用于检测肺癌相关基因甲基化的核酸组合物、试剂盒和检测方法与流程

本发明属于分子生物学领域，涉及医学和生物技术，具体的是涉及一种用于检测肺癌相关基因甲基化的核酸组合物、试剂盒和检测方法。
背景技术：
：肺癌每年在我国的发病约有78.1万例，死亡约有62.6万例，是目前我国发病率和死亡率均最高的癌症。由于早期肺癌没有明显症状，加上现有早期诊断手段不够敏感，肺癌发现时大多已是晚期，治疗手段有限，5年存活率仅有15.8％。《肺结节诊治中国专家共识(2018年版)》指出，中国肺结节患病率近1个亿，其中5～10％肺结节为肺癌，如果能够在这个阶段发现肺癌，并解决问题，可大幅提高肺癌患者的五年生存率。目前肺癌筛查与诊断手段包括血清学检查、影像学检查与获取肺癌组织学或细胞学检查技术等，这些手段各有利弊，都分别存在灵敏度或特异性低、费用高、操作难度大、适用范围窄或对患者造成伤害等不同问题。因此，迫切需要一种操作简单，安全创伤性小，灵敏度高，特异性好的肺癌诊断手段。dna甲基化检测是一种可以增强肺癌早期诊断准确性的手段。甲基化是dna表型修饰的一种，抑癌基因启动子cpg岛区域的超甲基化可能会导致转录沉默，从而影响肿瘤发生的进程。由于dna甲基化在几乎所有癌症中均有发现，并且多发生在癌前或者癌症早期阶段，因而有望成为癌症早期诊断的理想标志物。大量研究显示，通过对特定基因甲基化情况进行检测，可有效提高肺癌的诊断效能，相关的甲基化检测也渐渐从科研走向临床应用。目前已知有多个抑癌基因在肺癌早期出现异常甲基化，其中rassf1a、shox2与ptger4甲基化检测在肺癌诊断上具有高灵敏度与高特异性。rassf1a是ras信号通路的成员之一，位于3号染色体p21.3区域，调控细胞的增殖和自噬，可能是肺癌、鼻咽癌和胃癌等多种常见肿瘤的相关抑癌基因。rassf1a基因启动子区cpg岛特异性高甲基化是其失活的主要原因。shox2属shox基因家族，位于3号染色体q25-q26.1区域，编码转录调控因子，其基因表达调控与器官发育密切相关。shox2基因有2个cpg岛，分别位于5’端以及3’端，其甲基化与肺癌有关。ptger4为g蛋白偶联受体家族的成员，位于5号染色体p13.1，所编码蛋白介导pge2诱导的早期生长应答蛋白1(egr1)的表达，并激活糖原合成酶激酶-3(gsk3)的磷酸化。研究显示，rassf1a与shox2基因或shox2与ptger4任意甲基化检出率显著高于良性肺病对照，用于i期肺癌诊断的灵敏度远高于血清学与细胞学手段，具有优越的早期肺癌诊断价值。但目前缺乏同时检测这三种基因甲基化的相关试剂或试剂盒。鉴于此，特提出本发明。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种用于检测肺癌相关基因甲基化的核酸组合物，该核酸组合物可基于荧光定量pcr平台实现对rassf1a，hox2和ptger4基因甲基化的同时检测，且具有高灵敏度和高特异性的特点。本发明的另一目的在于提供一种用于检测肺癌相关基因甲基化的试剂盒，该试剂盒可直接同时对人肺癌特异性的rassf1a，shox2和ptger4三种基因甲基化分析，用于肺癌的早期诊断，不仅具有较高的灵敏度和特异性，而且具有操作方便、检测结果准确可靠的特点。本发明的另一目的在于提供一种肺癌相关基因甲基化的检测方法，该方法可以同时对人肺癌特异性的rassf1a，shox2和ptger4甲基化进行检测，具有较高的灵敏度和特异性，且操作方便、检测结果准确可靠。本发明是这样实现的：第一方面，本发明实施例提供一种用于检测肺癌相关基因甲基化的核酸组合物，其包括：引物组合物；所述引物组合物包括：用于检测rassf1a基因甲基化的第1引物对、用于检测shox2基因甲基化的第2引物对以及用于检测ptger4基因甲基化的第3引物对；所述第1引物对包括seqidno.1和seqidno.2所示的引物；所述第2引物对包括seqidno.4和seqidno.5所示的引物；所述第3引物对包括seqidno.7和seqidno.8所示的引物。目前市场上相关产品中关于rassf1a，shox2和ptger4基因位点单基因检测或两基因联检的较多，但未有产品将这三个指标进行同管检测。本发明所提供的核酸组合物可以同时对rassf1a，shox2和ptger4基因进行pcr扩增检测，简化操作步骤，缩短检测时间。对此，本发明提供的核酸组合物针对亚硫酸盐转化后rassf1a，shox2和ptger4的肺癌特异性甲基化cpg岛区域上7-10个cpg位点进行科学设计，避免dna序列中个别不相关的snp或点突变导致的假阳性结果，有效地提高了灵敏度与特异性，此外各引物对的序列是经过科学合理设计的，能够避免进行三重pcr时的非特异性扩增情况，大大地提高了特异性扩增能力。在本发明的一些实施方案中，所述核酸组合物还包括探针组合物；所述探针组合物包括：用于检测rassf1a基因甲基化的第1探针，用于检测shox2基因甲基化的第2探针以及用于检测ptger4基因甲基化的第3探针；所述第1探针、所述第2探针以及所述第3探针的核苷酸序列分别如seqidno.3、6和9所示。本发明的探针组合物也是针对亚硫酸盐转化后rassf1a，shox2和ptger4的肺癌特异性甲基化cpg岛区域上7-10个cpg位点进行科学设计得到，避免dna序列中个别不相关的snp或点突变导致的假阳性结果，有效地提高了灵敏度与特异性。在本发明的一些实施方案中，所述引物组合物还包括检测内参基因的内参引物对，所述探针组合物包括检测所述内参基因的内参探针。在本发明的一些实施方案中，所述内参基因为actb内参基因。需要说明的是，本发明的内参基因包括但不限于actb，在其他的实施例中，本领域技术人员可以根据实际需求，选择合适的内参基因，无论选择何种内参基因其都是属于本发明的保护范围。在本发明的一些实施方案中，所述内参引物对包括seqidno.10和seqidno.11所示的引物。在本发明的一些实施方案中，所述内参探针的核苷酸序列如seqidno.12所示。在本发明的一些实施方案中，所述探针组合物中的每种探针的5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团；所述探针组合物中，任意两种探针之间所标记的荧光报告基因的类型不同。在本发明的一些实施方案中，所述荧光报告基团选自fam、tet、rox、vic、joe、cy3、cy5和hex中的任意一种。需要说明的是，本发明的荧光报告基团包括但不限于fam、tet、rox、vic、joe、cy3、cy5和hex，在其他的实施例中，本领域技术人员可以根据实际需求，选择合适的荧光报告基团，无论选择何种荧光报告基团其都是属于本发明的保护范围。在本发明的一些实施方案中，所述荧光淬灭基团选自tamra、dabcyl、eclipse、bhq-1、bhq-2和bhq-3中的任意一种。需要说明的是，本发明的荧光淬灭基团包括但不限于tamra、dabcyl、eclipse、bhq-1、bhq-2和bhq-3，在其他的实施例中，本领域技术人员可以根据实际需求，选择合适的荧光淬灭基团，无论选择何种荧光淬灭基团其都是属于本发明的保护范围。在本发明的一些实施方案中，所述第1探针的5’端标记的荧光报告基团为fam，3’端标记的淬灭基团为bhq-1；在本发明的一些实施方案中，所述第2探针的5’端标记的荧光报告基团为vic，3’端标记的淬灭基团为bhq-1；在本发明的一些实施方案中，所述第3探针的5’端标记的荧光报告基团为rox，3’端标记的淬灭基团为bhq-2；在本发明的一些实施方案中，所述内参探针的荧光报告基团为cy5，3’端标记的淬灭基团为bhq-2。第二方面，本发明提供一种检测肺癌相关基因甲基化的试剂盒，其包括如上任一项所述的核酸组合物。在本发明的一些实施方案中，所述试剂盒还包括pcr缓冲液，所述pcr缓冲液包括如下组分中的一种或几种：tris-hcl、k+、dntp、mg2+、甘油、dmso、bsa、tween-20、np-40和tmac。在本发明的一些实施方案中，所述pcr缓冲液中含有如下组分：tris-hcl、k+、dntp、mg2+、甘油、dmso、bsa、tween-20、np-40和tmac。在本发明的一些实施方案中，所述pcr缓冲液中含有如下组分：28-32mmtris-hcl、95-105mmkcl、0.4-0.6mmdntp、5-7mmmgcl2、3％-5％甘油(体积百分比)、1.5％-2.5％dmso(体积百分比)、45-55ng/μlbsa、0.1％-0.3％tween-20(体积百分比)、0.08％-0.12％np-40(质量百分比)和3-5mmtmac。本发明的中pcr缓冲液中对于各组分浓度进行优化并适当加入有利于提高pcr反应中dna聚合酶稳定性的成分，针对亚硫酸盐转化后碎片化程度较高的dna模板扩增效率高，荧光定量pcr的扩增曲线基线平整，且对于可能的干扰物质容忍度高，可有效避免基线不平整、非特异性扩增等异常扩增曲线所导致的结果判读错误。在本发明的一些实施方案中，所述pcr缓冲液中含有如下组分：30mmtris-hcl、100mmkcl、0.5mmdntp、6mmmgcl2、4％甘油、2％dmso、50ng/μlbsa、0.2％tween-20、0.1％np-40和4mmtmac。采用上述实施方式中的浓度设计，更有利于提高pcr反应中dna聚合酶稳定性的成分，针对亚硫酸盐转化后碎片化程度较高的dna模板扩增效率更高，荧光定量pcr的扩增曲线基线更平整，且对于可能的干扰物质容忍度更高，更有效避免基线不平整、非特异性扩增等异常扩增曲线所导致的结果判读错误。在本发明的一些实施方案中，所述pcr缓冲液的ph为7.9-8.1。在本发明的一些实施方案中，所述试剂盒还包括dna聚合酶。在本发明的一些实施方案中，所述dna聚合酶为高保真dna聚合酶或普通dna聚合酶。需要说明的是，本发明的dna聚合酶可以是高保真dna聚合酶，也可以是普通dna聚合酶，通过上述pcr缓冲液的特殊设计，使得其反应体系可以使用各种dna聚合酶，其均能保证扩增结果的准确性。在本发明的一些实施方案中，所述高保真dna聚合酶选自phusiondna聚合酶、blendtaqdna聚合酶、iproofdna聚合酶、koddna聚合酶、pfudna聚合酶、ulltrapfdna聚合酶和q5超保真dna聚合酶中的至少一种。需要说明的是，本发明的高保真dna聚合酶包括但不限于phusiondna聚合酶、blendtaqdna聚合酶、iproofdna聚合酶、koddna聚合酶、pfudna聚合酶、ulltrapfdna聚合酶和q5超保真dna聚合酶，在其他的实施例中，本领域技术人员可以根据实际需求，选择合适的高保真dna聚合酶，无论其选择何种高保真dna聚合酶，其均是属于本发明的保护范围。在本发明的一些实施方案中，普通dna聚合酶选自taqdna聚合酶和tthdna聚合酶中的至少一种。需要说明的是，本发明的普通dna聚合酶包括但不限于taqdna聚合酶和tthdna聚合酶，在其他的实施例中，本领域技术人员可以根据实际需求，选择合适的普通dna聚合酶，无论其选择何种普通dna聚合酶，其均是属于本发明的保护范围。在本发明的一些实施方案中，所述taqdna聚合酶为热启动taqdna聚合酶。在本发明的一些实施方案中，在所述试剂盒中，所述核酸组合物以溶液或粉末形式存在。需要说明的是，在所述试剂盒中，本发明的核酸组合物存在的形式是多样的，可以是溶液，也可以是粉末，但也可以是这两种形式之外的其他形式，无论以何种形式包装至试剂盒中，其都是属于本发明的保护范围。在本发明的一些实施方案中，所述核酸组合物以溶液形式存在，溶液中，各引物浓度为1-1.5μm，各探针浓度为0.4-0.6μm。需要说明的是，当本发明的核酸组合物以溶液形式存在于试剂盒中时，溶液中的引物或探针浓度均是可以实际需求调整或设计的，例如各引物可以是1-1.5μm，各探针浓度可以是0.4-0.6μm，但也是其他浓度值，无论以何种浓度存在，其都是属于本发明的保护范围。在本发明的一些实施方案中，所述试剂盒的检测样本来源于人体的新鲜组织、石蜡包埋组织切片、肺泡灌洗液、胸水或血浆等。在本发明的一些实施方案中，所述试剂盒的检测样本来源于肺泡灌洗液或血浆。本发明所提供试剂盒适用于肺泡灌洗液与血浆样本中rassf1a，shox2和ptger4基因甲基化检测。由本发明的实施例可见，该试剂盒在肺泡灌洗液与血浆样本中检测肺癌的灵敏度分别为84％与64％，特异性分别为94％与96％，具有良好的肺癌早期诊断价值。但需要说明的是，本发明所述提供的试剂盒可以适用的检测样本可以是多种多样的，包括但不限于新鲜组织、石蜡包埋组织切片、肺泡灌洗液、胸水或血浆样本，其他来源或形式的样本也是可行的，无论以何种样本进行甲基化检测，其都是属于本发明的保护范围。第三方面，本发明实施例提供一种肺癌相关基因甲基化的检测方法，其包括：使用如上任一项所述的核酸组合物或如上任一项所述的试剂盒进行pcr扩增。如上进行pcr扩增的条件包括如下阶段中的至少一个阶段：第一阶段：94-96℃、9-11min；第二阶段：94-96℃、14-16s，59-61℃、28-32s，4-6个循环；第三阶段：94-96℃、14-16s，59-61℃、4-6s，56-58℃、28-32s，38-42个循环。在本发明的一些实施方案中，该检测方法以非疾病的诊断为目的。附图说明为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。图1为实施例1中阳性对照品荧光定量pcr扩增曲线图。图2为实施例1中阴性对照品荧光定量pcr扩增曲线图。图3为实施例4中rassf1a最低检出限检测荧光定量pcr扩增曲线图。图4为实施例4中shox2最低检出限检测荧光定量pcr扩增曲线图。图5为实施例4中ptger4最低检出限检测荧光定量pcr扩增曲线图。图6为实施例5中本发明2×甲基化检测pcr缓冲液与普通pcr缓冲液检测rassf1a效果对比荧光定量pcr扩增曲线图。图7为实施例5中本发明2×甲基化检测pcr缓冲液与普通pcr缓冲液检测shox2效果对比荧光定量pcr扩增曲线图。图8为实施例5中本发明2×甲基化检测pcr缓冲液与普通pcr缓冲液检测ptger4效果对比荧光定量pcr扩增曲线图。图9为对比例1中的实验组b检测阳性样本的荧光定量pcr扩增曲线图。图10为对比例1中的实验组b检测阴性样本的荧光定量pcr扩增曲线图。图11为对比例1中的实验组c检测阳性样本的荧光定量pcr扩增曲线图。图12为对比例1中的实验组c检测阴性样本的荧光定量pcr扩增曲线图。具体实施方式为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。实施例1以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。本实施例提供了一种用于检测肺癌相关基因甲基化的试剂盒，肺癌相关基因rassf1a，shox2和ptger4基因，试剂盒包括：引物探针混合液、热启动taqdna聚合酶、2×甲基化检测pcr缓冲液。其中，引物探针混合液包括：检测rassf1a，shox2和ptger4基因甲基化的引物探针组合与actb内参基因引物探针组合，各引物的浓度为1.25μm，各探针的浓度为0.5μm。各引物和探针的序列如下表1所示。表1表1中，rassf1a基因甲基化检测探针的5’端标记荧光报告基团fam，3’端标记有淬灭基团bhq1。shox2基因甲基化检测探针的5’端标记荧光报告基团vic，3’端标记有淬灭基团bhq1。ptger4基因甲基化检测探针的5’端标记荧光报告基团rox，3’端标记有淬灭基团bhq2。actb内参基因探针的5’端标记的荧光报告基团为cy5，3’端标记的淬灭基团为bhq2。试剂盒中，2×甲基化检测pcr缓冲液，其组分包括：30mmtris-hcl、100mmkcl、0.5mm(each)dntp、6mmmgcl2、4％甘油、2％dmso、50ng/μlbsa、0.2％tween-20、0.1％np-40、4mmtmac，ph8.0。各组分的作用如下：dmso：解除模板dna局部二级结构，增加引物与模板的特异性结合，使聚合酶更容易在二级结构处延伸。甘油：可降低模板溶解温度(tm)，提高产物产量。bsa：作为稳定剂，被用于限制酶或者修饰酶的保存溶液和反应液中，因为有些酶在低浓度下不稳定或活性低。加入bsa后，可以起到“保护”或“载体”作用，不少酶类添加bsa后能使其活性大幅度提高。对多数底物dna而言，bsa可使酶切更完全，并可实现重复切割。在37℃，酶切反应超过1h时，bsa可以使酶更加稳定，因为在不含bsa的反应缓冲液中，许多限制性内切酶在37℃下只能存活10-20min甚至更短。而bsa可以结合缓冲液或底物dna中抑制限制性内切酶活性的金属离子和其它化学物质。tween-20/np-40：作为非离子表面活性剂，可消除体系中有机溶剂或杂质对酶活力的影响，并确保体系整体的稳定。tmac(氯化四甲基铵)：减少模板二级结构，提高反应特异性并对聚合酶酶活无明显影响。采用本实施例提供的试剂盒检测rassf1a，shox2和ptger4基因甲基化方法，如下：(1)使用商业化试剂盒对人体来源样本(如血浆、肺泡灌洗液)提取dna。(2)使用商业化试剂盒将待测dna样本进行亚硫酸氢盐处理。(3)配置pcr反应液如下：2×甲基化检测pcr缓冲液：12.5μl；引物探针混合液：5μl；热启动taq酶(10u/μl)：0.5μl；转化dna溶液：5μl；无核酸酶水：2μl；共计：25μl。(4)配置好的pcr体系放入荧光定量pcr仪中，按以下条件进行反应：第一阶段：95℃10min；第二阶段：95℃15s，60℃30s，5个循环；第三阶段：95℃15s，60℃5s，57℃30s，40个循环；信号收集：第3阶段57℃时按表2进行信号收集：表2信号收集基因rassf1ashox2ptger4actb荧光信号famvicroxcy5(5)结果判读：(a)若actbct>30或无ct值，实验结果无效；(b)若actbct≤30，实验结果有效，按表3的标准进行判读：表3结果判读标准根据上述原则判定检测样本，若判定实验结果无效，需重新进行检测。使用阳性对照品(含rassf1a、shox2、ptger4甲基化阳性混合dna样本)与阴性对照(rassf1a、shox2、ptger4甲基化全部阴性的混合dna样本)进行检测，扩增曲线结果如图1(阳性对照品)与图2(阴性对照品)。ct值结果如下：表4对照品检测ct值结果ct值阳性对照品阴性对照品actb21.2522.14rassf1a24.23无ct值shox224.65无ct值ptger425.12无ct值实施例2肺泡灌洗液样本检测选取已知肺癌患者与良性肺病(肺炎、肺结核等)患者肺泡灌洗液样本各50例，取15ml肺泡灌洗液，1000×g离心5min收集细胞后，利用商业化试剂盒提取细胞dna，并利用本发明所提供检测方法对dna样本进行rassf1a、shox2与ptger4基因甲基化检测。肺癌患者与良性肺病患者的肺泡灌洗液样本检测结果如表5-6。根据以上检测数据可知，使用本发明试剂盒对肺泡灌洗液样本进行检测，肺癌检出的灵敏度84％，特异性为94％。表5肺癌患者肺泡灌洗液样本检测ct值表6良性肺病患者肺泡灌洗液样本检测ct值实施例3血浆样本检测选取已知肺癌患者与良性肺病(肺炎、肺结核等)患者血浆样本各50例，取4ml血浆利用商业化试剂盒提取血浆游离dna，并利用本发明所提供检测方法对dna样本进行rassf1a，shox2与ptger4基因甲基化检测。肺癌患者与良性肺病患者的肺泡灌洗液样本检测结果如表7-8。根据以上检测数据可知，使用本发明试剂盒对血浆样本进行检测，肺癌检出的灵敏度64％，特异性为96％。表7肺癌患者血浆样本检测ct值表8良性肺病患者血浆样本检测ct值实施例4最低检出限将带有转化后甲基化序列的rassf1a基因相应序列的质粒梯度稀释后，分别在本发明实施例1的pcr检测体系中加入拷贝数为103，102，10和1的质粒模板，并进行荧光定量pcr检测。结果显示，dna模板量低至1拷贝时，仍有明显扩增曲线(图3)。因此确定本发明实施例1所提供的试剂盒的对rassf1a甲基化的最低检出限为1拷贝。同样地，本发明实施例1试剂盒对shox2与ptger4甲基化的最低检出限为1拷贝(图4-5)。实施例5pcr扩增缓冲液检测效果对比选取已知rassf1a甲基化阳性与阴性dna样本各3例，分别使用本发明实施例1的试剂盒中的2×甲基化检测pcr缓冲液与普通pcr缓冲液(10×extaqbuffer，购自takara)进行检测(pcr缓冲液工作浓度均为1×，其他条件不变)，结果显示，使用本发明实施例1试剂盒检测有典型s型扩增曲线，荧光值高，扩增曲线拐点明显，便于进行结果判读；而使用普通pcr缓冲液检测结果无明显s型扩增曲线，结果如图6。同样地，本发明实施例1试剂盒中2×甲基化检测pcr缓冲液对shox2与ptger4甲基化有类似检测效果(图7-8)，典型s型扩增曲线，荧光值高，扩增曲线拐点明显，便于进行结果判读。对比例1分别针对3个基因rassf1a，shox2和ptger4设计3组不同的特异性引物和探针序列，具体如下表9所示，并按表中引物和探针进行随机组合，用于针对阳性和阴性质控品样本进行荧光pcr扩增检测。因随机组合的组数较多(39＝19683)，此处仅展示三种组合(见表10)的检测结果。各种组合的检测条件均相同，参考实施例1的检测方法进行。针对上述三种组合，进一步进行灵敏度验证，具体操作步骤参考实施例4。检测结果见图1-2和图9-12。表9各实验组的引物探针混合体系设置如下表10所示表10实验组rassf1ashox2ptger4actba1111b2221c3331通过对比三个实验组的检测结果，可明显看出实验组b针对阳性参考品可有效检测出相应结果(图9)，但对于阴性参考品而言，检测出rassf1a基因的扩增信号，易于被误判读为阳性(图10)，从而增大了实验结果产生假阳性的风险。同比实验组c，其针对阳性参考品虽可进行正确判读，但shox2和ptger4基因并未显现有效扩增信号，从而大大降低了检测结果的说服力(图11)；其针对阴性参考品也同样检测出rassf1a基因的扩增信号，易于被误判读为阳性(图12)。然而实验组a采用的引物和探针组(即实施例1提供的引物探针序列)可有效检测阳性和阴性参考品，并能直观有效判读(图1和图2)，从而有效地提高了检测特异性，增强了本发明试剂盒整体的检测准确性及结果说服力，该结果也充分说明，不同序列的引物探针组其检测结果是不可预期的。以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。sequencelisting<110>益善生物技术股份有限公司<120>用于检测肺癌相关基因甲基化的核酸组合物、试剂盒和检测方法<160>12<170>patentinversion3.5<210>1<211>19<212>dna<213>人工序列<400>1ggttcgttttgtggtttcg19<210>2<211>19<212>dna<213>人工序列<400>2gattaaacccgtacttcgc19<210>3<211>24<212>dna<213>人工序列<400>3tcggttcgcgtttgttagcgttta24<210>4<211>21<212>dna<213>人工序列<400>4agttaggtaattttcgtttcg21<210>5<211>2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