一种对香豆酸响应的动态调控系统及其构建方法与流程

本发明涉及一种对香豆酸响应的动态调控系统及其构建方法，属于代谢工程技术领域。

背景技术：

对香豆酸是苯丙素类化合物合成的直接前体，同时其也具有多种生理功能，如利肝利胆、保护心脏、降血脂、抗癌和抗氧化等，已经在食品和药品领域被广泛应用。以大肠杆菌为底盘微生物合成苯丙素类化合物(如黄酮类化合物和芪类化合物)过程中，往往涉及到丙二酰-coa的供给。胞内丙二酰-coa的供给不足是导致最终产量较低和对香豆酸积累的重要原因。因此，强化微生物中丙二酰-coa合成有助于降低对香豆酸积累和提高目标化合物产量。然而，丙二酰-coa的前体乙酰-coa大部分进入tca循环，为菌体生长提供必须的能量。过量消耗乙酰-coa合成丙二酰-coa可能会导致菌体能量供应不足等问题。目前已有报道中，研究者主要通过抑制胞内脂肪酸合成途径，以及过表达丙二酰-coa合成途径相关基因来强化积累丙二酰-coa。

已有报道都是应用静态的代谢工程策略强化丙二酰-coa合成，然而细胞生长以及能量消耗都是一个动态的变化过程。静态代谢工程策略在实施过程中添加诱导剂的时间、诱导时间、诱导剂浓度和菌体的生长状态等都对最终产量具有较大影响。因此，构建稳定、高效、可动态调节对香豆酸积累、丙二酰-coa合成、细胞生长和产物合成的动态调控平台菌株至关重要。

技术实现要素：

为了解决上述问题，本发明提供了一种动态响应对香豆酸含量调控丙二酰-coa合成途径的方法，从而进一步强化下游苯丙素类化合物合成。

本发明的第一个目的是提供一种动态响应对香豆酸含量调控丙二酰-coa合成途径的方法，是利用动态响应对香豆酸含量的生物传感器调控丙二酰-coa合成途径，所述生物传感器包括对香豆酸响应的调控蛋白padr和受padr调控的启动子ppadc，所述调控蛋白padr的氨基酸序列如ncbi-proteinid:np_388715所示。

在本发明的一种实施方式中，所述启动子ppadc包括ppadc(608-1)、ppadc(608-496)、ppadc(608-476)、ppadc(608-456)、ppadc(216-1)、ppadc(216-39)、ppadc(216-79)或ppadc(216-123)。所述ppadc(608-1)的核苷酸序列如seqidno.1所示。

以ppadc(608-1)3’端第一个核苷酸为1位、5’端第一个核苷酸为608位计算，ppadc(608-496)、ppadc(608-476)、ppadc(608-456)、ppadc(216-1)、ppadc(216-39)、ppadc(216-79)或ppadc(216-123)启动子所在区域分别为608-496、608-476、608-456、216-1、216-39、216-79和216-123区域(5’-3’)。

在本发明的一种实施方式中，编码所述调控蛋白padr的基因的核苷酸序列如ncbi-geneid:936174所示。

在本发明的一种实施方式中，所述调控丙二酰-coa合成途径包括利用ppadc启动子调控丙二酰-coa合成途径基因或其反义rna，抑制tca循环，强化丙二酰-coa积累。

在本发明的一种实施方式中，所述调控丙二酰-coa合成途径是利用反义rna抑制策略调控tca循环中编码柠檬酸脱氢酶的glta基因，并过表达编码乙酸激酶的acs基因和编码乙酰-coa羧化酶的acc基因。

所述反义rna，含有一个pt发夹回文结构携带目标基因的互补序列，以及一个rrnb终止子结构。

本发明的第二个目的是提供一种动态响应对香豆酸含量的生物传感器，包括对香豆酸响应的调控蛋白padr和受padr调控的启动子ppadc，所述启动子ppadc包括ppadc(608-1)、ppadc(608-496)、ppadc(608-476)、ppadc(608-456)、ppadc(216-1)、ppadc(216-39)、ppadc(216-79)或ppadc(216-123)。

本发明的第三个目的是提供一种动态响应对香豆酸含量的载体，含有上述生物传感器。

在本发明的一种实施方式中，所述载体是以prsm3为基础构建的。所述prsm3的构建方法公开于xu,p.,etal.(2012)."epathbrick:asyntheticbiologyplatformforengineeringmetabolicpathwaysine.coli."acssyntheticbiology1(7):256-266中。

本发明的第四个目的是提供一种动态响应对香豆酸含量的工程菌株，以上述载体为表达载体。

在本发明的一种实施方式中，所述工程菌株以大肠杆菌为宿主。

在本发明的一种实施方式中，所述工程菌株过表达acs和acc基因，抑制glta基因的表达。

本发明的第五个目的是提供上述生物传感器在食品或制药领域中的应用。

本发明的有益之处：

本发明建立了一种动态响应胞内对香豆酸含量的生物传感器，通过调控丙二酰-coa合成途径，最终强化柚皮素的合成。此方法是首次建立的针对微生物发酵生产以柚皮素为代表的黄酮类化合物的动态调控方法，为黄酮类化合物的微生物法生产提供了一个高效的代谢调控体系。其他具有相似代谢途径的苯丙素类化合物合成同样可采用此方法。与传统的静态调控方法相比较，本方法最大的优势是无需添加诱导剂，可实现细胞生长、丙二酰-coa积累以及柚皮素合成之间的动态平衡。更加有助于实现微生物全局代谢网络的平衡，强化苯丙素类化合物合成，可将柚皮素产量提高至原先的1.5倍。此外，此方法也为其他高附加值化合物的动态合成提供了思路。

附图说明

图1：启动子ppadc结构优化。a：t7启动子控制表达padr阻遏蛋白的传感器示意图；b：不同长度ppadc启动子表达其强度。

图2：对香豆酸响应的动态调控模块，虚线箭头代表促进反应，虚线钝尖头代表抑制反应。

图3：不同丙二酰-coa来源代谢途径基因组合与柚皮素产量关系。

图4：对香豆酸响应的丙二酰-coa来源动态调控原理图。模块b：图2所示调控模块。

具体实施方式

材料与方法

柚皮素合成菌株为9g3，仅含有pcdm-pssra-utrrpst-chs-putrglpd-chi和petm-putrtrxa-tal-putrtalb-4cl两个质粒用于合成柚皮素，公开于zhoushetal.,2019,biotechnolbioeng,116:1392-1404(doi：10.1002/bit.26941)中，限制性内切酶和dna聚合酶分别购自赛默飞和takara公司，mops盐购自生工生物工程(上海)股份有限公司。多功能酶标仪cytation3platereader(biotek)用于检测样品荧光强度。大肠杆菌bl21(de3)用于蛋白质表达和柚皮素合成，大肠杆菌jm109用于分子克隆。

prsm3经过xbai/kpni双酶切后回收1900bp片段。从枯草芽孢杆菌168基因组上扩增“padr-终止子”片段，经xbai/kpni双酶切后与prsm3连接得到prsm-padr质粒。

prsm3经过xbai/kpni双酶切后回收3700bp片段，并与xbai/kpni双酶切后的“padr-终止子”dna片段连接得到prsm-t7-padr质粒。

以枯草芽孢杆菌基因组为模板扩增不同长度的ppadc启动子区域。通过融合pcr将不同长度的ppadc启动子与egfp连接，得到不同的ppadc-pq-egfp组合。随后bamhi/spei双酶切prsm-t7-padr质粒，并与同样酶切的ppadc-pq-egfp连接，构建得到不同的prsm-t7-padr-ppadc(p-q)-egfp质粒(p-q组合分别为608-1、608-496、608-476、608-456、216-1、216-39、216-79和216-123)。

以大肠杆菌mg1655基因组为模板扩增对数期表达pcspa启动子，随后经过xbai/asci双酶切后连接prsm-padr质粒得到prsm-pcspa-padr质粒，从而使padr的在对数期表达且避免对依赖iptg诱导的依赖。以prsm-pcspa-padr质粒为基础，连接ppadc(608-476)-egfp得到prsm-pcspa-padr-ppadc(608-476)-egfp质粒，获得受对香豆酸诱导的生物传感器。

利用融合pcr融合ppadc(608-476)和acc、ppadc(608-476)和acs、ppadc(608-496)和ptasglta，分别构建得到ppadc(608-476)-acc片段、ppadc(608-476)-acs和ppadc(608-496)-ptasglta片段。以prsm-pcspa-padr质粒为骨架，首先利用biobrick原理在xbai/ndei位点依次连接入ppadc(608-476)-acs和ppadc(608-496)-ptasglta，得到prsm-padr-acs、prsm-padr-ptasglta和prsm-padr-acs-ptasglta质粒。以prsm-pcspa-padr，prsm-padr-acs，prsm-padr-ptasglta和prsm-padr-acs-ptasglta质粒为骨架，利用biobrick原理在bamhi/spei位点连接padc(608-476)-acc片段，得到质粒prsm-padr-acc、prsm-padr-acs-acc、prsm-padr-ptasglta-acc和prsm-padr-acs-ptasglta-acc。最后检测不同基因组合得到的柚皮素产量。

本发明构建的动态调控系统的工作机制：以l-酪氨酸为底物组成型表达柚皮素合成途径基因，当胞内丙二酰-coa供应不足时会引起上游代谢中间产物对香豆酸积累，当对香豆酸浓度高时，对香豆酸可与padr蛋白结合并激活受padr蛋白调控的ppadc启动子，从而强化表达受ppadc启动子调控的acs、acc和ptasglta基因，这三个基因的表达会进一步强化乙酸转化为丙二酰-coa，并且减弱丙二酰-coa的合成前体乙酰-coa的消耗途径(进入tca循环)，最终强化丙二酰-coa的合成。因此，本发明要解决的技术问题是，当丙二酰-coa不足导致对香豆酸积累后，工程菌株自发地强化丙二酰-coa合成，从而形成丙二酰-coa的动态平衡。

附图说明以及以下实施例中所涉及的所有菌体培养都利用lb培养基，培养条件为37℃、220rpm。柚皮素发酵利用mops培养基，发酵条件为30℃、220rpm。

本发明涉及的基因的核苷酸序列如表1所示。

表1本发明涉及的基因的核苷酸序列

实施例1ppadc启动子结构精简及生物传感器功能验证

由于对香豆酸响应蛋白padr的识别启动子ppadc的最小结构尚不清楚且结构复杂，而为了构建高效的调控体系必须利用最小长度的ppadc启动子。因此，利用启动子截短策略，从ppadc两端不同程度截短启动子，并利用截短的ppadc表达绿色荧光蛋白，克隆至prsm-t7-padr质粒的bamhi/spei位点，得到一系列的prsm-t7-padr-ppadc(p-q)-egfp质粒(图1a)。该质粒受到iptg诱导表达padr蛋白进而阻遏下游荧光蛋白表达，对香豆酸可与padr蛋白结合从而解除阻遏效应，开启荧光蛋白表达。首先在lb培养基37℃培养过夜，次日以1％的接种量接种到新的lb培养基中30℃培养至od600＝0.4-0.6，随后在添加0.01mm浓度iptg和100mg/l对香豆酸诱导条件下，30℃诱导培养8h，最后以ph＝7.4的pbs缓冲液洗涤诱导后的细胞2次，并利用荧光酶标仪在488nm激发光和520nm发射光条件下测定荧光强度和od600，检测绿色荧光蛋白表达水平。结果显示：ppadc启动子长度在608-476范围内，即ppadc(608-476)，具有较高强度，达38086荧光强度/od600，且启动子长度最短(图1b)，可用于后续代谢调控。而由于608-496范围内启动子不包含rbs位点且同样具有较高的表达水平，可直接用于表达反义rna。截短启动子下游区域(216-1)会导致启动子表达活性消失，说明ppadc启动子区域和蛋白质结合位点均处于上游区域(608-456)。

实施例2丙二酰-coa合成途径优化

在实施例1的基础上，利用结构精简的ppadc启动子构建如图2所示调控系统。其中ppadc(608-496)启动子调控glta基因的反义rna表达，ppadc(608-476)启动子过表达acs和acc基因，并组合表达上述基因。将7种途径优化组合(包括prsm-padr-acs、prsm-padr-ptasglta、prsm-padr-acs-ptasglta、prsm-padr-acc、prsm-padr-acs-acc、prsm-padr-ptasglta-acc和prsm-padr-acs-ptasglta-acc质粒)转化入柚皮素合成菌株中。首先挑取所有工程菌株的3个单克隆作为生物学平行，在lb培养基中37℃培养过夜，次日以1％的接种量接种到新鲜的mops培养基中30℃、220rpm培养48h。随后检测胞内生成的柚皮素产量。

结果显示：组合过表达acs和acc基因时柚皮素产量最高，相对柚皮素合成对照菌株，产量是原来的1.5倍，达56mg/l(图3)。组合柚皮素合成途径与实施例1中所构建生物传感器后即形成一个对香豆酸响应的动态调控系统(图4)，当胞内对香豆酸积累后启动模块b基因表达，从而强化丙二酰-coa的合成，为柚皮素合成的下游途径提供所需前体，最终实现降低对香豆酸积累、强化柚皮素合成的目的。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

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