一种溶血性曼氏杆菌及其应用的制作方法

本发明涉及兽用生物制品领域，特别是，涉及一种溶血性曼氏杆菌及其应用。

背景技术：

溶血性曼氏杆菌(mannheimiahaemolytica)，属于巴氏杆菌科，曼氏杆菌属。根据dna-dna杂交和16srrna序列分析的结果，将血清型分为a1、a2、a5、a6、a7、a8、a9、a12、a13、a14、a16和a17。

溶血性曼氏杆菌是弱溶血性的、革兰氏阴性的球杆菌，在形态上，本菌和多杀巴氏杆菌相似，长2.5μm，宽0.5μm，呈球状或杆状；无芽胞，无鞭毛不运动，有荚膜，可见两极着色，革兰氏染色阴性。对营养要求不严格，在普通培养基上均能生长良好，培养24小时后，菌落呈圆形、光滑、湿润、半透明。在血液琼脂上，新分离的菌落呈微弱的β-溶血，培养到48小时后，移去菌落后可见到溶血环，连续传代培养，溶血性便减弱或消失。血清型中a1和a2血清型是优势菌株。a1血清型的菌株是牛的曼氏杆菌病(又称为“运输热”)的病原。溶血性曼氏杆菌普遍存在抗生素抗性。这种抗生素抗性的出现部分是由于大量使用抗生素作为饲料添加剂进行预防性给药或者作为生长促进剂的结果。抗性基因有的存在质粒上，有些存在于染色体上。最为常见的抗性类型是β-内酰胺、四环素、链霉素、磺胺嘧啶、大环类脂类和磺胺二甲基嘧啶。

目前，本领域鲜有文献披露牛曼氏杆菌病灭活疫苗，能否将牛曼氏杆菌用于疫苗领域，是本领域一个需要解决的技术问题。

技术实现要素：

为了克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种溶血性曼氏杆菌及其应用。

为解决上述问题，本发明所采用的技术方案如下：

一种溶血性曼氏杆菌，属于巴氏杆菌科，曼氏杆菌属，拉丁文学名为mannheimiahaemolytica，其为溶血性曼氏杆菌a1型m164株，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：cgmccno.18873，保藏日期：2019年11月15日，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，邮编100101。

优选的，所述溶血性曼氏杆菌的16srrna基因序列为seqid.1所示的序列。

本发明还包括一种溶血性曼氏杆菌的应用，用于制备预防溶血性曼氏杆菌引起的牛曼氏杆菌病的疫苗制剂。

优选的，所述疫苗制剂包含灭活的溶血性曼氏杆菌、白细胞毒素和疫苗佐剂。

优选的，所述疫苗佐剂为603佐剂、605佐剂、氢氧化铝胶佐剂或矿物油佐剂中任一种或几种的组合物。

优选的，所述疫苗佐剂为605佐剂。

优选的，所述疫苗制剂每个免疫周期对牛施用两剂，免疫剂量为2ml/头份，其中第二剂在第一次施用后的14-28天期间施用。

优选的，所述疫苗制剂每头份剂量中含有经甲醛灭活的1.0×10⁸～1.0×10¹⁰个菌落形成单位的溶血性曼氏杆菌和640～5120毒素浓度单位的白细胞毒素。

相比现有技术，本发明的有益效果在于：本发明获得的疫苗制剂应用安全，对溶血性曼氏杆菌引起的肺炎有良好的免疫保护效果，免疫牛可获得至少6个月的保护。

附图说明

图1为溶血性曼氏杆菌分型鉴定pcr结果；

其中m：dl2000marker；1：阴性对照；2：m164株；3.阳性对照；

图2为牛曼氏杆菌病灭活疫苗免疫犊牛抗体消长规律。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明作进一步详细说明。

以下实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或者替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

下述实施例中，605佐剂为北京华夏兴洋生物科技有限公司申请的专利佐剂(专利公开号cn103083659a)，并且已经应用到疫苗的研究和生产中，利用605佐剂研发注册的新兽药制品新城疫灭活疫苗已经获得新兽药证书和生产许可文号；603佐剂为北京生泰尔科技股份有限公司申请的专利佐剂(专利公开号cn101428145a)，并且已经应用到疫苗的研究和生产中，利用603佐剂研发注册的新兽药制品猪支原体灭活疫苗、副猪嗜血杆菌三价灭活疫苗、牛传染性鼻气管炎灭活疫苗均已经获得新兽药证书和生产许可文号；矿物油佐剂及氢氧化铝胶佐剂按照兽药典方法制备，若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用其它原料均为市售商品。

实施例1溶血性曼氏杆菌a1型m164株的分离鉴定

1.1溶血性曼氏杆菌的分离用接种环沾取溶血性曼氏杆菌感染牛的肺脏病变部位，划线接种于含5％绵羊血tsa平板，37℃培养16小时，挑取单个菌落获得纯培养物后，转接液体培养基扩大培养，保存。在5％绵羊血的tsa培养基上，菌落形态光滑，凸出，灰色，可见β-溶血环。

1.2纯粹性检验取菌液0.2ml接种2块5％绵羊血tsa平板，放置37℃培养16小时，观察菌落形态，结果显示菌落形态均一。

1.3生化鉴定将生长于5％绵羊血tsa平板上的菌落作纯培养后，接种于葡萄糖、乳糖、麦芽糖、木糖、甘露醇、吲哚、肌醇、脲酶等微量细菌生化试验管，于37℃培养箱培养24～72小时，结果显示与伯杰氏手册中溶血性曼氏杆菌一致。

1.4分型鉴定将a1、a2、a6血清型标准阳性血清分别与溶血性曼氏杆菌分离株在玻片上作用1～2分钟，结果显示溶血性曼氏杆菌分离株与a1血清型标准阳性血清出现沉淀反应，表明溶血性曼氏杆菌分离株血清型为a1型。

1.5提取溶血性曼氏杆菌分离株基因组，用通用引物扩增16srrna，结果如图1所示，将扩增得到的基因序列与genbank中的序列进行blast分析，结果显示，与溶血性曼氏杆菌16srrna相似性达96％～99％。

1.6动物回归实验将上述溶血性曼氏杆菌纯培养物接入液体培养基扩大培养，经肺部注射途径接种新鲜菌液1×10¹⁰cfu，攻毒后观察4天。动物回归试验能复制出牛曼氏杆菌病症状，临床表现为精神沉郁、卧地不起、呼吸困难、死亡等，并能肺部中回收到病原。

1.7根据细菌形态及培养特性，并结合16srrna基因测序结果，判定该菌株为溶血性曼氏杆菌a1型，并将该菌株命名为m164株。

实施例2牛曼氏杆菌病灭活疫苗制备

2.1取溶血性曼氏杆菌a1型m164株x代基础种子，按2％接种于37℃预热的液体培养基，置37±1℃恒温培养，100r/min，48小时收获得到x+1代菌液，将x+1代菌液按5％比例接种于37℃预热的液体培养基，37±1℃恒温培养，100r/min，24小时收获得到x+2代，再将x+2代培养物按比例接种于37℃预热的液体培养基，37±1℃恒温培养，100r/min，16小时收获得到x+3代菌液，作为制苗菌液。

2.2取1.0ml菌液，用无菌生理盐水将菌液作10倍系列稀释，取10^-7稀释度涂布接种3块5％绵羊血tsa平板，每个板0.1ml，使菌液散开，置37℃恒温培养箱中晾干后，翻转平板，培养24小时后，统计3块板上的菌落平均值，进行cfu计算。结果显示每1.0ml菌液含1.0×10⁸～1.0×10¹⁰个菌落形成单位的活菌数。将菌液通过0.22μm滤膜过滤，滤出液用bl-3细胞进行白细胞毒素浓度测定，结果显示每1.0ml菌液含640～5120毒素浓度单位的白细胞毒素。

2.3按菌液总量的0.3％加入37％的甲醛溶液，经37℃，100r/min灭活24小时。灭活完成后，取样进行无菌检验和灭活检验，检验合格后方可用于疫苗配制。

2.4将检验合格的灭活抗原，通过离心浓缩，使不同佐剂配制的疫苗抗原含量相同。按照灭活抗原与605佐剂5:1比例进行混合，为本发明专利疫苗制剂1；灭活抗原与603佐剂2:1比例进行混合，为本发明专利疫苗制剂2；灭活抗原与矿物油佐剂按照1:2比例进行混合乳化，为本发明专利疫苗制剂3；灭活抗原与氢氧化铝胶佐剂按照5:1比例进行混合，为本发明专利疫苗制剂4，分装后密闭保存。

实施例3牛曼氏杆菌病灭活疫苗效力研究

3.1研究所用实验动物为8～12周龄牛曼氏杆菌抗体阴性犊牛，如表1所示，分为5组。组1～4为本发明所述疫苗制剂免疫组，在该研究的第0天接种，皮下接种2ml，免疫后21日以同样剂量及方式加强免疫一次，加强免疫后14日进行攻毒；组5是对照，不免疫，与前组用相同的方式及剂量进行攻毒，经肺部注射新鲜的溶血性曼氏杆菌菌液1×10¹⁰cfu。

表1牛曼氏杆菌病灭活苗效力研究免疫分组

3.2攻毒后连续观察4日，每日观察并记录攻毒牛的临床症状及死亡情况，并于第4日剖检所有试验牛，观察肺部病变，测量病灶大小，用mann-whitneyu检验法，统计免疫组及对照组的差异。

3.3结果

8～12周龄犊牛攻毒后连续观察4日，记录临床症状。4日后对所有试验牛剖检，取出完整的肺脏，总体估计归因于溶血性曼氏杆菌感染引起的病变特征性病灶，测量病灶大小。结果如表2所示。

表2临床观察及剖检结果

注：由于最大病变体积总和为453.25，故在4日内死亡的实验动物病变大小定为500。

根据测量的肺部注射部位病变灶大小，应用mann-whitneyu检验法对攻毒保护效果进行分析，将免疫组结果与对照组结果进行差异性比较，结果如表3-6所示。

表3疫苗1免疫组与对照组mann-whitneyu检验法比较

表4疫苗2免疫组与对照组mann-whitneyu检验法比较

表5疫苗3免疫组与对照组mann-whitneyu检验法比较

表6疫苗4免疫组与对照组mann-whitneyu检验法比较

由结果可知，施用本发明所述疫苗组与对照组相比，攻毒保护结果均显示差异显著。

实施例4牛曼氏杆菌病灭活疫苗抗体持续期研究

4.1研究所用实验动物为8～12周龄牛曼氏杆菌抗体阴性犊牛，如表7所示，分为5组。组1～4为本发明所述疫苗免疫组，在该研究的第0天接种，皮下接种2ml，免疫后21日以同样剂量及方式加强免疫一次。

表7牛曼氏杆菌病灭活苗抗体持续期研究免疫分组

4.2分别于一免后14日、一免后21日、二免后14日、二免后28日、二免后2个月、二免后4个月、二免后6个月、二免后8个月采血测定抗体效价。结果如图2所示，结果表明，溶血性曼氏杆菌抗体一免后14日开始产生，一免后21日抗体效价有所上升，但抗体水平较低。在加强免疫后14日，抗体水平迅速提升，二免后2个月抗体水平达到最高，其中605佐剂配制的疫苗抗体最高，且抗体持续期最长，至二免后8个月抗体仍可维持较高水平。

序列表

<110>北京华夏兴洋生物科技有限公司

北京生泰尔科技股份有限公司

<120>一种溶血性曼氏杆菌及其应用

<160>1

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>490

<212>dna

<213>溶血性曼氏杆菌(mannheimiahaemolytica16srrna基因序列)

<400>1

atgagcgagaacccaaaacatattacagtattattgcacgaagcggttgacggcttggca60

attaagcctaacggtatctatattgacggtactttcgggcgtggcgggcattctcgcttg120

attttatccaaactgggcgaaaatgggcgattaatcgcaactgatcgtgacccacgagcg180

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