检测沼虾杆套病毒-1的特异性引物、探针及快速检测试剂盒的制作方法

本发明属于靶rna片段的快速检测领域，具体地说，涉及一种检测沼虾杆套病毒-1的特异性引物、探针及快速检测试剂盒。
背景技术：
：沼虾杆套病毒-1(macrobrachiumrosenbergiironivirus，mrrov)是引起沼虾幼体期和养殖期大量死亡的致病性病毒，常引起罗氏沼虾幼体沉底、蜕皮变态缓慢，特别是幼体蜕变为仔虾过程中出现大量急性死亡，还可引起养殖期成虾鳃损伤而引起死亡，对沼虾育苗业和养殖业危害极大。mrrov为单链rna病毒，属于巢式病毒目(nidovirales)杆套病毒科(roniviridae)，现今该科下仅有一个头甲病毒属(okavirus)，该属下仅有一个种，即对虾黄头病毒(yellowheadvirus)。沼虾杆套病毒-1于2010年从患病沼虾幼体中分离获得，之后在患病成虾中也被检出，根据流行病学调查，发现该病毒具有多个基因型，不同基因型表现不同的毒力，低毒基因型广泛流行于各大沼虾养殖场，常呈潜伏感染，在沼虾环境突变或是抗病力低下时，可引起沼虾发病死亡。但其对沼虾幼体具有高致死性，死亡率一般为60～70％，严重的达到85％以上；而对养殖大虾，引起的死亡率在10-20％左右，但累积死亡率可以达到40％以上。该病毒近几年对沼虾产业造成的经济损失无法估量。根据发现的该病毒的基因组序列，与已报道的杆套病毒序列相似性低于40％，表明是一种新的杆套病毒。该病毒在国内外未见报道，由于该病毒至今未有检测试剂盒和检测方法，因此，本试剂盒的研制与开发，具有创新性和唯一性。该病毒检测试剂盒的开发和应用也会对该病毒引起的沼虾病害起到预警和提前防控作用。技术实现要素：有鉴于此，本发明针对上述问题，提供了一种检测沼虾杆套病毒-1的特异性引物、探针及快速检测试剂盒，本发明的引物、探针和试剂盒特异性强，敏感性高，能实现快速、有效且准确检测沼虾杆套病毒-1；本发明的试剂盒为一步法荧光定量检测试剂盒，该试剂盒可在封闭的情况下判断结果，扩增产物不会对检测环境造成污染，可用于沼虾杆套病毒-1病的监测和早期预防，也可用于无杆套病毒沼虾种虾的筛选。本发明采用荧光定量技术，通过检测沼虾杆套病毒-1的复制酶基因，来间接检测沼虾杆套病毒-1的携带情况，这是目前国内外首次研制检测沼虾杆套病毒-1的试剂盒；该试剂盒的研制为沼虾杆套病毒-1病的监测和预防奠定基础。为了解决上述技术问题，本发明公开了一种检测沼虾杆套病毒-1的引物探针混合液，其特殊之处在于所述混合液由引物组a和taqman荧光探针b组成，探针b的5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团，所述引物组a和探针b是根据本发明人发现的沼虾杆套病毒-1的序列设计的。所述引物组a包含引物mrrov-q119f和引物mrrov-q119r；引物mrrov-q119f的核苷酸序列为：seqidno：1—5’-cttggaaaacccttaccta-3’引物mrrov-q119r的核苷酸序列为：seqidno：2—5’-gctgaacgtttatatataaagttag-3’taqman荧光探针b的核苷酸序列为：seqidno：3—5’-accatcaacttcaatctcaggctct-3’所述引物组与探针设计参照的沼虾杆套病毒-1的序列为：seqidno：4—5’-cttggaaaacccttacctattgccgctcctataccagctcggtcctttactccagagcctgagattgaagttgatggttctttacatgatattcctaactttatatataaacgttcagc-3’进一步地，所述荧光报告基团选自6-羧基荧光素(6-fam)、六氯-6-甲基荧光素(hex)、vic荧光染料(vic)、四氯-6-羧基荧光素(tet)、羧基-x-罗丹明(rox)、6-羧基四甲基罗丹明(tamra)、磺酰罗丹明(texasred)、6-羧基-4’，5’-二氯-2’，7’-二甲氧基荧光素琥珀酰亚胺酯(joe)、花菁3(cy3)、花菁3.5(cy3.5)、花菁5(cy5)、花菁5.5(cy5.5)中的一种；所述荧光淬灭基团选自6-羧基四甲基罗丹明(tamra)、4-(4-二甲基氨基苯偶氮基)苯甲酸(dabcyl)、黑洞淬灭剂1(bhq1)、黑洞淬灭剂2(bhq2)、黑洞淬灭剂3(bhq3)中的一种。更进一步地，所述荧光报告基团为6-羧基荧光素(6-fam)，所述荧光淬灭基团为黑洞淬灭剂1(bhq1)。本发明还公开了一种沼虾杆套病毒-1荧光定量检测试剂盒，其特殊之处在于所述试剂盒具有所述引物组a和taqman荧光探针b，还具有独立包装rt-qpcr反应液、阳性质控品、阴性质控品，其中rt-qpcr反应液为一步探针法rt-qpcr反应液，阴性质控品为灭菌生理盐水，阳性质控品是含有沼虾杆套病毒-1复制酶基因的载体。本发明还公开了一种由所述检测试剂盒在检测沼虾杆套病毒-1中的应用，包括以下步骤：采用商业rna提取试剂盒提取的待检沼虾样品的总rna，再将3ulrna加入到含所述引物探针混合液和rt-qpcr反应液的pcr管中，混匀后进行一步法rt-qpcr，反应条件为：42℃20-30分钟，95℃5-8分钟，95℃10-15秒钟，60℃30-40秒钟，共38-42个循环；荧光信号收集设定为fam，60℃反应末；结果判断：检测通道不出现s型扩增曲线，判为沼虾杆套病毒-1阴性；检测通道出现s型扩增曲线，且ct值≤35，判为沼虾杆套病毒-1阳性；检测通道出现s型扩增曲线，且ct值>35时，需重新进行检测，若仍然ct值>35时，则判为沼虾杆套病毒-1阴性。现国内外未有检测沼虾杆套病毒-1的试剂盒和技术，因此，本发明中试剂盒的检测技术具有独特性和唯一性，并且该试剂盒可将逆转录和qpcr在同一反应管连续进行，操作简单，可以有效防止污染，在反应过程中可实时监测扩增产物，大大提高了检测灵敏度，并省略了pcr反应后的电泳步骤。本试剂盒的技术不与国内外现有技术相同。当然，实施本发明的任一产品必不一定需要同时达到以上所述的所有技术效果。附图说明图1是沼虾杆套病毒-1荧光定量检测试剂盒特异性检测结果图；病毒核酸来源分别为，1.罗氏沼虾杆套病毒-1；2.罗氏沼虾虹彩病毒；3.罗氏沼虾双顺反子病毒；4.罗氏沼虾野田村病毒；5.罗氏沼虾纽缔病毒；6.对虾黄头病毒；7.对虾白斑综合征病毒。图2是沼虾杆套病毒-1荧光定量检测试剂盒灵敏度检测图；病毒rna稀释度分别为，-1.10-1；-2.10-2；-3.10-3；-4.10-4；-5.10-5；-6.10-6；-7.10-7。具体实施方式以下将配合附图及实施例来详细说明本发明的实施方式，藉此对本发明如何应用技术手段来解决技术问题并达成技术功效的实现过程能充分理解并据以实施。下述所用到的试剂和材料若非特殊说明均为本领域人员的公知常识。实施例1检测沼虾杆套病毒-1的引物探针混合液，其由引物组a和taqman荧光探针b组成，探针b的5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团。该引物组a包含引物mrrov-q119f和引物mrrov-q119r；所述引物mrrov-q119f的核苷酸序列如seqidno：1所示；所述的引物mrrov-q119r的核苷酸序列如seqidno：2所示；所述探针的b的核苷酸序列如seqidno：3所示。其中，荧光报告基团选自6-羧基荧光素(6-fam)、六氯-6-甲基荧光素(hex)、vic荧光染料(vic)、四氯-6-羧基荧光素(tet)、羧基-x-罗丹明(rox)、6-羧基四甲基罗丹明(tamra)、磺酰罗丹明(texasred)、6-羧基-4’，5’-二氯-2’，7’-二甲氧基荧光素琥珀酰亚胺酯(joe)、花菁3(cy3)、花菁3.5(cy3.5)、花菁5(cy5)、花菁5.5(cy5.5)中的一种；所述荧光淬灭基团选自6-羧基四甲基罗丹明(tamra)、4-(4-二甲基氨基苯偶氮基)苯甲酸(dabcyl)、黑洞淬灭剂1(bhq1)、黑洞淬灭剂2(bhq2)、黑洞淬灭剂3(bhq3)中的一种。优选地，按照下表1所示来选择荧光报告基团和荧光淬灭基团。表1荧光淬灭基团荧光报告基团dabcyl6-fam、tet、joe、hex、cy3中的一种tamra6-fam、tet、joe、hex中的一种bhq16-fam、tet、joe、hex、cy3中的一种bhq2tamra、cy3、rox、texasred中的一种bhq3cy5或cy5.5更优选地，所述荧光报告基团为6-fam；所述荧光淬灭基团为bhq1。实施例2沼虾杆套病毒-1荧光定量检测试剂盒，由独立包装的rt-qpcr反应液、阳性质控品、阴性质控品和引物探针混合液组成。所述引物探针混合液，由实施例1的引物组a和taqman荧光探针b组成，其中引物组a上下游引物终浓度均为0.2μm，探针终浓度为0.1μm。taqman荧光探针b，其核苷酸序列5’端标记6-fam，3’端标记bhq1；阴性质控品为灭菌生理盐水；阳性质控品是以提纯的沼虾杆套病毒-1基因组为模板，由引物组a进行pcr扩增，扩增产物连接载体，经基因测序确认正确后包装所得的假病毒；所述的rt-qpcr反应液为一步探针法荧光定量rt-pcr反应液，含有amv反转录酶、hotstartaq聚合酶、抗体修饰的antitaqdna聚合酶、dntps和mg2+ph为8.3的20mmol/ltris-hcl溶液。实施例3沼虾杆套病毒-1荧光定量检测试剂盒进行应用，待检样品使用商业化rna提取试剂盒进行总rna提取，在反应管中加入3ulrna、3ul实施例1的引物探针混合液，再加入19ulrt-qpcr反应液，混匀后进行一步法荧光定量rt-qpcr，反应条件为：42℃20分钟，95℃5分钟，95℃10秒钟，60℃40秒钟，共40个循环；荧光信号收集时设定为fam，60℃反应末；结果判断：检测通道出现s型扩增曲线，ct值≤35，则沼虾杆套病毒-1被判定为阳性；检测通道没有出现s型扩增曲线，沼虾杆套病毒-1被判定为阴性；检测通道出现s型扩增曲线，ct值>35时，需重新进行检测，若仍然ct值>35时，则判为沼虾杆套病毒-1阴性。本发明所述的引物组a和探针b是针对沼虾杆套病毒-1复制酶基因进行设计的，采用特异性探针的荧光基团捕获来进行结果检测，具有灵敏度高，使用方便的特点，也是国际检测用试剂盒的通用标准。实施例4沼虾杆套病毒-1荧光定量检测试剂盒的特异性(1)rna抽提：采用天根的病毒rna提取试剂盒(dp315-r)对采集的50mg患杆套病毒病沼虾幼体整虾进行总rna提取，提取获得的rna作为待检模板。(2)一步法荧光定量rt-qpcr：在9个反应管中分别加入rt-qpcr反应液19μl，所述引物探针混合液3μl配制成反应体系，然后在反应管中分别加入以下病原的核酸：沼虾杆套病毒-1、沼虾虹彩病毒、沼虾双顺反子病毒、沼虾野田村病毒、沼虾纽缔病毒、对虾黄头病毒、对虾白斑综合征病毒；荧光定量rt-pcr反应条件：42℃，20分钟；95℃，5分钟；95℃，10秒钟；60℃，40秒种，40个循环。采用mx3005p荧光定量pcr仪，荧光信号收集设定为fam荧光素，60℃反应末。每批次反应均设置阴性质控品(灭菌生理盐水)、阳性质控品(沼虾杆套病毒-1复制酶基因的质粒)。(3)结果判断：检测通道不出现s型扩增曲线，判定为沼虾杆套病毒-1阴性；检测通道出现s型扩增曲线，ct值≤35，则判定为沼虾杆套病毒-1阳性；检测通道出现s型扩增曲线，ct值>35时，需重新进行检测，若仍然ct值>35时，则判为沼虾杆套病毒-1阴性。结果验证：将检测阳性的扩增产物进行基因测序，测序结果与沼虾杆套病毒-1复制酶基因序列一致。采用上述沼虾杆套病毒-1荧光定量检测试剂盒和方法进行快速检测沼虾杆套病毒-1特异性性试验结果如附图1所示。实施例5沼虾杆套病毒-1荧光定量检测试剂盒的灵敏度(1)rna抽提：采用天根的病毒rna提取试剂盒(dp315-r)对采集的50mg沼虾杆套病毒病阳性的沼虾幼体整虾样品进行总rna提取，提取获得的rna作为待检模板，并进行梯度稀释至10-7。(2)一步法荧光定量rt-qpcr：在9个反应管中分别加入rt-qpcr反应液19μl，所述引物探针混合液3μl配制成反应体系，然后在各反应管中分别加入各稀释度的病毒核酸rna3μl；荧光定量rt-pcr反应条件：42℃，20分钟；95℃，5分钟；95℃，10秒钟；60℃，40秒钟，40个循环。采用mx3005p荧光定量pcr仪，荧光信号收集时设定为fam荧光素，60℃反应末。(3)结果判断：检测通道没有出现s型扩增曲线，判定为沼虾杆套病毒-1阴性；检测通道出现s型扩增曲线，ct值≤35，则沼虾杆套病毒-1被判定为阳性；检测通道出现s型扩增曲线，ct值>35时，需重新进行检测，若仍然ct值>35时，则判为沼虾杆套病毒-1阴性。图2是沼虾杆套病毒-1灵敏性检测图，如图所示，经一步法rt-qpcr后的沼虾杆套病毒-1rna系列稀释的扩增图，当反应体系中分别加入稀释度为10-1-10-6的病毒rna，扩增结果都被判定为阳性。上述说明示出并描述了发明的若干优选实施例，但如前所述，应当理解发明并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文所述发明构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离发明的精神和范围，则都应在发明所附权利要求的保护范围。序列表<110>浙江省淡水水产研究所<120>检测沼虾杆套病毒-1的特异性引物、探针及快速检测试剂盒<130>2<160>4<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>19<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>1cttggaaaacccttaccta19<210>2<211>25<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>2gctgaacgtttatatataaagttag25<210>3<211>25<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>3accatcaacttcaatctcaggctct25<210>4<211>119<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>4cttggaaaacccttacctattgccgctcctataccagctcggtcctttactccagagcct60gagattgaagttgatggttctttacatgatattcctaactttatatataaacgttcagc119当前第1页1 2 3