用于神经系统疾病的诊治分子的制作方法

本发明属于生物医学领域，涉及一种用于神经系统疾病的诊治分子。

背景技术：

帕金森病(parkinsoni’sdisease，pd)是好发于中老年的神经系统退行性疾病，也是中老年最常见的锥体外系疾病。其发病率在中老年人群中位居第二位，仅次于阿尔茨海默病(alzheimefisdisease，ad)，并且有逐年上升的趋势，随着年龄的增高，男性发病率远较女性高。pd的常见临床表现为静态下震颤、反应迟纯、僵硬和姿势扭曲。其病理学特点多表现为黑质致密部的多巴胺能神经元进行性、广泛性变性和缺失，进而使纹状体内的多巴胺水平降低，神经元细胞内出现路易小体(lewybody，lb)，后者主要含有聚集α-突触核蛋白(α-synuclein，α-syn)。帕金森病给病人带来极大的痛苦，严重影响了患者的日常生活，甚至使患者丧失劳动能力，给家庭和社会带来沉重的经济负担。

但目前pd的病因及确切的发病机制仍未完全清楚，多数学者的体内外实验证实，线粒体功能障碍、氧化应激和泛素化蛋白酶体等途径与pd发病机制有关，pd的发生和发展可能是衰老、遗传、环境、氧化应激反应、感染、神经营养因子缺乏、免疫异常等机制互相作用的结果。近年来研究发现基因对pd和多巴胺能神经元细胞调亡的调控作用十分重要。因此，深入探究pd发病机制和发病过程，寻找有效的神经保护剂是未来治疗pd的重要策略之一。这仍然需要我们做进一步的深入研究。

技术实现要素：

本申请实验证明相比健康人群，帕金森病患者血液中hal基因表达上调，提示hal可能作为诊断帕金森病的生物标志物，为了进一步研究hal基因与帕金森病的相关性，进行了体外细胞实验，通过构建帕金森病细胞模型，观察hal基因表达被抑制对帕金森病细胞模型增殖和凋亡的影响，结果显示抑制hal基因表达逆转了mpp+诱导的细胞损伤，促进细胞增殖且抑制细胞凋亡，表明hal是帕金森病的关键基因，可以成为帕金森病的诊治标志物。根据上述研究成果，本申请保护内容如下：

根据本发明的一个方面，本发明提供了一种诊治帕金森病的生物标志物，所述生物标志物是hal基因或其表达产物。

根据本发明的另一个方面，本发明提供了检测前面所述的生物标志物的试剂。

进一步，所述试剂包括检测hal基因mrna水平的试剂，或检测hal蛋白水平的试剂。

更进一步，检测hal基因mrna水平的试剂包括针对hal基因mrna的引物和/或探针；检测hal蛋白水平的试剂包括针对hal蛋白的抗体。

根据本发明的又一个方面，本发明提供了前面所述的生物标志物在制备帕金森病的诊断工具中的应用。

根据本发明的又一个方面，本发明提供了前面所述的试剂在制备帕金森病的诊断工具中的应用。

进一步，所述工具包括芯片、试剂盒、试纸、高通量测序平台、帕金森病诊断系统。

更进一步，所述帕金森病诊断系统包括诊断模块，所述诊断模块根据受试者的hal基因或其表达产物的表达水平判断受试者是否患有帕金森病。

根据本发明的又一个方面，本发明提供了前面所述的生物标志物在制备治疗帕金森病的药物中的应用。

进一步，所述药物包括抑制所述生物标志物表达的试剂。

更进一步，所述试剂包括但不限于sirna、shrna。

本发明所述药物还包括药物学上可接受的载体。通过常规制药工艺将有效成分-抑制所述生物标志物表达的试剂与药物学上可接受的载体制备成本发明的药物。

根据本发明的又一个方面，本发明提供一种治疗帕金森病的方法，所述方法包括施用抑制前面所述生物标志物表达的试剂或施用前面所述的包括抑制前面所述生物标志物表达的试剂的药物。

附图说明

图1显示利用qpcr检测hal基因mrna表达水平的统计图；

图2显示利用免疫印迹检测hal蛋白表达水平的统计图；

图3显示利用qpcr检测hal基因表达抑制程度的统计图；

图4显示利用mtt检测细胞活性的统计图；

图5显示利用tunel检测细胞凋亡的统计图。

具体实施方式

核酸和蛋白

本文中的“hal基因”，指编码所有或部分hal蛋白或与所有或部分ncbigeneid:3034的核酸序列或其类似物大致相同的核酸。

“大致相同”表示多肽或核酸展示与参考氨基酸或核酸序列至少75％，85％，90％，95％或甚至99％同一性。对于多肽，比对序列长度通常为至少35个氨基酸、45个氨基酸、55个氨基酸或甚至70个氨基酸。对于核酸，比对序列长度通常为至少60个核苷酸、90个核苷酸或甚至120个核苷酸。

通常使用公开可获得的计算机程序测定序列同一性。测定两条序列间同一性的计算机程序方法包括但不限于gcg程序包(devereux等，nucleicacidsresearch12：387，1984)、blastp、blastn和fasta(altschul等，j.mol.biol.215：403，1990)。熟知的smithwaterman算法也可用来确定同一性。blast程序可从ncbi和其它来源(如，blast手册，altschul等，ncbinlmnih，bethesda，md20894)公开获得。这些软件程序通过对各种置换、缺失和其它修改指定同源程度来匹配相似序列。氨基酸比对的保守置换通常包括在以下组中的置换：甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸；天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺；丝氨酸、苏氨酸；赖氨酸、精氨酸；和苯丙氨酸、酪氨酸。

如本文所使用的，当涉及蛋白质(如在“给定的蛋白的部分”中)时，术语“部分”是指该蛋白质的片段。所述片段可在大小上在从4个氨基酸残基至整个氨基酸序列减去一个氨基酸的范围内变化(例如，4、5、6、......、n-1)。

检测

本文使用的术语"检测蛋白表达水平"意指检测和鉴定生物样品中帕金森病的诊断标志物(蛋白)或编码其的基因的存在和表达水平。用于检测或比较分析蛋白的方法的实例包括但不限于：蛋白芯片测定、免疫测定、配体结合测试、

maldi-t0f(基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱)、seldi-t0f(表面增强激光解吸/电离飞行时间质谱)、放射免疫测定、放射免疫扩散、双向免疫扩散(ouchterlonyimmunodiffusion)、火箭免疫电泳、免疫组化染色、补体结合试验、2-d电泳、液相色谱-质谱(lc-ms)、液相色谱-质谱/质谱(lc-ms/ms)、免疫印迹、和elisa(酶联免疫吸附试验)。

在本公开内容中，用于检测的蛋白表达水平的试剂可包含可特异性结合至hal蛋白的抗体、寡肽、配体、pna(肽核酸)或适体。

本文使用的术语“抗体”是指特异性结合抗原以引发抗原-抗体反应的物质。出于本公开内容的目的，术语“抗体”意指特异性结合至hal蛋白的抗体。落入本公开内容的抗体的范围的是多克隆抗体、单克隆抗体和重组抗体。使用本领域熟知的技术可容易地制备这些抗体。此外，可用于本公开内容的抗体可以是由两条全长轻链和两条全长重链组成的完整抗体、或是完整抗体分子的功能片段。术语抗体分子的“功能片段”意指保留抗体结合功能的片段，例如fab、f(ab')、f(ab')2和fv。

本文使用的术语“pna(肽核酸)”是指与dna或rna相似的人工合成的聚合物，1991年由nielsen、egholm、berg和buchardt(哥本哈根大学，丹麦)教授首次引入。dna具有磷酸-核糖骨架，而pna的骨架由通过肽键连接的重复的n-(2-氨基乙基)-甘氨酸单元构成。由于这种结构，pna显著增强dna或rna的亲合力及稳定性，因此有效地用于分子生物学研究、诊断、和反义疗法。对于pna的详细说明，可参考文献[nielsenpe,egholmm,bergrh,buchardt0(1991年12月)·”sequence-selectiverecognitionofdnabystranddisplacementwithathymine-substitutedpolyamide".science254(5037):1497-1500]。

本文使用的“适体”是结合至特定靶分子的寡核苷酸或肽分子。对于适体的详细说明，可参考文献[bocklcetal·，nature355(6360):5646(1992)；hoppe-seylerf,butzk〃peptideaptamers:powerfulnewtoolsformolecularmedicine".jmolmed.78(8):42630(2000)；cohenba,colasp，brentr."anartificialcell-cycleinhibitorisolatedfromacombinatoriallibrary.procnatlacadsciusa.95(24):142727(1998)]。

本文使用的术语"检测mrna表达水平"意指检测和鉴定生物样品中编码诊断标记物(蛋白)的基因的mrna的存在和表达水平。在本公开内容中，可用于检测mrna表达水平的分析方法的实例包括反转录聚合酶链式反应(rt-pcr)、竞争性rt-pcr、实时rt-pcr、核糖核酸酶保护测定(rpa)、rna印迹和dna芯片，但不限于此。

在本公开内容中，用于检测编码hal的基因的mrna表达水平的试剂包含特异性结合至编码hal的基因的mrna的引物、探针或反义核苷酸。关于hal蛋白的信息可通过uniprot获得，本领域技术人员可基于该信息设计特异性结合至编码该蛋白的基因的mrna的引物、探针或反义核苷酸。

本文使用的术语“引物”是识别靶基因序列的短核酸序列的链，其包括一对正反向引物。具体地，所述“引物”包括一对提供特异性和灵敏度的分析结果的引物。引物被认为在用于扩增靶基因序列时提供高度特异性，但它不引起与靶基因序列不一致或互补的非靶序列的扩增。

本文使用的术语“探针”是指特异性结合至样品中待检测的靶标的物质。通过所述结合，探针可确定样品中靶标的存在。只要它通常用于本领域中，任何探针都可用于本公开内容。特别地，所述探针可以是pna(肽核酸)、lna(锁核酸)、肽、多肽、蛋白、rna或dna，最优选pna。具体地，所述探针是一种生物材料，其可以来自有机体或可以体外合成、或是其模拟物。例如，所述探针可以是酶、蛋白、抗体、微生物、动物或植物细胞或器官、神经元、dna或rna。dna可包括cdna、基因组dna和寡核苷酸。同样地，基因组rna、mrna和寡核苷酸可落入rna的范围内。蛋白的实例包括抗体、抗原、酶和肽。

本文使用的术语“反义”是指具有核苷酸碱基序列和亚基-亚基骨架的寡聚体，所述骨架允许反义寡聚体通过watson-crick碱基配对与rna中的靶序列杂交以在靶序列中形成rna:寡聚体异源双链核酸分子。

试剂盒

此外，本公开内容提供了用于诊断帕金森病的试剂盒，其包含用于诊断帕金森病的组合物。例如，所述试剂盒可以是rt-pcr试剂盒、dna芯片试剂盒、elisa试剂盒、蛋白芯片试剂盒、快速试剂盒、或mrm(多反应监测)试剂盒。

例如，所述诊断试剂盒可进一步包含反转录聚合酶链式反应所必需的元件。rt-pcr试剂盒包含一对特异性针对编码标记物蛋白的基因的引物。各引物是具有特异性针对所述基因的核酸序列的序列的核苷酸，其长度可为约7至50bp，更特别为约10至39bp。此外，所述试剂盒可进一步包含特异性针对对照基因的核酸序列的引物。此外，所述rt-pcr试剂盒可包含测试管或合适的器皿、反应缓冲液(不同ph值和镁浓度)、脱氧核苷酸(dntp)、酶(例如taq聚合酶和反转录酶)、脱氧核糖核酸酶抑制剂、核糖核酸酶抑制剂、depc-水、和无菌水。

此外，本公开内容的诊断试剂盒可包含用于操作dna芯片所必需的元件。所述dna芯片试剂盒可包含与基因或cdna或相当于其片段的寡核苷酸结合的底物、及用于构建荧光标记的探针的试剂、药剂和酶。此外，所述底物可包含对照基因或cdna或相当于其片段的寡核苷酸。

在一些实施方案中，本公开内容的诊断试剂盒可包含用于进行elisa所必需的元件。所述elisa试剂盒可包含特异性针对蛋白的抗体。所述抗体具有针对标记物蛋白的高选择性和亲合力，与其他蛋白无交叉反应性，并且可以是单克隆抗体、多克隆抗体或重组抗体。此外，所述elisa试剂盒可包含特异性针对对照蛋白的抗体。此外，所述elisa试剂盒可进一步包含能够检测被结合的抗体的试剂，例如，标记的第二抗体、发色团、酶(例如，与抗体缀合)、及其底物或能够结合所述抗体的物质。

与检测结合使用的术语“样品”是指随着帕金森病的发病，蛋白或基因表达水平不同的生物样品，样品的实例包括组织、细胞、血清、血浆、唾液、脑脊液和尿，优选血液、血清或血浆。在本发明的具体实施方案中，样品是血液。

药物

短语“药学上可接受的载体”是本领域认可的并且包括例如参与从身体的一个器官或部分携带或运输任何主题组合物至身体的另一个器官或部分的药学上可接受的材料、组合物或赋形剂，如液体或固体填充剂、稀释剂、溶剂或包囊材料。每种载体必须在与主题组合物的其他成分相容的意义上是“可接受的”并且对患者无害。在某些实施方案中，药学上可接受的载体是无热原的。可以用作药学上可接受的载体的材料的一些例子包括：(1)糖，如乳糖、葡萄糖和蔗糖；(2)淀粉，如玉米淀粉和马铃薯淀粉；(3)纤维素及其衍生物，如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和乙酸纤维素；(4)粉末状黄蓍胶；(5)麦芽；(6)明胶；(7)滑石粉；(8)可可脂和栓剂蜡；(9)油，如花生油、棉籽油、葵花籽油、芝麻油、橄榄油、玉米油和大豆油；(10)二醇，如丙二醇；(11)多元醇，如甘油、山梨醇、甘露糖醇和聚乙二醇；(12)酯，如油酸乙酯和月桂酸乙酯；(13)琼脂；(14)缓冲剂，如氢氧化镁和氢氧化铝；(15)海藻酸；(16)无热原的水；(17)等渗盐水；(18)林格氏溶液；(19)乙醇；(20)磷酸盐缓冲液；和(21)药物制剂中使用的其他无毒的相容物质。

“施用”表示将剂量药物给患者的方法。在本发明方法中使用的组合物可通过选自但不限于如下途径施用：吸入、眼部、肠胃外、皮肤、经皮、口腔、直肠、舌下、舌周(perilingual)、鼻、局部给药和口服给药。肠胃外给药包括静脉内、腹膜内、皮下和肌内给药。优选的给药方法可根据多种因素变化，如，被施用的组合物的组分和被治疗的病症的严重度。

以本领域熟练技术人员已知的方式制备本发明的药物，如通过常规的溶解、冻干、混合、制粒或成型方法。制造制剂的本领域熟知方法示于如remington：thescienceandpracticeofpharmacy，第20版，a.r.gennaro编，2000，lippincottwilliams&wilkins，philadelphia，和encyclopediaofpharmaceuticaltechnology(制药技术百科)，j.swarbrick和j.c.boylan编，1988-1999，marceldekker，newyork。

本领域熟练技术人员可容易地确定在本发明药物中使用的任何试剂的剂量。希望地，本发明药物中的试剂的剂量会足以缓解患者的帕金森病的症状。可选择性地，所述剂量会足以抑制患者细胞中的hal。

其他术语

本文使用的术语"诊断"旨在涵盖确定受试者对某种疾病或病症的易感性、确定受试者是否患有某种疾病或病症、确定患有某种疾病或病症的受试者的预后或度量疗法(therametrics)(例如，监测受试者的状态以提供关于治疗功效的信息)。特别地，本文使用的诊断意指确定帕金森病的发病或发病的可能性(风险)。

术语“治疗”是本领域公知的，并且包括预防疾病、失调或病症在可能有出现疾病、失调和/或病症的倾向但还没有被诊断患有所述疾病、失调和/或病症的动物中发生；抑制疾病、失调或病症，例如，阻碍其进展；并缓解疾病、失调或病症，例如，引起疾病、失调和/或病症的消退。治疗疾病或病状包括改善特定疾病或病状的至少一种症状，即便基础病理生理学不受影响，如通过施用药剂治疗受试者的神经系统病状如多发性硬化和与氧化应激相关的其他疾病如肾脏疾病，尽管这种药剂不治疗该病状的病因。如本文所用的术语“治疗(treating)”、“治疗(treat)”或“治疗(treatment)”包括治愈性疗法、预防性(例如，预防疾病的)疗法、辅助疗法和姑息疗法。

本文使用的术语“标志物”、“生物标志物”或“诊断标志物”意指允许区分正常和疾病状态、或能够使治疗结果被预测或客观测量的标签。具体地，在与帕金森病相关的情况下，标志物意指在患帕金森病或有帕金森病发病风险的受试者中，相比于正常对照(未患帕金森病的受试者)，其蛋白或基因表达水平显著升高或降低的有机生物分子，例如多肽或核酸(例如mrna等)、脂质、糖脂、糖蛋白、糖(单糖、二糖、寡糖等)。

如本文所使用的，术语“受试者”和“患者”是指任何生物，包括植物、微生物和动物(例如，哺乳动物例如狗、猫、家畜和人)。

术语“sirna”是指短干扰rna。在一些实施方案中，sirna包含双链体或双链区域，其中所述双链区域的每条链的长度为大约18至25个核苷酸；所述双链区域的长度可以短至16个碱基和长至29个碱基对，其中该长度由反义链决定。通常，sirna在每条链的3′末端包含大约2至4个未配对的核苷酸。在无脊椎动物和脊椎动物中引发rna干扰方面，以及在植物中在转录后基因沉默过程中引发序列特异性rna降解方面，sirna似乎起着关键的中间物的作用。sirna的双链体或双链区域中的至少一条链与靶rna分子基本上同源或者基本上互补。与靶rna分子互补的链为“反义”链；与靶rna分子同源的链为“正义”链，并且该链还与sirna反义链互补。双链区域中的一条链不必具有相反链的确切长度，因此，一条链可以比相反的互补链少至少一个核苷酸，从而导致在相反链中形成“泡”或至少一个未匹配的碱基。双链区域的一条链不必与相反链精确互补；因此，所述链(优选为正义链)可以具有至少一个错配的碱基对。

sirna还可以包含另外的序列；此类序列的非限定性实例包括，连接序列，或环，其连接了双链体区域的两条链。这种形式的sirna可以被称为“si-样rna”、“短发夹sirna”(其中短涉及sirna的双链体区域)或“发夹sirna”。在sirna中存在的另外序列的另外非限定性实例包括茎和其他折叠结构。所述另外的序列可以具有或不具有已知的功能；此类功能的非限定性实例包括增加sirna分子的稳定性或提供细胞目的信号(cellulardestinationsignal)。

下面结合具体实施例对本发明作更进一步的说明，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1hal基因表达与帕金森病诊断的关联性研究

1、研究对象

收集原发性pd患者55例，男30例，女25例，年龄34-80岁，病程6个月-20年。pd入组标准：诊断标准均符合pd临床诊断标准(参考“蒋雨平，王坚，丁正同，等，原发性帕金森病的诊断标准，2005，中国临床神经科学，2006，14:40”)。排除标准：(1)特发性震颤；(2)继发性帕金森综合征；(3)严重痴呆、构音障碍者；(4)患有其他精神疾患者。

正常组：选取年龄34-80岁的健康志愿者40例，男女各20例。

两组之间年龄、性别差异无统计学意义(p>0.10)，具有可比性。

2、血液中总rna的提取

(1)匀浆处理(homogenization)

直接取新鲜的血液(外周血)，加入3倍体积红细胞裂解液，混匀后室温放置10分钟，10,000rpm离心1分钟。彻底吸弃上清，收集白细胞沉淀。每100-200μl血液收集的白细胞沉淀加入1mltrizol。

(2)分层(phaseseparation)

a.样品加入trizol后，室温放置5min，使样品充分裂解。

b.每1mltrizol加入200μl氯仿，剧烈振荡混匀后室温放置3-5min使其自然分相。

(3)rna沉淀(rnaprecipitation)

a.4℃12,000rpm离心10-15min。样品会分成三层：黄色的有机相，中间层和无色的水相，rna主要在水相中，把水相(通常可吸取550μl)转移到新管中。

b.在上清中加入等体积冰冷的异丙醇，室温放置10-20min。4℃12,000rpm离心10min，弃上清，rna沉淀于管底。

(4)rna漂洗(rnawash)

a.rna沉淀中加入1ml75％乙醇(用rnase-free水配制)，温和振荡离心管，悬浮沉淀。每1mltrizol加入1ml75％乙醇。

b.4℃5,000-8,000rpm离心1-2min，弃上清；短暂快速离心，用移液器小心吸弃上清，室温放置1-2分钟晾干沉淀。

(5)溶解rna(redissolvingtherna)

沉淀中加入50-100μlrnase-free水，轻弹管壁，以充分溶解rna，-70℃保存。

3、rna质量和纯度检测

rna质量：通过rna完整性来表示，可用普通琼脂糖凝胶电泳(电泳条件：1.2％胶；0.5×tbe电泳缓冲液；150v，15分钟)检测完整性。

rna纯度：od260/od280比值是衡量rna样品中蛋白质污染程度的指标。高质量的rna样品，od260/od280值(10mmtris,ph7.5)在2.0左右。

3、逆转录

用逆转录缓冲液对lμg总rna进行逆转录合成cdna。采用25μl反应体系，每个样品取1μg总rna作为模板rna，在pcr管中分别加入以下组分：depc水，5×逆转录缓冲液，10mmol/ldntp，0.1mmol/ldtt，30μmmol/loligodt,200u/μlm-mlv，模板rna。42℃孵育1h，72℃10min，短暂离心。

4、qpcr

根据genbank中hal基因和gapdh基因的编码序列设计qpcr扩增引物，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。具体引物序列如下：

hal基因：

正向引物为5’-gcaacagataatcctatggt-3’(seqidno.1)；

反向引物为5’-ctttggctgggtattcac-3’(seqidno.2)，

gapdh基因：

正向引物为5’-tttaactctggtaaagtggatat-3’(seqidno.3)；

反向引物为5’-ggtggaatcatattggaaca-3’(seqidno.4)。

采用cdna2.0μl进行qpcr反应。扩增程序为：95℃5min，(95℃15s，50℃60s)*40个循环。以sybrgreen作为荧光标记物，在lightcycler荧光实时定量pcr仪上进行pcr反应，δδct法进行相对定量。

4、westernblot检测

提取细胞总蛋白。采用bca蛋白浓度试剂盒对提取的总蛋白进行定量。每个样本取50μg总蛋白，12％sds-page电泳1.5h后，转膜。5％脱脂奶粉封闭，一抗4℃孵育过夜，二抗37℃孵育2h。电化学法发光ecl发光液显色，凝胶成像系统曝光显色；灰度分析，目的蛋白的相对表达量取其与gapdh的灰度值比值。

5、结果

(1)qpcr结果

如图1所示，与正常人相比，帕金森病患者中hal基因mrna水平显著升高，差异具有统计学意义(p<0.05)。

(2)westernblot结果

如图2所示，与正常人相比，帕金森病患者中hal蛋白水平显著升高，差异具有统计学意义(p<0.05)。

实施例2抑制hal基因表达

1、细胞培养

培养箱中培养sh-sy5y细胞，培养液为含有100u/ml青霉素、100μg/ml链霉素和10％胎牛血清的dmem高糖培养液(gibco)，培养条件设置为37℃、5％co2。从瓶壁上分离细胞，分离细胞采用25％的胰蛋白酶，按1:2-1:3比例进行传代。传三代后，挑选状态良好的细胞冻存，其他传代细胞进入对数生长期即进行实验。

2、设计合成针对hal的sirna

根据halmrna序列，利用在线sirna设计软件(http://www.ambion.com)。根据ambion公司提供的设计原则，筛选出1对特异性靶向hal基因的sirna序列。sirna序列由广州市锐博生物科技有限公司合成。上述序列通过blast分析验证与人类其他编码序列无同源性。通用阴性对照序列(sirna-nc)由广州锐博生物科技有限公司提供。

sirna-hal：

正义链为5’-agacauugauccuuaaagcca-3’(seqidno.5)；

反义链为5’-gcuuuaaggaucaaugucuua-3’(seqidno.6)，

3、细胞转染

采用脂质体lipofectamine2000为转染试剂。实验分2组：阴性对照组(转染sirna-nc)，实验组(转染sirna-hal)。取对数生长期的sh-sy5y细胞，接种于6孔细胞培养板。24h后细胞培养板覆盖率约为70％-80％。转染方式参照lipofectamine2000说明书进行。

4、qpcr实验检测sirna-hal的干扰效率

步骤同实施例1。

5、结果

结果如图3所示，sirna-hal可显著抑制hal表达，差异具有统计学意义(p<0.05)。

实施例3hal基因表达与帕金森病治疗的关联性研究

1、mpp+的配制

1ml细胞培养液中溶解10mg的mpp+(sigma)，配制成原液。取原液0.1ml，加到细胞培养液，细胞培养液为0.9ml，从而配制成3365.5μm的mpp+工作液。

2、帕金森病细胞模型构建

前期试验已经证明使用4mmmpp+给药浓度，诱导损伤sh-sy5y细胞24h，细胞存活率60％左右，因此以4mmmpp+可建立稳定的帕金森病细胞模型。

3、干扰hal基因表达对mpp+诱导的sh-sy5y细胞损伤的影响

通过测定细胞存活率以及细胞凋亡率来研究干扰hal基因表达对mpp+诱导的sh-sy5y细胞损伤的影响。

3.1mtt实验

调整sh-sy5y细胞到合适浓度接种到96孔板，当细胞汇合度达到70％-80％，按照实施例2的方法转染sirna，转染48小时后加入mpp+作用24h。

实验分组如下：

空白对照组：不处理；

模型组：加mpp+；

阴性对照组：转染sirna-nc，加mpp+；

治疗组：转染sirna-hal，加mpp+；

之后应用mtt法检测细胞活性：mtt用pbs溶解，终浓度为5mg/ml，将孔内溶液弃掉，加入100μl培养基，再每孔加入5mg/mlmtt10μl，37℃孵箱中继续培养4h，再将孔内溶液弃掉，每孔加dmso100μl，室温摇床孵育5-10min。酶标仪上读取570nm并630nm双波去除背景处吸光度(od)值，与对照组的吸光度值的百分比即为细胞活性百分比。按如下公式计算:细胞活性百分比％＝实验组od值/对照组od值*100％。

3.2tunel实验

调整sh-sy5y细胞到合适浓度接种到12孔板，当细胞汇合度达到70％-80％，按照实施例2的方法转染sirna，转染48小时后加入mpp+作用24h。

实验分组如下：

阴性对照组：转染sirna-nc，加mpp+；

治疗组：转染sirna-hal，加mpp+；

之后使用碧云天公司的tunel细胞凋亡检测试剂盒(显色法)(货号：c1091)测定细胞凋亡情况，按照操作说明书进行。

4、结果

4.1mtt实验

结果如图4所示，与模型组(存活率约为64％)相比，治疗组(存活率约为85％)的hal基因沉默后可引起细胞死亡率降低，p<0.05，具有统计学差异；阴性对照组相比模型组，细胞存活率略有下降，p>0.05，没有统计学差异。上述结果表明，抑制hal基因可逆转mpp+诱导的sh-sy5y细胞损伤。

4.2tunel实验

结果如图5所示，与阴性对照组相比，治疗组的hal基因沉默后可显著降低tunel染色阳性细胞百分数，差异具有统计学意义。表明抑制hal基因表达可抑制mpp+诱导的sh-sy5y细胞凋亡。

以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。

序列表

<110>青岛泱深生物医药有限公司

<120>用于神经系统疾病的诊治分子

<160>6

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

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<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

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ctttggctgggtattcac18

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<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

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<400>6

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