一种提高桑黄液态发酵三萜产量的方法与流程

本发明涉及一种提高桑黄液态发酵三萜产量的方法，属于微生物发酵技术领域。

背景技术：

桑黄是一种珍贵的药食两用真菌，寄主是桑树，有“久服轻身不老延年”之功效。桑黄中含有三萜、黄酮、多糖、多酚等多种具有药理活性的化学成分，具有抗癌、抗氧化、降血糖、免疫调节等功能。桑黄三萜以羊毛脂烷型为主，是其抗炎症、抗肿瘤的主要活性成分。因此，以桑黄三萜作为原料开发新药将显示出巨大的发展潜力和经济效益。

由于野生桑黄子实体的数量极少,加上人为的掠夺性开采,已难以成为稳定的工业产品来源，为缓解这一情况，人们对桑黄的人工培养开展了更加深入的研究，目前关于桑黄人工培养方式主要包括段木栽培、代料栽培和液态发酵三大类，但至今为止，有关野生桑黄的人工繁殖和驯化栽培技术还未成熟。虽有报道显示能成功进行人工栽培获得桑黄子实体，但其得到的产量较低，生产周期长且重现度差，大规模生产存在着较大的困难。液态发酵技术是一种很有前景的用于获取更多高价值次级代谢物的可靠途径。相比传统的固体发酵方法，液态发酵技术具有生产周期短，产率高、生产过程容易控制、产量高以及易于提取分离等优点，在食药用菌生产中具有广阔的应用前景。

由于桑黄三萜类化合物提取率较低、产量较低和纯度不高等因素影响，导致桑黄三萜药用价值开发利用严重不足，产量低成为了桑黄三萜研究与实际应用的限制性因素。目前，针对桑黄三萜产量的研究并不多。

姚强等人通过添加稀土元素铈诱导，使桑黄胞内三萜含量达106.7mg/l。高兴喜等人通过添加油酸诱导，使胞内三萜含量达339.3mg/l。但在上述研究中，由于铈以及油酸价格等问题，导致其在工业化生产中成本过高。

技术实现要素：

为了弥补已有文献外源因子选择范围较窄的不足，本发明利用外源因子(包括桑树木屑水提物、石油醚提取物、乙酸乙酯提取物、甲醇提取物)提高了桑黄三萜的产量。在此基础上，经过对桑树木屑不同溶剂提取物的筛选，发现乙酸乙酯提取物和甲醇提取物作为外源因子的效果更好，可使桑黄三萜的产量达到299.5mg/l。

此外，能否通过发酵工艺优化实验来提升液态发酵桑黄菌丝体中三萜类化合物的产量则显得尤为重要。但目前关于液态发酵优化提高桑黄总三萜含量的文献报道仅有一篇，且最终优化的效果并不显著，三萜含量仅为67.6mg/l，无法满足工业上生产的需求。因此，本发明还针对桑黄三萜这一类具有抗癌活性的物质进行液态发酵的培养基和培养条件的优化。

本发明的第一个目的是提供一种提高桑黄液态发酵三萜产量的方法，所述方法是在桑黄菌的发酵过程中添加桑树木屑提取物。

在一种实施方式中，所述桑树木屑提取物为以下任意一种或者多种：桑树木屑水提物、桑树木屑石油醚提取物、桑树木屑乙酸乙酯提取物、桑树木屑甲醇提取物。

在一种实施方式中，所述桑树木屑提取物的制备方法是：加入溶剂和桑树木屑(桑树枝干粉碎)，超声提取，抽滤，旋干溶剂，得到桑树木屑提取物。

在一种实施方式中，所述桑树木屑水提物的制备方法，包括：加入一定量去离子水，超声提取,抽滤，旋蒸仪旋干，制得桑树木屑水粗提物。具体方法为：取15g木屑，加入150ml去离子水，超声(160w、40℃)20min,抽滤，旋干，得桑树木屑水粗提物。

在一种实施方式中，所述桑树木屑石油醚提取物的制备方法，包括：加入一定量石油醚，超声提取,抽滤，旋蒸仪旋干，制得桑树木屑石油醚粗提物。具体方法为：取15g木屑，加入150ml石油醚，超声(160w、40℃)20min,抽滤，旋干，得桑树木屑石油醚粗提物。

在一种实施方式中，所述桑树木屑乙酸乙酯提物的制备方法，包括：加入一定量乙酸乙酯，超声提取,抽滤，旋蒸仪旋干，制得桑树木屑乙酸乙酯粗提物。具体方法为：取15g木屑，加入150ml乙酸乙酯，超声(160w、40℃)20min,抽滤，旋干，得桑树木屑乙酸乙酯粗提物。

在一种实施方式中，所述桑树木屑甲醇提物的制备方法，包括：加入一定量甲醇，超声提取,抽滤，旋蒸仪旋干，制得桑树木屑甲醇粗提物。具体方法为：取15g木屑，加入150ml甲醇，超声(160w、40℃)20min,抽滤，旋干，得桑树木屑甲醇粗提物。

在一种实施方式中，所述的木屑提取物为水提取物、石油醚提取物、乙酸乙酯提取物、甲醇提取物，添加浓度为0.001％-0.1％(w/v)(即提取物添加质量与发酵液体积的百分比，100ml发酵液中添加0.001-0.1g提取物)。

在一种实施方式中，所述的木屑提取物为乙酸乙酯提取物，添加浓度为0.02％以上。

在一种实施方式中，所述的木屑提取物为甲醇提取物，添加浓度为0.02％以上。

在一种实施方式中，所述方法是将桑黄菌接种至发酵培养基中进行发酵，并在发酵过程中添加桑树木屑提取物。

在一种实施方式中，所述桑树木屑提取物得添加时间为发酵中期第3-4天。

在一种实施方式中，所述发酵使用的发酵培养基的碳源为葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、米粉、马铃薯淀粉、玉米淀粉、可溶性淀粉中的一种；所述发酵培养基氮源为玉米浆粉、酵母膏、牛肉膏、鱼粉蛋白胨、硫酸铵、氯化铵、酒石酸铵、尿素中的一种。

在一种实施方式中，所述碳源为葡萄糖。可选地，所述葡萄糖的添加量为20-70g/l。优选为60g/l。

在一种实施方式中，所述氮源为玉米浆粉。可选地，玉米浆粉的添加量为4-14g/l。优选，玉米浆粉的添加量为10g/l。

在一种实施方式中，所述发酵液的ph范围为3-8,优选，发酵液ph为4。

在一种实施方式中，所述种子液接种量为5-25％，优选，种子液接种量为15％。

在一种实施方式中，所述种子液种龄为2-6天，优选，种子液种龄为第四天。

在一种实施方式中，所述发酵液的培养周期为2-11天，优选，发酵液培养周期为8天。

在一种实施方式中，所述发酵培养基：葡萄糖60g/l，玉米浆粉10g/l，mgso4·7h2o0.5g/l，kh2po41g/l，初始ph为4。

在一种实施方式中，所述接种的接种量为5-25％，初始ph为3-8，种龄为2-6天。

在一种实施方式中，所述接种是接种桑黄种子液；所述种子液是将平板培养的桑黄切块接种至种子培养基，25-30℃，130-170rpm，培养2-6天。

在一种实施方式中，种子培养基为：葡萄糖15-25g/l，大豆水解液15-25ml/l，酵母浸粉0.5-1.5g/l，mgso4·7h2o0.2-0.8g/l，kh2po40.5-1.5g/l，cacl20.05-0.2g/l，初始ph自然。

本发明还提供所述方法及其制备得到的桑黄三萜在药物制备和食品领域的应用。

本发明的有益效果：

本发明利用添加外源因子作为提升三萜产量的调控手段，经过对大量外源因子的筛选，发现桑树木屑提取物可以有效提高桑黄三萜的产量，其中以桑树木屑乙酸乙酯提取物、桑树木屑甲醇提取物效果最佳，可使三萜产量分别提高31.2％和30.2％。桑树木屑提取物，原料来源丰富、成本低廉，适合工业化应用。

进一步地，针对桑黄三萜这一具有抗癌活性的物质进行液态发酵的培养基和培养条件的优化，在此基础上，再三萜产量最高达299.5mg/l。

本发明设备投资少，后处理简单，基本无污染，成本低，资源利用率高，能明显提高桑黄液态发酵三萜产量。

生物材料

本发明采用的菌株分别为鲍氏桑黄(cgmcc5.1265)、瓦宁桑黄(cgmcc5.891)、火木层孔菌(cgmcc5.864)，购自中国普通微生物菌种保藏中心；裂蹄层孔菌(cfcc84388)，购自中国林业微生物菌种保藏中心。

附图说明

图1：三萜分光光度计标准曲线。

图2：桑黄液态发酵产三萜的生长曲线。

具体实施方式

三萜的检测方法：

(1)液态发酵桑黄菌丝体预处理

将液态发酵所得桑黄菌球用4层纱布过滤后用去离子水洗去表面漂浮物，于45℃烘箱中烘干至恒重并称重，随后再用研钵将烘干的菌体磨成粉末状。取0.15g菌粉放置在比色管中，加入无水乙醇10ml，称定初始体系重量，超声处理(功率160w)20min，放冷，摇匀过滤，取滤液作为三萜化合物供试品溶液。

(2)三萜含量测定

以香草醛-冰醋酸法测桑黄子实体以及菌丝体中的三萜化合物的含量，吸取供试品溶液1ml于70℃金属浴中挥干溶剂，加0.4ml5％香草醛-冰醋酸溶液和1.6ml高氯酸，混匀，70℃水浴加热15min后，取出置于冷水浴中冷却至室温，再加入5ml冰醋酸，充分摇匀，静置冷却至室温，546nm波长处测定吸光度，通过三萜标准曲线计算出供试品溶液中三萜含量(如图1所示，以齐墩果酸为标准品来测总三萜含量是常用的一种总三萜定量方法)。

(3)三萜含量的计算

c＝(吸光度+0.0001)/2.4132

三萜含量(mg/l)＝c*10*m/0.15

式中c：萃取液中三萜浓度(mg/ml)；

m:菌体干重(g/l)

10：萃取液体积(ml)

0.15:测样菌体干重(g)

桑树木屑提取物：

桑树木屑水提物：取15g木屑，加入150ml去离子水，超声(160w、40℃)20min,抽滤，旋干，制得桑树木屑水粗提物。

桑树木屑石油醚提取物：取15g木屑，加入150ml石油醚，超声(160w、40℃)20min,抽滤，旋干，制得桑树木屑石油醚粗提物。

桑树木屑乙酸乙酯提取物：取15g木屑，加入150ml乙酸乙酯，超声(160w、40℃)20min,抽滤，旋干，制得桑树木屑乙酸乙酯粗提物。

桑树木屑甲醇提取物：取15g木屑，加入150ml甲醇，超声(160w、40℃)20min,抽滤，旋干，制得桑树木屑甲醇粗提物。

实施例1：利用外源因子(桑树木屑提取物)提高不同桑黄菌株发酵生产三萜的产量

种子液培养基：葡萄糖20g/l，大豆水解液20ml/l，酵母浸粉1g/l，mgso4·7h2o0.5g/l，kh2po41g/l，cacl20.1g/l，初始ph自然。

发酵液培养基：葡萄糖30g/l，鱼粉蛋白胨3g/l，酵母浸粉2.5g/l，(nh4)2so42g/l，mgso4·7h2o1g/l，kh2po41g/l，初始ph自然。

(1)种子液的制备

将鲍氏桑黄(cgmcc5.1265)、瓦宁桑黄(cgmcc5.891)、火木层孔菌(cgmcc5.864)、裂蹄层孔菌(cfcc84388)活化后接种到种子液培养基，在转速为150rpm，温度28℃条件下，摇瓶发酵培养4d。

(2)直接发酵培养

分别将步骤(1)中得到的处于对数生长期的鲍氏桑黄(cgmcc5.1265)、瓦宁桑黄(cgmcc5.891)、火木层孔菌(cgmcc5.864)、裂蹄层孔菌(cfcc84388)液体种子以体积比10％的接种量接入发酵培养基中，在温度28℃转速150rpm条件下，发酵培养7d。结束后测得三萜含量分别为71.3mg/l、63.2mg/l、52.7mg/l、54.3mg/l(见表1)。

(3)添加外源提取物的发酵培养

分别将步骤(1)中得到的处于对数生长期的鲍氏桑黄(cgmcc5.1265)、瓦宁桑黄(cgmcc5.891)、火木层孔菌(cgmcc5.864)、裂蹄层孔菌(cfcc84388)液体种子以体积比10％的接种量接入发酵培养基中，在温度28℃转速150rpm条件下，发酵培养3d，然后分别添加0.005％(m/v)的桑树木屑水提物、0.005％(m/v)桑树木屑石油醚提取物、0.02％(m/v)桑树木屑乙酸乙酯提取物、0.02％(m/v)桑树木屑甲醇提取物，再培养4d。

结果显示，添加水提物、石油醚提取物、乙酸乙酯提取物、甲醇提取物的：

鲍氏桑黄的发酵液的三萜含量分别为81.4mg/l、83.5mg/l、93.1mg/l、89.9mg/l，比直接发酵的产量分别提高了14.1％、17.1％、30.4％、25.0％。

瓦宁桑黄的发酵液的三萜含量分别为70.2mg/l、74.5mg/l、69.8mg/l、78.3mg/l，比直接发酵的产量分别提高了11.1％、17.3％、10.4％、23.9％。

火木层孔菌的发酵液的三萜含量分别为62.4mg/l、61.7mg/l、61.9mg/l、59.3mg/l，比直接发酵的产量分别提高了18.4％、17.1％、17.6％、12.5％。

裂蹄层孔菌的发酵液的三萜含量分别为61.6mg/l、60.3mg/l、67.0mg/l、62.4mg/l，比直接发酵的产量分别提高了15.3％、11.0％、23.4％、14.9％。

表1不同菌种发酵的结果

实施例2：不同提取物浓度对桑黄液态发酵产三萜的影响

与实施例1的(3)相比，改变外源因子提取物的浓度，其他培养条件不变，比较了提取物浓度对鲍氏桑黄(cgmcc5.1265)的发酵产三萜的影响。

表2不同提取物浓度的发酵结果

实施例3：不同碳源对桑黄液态发酵产三萜的影响

发酵培养基：碳源(葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、米粉、马铃薯淀粉、玉米淀粉、可溶性淀粉中的一种)30g/l，鱼粉蛋白胨3g/l，酵母浸粉2g/l，(nh4)2so42g/l，mgso4·7h2o0.5g/l，kh2po41g/l，初始ph自然。

将实施例1中得到的处于对数生长期的桑黄(cgmcc5.1265)种子液以体积比10％的接种量接入含有30g/l不同的碳源种类的发酵培养基中，在温度28℃转速150rpm条件下，发酵培养7d。碳源种类分别为葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、米粉、马铃薯淀粉、玉米淀粉、可溶性淀粉。发酵结束后，测桑黄胞内三萜的含量。最优碳源为葡萄糖，三萜产量为78.1mg/l。

表3不同碳源的发酵结果

实施例4：不同氮源对桑黄液态发酵产三萜的影响

发酵培养基：氮源(玉米浆粉、酵母膏、牛肉膏、鱼粉蛋白胨、硫酸铵、氯化铵、酒石酸铵、尿素中的一种)7g/l，葡萄糖30g/l，mgso4·7h2o0.5g/l，kh2po41g/l，初始ph自然。

将实施例1中得到的处于对数生长期的桑黄(cgmcc5.1265)种子液以体积比10％的接种量接入含有7g/l不同氮源的发酵培养基中，在温度28℃转速150rpm条件下，发酵培养7d。氮源种类分别为玉米浆粉、酵母膏、牛肉膏、鱼粉蛋白胨、硫酸铵、氯化铵、酒石酸铵、尿素。发酵结束后，测桑黄胞内三萜含量。最优氮源种类为玉米浆粉，三萜产量为126.7mg/l。

表4不同氮源种类的发酵结果

实施例5：不同碳源添加量对桑黄液态发酵产三萜的影响

发酵培养基：葡萄糖(分别为20、30、40、50、60、70g/l)，玉米浆粉7g/l，mgso4·7h2o0.5g/l，kh2po41g/l，初始ph自然。

将实施例1中得到的处于对数生长期的桑黄(cgmcc5.1265)种子液以体积比10％的接种量接入含有不同添加量的葡萄糖的碳源发酵培养基中，在温度28℃转速150rpm条件下，发酵培养7d。碳源(葡萄糖)添加量分别为20、30、40、50、60、70g/l。发酵结束后，测桑黄胞内三萜的含量。最优葡萄糖添加量为60g/l，三萜产量为157.8mg/l。

表5不同碳源添加量的发酵结果

实施例6：不同氮源添加量对桑黄液态发酵产三萜的影响

发酵培养基：玉米浆粉(分别为4、6、8、10、12、14g/l)，葡萄糖60g/l，mgso4·7h2o0.5g/l，kh2po41g/l，初始ph自然。

将实施例1中得到的处于对数生长期的桑黄(cgmcc5.1265)种子液以体积比10％的接种量接入含有不同添加量的玉米浆粉的氮源发酵培养基中，在温度28℃转速150rpm条件下，发酵培养7d。氮源(玉米浆粉)添加量分别为4、6、8、10、12、14g/l。发酵结束后，测桑黄胞内三萜的含量。最优玉米浆粉添加量为10g/l，三萜产量为187.8mg/l。

表6不同碳源添加量发酵的结果

实施例7：不同ph对桑黄液态发酵产三萜的影响

发酵培养基：葡萄糖60g/l,玉米浆粉10g/l，mgso4·7h2o0.5g/l，kh2po41g/l，初始ph为3、4、5、6、7中的一种。

将实施例1中得到的处于对数生长期的桑黄(cgmcc5.1265)种子液以体积比10％的接种量接入发酵培养基中，在温度28℃转速150rpm条件下，发酵培养7d。ph分别为3、4、5、6、7。发酵结束后，测桑黄胞内三萜的含量。最优ph为4，三萜产量为190.3mg/l。

表7不同ph发酵的结果

实施例8：不同接种量对桑黄液态发酵产三萜的影响

发酵培养基：葡萄糖60g/l,玉米浆粉10g/l，mgso4·7h2o0.5g/l，kh2po41g/l，初始ph自然。

将实施例1中得到的处于对数生长期的桑黄(cgmcc5.1265)种子液以不同体积比的接种量接入发酵培养基中，在温度28℃转速150rpm条件下，发酵培养7d。接种量分别为5％、10％、15％、20％、25％。发酵结束后，测桑黄胞内三萜的含量。最优接种量为15％，三萜产量为220.2mg/l。

表8不同桑黄接种量的发酵结果

实施例9：不同种龄对桑黄液态发酵产三萜的影响

种子液培养基：葡萄糖20g/l，大豆水解液20ml/l，酵母浸粉1g/l，mgso4·7h2o0.5g/l，kh2po41g/l，cacl20.1g/l，初始ph自然。

发酵培养基：葡萄糖60g/l，玉米浆粉10g/l，mgso4·7h2o0.5g/l，kh2po41g/l，初始ph为4。

种子液的制备

将桑黄(cgmcc5.1265)活化后接种到种子液培养基，在转速为150r/min，温度28℃条件下，摇瓶发酵培养2-6d。

分别将种龄为2、3、4、5、6天的桑黄(cgmcc5.1265)液体种子以体积比15％的接种量接入发酵培养基中，在温度28℃转速150rpm条件下，发酵培养7d。发酵结束后，测桑黄胞内三萜的含量。最优种龄为4天，三萜产量为229.7mg/l。

表9不同种龄桑黄的发酵结果

实施例10：不同培养周期对桑黄液态发酵产三萜的影响

发酵培养基：葡萄糖60g/l，玉米浆粉10g/l，mgso4·7h2o0.5g/l，kh2po41g/l，初始ph为4。

将实施例9中得到的培养四天的桑黄(cgmcc5.1265)种子液以15％的接种量接入发酵培养基中，在温度28℃转速150rpm条件下，分别发酵培养2-11天(发酵曲线如图2所示)。发酵结束后，测桑黄胞内三萜的含量。最优培养时间为8天，三萜产量为236.8mg/l。

表10不同培养时间桑黄的发酵结果

实施例11：四种桑树木屑提取物对桑黄液态发酵产三萜的影响

发酵培养基：葡萄糖60g/l，玉米浆粉10g/l，mgso4·7h2o0.5g/l，kh2po41g/l，初始ph为4。

将实施例1中得到的处于对数生长期的桑黄(cgmcc5.1265)种子液以体积比15％的接种量接入发酵培养基中。在温度28℃转速150rpm条件下，在发酵的第3天，分别加入0.005％(m/v)的桑树木屑水提物、0.005％(m/v)桑树木屑石油醚提取物、0.02％(m/v)桑树木屑乙酸乙酯提取物、0.02％(m/v)桑树木屑甲醇提取物，再发酵培养5d。结果显示，添加水提物、石油醚提取物、乙酸乙酯提取物、甲醇提取物的桑黄发酵液的三萜含量分别为256.4mg/l、262.7mg/l、299.5mg/l、297.1mg/l，比直接发酵(对照，不额外添加桑树木屑提取物，其他条件一样)的产量分别提高了12.4％、15.1％、31.2％、30.2％。

表11不同种类木屑提取物的发酵结果

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。