具有血栓溶解活性的多肽的制作方法

本发明为分案申请，原案申请号为201710740956.9，原案申请日为2017年8月25日，原案发明名称为：具有血栓溶解活性的多肽。本发明属于生物医药领域，具体涉及具有血栓溶解活性的多肽。
背景技术：
：随着人类生活水平的不断提高，冠心病等心脑血管发病率逐年增高，目前心脑血管疾病在疾病死亡原因中高居榜首。特别是脑血栓在中老年人群中急性血栓性疾病的发病率、致残率和死亡率的特点，目前研究发现，脑血栓等心脑血管疾病具有年青化的趋势，已严重威胁着人类的健康。血栓形成是心脑血管疾病发病的罪魁，它是指在一定条件下，血液有形成分在血管内(多数为小血管)形成栓子，造成血管部分或完全堵塞、相应部位血供障碍的病理过程。抗凝治疗和溶栓治疗做为目前缺血性心脑血管疾病最有前途的治疗方法。传统的抗凝药物主要有两类，分别是阻滞剂和肝素。肝素的生物利用度、半衰期和抗凝效果因人而异，术后出血风险较高。阻滞剂类目前常用的直接凝血酶抑制剂有水蛭素和重组水蛭素，半衰期短，为0.5-1小时，主要由肾脏清除，因此肾功能不全的患者慎用。并且这两种药物安全剂量范围狭窄，必须进行实验室监测。并且，目前临床上使用的溶栓药物，剂量过大可以导致致死性出血并发症，而剂量过小会影响溶栓治疗效果等特点，而使其应用受到很大限制，因此需要不断研发新的抗凝药物。多肽药物研究方兴未艾，多肽药物主要针对体内通路上的关键蛋白做靶标结合来改变蛋白结构治疗疾病。多肽阵列技术平台是先进的高通量筛选多肽药物的平台。本发明制备的具有血栓溶解活性的多肽可以开发成新型具有溶栓活性的多肽药物。技术实现要素：针对上述溶栓药物的缺陷，本发明提供一组具有溶栓活性的多肽。根据本发明的一个方面，本发明提供一种具有溶栓活性的多肽，其氨基酸序列为：ile-thr-met-ala-x1-x2，其中，x1选自ala、ile、asp；x2选自gln、lys、ser。优选的，所述多肽氨基酸序列如seqidno：1、seqidno：2或seqidno：3所示，具体为：ile-thr-met-ala-ala-gln、ile-thr-met-ala-ile-lys或ile-thr-met-ala-asp-ser。根据本发明的另一个方面，本发明提供一种具有溶栓活性的多肽，其氨基酸序列为：glu-asp-ser-arg-x3-x4，其中，x3选自gln、ile、tyr；x4选自his、thr、gln。优选的，所述多肽氨基酸序列如seqidno：4、seqidno：5或seqidno：6所示，具体为glu-asp-ser-arg-gln-his、glu-asp-ser-arg-ile-thr或glu-asp-ser-arg-tyr-gln。根据本发明的另一个方面，本发明提供所述多肽在制备治疗和/或预防血栓的药物中的应用。根据本发明的另一个方面，本发明提供一种药物组合物，该药物组合物包括活性成分多肽和药学上可接受的载体。所述药物组合物包括但不限于注射剂、片剂、颗粒剂、胶囊剂、口服液、丸剂等。所述药学上可接受的载体包括药学领域常规的稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体、润滑剂等，必要时还可以加入香味剂、甜味剂等。本发明所述多肽作为活性成分时应为“有效量”的，所述“有效量”是指无毒性，但足够量的提供所需的作用的药物或药剂。在本发明的药物组合物中，一种成分的“有效量”是指该成分在和其他成分联合应用时有效提供所需效应的量。“有效量”会因受试者的不同而不同，依据年龄和个体的一般情况，特定的活性药物等等。因此，不可能总是指精确的“有效量”，然而，任何个体病例中合适的“有效量”可以由本领域普通技术人员应用常规的实验方法来测定。本发明所述多肽可以采用本领域技术人员已知的方法(例如固相合成方法)制备得到，以及可以采用本领域已知的分离纯化方法(例如高效液相色谱法)分离纯化。本发明研究结果显示六种多肽均能明显延长大鼠颈动脉血栓形成的时间，且能够明显的缩短大鼠体外血栓的长度，减轻血栓的重量，表明多肽具有良好的血栓溶解活性，可以用于制备用于血栓溶解的药物。附图说明图1为筛选用多肽芯片合成完的图像；图2为多肽体外溶栓实验曲线；图3为多肽pep1的hplc图谱；图4为多肽pep2的hplc图谱；图5为多肽pep3的hplc图谱；图6为多肽pep4的hplc图谱；图7为多肽pep5的hplc图谱；图8为多肽pep6的hplc图谱；图9为多肽pep1的ms图谱；图10为多肽pep2的ms图谱；图11为多肽pep3的ms图谱；图12为多肽pep4的ms图谱；图13为多肽pep5的ms图谱；图14为多肽pep6的ms图谱。具体实施方式下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外，应理解，在阅读了本发明所记载的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本发明所限定的范围。实施例1溶栓活性多肽的筛选1、设计筛选数据库1)建立随机初级六肽数据库全库：x-x-x-x-x-x。其中x是fmoc保护的d-gly、d-ala、d-val、d-leu、d-ile、d-phe、d-pro、d-tyr、d-ser、d-thr、d-trp、d-met、d-glu、d-gln、d-asp、d-asn、d-lys、d-arg、d-his等摩尔量混合物。2)建立二级六肽随机数据库：ile-thr-x-x-x-x和glu-asp-x-x-x-x。其中x是fmoc保护的d-gly、d-ala、d-val、d-leu、d-ile、d-phe、d-pro、d-tyr、d-ser、d-thr、d-trp、d-met、d-glu、d-gln、d-asp、d-asn、d-lys、d-arg、d-his等摩尔量混合物。3)建立三级六肽随机数据库：ile-thr-met-ala-x-x-x-x和glu-asp-ser-arg-x-x-x-x。其中x是fmoc保护的d-gly、d-ala、d-val、d-leu、d-ile、d-phe、d-pro、d-tyr、d-ser、d-thr、d-trp、d-met、d-glu、d-gln、d-asp、d-asn、d-lys、d-arg、d-his等摩尔量混合物。4)根据1)、2)、3)建立的多肽组合数据库。利用多肽阵列合成仪，使用特殊处理的纤维素膜最为基质，合成多肽芯片多肽芯片基质为fmoc-peg-纤维素膜，多肽芯片大小是15cm*11cm，每张芯片承载198个多肽点，一组芯片361个多肽点需要两张芯片。采用原位合成，逐层合成来实现。合成参数为每个肽点氨基酸上样量为0.6ul，肽点直径为0.5cm，肽点间距为0.1cm，氨基酸浓度为0.25m，肽点合成重复一次。合成的筛选芯片如图1所示。上述步骤1)-4)合成的多肽芯片用于具有溶栓活性多肽的筛查。2、活性筛查1)对芯片上每一个多肽复合物进行血栓溶解活性筛选，测试采取的测定方法是：将合成完的芯片用饱和氨气室温处理12h，然后将合成在芯片上的361个多肽用打孔器打下置于1.5mlep管底部，每管加入30ul，ph值为8.0的50mm的trisbuffer室温溶解2小时取液体20ul用于血栓溶解活性筛选测试。2)配制1m的cacl2、50mm的trisbuffer、浓度1mg/ml的羧肽酶抑制肽溶液、阳性对照肽cpi-2ki、thrombomodulin、trombin/cacl2mixture：860ultrisbuffer+100ulcacl2溶液+40ulddtris溶解trombin、130μg/ml的tpa、上述筛查得到的具有血栓溶解活性的多肽各1mg/ml用于体外血栓溶解测定实验。3)取96孔板上用于实验，按下表从上到下加试剂：取对板孔应量(如上表)的plasma用前37摄氏度预热5min，然后加入对应量的tpa，再加入体系。即时开始测定420nm的od值：前5min，每分钟测定1次，后续开始测定每5min测定1次共测定2h。根据测定数据绘制折线图。找出具有明显溶栓活性的多肽组(对应芯片上的一个多肽点，可能是多种多肽的混合物)筛选出的一组具有明显血栓溶解活性的多肽，ile-thr-met-ala-ala-gln、ile-thr-met-ala-ile-lys、ile-thr-met-ala-asp-ser、glu-asp-ser-arg-gln-his、glu-asp-ser-arg-ile-thr、glu-asp-ser-arg-tyr-gln其筛选结果，具有溶栓活性多肽数据曲线见图2(注：pep1代表ile-thr-met-ala-ala-gln；pep2代表ile-thr-met-ala-ile-lys；pep3代表ile-thr-met-ala-asp-ser；pep4代表glu-asp-ser-arg-gln-his；pep5代表glu-asp-ser-arg-ile-thr；pep6代表glu-asp-ser-arg-tyr-gln)。实施例2多肽的合成与纯化合成采用固相合成法从c-端到n-端合成多肽。合成采用化学合成仪(ams586multiplepeptidesynthesiser，abimed，germany)合成，用fmoc保护的氨基酸作为原料，以fmoc-rinklinkerresin树脂为附着基质，用hobt作为缩合剂，dic作为激活剂，逐层合成多肽。合成过程中用2％乙酸酐的dmf溶液做侧链封闭试剂；用20％哌啶做fmoc去除试剂，合成完毕经过tfa切割和侧链基团的去除操作。合成完毕的粗产物经离心收集，用r-hplc(waters741)和c18-column(watersdelta-paktm，40*100mm，15um，100埃)纯化得到纯度大于98％的多肽，冻干成粉末。多肽ile-thr-met-ala-ala-gln(pep1)、ile-thr-met-ala-ile-lys(pep2)、ile-thr-met-ala-asp-ser(pep3)、glu-asp-ser-arg-gln-his(pep4)、glu-asp-ser-arg-ile-thr(pep5)、glu-asp-ser-arg-tyr-gln(pep6)其hplc图谱见图3-8(色谱条件见表1)，ms图谱见图9-14。表1多肽hplc色谱条件hplc图谱显示各多肽分别有一个特征峰组成；ms分析多肽的分子量见表2。表2多肽分子量理论mr/g/molms测定mr/g/molile-thr-met-ala-ala-gln633.77634.05ile-thr-met-ala-ile-lys675.89676.10ile-thr-met-ala-asp-ser636.72637.00glu-asp-ser-arg-gln-his770.76770.90glu-asp-ser-arg-ile-thr719.76720.00glu-asp-ser-arg-tyr-gln783.76783.90实施例3多肽溶栓活性的动物实验1体内血栓溶解实验实验方法：选择wistar大鼠200只，随机分成20组，每组10只，分别为空白对照组、阳性对照组、给药低、中、高剂量组(实验多肽样本分别是0.25、0.5、1.0mg/kg)，阳性药组给药尿激酶3000u/kg，对照组给同体积生理盐水。各组静脉给药45分钟后，腹腔注射3％戊巴比妥钠(1ml/kg)麻醉，电刺激损伤大鼠颈动脉以形成血栓，用血栓测定仪观察血栓形成时间。实验结果见表3。表3体内血栓溶解实验结果※p＜0.05实验组与对照组有统计学差异实验结果显示，给药低、中、高剂量组(实验多肽样本分别是0.25、0.5、1.0mg/kg)均能明显延长大鼠颈动脉血栓形成的时间，并且高剂量组抑制血栓形成的作用强于阳性对照药物尿激酶。表明实验多肽样本对电刺激大鼠颈动脉血栓形成具有明显抑制作用。2体外血栓溶解实验实验方法：选择wistar大鼠200只，随机分成20组，每组10只，分别为空白对照组、阳性对照组、给药低、中、高剂量组(实验多肽样本分别是0.25、0.5、1.0mg/kg)，阳性药组给药尿激酶3000u/kg，对照组给同体积生理盐水。静脉给药10分钟后，腹腔注射3％戊巴比妥钠(1ml/kg)麻醉，沿腹中线切开腹壁，腹主动脉取血约1.8ml，注入硅化塑胶管中，将塑胶管两端对接紧密，放入体外血栓形成仪中，37℃恒温15分钟，取出塑胶管中血栓置于滤纸上，吸净表面血迹，测血栓长度、湿重、干重，并记录。实验结果见表4。表4体外血栓溶解实验结果※代表和空白对照做比较p＜0.05，※※代表p＜0.01，※※※代表p＜0.001实验结果显示，低、中、高剂量组(实验多肽样本分别是0.25、0.5、1.0mg/kg)的多肽均能够明显的缩短大鼠体外血栓的长度，减轻血栓的重量，其中高剂量组(多肽样本量1.0mg/kg)作用优于阳性对照(尿激酶3000u/kg)。实施例5取pep1-pep6任意一种多肽10g，加入注射剂(包括冻干粉针剂和无菌分装干粉针剂)适当辅料，按注射剂(包括冻干粉针剂和无菌分装干粉针剂)工艺制备成溶栓注射剂。实施例6取pep1-pep6任意一种多肽10g，加入片剂(包括缓控释片、骨架片、包衣片、分散片等)适当辅料，按片剂(包括缓控释片、骨架片、包衣片、分散片等)工艺制备成溶栓片剂。实施例7取pep1-pep6任意一种多肽10g，加入胶囊剂适当辅料，按胶囊剂工艺制备成溶栓胶囊剂。实施例8取pep1-pep6任意一种多肽10g，加入乳剂(包括微乳、纳米乳等)适当辅料，按乳剂(包括微乳、纳米乳等)工艺制备成溶栓乳剂。实施例9取pep1-pep6任意一种多肽10g，加入颗粒剂适当辅料，按颗粒剂工艺制备成溶栓颗粒剂。实施例10取pep1-pep6任意一种多肽10g，加入缓释控释剂适当辅料，按缓释控释剂工艺制成溶栓缓释控释剂。实施例11取pep1-pep6任意一种多肽10g，加入口服液适当辅料，按口服液工艺制备成溶栓口服液。实施例12取pep1-pep6任意一种多肽10g，加入脂质体剂型适当辅料，按脂质体工艺制备成溶栓脂质体剂型。序列表<110>北京博肽聚康生物技术有限公司<120>具有血栓溶解活性的多肽<160>6<170>patentinversion3.3<210>1<211>6<212>prt<213>人工序列<400>1ilethrmetalaalagln6<210>2<211>6<212>prt<213>人工序列<400>2ilethrmetalailelys6<210>3<211>6<212>prt<213>人工序列<400>3ilethrmetalaaspser6<210>4<211>6<212>prt<213>人工序列<400>4gluaspserargglnhis6<210>5<211>6<212>prt<213>人工序列<400>5gluaspserargilethr6<210>6<211>6<212>prt<213>人工序列<400>6gluaspserargtyrgln6当前第1页1 2 3