又成功的融合了胶体金快速的特点。通过试纸条检测核酸，只需10min左右即可进行结果判读。在操作上也十分简单，只需将核酸特异扩增物和检测探针混合后滴到检测试纸上即可，对实验人员技术要求低，更无需特殊的仪器设备，易于sa及mrsa核酸检测向基层及偏远农村医疗机构的推广。附图说明图1rna恒温扩增原理图；图2试纸条显色原理图；图3试纸条示意图；图4检测阴阳性示意图；a：sa阴性、meca阴性、内参阴性；b：sa阴性、meca阴性、内参阳性；c：sa阳性、meca阴性、内参阳性；d：sa阴性、meca阳性、内参阳性；e：sa阳性、meca阳性、内参阳性；具体实施方式通过以下详细说明结合附图可以进一步理解本发明的特点和优点。所提供的实施例仅是对本发明方法的说明，而不以任何方式限制本发明揭示的其余内容。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，如《分子克隆：实验室指南》第3版(newyork:coldspringharborlaboratorypress,2005)中所述的条件进行。【实施例1】核酸检测试纸条的制备在制备核酸检测试纸条时需要的主要原材料：硝酸纤维素膜(nc膜)、样品垫、吸水纸、pvc底板等。1、喷膜：检测线sa-t：能够捕获结合sa特异探针ces序列，10μmsa包被探针，喷膜量：2～3μl/cm；检测线meca-t：能够捕获结合meca特异探针ces序列，10μmmeca包被探针，喷膜量：2～3μl/cm；检测线内参-t：能够捕获结合内参特异探针ces序列，10μm内参包被探针，喷膜量：2～3μl/cm；质控线(c线)：能够捕获结合c线显色探针序列，10μmc线包被探针，喷膜量：2～3μl/cm；喷膜完毕后，在紫外交联仪中自动交联一次，放于37℃洁净恒温箱内干燥2小时，存于干燥环境中备用。2、试纸条组装分别裁取2cm长的吸水纸、包被好的nc膜、样品垫从上到下依次固定于pvc底板上，即成检测试纸条。试纸条的组装结构图如图3。【实施例2】灵敏度测试将武汉大学中南医院来源的已知浓度的sa及mrsa病原菌悬液进行梯度稀释液进行最低检测限确定，mrsa即耐甲氧西林金黄色葡萄球菌，含meca基因，用来确定meca检测灵敏度，每个梯度的病原菌稀释液重复3～5份，每份进行20次的重复检测，将具有90％～95％阳性检出率的病毒水平作为最低检测限，检出结果如下：sa最低检测限检测表1.1不同浓度的sa检测实验数据表1.2sa最低检测限实验数据mrsa最低检测限检测表2.1不同浓度的mrsa检测实验数据表2.2sa最低检测限实验数据最终确定本发明试剂盒的检测灵敏度为：检测指标菌株来源最低检测限sa武汉大学中南医院临床分离1.4×10cfu/mlmrsa武汉大学中南医院临床分离1.6×10cfu/ml【实施例3】特异性验证1、测试病原菌将不同的微生物提取核酸后检测，验证本发明试剂盒引物及探针设计的特异性。相关病原体及滴度如下：表3特异性验证测试菌株信息2、测试结果测试结果如下：表4特异性验证测试结果3、结论从以上数据可以看出，本发明试剂盒对这些微生物的检测结果都为阴性，证明本发明试剂盒与其他微生物之间没有交叉反应，说明试剂盒检测病原体的特异性强。【实施例4】临床样本的验证1、临床样本信息在武汉大学中南医院共检测痰液样本317例，其中男性样本173例，女性样本144例，分别占比54.57％和45.43％。317例样本年龄最大的65岁，最小的5月。入组患者诊断结果均与呼吸道感染相关，其中下呼吸道感染146例，咳嗽咳痰85例，呼吸困难27例，急性气管炎33例，急性肺炎15例，其他11例。2、检测结果a，sa检测结果检测参比试剂盒为某商品化sa及mrsa荧光定量pcr试剂盒，具体检测结果如下：对不一致3例样本用基因测序法进行复测，结果为1例sa阳性，为本发明试剂盒检测阳性某商品化sa及mrsa荧光定量pcr试剂盒检测阴性样本。有测序结果可知，某商品化试剂盒漏检1例，假阳性2例。基于此可见本发明专利试剂盒检测临床样本sa时检测灵敏度更高，特异性更强。b，mrsa检测结果检测时同时使用本发明试剂盒和某商品化检测sa及mrsa荧光定量pcr试剂盒同时对样本进行检测，检测结果汇总如下：同样用基因测序法及分离培养法对检测阳性样本及不一致样本进行鉴定发现，某商品化试剂盒在检测时易出现假阳现象，特异度及灵敏度均不及本发明试剂盒。对不一致6例样本用基因测序法进行复测，结果为2例mrsa阳性，为本发明试剂盒检测阳性某商品化sa及mrsa荧光定量pcr试剂盒检测阴性样本。同时对不一致样本进行药敏实验验证，结果和基因测序法一致。由此可知本发明专利试剂盒检测临床样本耐药基因meca时检测灵敏度更高，特异性更强。序列表<110>武汉中帜生物科技股份有限公司<120>金黄色葡萄球菌及耐甲氧西林金黄色葡萄球菌耐药基因meca检测试剂盒及其应用<160>27<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>41<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>1taatacgactcactatagggagacgctttaattaatgtcgc41<210>2<211>18<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>2caaatgcatcacaaacag18<210>3<211>41<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>3taatacgactcactatagggagatgaagcaaccatcgttac41<210>4<211>18<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>4ctacaatgccaaaatctc18<210>5<211>41<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>5taatacgactcactatagggagagcaactttaatatacgct41<210>6<211>18<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>6aggccctgtaattggaat18<210>7<211>40<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>7ataacggcgtaaatagttttacttggctacgtagctacgt40<210>8<211>40<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>8aagtggttctgaagatttttacttggctacgtagctacgt40<210>9<211>44<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>9ccaacagtatatagtgtttttacagtacagcctgacacctagct44<210>10<211>44<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>10caacttcaactaaaaatttttacagtacagcctgacacctagct44<210>11<211>44<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>11attacataaagaaccttttttacagtacagcctgacacctagct44<210>12<211>37<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>12aggtaaagtgtatgattttttagtcgtattagtagca37<210>13<211>37<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<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