一种用于检测ABO血型系统中O基因突变的SNP标记的制作方法

本发明属于基因诊断制品技术领域，具体涉及一种用于检测abo血型系统中o基因突变的snp标记。

发明背景

abo血型系统是由奥地利病理学家、免疫学家karllandsteiner在1900年发现并命名的人类第一个血型系统，也是目前为止最为重要的血型系统，在临床输血、新生儿溶血病中占有重要地位，他也因此获得了诺贝尔生理学和医学奖。abo血型系统是根据红细胞表面有无特异性抗原(凝集原)a和b来划分的血型系统。根据凝集原a、b的分布把红细胞分为a、b、ab和o四型。进一步，1924年德国学者f.bernstein证明abo血型分别为三个复等位基因所控制，在abo抗原的生物合成中a、b、o三个等位基因控制着a、b抗原的形成。abo抗原的前体是h抗原；a基因编码一种叫n-乙酰半乳糖胺转移酶的蛋白质(a酶)，能把h抗原转化成a抗原；b基因编码一种叫半乳糖转移酶的蛋白质(b酶)，能把h抗原转化成b抗原；o基因不能编码有活性的酶，而只有h抗原。

输血时若血型不合会使输入的红细胞发生凝集，导致急性溶血性输血反应(acutehemolytictransfusionreaction，ahtr)，引起血管阻塞和血管内大量溶血，多于输血后立即发生，是最严重的输血副反应，一旦发生需立即抢救，否则致死率很高。所以在输血前必须作血型鉴定。正常情况下只有abo血型相同者可以相互输血。在缺乏同型血源的紧急情况下，因o型红细胞无凝集原，不会被凝集，可输给任何其他血型的人。ab型的人，血清中无凝集素，可接受任何型的红细胞。但是异型输血输入量大时，输入血中的凝集素未能被高度稀释，有可能使受血者的红细胞凝集。所以大量输血时仍应采用同型血。

目前各地血液中心或临床输血科对献血员和患者均采用血清学实验进行abo血型鉴定，但血清学实验会到疾病、药物或者个体情况的干扰，比如肿瘤、白血病等某些疾病会影响血型抗原从而导致正定型不准确；而血清中自身抗体或不规则抗体的干扰，会干扰反定型导致定型困难甚至定型错误。而相对于这些不足之处，分子生物学技术在这几方面均有优势，并且随着科技时代的发展和大数据时代的来临，采用dna直接测序来检测abo血型必定是大势所趋，因此，对于abo血型的分子机制研究必须充分和完善。只有将分子机制研究充分、透彻，才有可能以分子生物学来代替血型血清学检测abo血型、进行基因分型、用基因直接计数法统计计算基因多态性分布。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种用于检测abo血型系统中o基因突变的snp标记，可以完善abo基因库的数据，从而弥补现有技术的不足。

申请人对一个呈常染色体9q34.1-9q34.2遗传的变异型血型基因的家系成员进行了测序，找到了该家系成员o型变异型基因存在遗传上的突变，导致h抗原无法转变为a抗原或b抗原，从而提供了一种为o血型的准确定型、避免通过输血造成急性溶血性输血反应的检测位点。

本发明首先提供一种与abo血型系统中o基因突变相关的snp位点，为abo血型基因(ncbireferencesequence:nm_020469.3)编码区atg起始第484位到492位；缺失gtgacgctg共9个碱基。

本发明的另一个方面提供一种用于检测红细胞abo血型的制品，所述的制品是用于检测上述的snp位点；

所述的制品为pcr扩增测序试剂盒，其中包含有检测上述snp位点的直扩增引物；

其中扩增引物的序列信息如下：

abo-e7f:5'-atccgcctgccttgcagata-3'seqidno:1

abo-e7r:5'-agcctaggcttcagttactcacaaca-3'seqidno:2

所述的制品为单倍型扩增及测序试剂盒，其中用于检测上述snp位点单倍型扩增及测序引物信息如下：

abo-e6mo：5'-cgggatccatgtgggtggcaccctgcca-3'seqidno:3

abo-e7mo：5'-gggcctaggcttcagttactc-3'seqidno:4。

本发明通过检测筛选获得的snp位点，从而提供了一种有效的进行abo血型基因诊断途径，完善了abo基因数据库，应用效果表明本发明所提供的基因的snp位点及检测引物可以有效的用于临床患者外周血进行abo血型o型变异型基因突变位点的快速检测。

附图说明

图1：先证者abo基因exon7直接测序结果图，采用abo-e7r引物对pcr产物进行测序，黑色箭头所指为第484bp(从atg起始)，提示其中一条链有碱基缺失。

图2：先证者abo基因exon7克隆测序结果图，将pcr产物进行克隆，挑取单克隆测序，黑色箭头所指为第484bp(从atg起始)，通过与ncbi标准序列的比较，证实o基因在484bp至492bp缺失gtgacgctg碱基。

具体实施方式

申请人在一个abo血型b亚型家系中进行dna测序时，发现一例新的snp突变导致o型变异型基因。

abo基因位于染色体9q34.1-9q34.2，可转录成大约1065bp的mrna(ncbi登录号为nm_020469.2)，o基因由于在261位碱基处缺失g，导致提前终止形成115个氨基酸的无效产物，从而无法将h抗原转化为a或b抗原，导致形成o血型。在进行大规模分子水平鉴定abo血型时，完善o基因的snp突变，有助于abo血型的正确定型，避免由于定型错误出现严重的输血反应。

对于本发明所涉及snp标记(singlenucleotidepolymorphism，snp，即单核苷酸多态性)是指基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的dna序列多态性。snp表现出的多态性仅涉及到单个碱基的变异，表现是有转换、颠换、插入和缺失等。

下面结合实施例对本发明进行详细的描述。

实施例1：snp标记的筛选

1、提取外周血基因组dna：

在符合国家相关政策规定，并在取样对象同意的基础上，抽取o型变异型基因家系成员外周静脉血2-5ml，放入edta-na2抗凝管内，-80℃冻存备用；dna提取使用life公司的dna提取试剂盒，具体操作流程如下：

冻存的edta抗凝血在室温融化后，取500μl放于离心管，加入等体积的红细胞裂解液(ph8.0)，涡旋混匀5分钟，12000rpm离心5分钟，弃上清。重复加入红细胞裂解液500ul涡旋混匀5分钟，12000rpm离心5分钟，弃上清。

沉淀物涡旋混匀5分钟，加入核裂解液50μl，涡旋混匀5分钟，置于56℃金属浴15分钟。从水浴中取出样品，加入蛋白清除液135μl。涡旋充分混匀，至于4℃30分钟。

室温下12000rpm离心5分钟，吸取上清液(约200μl)至一新离心管中。加入冰乙醇500μl，反复震荡离心管，直至白色dna沉淀物析出。室温12000rpm离心2分钟，弃上清。向dna沉淀加入75％乙醇，漂洗一次，室温12000rpm离心3分钟，弃上清，置于室温中挥发剩余乙醇，最后加入50μlte(ph8.0)，4℃过夜溶解dna。

对提取的dna行琼脂糖胶电泳，并应用紫外分光光度计在260nm和280nm比色，检测dna纯度及浓度。

2、直接测序法寻找先证者o变异型基因的突变位点

pcr扩增目的片段：反应条件与反应体系：

(1)pcr反应条件：95℃预变性10分钟；94℃60秒，63℃90秒，72℃60秒，10个循环；94℃60秒，61℃90秒，72℃60秒，25个循环；72℃延伸10min，扩增产物10℃保温。

(2)反应体系：(takaraex-taqpolymerase)

应用该反应体系进行先证者的基因组dna模板与上述abo-e7f、abo-e7r引物的扩增反应。

pcr产物测序：应用常规sanger测序法对上述pcr产物进行测序，其中应用引物对abo-e7f:5'-atccgcctgccttgcagata-3'；abo-e7r:5'-agcctaggcttcagttactcacaaca-3'在先证者发现abo血型基因第七外显子第484位(atg起始)前存在双峰(使用abo-e7r测序)(图1)，提示该先证者双链dna中有一条链存在碱基缺失。多次测序结果表明该突变位点并不是因为扩增或测序错误引进的。

3、对abo基因第7外显子及第6内含子进行单倍型测序，确定先证者o变异型基因的突变位点；

pcr扩增目的片段引物：

abo-e6mo：5'-cgggatccatgtgggtggcaccctgcca-3'；

abo-e7mo：5'-gggcctaggcttcagttactc-3'。

pcr扩增引物也可以选用其它能扩增上述snp位点的引物对。

pcr扩增目的片段的反应条件与反应体系：

(1)pcr反应条件：95℃预变性5分钟；95℃30秒，60℃30秒，72℃50秒，40个循环；72℃延伸5min，扩增产物10℃保温。

(2)反应体系：(takarala-taqpolymerase)

应用该反应体系分别进行每名家系成员的基因组dna模板与发明者设计的克隆测序的引物进行扩增反应。将pcr产物克隆入t载体，挑取多个菌落进行单倍型序列测定，单倍型测序引物使用abo-e6mo：5'-cgggatccatgtgggtggcaccctgcca-3'；abo-e7mo：5'-gggcctaggcttcagttactc-3'(测序引物也可以选用从o型变异基因上设计的，能扩增snp位点的其它引物)得到单倍型序列(图2)，与ncbi参考序列(nm_020469.3)进行比较，发现在第七外显子第484位到492位缺失gtgacgctg共9个碱基：

先证者：gccggccgcggtgccccgc---------gggaccggtcggcagctgtcagtgctggaggt

参考序列：gccggccgcggtgccccgcgggaccggtcggcagctgtcagtgctggaggt

该突变为一新发现突变。该突变不存在于下面的四个数据库中：单核苷酸多态性数据库(ftp://ftp.ncbi.nih.gov/snp/database/)，千人基因组计划(ftp://ftp-trace.ncbi.nih.gov/1000genomes/ftp/)，hapmap8数据库(http://hapmap.ncbi.nlm.nih.gov/)，及炎黄数据库(http://yh.genomics.org.cn/)，表明该突变非常罕见，而在近300例正常当地人群的外周血基因组dna样本中进行该位点的突变筛查，未发现该突变。

在青岛市中心血站输血医学研究所收集的先证者家系成员，提取他们的外周血基因组dna，应用上述dna作为模板与abo-e7f、abo-e7r引物进行pcr目的片段的扩增，常规sanger测序法应用上述这对引物对pcr产物进行直接测序，发现该先证者的两名家系成员的abo血型o基因存在本发明中发现的snp突变，即编码区域由起始密码子起第484至492位删失gtgacgctg碱基。继续对发现snp突变的两位家系成员进行abo基因第6,7外显子及第6内含子的单倍型测序，应用上述提取的两名家系成员的基因组dna作为模板与abo-e6mo、abo-e7mo引物进行pcr目的片段的扩增，将pcr产物克隆入t载体，挑取多个菌落进行单倍型序列测定，单倍型测序引物使用上述引物，确定样本的单倍型序列均存在起始密码子起第484至492位gtgacgctg碱基缺失。

通过上述的分析，证明该snp位点能够精准的确定待测者的abo血型，对于基因确定abo血型提供了更加准确的数据背景，对患者制定输血政策具有重要意义。

序列表

<110>青岛市中心血站

<120>一种用于检测abo血型系统中o基因突变的snp标记

<160>4

<170>siposequencelisting1.0

<210>2

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

atccgcctgccttgcagata20

<210>3

<211>26

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

agcctaggcttcagttactcacaaca26

<210>3

<211>28

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

cgggatccatgtgggtggcaccctgcca28

<210>4

<211>21

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>4

gggcctaggcttcagttactc21