一种棉花细胞质雄性不育恢复基因的分子标记及其应用的制作方法

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种棉花细胞质雄性不育恢复基因的分子标记；还涉及该分子标记的应用。

背景技术：

棉花(gossypiumspp.)作为重要的经济作物,不仅为纺织工业提供天然纤维，也是重要的食用油来源，因此提高棉花的产量和纤维品质尤为重要。杂种优势的利用在提高棉花产量、改进品质、提高抗性等方面发挥着重要作用。如中国农业科学院生物技术研究所等培育的棉花杂交种“银棉2号”和“银棉8号”等，不仅使棉花产量增产20%以上，还极大改善了纤维品质。

棉花杂交种制种中的“三系”是指：细胞质雄性不育系、保持系和恢复系。细胞质雄性不育系含有不育细胞质和核不育基因，但缺乏核恢复基因（wuetal.,2007）。保持系有正常可育的细胞质，但是核基因组却和细胞质雄性不育系一样，在生产中，细胞质雄性不育系作为母本，保持系作为父本为细胞质雄性不育系繁殖后代。恢复系含有恢复基因，其作为父本与细胞质雄性不育系杂交生产杂交种。但是由于恢复系存在恢复力不强等缺陷，使得棉花细胞质雄性不育（cytoplasmicmalesterility，cms）的应用受到极大的限制。因此，育种家长期围绕强恢复力的优良恢复系选育和改良开展相关研究。

含哈克尼西棉细胞质雄性不育胞质(cms-d2)的陆地棉不育系和含有恢复基因的恢复系是棉花杂种优势利用中主要的三系配套系统之一。目前，棉花杂交种(以哈克尼西棉细胞质雄性不育三系材料为主)的育种已经取得了一定进展，但由于棉花中恢复基因来源狭窄及恢复能力限制，且恢复基因的克隆和育性恢复的相关机理尚不清楚，使得优良恢复系亲本资源匮乏，造成强优势三系杂交组合的选育过程较为缓慢。因此，在三系杂交棉选育过程中，强恢复力的优良恢复系的选育和改良是育种工作中长期面临的重点和难点。

有些研究认为哈克尼西棉cms育性恢复受一个部分显性基因控制，并受到一些基因的修饰作用（weaverjb,1977;sheetzandweaver,1980）。还有研究表明，哈克尼西棉cms育性恢复至少受三对显性基因rf调控（silvaetal.,1981），还有人认为哈克尼西棉cms育性恢复仅受一对基因rf控制（kohelrj,1984）。因此，目前对哈克尼西棉cms育性恢复的遗传机理仍未有定论；zhang等人在研究三裂棉cms的育性恢复中发现，其雄性不育特性既能被三裂棉恢复系的恢复基因rf2所恢复，又能被来自哈克尼西棉恢复系的恢复基因rf1所恢复，但恢复基因rf2不能恢复哈克尼西棉cms-d2-2的育性，且遗传分析表明，rf1与rf2紧密连锁、相距仅0.93cm（zhangjf,2001）。目前所用恢复基因的分子标记有：6个与rf1紧密连锁的est-ssr标记(nau2650、nau2924、nau3205、nau3652、nau3938和nau4040)表现为共分离,均与rf1基因相距0.327cm，其中nau3205为显性标记,其它5个都是共显性标记（《南京农业大学》，杨路明，2009）；分别与rf1、rf连锁的ssr标记bnl3535、cm042(西北植物学报，2007,27（10）：1937-1942)；位于rf两侧的bnl632、cir222标记，两标记相距6.7cm,(新疆农业科学2013,50（6）：1003-1007)等。

对恢复系的选育主要采用回交改良方法，对转育后代需要通过测交试验和田间表型观察来确定育性，不仅育种周期长，且田间表型观察易受环境影响，耗时费力、效率低，而引用分子标记辅助育种可以解决这一问题。利用分子标记辅助育种技术可以直接在分子水平上鉴定恢复基因，可在苗期进行早期鉴定，不受发育阶段和外界环境的影响，无需通过测交鉴定后代表型，极大地缩短了育种周期。因此，通过与恢复基因紧密连锁的分子标记在早期进行辅助选择，可以对恢复基因进行稳定可靠而又快速的鉴定和筛选。

在恢复系选育中常用的分子标记有indel、caps、rflp、rapd、ssr、aflp、sts等。但indel(插入缺失：insertion-deletion，简写为indel)分子标记以其操作简单、扩增产物易于检测等优点，近年来在分子标记辅助育种中得到广泛应用。indel标记具备共显性、位点特异性、扩增产物稳定和易于检测等优点。与已报道的恢复基因相关的ssr和caps标记等相比，该技术只需通过简单的琼脂糖凝胶电泳检测，不需要通过聚丙烯酰胺凝胶电泳(page)和银染等繁琐且具有污染的技术进行检测，而且也不需要像caps标记进行限制性内切酶酶切，从而节约了检测成本。

前人研究中多是利用非恢复系的棉花基因组为数据参考序列。因棉花基因组庞大且恢复区段序列高度重复、结构复杂，目前已发表的棉花基因组数据中在棉花恢复区段未获得高质量的组装序列，并且存在缺失。因此，到目前为止，已报道的分子标记与主效恢复基因遗传距离仍相对较远。

技术实现要素：

为了克服现有技术的不足，针对哈克尼西棉细胞质雄性不育恢复系选育中存在的问题，本发明目的在于提供一种与主效恢复基因遗传距离更近的分子标记。

本发明提供一种棉花细胞质雄性不育恢复基因的分子标记，所述分子标记为rfm1、rfm2或rfm3之1～3种；其中：

所述rfm1的片段长度为184bp，其核苷酸序列如seqidno：1所示；

所述rfm2的片段长度为154bp，其核苷酸序列如seqidno：2所示；

所述rfm3的片段长度为521bp，其核苷酸序列如seqidno：3所示。

本发明还提供了上述分子标记在棉花细胞质雄性不育恢复系鉴定上的应用。

本发明还提供了用于扩增上述分子标记的引物对，其中所述用于扩增上述分子标记rfm1的引物对为：

rfm1-f:5^’-aggttggtttgctatgaataggt-3^’（seqidno：4），

rfm1-r：5^’-catcacttgcaatgtgaatcagt-3^’（seqidno：5）；

所述用于扩增上述分子标记rfm2的引物对为：

rfm2-f：5^’-cacttaaggttggtttgctatga-3^’（seqidno：6），

rfm2-r：5^’-tgcacagtgataaaagattgtgg-3^’（seqidno：7）；

所述用于扩增上述分子标记rfm3的引物对为：

rfm3-f：5^’-attagcctgaacgcgtggaa-3^’（seqidno：8），

rfm3-r：5^’-ggttgagggacgattcagca-3^’（seqidno：9）。

本发明还提供了上述引物对在棉花细胞质雄性不育恢复系鉴定上的应用。

本发明还提供了利用上述分子标记鉴定和筛选棉花细胞质雄性不育恢复基因的方法，包括如下步骤：利用特异性引物对对待测棉花材料的总dna进行pcr扩增，然后对所得扩增产物进行琼脂糖电泳凝胶检测，再根据所得扩增产物大小进行判断：

（1）当特异性引物对为rfm1-f和rfm1-r时，如果电泳条带出现184bp特异性条带，则该待测棉花样品含有恢复基因；其中所述的rfm1-f由seqidno：4所示的核苷酸序列组成；所述的rfm1-r由seqidno：5所示的核苷酸序列组成；

（2）当特异性引物对为rfm2-f和rfm2-r时，如果电泳条带出现154bp特异性条带，则该待测棉花样品含有恢复基因；其中所述的rfm2-f由seqidno：6所示的核苷酸序列组成；所述的rfm2-r由seqidno：7所示的核苷酸序列组成；

（3）当特异性引物对为rfm3-f和rfm3-r时，如果电泳条带出现521bp特异性条带，则该待测棉花样品含有恢复基因；其中所述的rfm3-f由seqidno：8所示的核苷酸序列组成；所述的rfm3-r由seqidno：9所示的核苷酸序列组成；

上述（1）、（2）或（3）相互独立检测，只要扩增产物中含有（1）、（2）或（3）中任一所述特异性条带，则该待测棉花材料含有恢复基因；如果扩增产物中没有检测到上述（1）、（2）或（3）中任一所述的特异性条带，则该待测棉花材料不含恢复基因。

进一步地，所述pcr扩增的反应体系为：正向引物（10um）1ul，反向引物（10um）1ul，2xtaqpcrstarmixwithloadingdye10ul，超纯水7ul，模板dna（50ng/ul）1ul，反应体系总体积为20μl。

进一步，所述pcr扩增的反应程序为：94℃预变性3min；94℃预变性30s，55℃退火30s；72℃延伸30s，72℃彻底延伸10min；35个循环。

进一步，所述扩增产物在2%琼脂糖凝胶、电压120v条件下电泳30min，在凝胶成像分析系统中记录结果。

本发明还提供了利用上述分子标记辅助选择棉花细胞质雄性不育恢复系的育种方法，包括在杂交或自交后代，以特异性引物对为引物、以待测棉花材料的dna为模板进行pcr扩增，对所得扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，根据扩增产物条带大小进行判定，保留含有恢复基因的棉花材料；淘汰不含恢复基因的棉花材料；其中：

（1）当以rfm1-f和rfm1-r为引物时，如果电泳条带出现184bp特异性条带，则该待测棉花材料含有恢复基因；其中所述的rfm1-f由seqidno：4所示的核苷酸序列组成；所述的rfm1-r由seqidno：5所示的核苷酸序列组成；

（2）当以rfm2-f和rfm2-r为引物时，如果电泳条带出现154bp特异性条带，则该待测棉花材料含有恢复基因；所述的rfm2-f由seqidno：6所示的核苷酸序列组成；所述的rfm2-r由seqidno：7所示的核苷酸序列组成；

（3）当以rfm3-f和rfm3-r为引物时，如果电泳条带出现521bp特异性条带，则该待测棉花材料含有恢复基因；所述的rfm3-f由seqidno：8所示的核苷酸序列组成；所述的rfm3-r由seqidno：9所示的核苷酸序列组成；

上述（1）、（2）或（3）相互独立检测，只要扩增产物中含有（1）、（2）或（3）中任一所述特异性条带，则该待测棉花材料含有恢复基因；如果扩增产物中没有检测到上述（1）、（2）或（3）中任一所述的特异性条带，则该待测棉花材料不含恢复基因。

本发明还提供了用于鉴定棉花细胞质雄性不育恢复基因的检测试剂盒，所述的检测试剂盒中含有上述引物对。

与现有技术相比，本发明的有益效果在于：（1）本发明所提供的3个分子标记与棉花恢复基因连锁紧密，利用该3个分子标记鉴定棉花恢复基因准确性高、可靠性强。（2）利用本发明分子标记在分子水平上对恢复基因进行鉴定，不受外在环境等因素的影响，并且本发明indel分子标记具有共显性好、稳定性好、重复性好的优点。（3）检测速度快。利用本发明分子标记可在苗期对棉花单株是否含有恢复基因进行大规模筛选鉴定，不需要进行测交试验等进行鉴定，大大缩短了育种周期。（4）简单实用。pcr扩增检测简单易操作，节约了大量的人力和物力。

附图说明

图1为用rfm1-f和rfm1-r为引物鉴定23种棉花材料的pcr扩增产物电泳图谱；其中依次为阴性对照，之后1为hair，2为y18，3为0-613-2r，4为尤r，5为13hn6-4-6，6为湘远r，7为三裂棉，8为雷蒙德式棉，9为tm-1，10为p30a，11为p53a，12为安d09a，13为湘s26a，14为中12，15为新海18，16为毛棉，17为中草1号，18为中亚1号，19为瑟伯氏，20为拟似棉，21为比麻棉，22为达尔文棉，23为黄褐棉。

图2为用rfm2-f和rfm2-r为引物鉴定23种棉花材料的pcr扩增产物电泳图谱；其中依次为阴性对照，之后1为hair，2为y18，3为0-613-2r，4为尤r，5为13hn6-4-6，6为湘远r，7为三裂棉，8为雷蒙德式棉，9为tm-1，10为p30a，11为p53a，12为安d09a，13为湘s26a，14为中12，15为新海18，16为毛棉，17为中草1号，18为中亚1号，19为瑟伯氏，20为拟似棉，21为比麻棉，22为达尔文棉，23为黄褐棉。

图3为用rfm3-f和rfm3-r为引物鉴定23种棉花材料的pcr扩增产物电泳图谱；其中依次为阴性对照，之后1为hair，2为y18，3为0-613-2r，4为尤r，5为13hn6-4-6，6为湘远r，7为三裂棉，8为雷蒙德式棉，9为tm-1，10为p30a，11为p53a，12为安d09a，13为湘s26a，14为中12，15为新海18，16为毛棉，17为中草1号，18为中亚1号，19为瑟伯氏，20为拟似棉，21为比麻棉，22为达尔文棉，23为黄褐棉。

图4为用rfm1-f和rfm1-r为引物鉴定自育的棉花恢复系的pcr扩增产物电泳图谱；其中1为恢复系hair(作为阳性对照)，2为不育系p30a（作为阴性对照），3为保持系272b(作为阴性对照)，4为p80r2，5为d45-4242,6为d35-5，7为ky18，8为wsj07-2-4，9为d29-1-1，10为d24-3。

图5为用rfm2-f和rfm2-r为引物鉴定自育的棉花恢复系的pcr扩增产物电泳图谱；其中1为恢复系hair(作为阳性对照)，2为不育系p30a（作为阴性对照），3为保持系272b(作为阴性对照)，4为p80r2，5为d45-4242,6为d35-5，7为ky18、8为wsj07-2-4，9为d29-1-1，10为d24-3。

图6为用rfm3-f和rfm3-r为引物鉴定自育的棉花恢复系的pcr扩增产物电泳图谱；其中1为恢复系hair(作为阳性对照)，2为不育系p30a（作为阴性对照），3为保持系272b(作为阴性对照)，4为p80r2，5为d45-4242,6为d35-5，7为ky18，8为wsj07-2-4，9为d29-1-1，10为d24-3。

具体实施方式

实施例1棉花细胞质雄性不育恢复基因的indel分子标记的筛选

（1）群体构建及数据的获得

以陆地棉不育系p30a为母本、以海岛棉恢复系hair（为申请人自育的棉花恢复系，曾用名isr，其恢复基因来源于0-613-2r）为父本杂交，得f1代；然后自交得f2代，构建f2代分离群体。具体如下：

2015年5月在北京平谷种植hair和p30a各500株。当年7月，以p30a为母本、以hair为父本杂交；10月，收获杂交f1代种子。

2015年10月在海南崖州种植f1代800株，开花期做自交，2016年3月收获自交种子，得f2代。

2016年5月在北京平谷种植f2分离大群体3.4万株，当年7月，对单株进行田间农艺性状的调查及棉花完全可育单株、完全不育单株的标记，按性状单株取样。

（2）采用ctab法提取上述（1）中单株dna

用本申请人实验室的恢复系hair的基因组数据及陆地棉tm-1的基因组数据设计indel分子标记，对双亲本（海岛棉hair和陆地棉p30a）进行多态性筛选，再用多态性分子标记对f2群体进行基因型检测。引物由上海生工合成。

（3）棉花恢复基因qtl定位

根据f2分离大群体的棉花育性性状的表型数据和基因型数据，将棉花恢复基因rf1定位在d05染色体106kb的区段内，将此区段称为恢复区段，确定了恢复基因的定位区间以后，用本申请人的海岛棉hair的基因组数据及陆地棉tm-1的基因组数据设计indel分子标记（见表1）。

表1设计的indel分子标记

用上述indel标记对亲本海岛棉hair和陆地棉p30a进行多态性筛选，用于筛选恢复系，结果筛选到marker3、marker4和marker12（见表1）3个分子标记，将所筛选的3个分子标记marker3、marker4和marker12分别命名为rfm1、rfm2和rfm3。

多态性分子标记用于区分恢复系与非恢复系。

此三个分子标记rfm1、rfm2和rfm3的扩增引物对分别独立对待测棉花材料进行扩增。这三个分子标记属于相互验证的关系，分别代表三个位置。因棉花基因组结构比较复杂，如果混在一起扩增，可能会出现非特异条带。

其中，各分子标记的特异性引物序列和扩增的目的片段长度如下：

（1）分子标记rfm1的引物对为：

rfm1-f：5^’-aggttggtttgctatgaataggt-3^’（seqidno：4），

rfm1-r：5^’-catcacttgcaatgtgaatcagt-3^’（seqidno：5）。

可扩增长度为184bp的dna片段,扩增产物序列如seqidno：1所示，见序列表。

（2）分子标记rfm2的引物对为：

rfm2-f：5^’-cacttaaggttggtttgctatga-3^’（seqidno：6），

rfm2-r：5^’-tgcacagtgataaaagattgtgg-3^’（seqidno：7）。

可扩增长度为154bp的dna片段,扩增产物序列如seqidno：2所示，见序列表。

（3）分子标记rfm3的引物对为：

rfm3-f：5^’-attagcctgaacgcgtggaa-3^’（seqidno：8）,

rfm3-r：5^’-ggttgagggacgattcagca-3^’（seqidno：9）；

可扩增长度为521bp的dna片段,扩增产物序列如seqidno：3所示，见序列表。

实施例2：本发明分子标记对棉花恢复系鉴定的特异性分析试验

（1）dna提取：将23种不同棉花材料（见表2）的种子除去外壳，然后通过ctab法提取dna，测定dna浓度后稀释到50ng/μl，-20℃保存备用。

（2）以步骤（1）中提取的dna为模板，分别以rfm1、rfm2或rfm3的特异引物对为引物进行pcr扩增，检测带型，以恢复系hair和不育系p30a的基因型作为参照。indel标记的pcr反应体系为20ul，其中正向引物（10um）1ul,反向引物（10um）1ul,2xtaqpcrstarmixwithloadingdye10ul,超纯水7ul,模板dna（50ng/ul）1ul.indel标记的pcr反应程序：94℃预变性3min；94℃预变性30s，55℃退火30s；72℃延伸30s，72℃彻底延伸10min，35个循环。扩增反应在bio-radpcr扩增仪上进行，扩增产物在2%琼脂糖凝胶、电压为120v条件下电泳30min，在bio-rad凝胶成像分析系统中记录结果。

（3）结果分子标记rfm1、rfm2、rfm3的电泳图谱分别见图1、图2和图3，对电泳结果进行分析（见表2）。含恢复基因的材料与恢复系hair的带型一致，不含恢复基因的材料跟p30a一致，无条带。上述结果说明本发明3个分子标记对棉花恢复系的鉴定的特异性强，鉴定结果准确、可靠。

表2用本发明3个分子标记对23种棉花材料恢复基因的pcr鉴定结果

实施例3：用本发明分子标记对棉花细胞质雄性不育恢复系的鉴定试验

（1）dna提取：试验材料为本申请人培育的6种高代纯合棉花细胞质雄性不育恢复系（见表3编号4-9），将棉花种子除去外壳，按照ctab法提取dna；测定dna浓度后稀释到50ng/μl，-20℃保存备用。

（2）以步骤（1）中提取的dna为模板，分别以分子标记rfm1、rfm2或rfm3的引物对为引物进行pcr扩增，检测带型，以恢复系hair、不育系p30a和保持系272b的基因型作为参照。indel标记的pcr反应体系为20ul，其中正向引物（10um）1ul,反向引物（10um）1ul,2xtaqpcrstarmixwithloadingdye10ul,超纯水7ul,模板dna（50ng/ul）1ul.indel标记的pcr反应程序：94℃预变性3min；94℃预变性30s，55℃退火30s；72℃延伸30s，72℃彻底延伸10min。扩增反应在bio-rad公司t00^tmthermalcycler进行，扩增产物在2%琼脂糖凝胶、电压为120v条件下电泳30min，然后在bio-radgeldoc^tmxr⁺凝胶成像分析系统中记录结果。

（3）结果分子标记rfm1、rfm2、rfm3的pcr扩增产物电泳图谱分别见图4、图5和图6，对检测结果进行分析（见表3），结果3种分子标记rfm1、rfm2和rfm3仅特异性地存在于恢复系，不育系和保持系都没有扩增产物，说明用分子标记rfm1、rfm2或rfm3特异性强，对棉花细胞质雄性不育恢复系鉴定结果准确、可靠，且方法简单，适于大规模在棉花育种中用于恢复基因的辅助选择。

表3用本发明3个分子标记对6个自育恢复系的鉴定结果

综上所述，本发明获得了用于鉴定棉花细胞质雄性不育恢复基因的indel分子标记rfm1、rfm2和rfm3，可用于棉花恢复系的分子标记辅助育种，使用该分子标记在棉花幼苗期即可进行恢复基因鉴定，无需进行回交鉴定以及田间表型观察，将极大缩短恢复系的育种周期，提高恢复系育种效率，具有广阔的应用前景。

以上实施例仅用于说明本发明的技术方案而非对其限制，尽管上述实施例对本发明进行了详细的说明，所属领域的普通技术人员依然可以对本发明的具体实施方式进行修改或者等同替换，而这些未脱离本发明精神和范围的任何修改或者等同替换，均在本发明的权利要求保护范围之内。

序列表

<110>中国农业科学院生物技术研究所

<120>一种棉花细胞质雄性不育恢复基因的分子标记及其应用

<141>2019-11-22

<160>9

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>184

<212>dna

<213>gossypiumspp.

<400>1

aggttggtttgctatgaataggttcgtgagggtatgatatgtttcaatatgagtgattga60

agtttgctcaaaatagacactaaaccaataatattgaaaataggcactaaacctcattct120

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<210>2

<211>154

<212>dna

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<400>2

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<210>3

<211>521

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<210>4

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<213>gossypiumspp.

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