一种基因稀有突变的高通量检测方法与流程
本发明属于生物医药技术和分子诊断领域，具体涉及一种基因稀有突变的高通量检测方法。
背景技术：
随着对遗传病分子基础认识的不断深入，检测特异基因稀有突变的技术能力不断提高。稀有突变指的是存在于大量野生型dna序列背景下的相对稀少的突变型dna序列，例如肿瘤病人血液中含有的少量肿瘤突变基因dna，治疗后癌症病人血液中残余的少量肿瘤突变dna，孕妇血液中含有的少量胎儿dna，嵌合体中少量不同遗传性状嵌合或混杂，初期出现的细菌或者病毒的耐药突变等等，都属于稀有突变的范畴，狭义的稀有突变一般指点突变。上述突变常常与疾病相关，或者是某个疾病发病的直接原因，或者是某种疾病发病的早期征兆或重要的生物标志物。因此，稀有突变与人类健康关系十分密切，对稀有突变的检测在无创产前诊断、疾病早期筛査以及疾病预后及治疗评价等方面具有十分积极的意义。检测突变的方法已经很多，但是多数已报道的方法只限于定性检测突变，而无法进行精确的定量检测，尤其高通量定量检测稀有突变的方法更为罕见。目前主要的几种检测方法简述如下。
1、基于毛细电泳检测的测定方法
一种是基于sanger测序的检测技术，该方法主要是进行待检样本dna的分离和纯化，然后针对待检测位点设计引物扩增后进行直接测序，可通过测序结果中是否存在有微量区别于野生型的等位基因，判断是否存在稀有突变。另一种是基于荧光标记的特异性核苷酸终止延伸的方法，该方法主要是针对待检测位点设计扩增引物进行目的片段pcr扩增，再针对待检测位点设计特异性延伸引物，根据待检测位点序列特点，有选择性的利用荧光标记的双脱氧核苷酸(ddntp)中的一种替换单脱氧核苷酸(dntp)中对应的一种核苷酸，当dna中存在突变型dna序列时，延伸不会在目标位点位置终止，而是会在目标位点下游数个碱基的位置终止，通过毛细管电泳检测出微量的信号。这些方法的缺陷在于毛细电泳检测背景较高时也会导致检测结果不准确，检测灵敏性较低。
2、基于突变扩增系统技术的检测方法
突变扩增系统(amplificationrefractorymutationsystem,arms)又称等位基因特异性扩增法(allelespecificamplification,asa)，是newton等首先建立用来检测已知突变的方法。其基本原理是，如果引物的3′端碱基与模板碱基不互补，则用一般耐热dna聚合酶无法延伸。因此根据已知点突变设计3条引物，其3’端碱基分别与突变和正常的模板碱基互补，从而将有某种点突变的模板与正常模板区分开来。目前该技术已成为国际上肿瘤个体化分子检测重要方法之一。该方法的缺点在于无法对稀有突变进行定量检测，也不适宜对多个位点同时检测。
3、基于digitalpcr的检测方法
20世纪末，vogelstein等提出数字pcr(digitalpcr，dpcr)的概念，通过将一个样本分成几十到几万份，分配到不同的反应单元，每个单元包含一个或多个拷贝的目标分子(dna模板)，在每个反应单元中分别对目标分子进行pcr扩增，扩增结束后对各个反应单元的荧光信号进行统计学分析和定量。该方法需要使用数字pcr平台，增加了操作难度和检测成本。
技术实现要素：
本申请提供一种基因稀有突变的高通量检测方法，该技术通过dna片段化、通用接头连接、特异引物与接头序列引物的多重pcr扩增以及高通量高深度测序，可对多个待检测位点进行平行测序，进行测序序列比对拼接，通过特异性拼接序列分析剔除测序错误(假阳性)序列，提高稀有突变定量检测分析的准确性。
为解决上述技术问题，实现上述技术目的，本申请采取的技术方案为：一种基因稀有突变的高通量检测方法，包括
设计特异性探针，针对待检测的位点各自设计一对正链探针和负链探针，每一对探针中的正链探针位于基因序列的正链上，负链探针位于基因组序列的负链上；
构建基因组文库，待检dna片段化处理后连接y型通用接头，通过正向通用引物和反向通用引物进行pcr扩增完成基因组文库构建；
对基因组文库进行扩增，所述正链探针和所述反向通用引物形成扩增引物组合一、所述负链探针和所述正向通用引物形成扩增引物组合二，分别对待检dna构建的基因组文库进行扩增；
测序序列的样本归类，利用pcr引物对引物组合一与引物组合二进行扩增，对第二轮pcr扩增产物进行高通量双端测序，对测序数据进行分析，实现测序序列的样本归类；
基因组序列比对：首先根据标签序列将测序获得的序列归到相应的样本上，然后根据每个序列的碱基组成将其归到相应基因片段的扩增产物上；
测序数据分析：对于相同起始和终止位置的测序序列归类分析，此类序列统计计数为n，对于目标位点某一碱基类型计数低于10％*n则以测序错误过滤，经过过滤统计每个目标位点等位基因的测序深度，目标位点参考等位基因的测序深度计数a和其他等位基因(突变)的测序深度计数b，则该位点的真实突变比例为b/(a+b)。
作为本申请改进的技术方案，所述的正链探针或负链探针中，每个探针的5’端部分序列是与最后标记的pcr扩增引物相一致的通用序列。
作为本申请改进的技术方案，所述的正链探针或负链探针中，每个探针的3’端部分为与待检测位点所在5’端部分上游区域特异性结合的序列。
作为本申请改进的技术方案，特异性结合序列的3’末端和待检测位点之间的间距为2-100bp。
作为本申请改进的技术方案，所述特异性探针长度为18-36bp。
作为本申请改进的技术方案，所述特异性探针长度为20-27bp。
作为本申请改进的技术方案，所述正向通用引物和反向通用引物含有与y型通用接头中分叉端相同或反向互补的序列，以实现对所有两端连接此通用接头的dna分子进行pcr扩增
作为本申请改进的技术方案，所述dna片段化处理后长度介于200-1000bp。
作为本申请改进的技术方案，pcr扩增完成基因组文库构建中扩增循环数为6-12。
作为本申请改进的技术方案，对第二轮pcr扩增产物进行高通量双端测序时平均测序深度大于50000x。
本发明所述的一种基因稀有突变的高通量检测方法，主要具有以下优点：
1、检测通量的提高：一个反应可同时检测几十个至几千个位点；
2、检测成本的降低：在非专有检测平台上应用，不需额外设备投入，同时一个检测反应能够完成成千上万个基因片段的分析，因此单个基因片段的检测成本大大降低；
3、应用灵活：针对任意需要检测的目的基因片段能够快速建立检测体系；
4、准确性提高：采用数字计数进行定量，特异性分析方法降低测序错误(假阳性)检测背景影响，因此大大提高准确性。
5、检测灵敏度的提高：采用单分子扩增产物测序的序列鉴定以及数字计数定量方法可以大大提供灵敏度。
附图说明
图1：待检位点正链和负链探针设计示意图；
图2：y型通用接头结构及序列示意图；
图3：测序分析示意图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的和技术方案更加清楚，下面将结合本发明实施例的附图，对本发明实施例的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于所描述的本发明的实施例，本领域普通技术人员在无需创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本技术领域技术人员可以理解，除非另外定义，这里使用的所有术语(包括技术术语和科学术语)具有与本发明所属领域中的普通技术人员的一般理解相同的意义。还应该理解的是，诸如通用字典中定义的那些术语应该被理解为具有与现有技术的上下文中的意义一致的意义，并且除非像这里一样定义，不会用理想化或过于正式的含义来解释。
一种基因稀有突变的高通量检测方法，其技术方案如下：
(1)针对多个待检测位点，分别设计一对正链和负链探针(图1)，每一对探针分别位于基因组序列的正链和负链上，每个探针5’端部分序列是与最后标签标记pcr扩增引物相一致的通用序列，3’端部分为与待检测位点所在5’上游区域特异性结合的序列。特异性结合序列的3’末端和待检测位点之间的间距为2-100bp；所述特异性探针长度优选为18-36bp，更优选为20-27bp。
(2)待检dna通过物理方法(如超声等)或化学方法(如随机酶切或转座酶等)进行片段化处理，dna处理后片段化长度大小优选范围为200-1000bp，片段化后的待检dna连接y型通用接头(图2所示)，通过正向和反向通用引物进行pcr扩增完成基因组文库构建，正向和反向通用引物含有与y型通用接头中分叉端相同或反向互补的序列，可对所有两端连接此通用接头的dna分子进行pcr扩增，得到全基因组文库，优选的扩增循环数为6-12。
(3)使用(1)所述正链探针和(2)所述反向通用引物形成扩增引物组合1、(1)所述负链探针和(2)所述正向通用引物形成扩增引物组合2，分别对待测dna构建的基因组文库进行扩增；如(2)所述，待检dna构建的全基因组文库中均包含通用接头序列结构，通过一条接头通用扩增引物和针对目的位点设计的一条特异性探针可对全基因组文库中含有目标位点的片段进行富集扩增目的；
(4)上述引物组合1和引物组合2扩增得到的产物等量混合，利用一对与二代测序平台测序引物相匹配的pcr引物对其进行扩增，通常情况下，pcr引物还有一段数个至数十个碱基长度的标签序列，来自不同样本的扩增产物可以用带不同标签序列的pcr引物进行扩增，这样不同样本的扩增产物可以混合在一起，在后续高通量测序数据中可以根据该标签序列将测序所得序列归类到不同样本中去；
(5)对第二轮pcr扩增产物进行高通量双端测序，测序读长可为pe150-300bp，平均测序深度优选大于50000x；
(6)对测序数据进行分析，实现测序序列的样本归类，基因组序列比对：首先根据标签序列将测序获得的序列归到相应的样本上，然后根据每个序列的碱基组成将其归到相应基因片段的扩增产物上，如(3)所述，通用一条接头通用扩增引物和针对目的位点设计的一条特异性探针扩增，可以得到包含目标位点的测序序列，测序序列由相同的特异性探针起始，终止位置由于随机片段化处理断点位置的不同而各不相同，如图3所示，对于相同起始和终止位置的测序序列归类分析，此类序列统计计数为n，对于目标位点某一碱基类型计数低于10％*n则以测序错误过滤，经过过滤统计每个目标位点等位基因的测序深度，目标位点参考等位基因的测序深度计数a和其他等位基因(突变)的测序深度计数b，则该位点的突变比例为(b/a+b)。
实施例1
检测模拟样本46个snp位点的突变比例
针对46个snp位点设计探针，每个位点分别设计一对正链和负链探针，探针及通用引物信息见表1(序列表)：
配置不同突变比例的模拟样本(0.1％，0.5％，1％)，通过随机酶切进行dna片段化，连接通用接头，通过通用引物扩增，使用各位点正链探针混合液和接头通用反向引物进行pcr扩增得到扩增产物1，使用各位点负链探针混合液和接头通用正向引物进行pcr扩增得到扩增产物2，将两种产物混合，然后通用带不同标签序列的illumina测序平台兼容的pcr引物进行扩增，各样本产物均匀混合后上illumina测序仪器进行pe150模式测序，测序数据进行后续分析；
实验流程：
(1)对野生型样本和突变样本进行浓度定量，按比例(0.1％，0.5％，1％)配置标准品
(2)各取500ng标准品用dna稀释液稀释至50ul，加入10ul片段化混合液
(3)使用正链探针混合液-接头通用反向引物混合液1和负链探针混合液-接头通用正向引物混合液2，各引物浓度均为2um；取连接纯化产物2ul作为模板进行pcr反应，反应体系20ul，包含10u12xhifimultipcrmastermix，2u1pmix1forp1或pmix2forp2，2ul连接纯化产物，6ul无菌水；其pcr程序为:98℃2min；32x(96℃20s,60℃4min)；ho1dat10℃，p1和p2等比例混合后使用dna纯化磁珠试剂盒按1.8x比例对反应产物进行纯化，
(4)使用带不同标签序列的illumina测序平台兼容的pcr引物unipcrf/udirxxxx，各引物浓度均为2um；取连接纯化产物2ul作为模板进行pcr反应，反应体系20ul，包含10u12xhifipcrmastermix，2u1pmix，2ul连接纯化产物，6ul无菌水；其pcr程序为:98℃2min；12x(98℃10s,60℃30s，72℃30s)；ho1dat10℃
(5)最终产物illumina测序平台进行pe150模式测序，测序数据进行后续分析
(6)根据标签序列将测序的读序分到不同样本中，相同特异探针起始的拼接序列根据终止位置的不同进行分类，将同类序列进行假阳性序列过滤，最终对目标位点不同等位基因进行计数。
本实施例中使用的通用引物序列如下(序列表):
接头通用引物f
接头通用引物r
三个样本snp位点和等位基因测序深度结果见表2
模拟样本经过精确定量后配置理论突变比例(0.1％,0.5％,1％),经过相同起始和终止位置序列的测序错误过滤，统计目标位点参考等位基因的测序深度计数a和其他等位基因(突变)的测序深度计数b，通过突变等位基因的计数进行突变比例的计算(b/a+b)，检测结果显示模拟样本突变比例与理论比例相符合。
以上仅为本发明的实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些均属于本发明的保护范围。
序列表
<110>苏州赛美科基因科技有限公司
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<213>接头通用引物(r)
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<213>unipcrf
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