一种具有抑制碳钢腐蚀并降解原油的菌株及其筛选培养方法和应用与流程

本发明属于化学技术领域，具体属于原油采出液处理工程技术领域，具体地说，涉及一种具有抑制碳钢腐蚀并降解原油的菌株及其筛选培养方法。

背景技术：

钢是石油和天然气行业中使用最广泛的管道材料之一。碳钢管道的内部腐蚀是造成损失的主要问题。在工业环境中，最熟悉的金属转换是钢铁生锈，在这个过程中微生物起着重要的作用。微生物影响的腐蚀(mic)可能是一个严重的工业问题，并且影响到从铸铁管道和下水道中的水分配到钢管道中等各种过程。

现阶段的油田防腐技术主要是加杀菌剂、加缓蚀剂、使用耐腐蚀材料、电化学防腐等。虽然在一定程度上能抑制腐蚀的发生，但不能同时兼顾防腐、环境友好和成本问题，不是理想的防腐技术。自从1987年iverson首先发现了细菌可以抑制淡水以及海水中铜的腐蚀，微生物抑制腐蚀领域逐步发展。san.n.o等人对pseudomonasaeruginosa在镍锌、镍铜合金表面形成的生物膜的腐蚀抑制作用进行了研究。本发明通过失重法、sem、xrd、ftir研究了同为假单胞菌菌属的荧光假单胞菌对碳钢的抑制腐蚀能力及降解原油能力，为微生物抑制金属腐蚀提供更多依据。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服现有技术中存在的缺陷，提供一种具有抑制碳钢腐蚀并降解原油的菌株及其筛选培养方法和应用。

其具体技术方案为：

一种具有抑制碳钢腐蚀并降解原油的菌株，所述菌株命名为荧光假单胞菌(pseudomonasfluorescens)fsyz01，该菌株，已于2018年12月24日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctccno：m2018924。保藏地址为：中国武汉，武汉大学。

进一步，所述菌株的核苷酸序列如seq:id:no:1所示。

本发明所述具有抑制碳钢腐蚀并降解原油的菌株的筛选培养方法，包括以下步骤：

(1)菌种来源：将原油采出液与原油泥搅拌均匀，将原油泥中的细菌同采出水中的细菌混合，在超净工作台稀释10000倍。

(2)筛选方法：失重法、tafel曲线法。

一种具有抑制碳钢腐蚀并降解原油的菌株的培养方法，包括以下步骤：

(1)lb培养基的制备：取5g氯化钠、5g胰蛋白胨、2.5g酵母浸粉，500ml蒸馏水搅拌均匀后分装至5个250ml锥形瓶中，每个锥形瓶倒100ml培养液。

(2)灭菌：将所有锥形瓶用纱布包好封口，置于高压灭菌锅中灭菌20min。

(3)菌种活化：将荧光假单胞菌在超净工作台上接种至1个锥形瓶中，在30℃130rpm/min下于摇床中培养2天。

(4)接种：将活化好的细菌按2％的浓度比用灭菌的移液管在超净工作台上接种至其它的锥形瓶中。

本发明具有抑制碳钢腐蚀并降解原油的菌株在原油降解过程中的应用。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

(1)本发明具有缓蚀效果好、阻垢效果良好，且成本较低的优点。经挂膜实验，在接有荧光假单胞菌的系统中，置于摇床中30℃116r/min下运行13天，碳钢腐蚀速率为0.1225(g/m²·h)，而未接菌的碳钢腐蚀速率为0.4281(g/m²·h)。

(2)经过5天培养，接菌的原油降解效率达61.07％。

(3)本发明的菌剂营养要求简单、易培养能够进行大规模生产。

附图说明

图1分子进化树

图2失重法测定质量差；

图3塔菲尔(tafel)曲线法测定腐蚀速率；

图4荧光假单胞菌的扫描电镜图(3000倍)；

图5荧光假单胞菌的扫描电子显微镜图(5000倍)；

图6把接有荧光假单胞菌的碳钢放入lb培养基中，腐蚀7后的扫描电镜图；

图7把接有荧光假单胞菌的碳钢放入lb培养基中，腐蚀13天后的扫描电镜图；

图8把未接荧光假单胞菌的碳钢放入lb培养基中，腐蚀7天后的扫描电镜图；

图9把未接荧光假单胞菌的碳钢放入lb培养基中，腐蚀13天后的扫描电镜图；

图10把接有/未接荧光假单胞菌的碳钢放入lb培养基中的腐蚀速率图；

图11把未接荧光假单胞菌的碳钢放入lb培养基中，腐蚀7后和13天后的x射线衍射图；

图12把接有荧光假单胞菌的碳钢放入lb培养基中，腐蚀7后和13天后的x射线衍射图；

图13把未接荧光假单胞菌的碳钢放入lb培养基中，腐蚀7后和13天后的红外图；

图14把接有荧光假单胞菌的碳钢放入lb培养基中，腐蚀7后和13天后的红外图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明的技术方案作进一步详细地说明。

1材料

1.1仪器

离心机(tgl-16m超速冷冻离心机)；人工智能箱式电阻炉(sgmm25/12a)；sem扫描电子显微镜(s-570)；xrd衍射仪(d/max-3c)；傅里叶红外光谱仪(布鲁克tensor27)

1.2样片

25#钢(江苏省扬州市祥玮机械有限公司)：含碳0.22％～0.29％，含锰0.50％～0.80％，含硅0.17％～0.37％，含铬不大于0.25％，含镍不大于0.30％，试片表面积为28cm²。

1.3试剂

戊二醛(天津市瑞金特化学品有限公司)；酵母浸粉(北京奥博星生物技术有限责任公司)；氯化钠(天津市科密化学试剂有限公司)；氯化钾(天津市致远化学试剂有限公司)；胰蛋白胨(北京奥博星生物技术有限责任公司)；硼酸(天津博迪化工股份有限公司)；磷酸氢二钠(天津市致远化学试剂有限公司)；磷酸二氢钾(天津市致远化学试剂有限公司)；无水乙醇(天津永晟精细化工有限公司)。

2方法与结果

2.1筛选细菌

2.1.1菌源接种

用涂布平板法将菌源涂布于固体培养基表面，分别设置平行，放入培养箱(25℃)中培养72h。

2.1.2分离单菌落：

用平板划线分离法对平板表面做多次划线、分区、稀释，获得单菌落。

2.2样片预处理

用干净的镊子夹着脱脂棉使用无水乙醇对碳钢进行除油除灰，清洗结束后放入105℃的烘箱4h至恒重，最后将样片放置于干燥皿中备用。实验前和实验结束后将干燥的碳钢样片用分析天平称量其质量，每次测量三次取平均值。

2.3失重法

如图2所示，将碳钢样片放入接有细菌的锥形瓶中，样片完全浸没在液体培养基内。将其置于摇床中设定温度30℃，转速为116r/min培养4日，培养结束后将样片上的挂膜用有机溶剂清洗，清洗后置于105℃烘箱内4h，实验前和实验结束后将干燥的试片用分析天平称量其质量，每次测量三次取平均值。

2.4tafel曲线法

如图3所示，tafel曲线法是一种电化学测试曲线，主要是通过给样品外加不同的偏压，测试在加偏压条件下试样表面所产生的电流，给出电位-电流曲线，从而计算样品的腐蚀电流和腐蚀速率。

以钢片对应培养液为电解质溶液，用电化学分析仪测定钢片的电流-电位曲线(logi-u曲线，初始电位和终止电位根据钢片实际情况而定，一般为初始电位-0.4v，终止电位-1.0v；扫描速度为0.005v/s；灵敏度为1.0e-001a/v)，获得如下曲线；并直接用其对应软件分析处理数据，计算每块钢片的腐蚀电流和腐蚀速率。

2.5基因测序

将12小时活菌送至北京三博远志生物技术有限责任公司测dna序列，鉴定结果为荧光假单胞菌(pseudomonasfluorescens)

>引物27f测序序列：

cacatgcagtcgagcggcagcacgggtacttgtacctggtggcgagcggcggacgggtgagtaatgcctaggaatctgcctagtagtgggggataacgtccggaaacgggcgctaataccgcatacgtcctacgggagaaagtgggggatcttcggacctcacgctattagatgagcctaggtcggattagctagttggtgaggtaatggctcaccaaggcgacgatccgtaactggtctgagaggatgatcagtcacactggaactgagacacggtccagactcctacgggaggcagcagtggggaatattggacaatgggcgaaagcctgatccagccatgccgcgtgtgtgaagaaggtcttcggattgtaaagcactttaagttgggaggaagggcagttacctaatacgtgattgttttgacgttaccgacagaataagcaccggctaactctgtgccagcagccgcggtaatacagagggtgcaagcgttaatcggaattactgggcgtaaagcgcgcgtaggtggtttgttaagttggatgtgaaagccccgggctcaacctgggaactgcatccaaaactggcaagctagagtatggtagagggtggtggaatttcctgtgtagcggtgaaatgcgtagatataggaaggaacaccagtggcgaaggcgaccacctggactgatactgacactgaggtgcgaaaagcgtggggagcaaacaggattagatacccttagtagtccacgccgtaaaacgatg。

表1鉴定结果

备注：

1、此菌株为16srdna部分序列鉴定，比对所用序列为细菌16s序列的前半段(1-700bp)；若有必要，

建议做16srdna全部序列鉴定。

2、此结论仅作为科研检测结果，不具备法律效力。如对鉴定结果有异议，请于两周内提出，重新检测。

用mega4构建分子进化树，采用neighbor.joining法的completedeletion模式建树如图1所示，用bootstrap进行检验，并重复1000次。

2.1sem

2.1.1菌株形貌

取培养3天的菌液40ml于离心管中，在8000rpm下离心10分钟，倒掉上清液。用2％的戊二醛浸泡24h后，在8000rpm下离心10分钟，倒掉上清液。用pbs缓冲液浸泡4h，在8000rpm下离心10分钟，倒掉上清液。用2％的硼酸在100rpm下浸泡1h后，在8000rpm下离心10分钟，倒掉上清液。用30％、50％、70％、90％的乙醇分别浸泡15分钟后，在8000rpm下离心10分钟，倒掉上清液。最后，用无水乙醇浸泡30分钟，在8000rpm下离心10分钟，倒掉上清液，并重复一次此步骤。细胞固定完毕后用sem观察菌株形态。

2.1.2碳钢表明腐蚀形貌

将碳钢放入105℃的烘箱中4h后刮下腐蚀产物待用。用有机溶剂清洗碳钢样片表面，洗净后将碳钢置于105℃的烘箱内4h进行干燥，干燥结束后冷却至室温，用sem观察碳钢样片表面形态。

图4、图5表明，接有细菌的样片沿着样片的车线方向发生腐蚀，且以点蚀为主。未接菌的样片腐蚀情况明显，在整个样片表面出现了深浅不一的腐蚀坑。结合图6-图10，未接菌的样片，腐蚀速率先下降后上升；接有细菌的样片腐蚀速率持续降低。未接菌的样片腐蚀速率下降是由样片表面形成均匀的腐蚀产物导致的；接有细菌的样片腐蚀速率下降是由致密的生物膜导致的。从7天到13天，未接菌的样片表现出很高的腐蚀速率，接菌的却恰好相反。一方面，腐蚀产物并不像生物膜一样致密；另一方面，接菌的样片细菌数量足够多，生物膜的保护作用更加明显。

2.2xrd

取约1g腐蚀产物于马弗炉中，在通入氮气的情况下于600℃煅烧2h，冷却至室温后用于x-射线衍射实验。

图11-图12显示了α-fe2o3的特征峰，fe2o3是一种典型的iob腐蚀产物。与接有细菌的样片相比，未接菌样片的最强峰位置发生改变，这归因于晶格常数、晶面间距和晶胞体积等发生变化。这表明接有细菌的样片有良好的保护作用，晶格常数等未发生改变。

2.3ftir

取约0.01g腐蚀产物，用kbr压片法进行傅里叶红外光谱实验。

图13和图14中，波数为3378cm^-1和3359cm^-1的伸缩振动峰是o-h伸缩振动峰。波数在2958cm^-1～2927cm^-1之间的两个伸缩振动峰，分别是ch3和ch2不对称伸缩振动峰。波数为1643cm^-1和1639cm^-1的伸缩振动峰是酰胺c＝o伸缩振动峰。波数为1558cm^-1～1403cm^-1的伸缩振动峰，分别代表氨基酸coo^-不对称和对称伸缩振动峰。波数为1108cm^-1～1105cm^-1的伸缩振动峰是糖类c-oh伸缩振动峰。波数为690cm^-1的伸缩振动峰是c-h弯曲伸缩振动峰。此外，波数为780cm^-1、584cm^-1和472cm^-1处分别出现α-feooh、fe3o4和fe-o伸缩振动峰，它们都是fe2o3的前体物质。

(1)吸收频率的变化表明荧光假单胞菌通过酰胺c＝o、氨基酸coo^-和糖类c-oh基团牢固地吸附在金属表面。

(2)在1400cm^-1左右的coo^-谱带和在3300cm^-1左右的o-h谱带的拓宽，表明荧光假单胞菌与金属表面形成配位键。

(3)伸缩振动峰发生改变，表明荧光假单胞菌牢固吸附在碳钢样片表面。随着腐蚀时间的增长，脂肪类c-h官能团峰值未发生漂移或消失，表明它并未参与离子结合过程或起的作用非常小。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，本发明的保护范围不限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，可显而易见地得到技术方案的简单变化或等效替换均落入本发明的保护范围内。

序列表

<110>西北大学

<120>一种具有抑制碳钢腐蚀并降解原油的菌株及其筛选培养方法和应用

<160>1

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>768

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

cacatgcagtcgagcggcagcacgggtacttgtacctggtggcgagcggcggacgggtga60

gtaatgcctaggaatctgcctagtagtgggggataacgtccggaaacgggcgctaatacc120

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