一种活性增强的酮还原酶突变体及其应用的制作方法

本发明涉及一种酶、生物催化方法及其应用，特别是涉及一种活性增强的酮还原酶突变体及其应用，属于生物
技术领域：
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背景技术：
：酮还原酶是一种多用途催化剂，通过醛或酮的对映体选择性还原成对应醇；(r)特异性酮还原酶与(s)特异性酮还原酶具有不同特性，并且这些催化剂在光学活性醇的工业合成中被越来越频繁地用到；旋光性是许多医药和农药活性化合物选择性作用的必要条件，在一些情况下，一个对映体具有有益的药物活性，另一个对映体却具有基因毒性作用；因此，在药用和农药用活性化合物的合成中，需要使用具有所要求的立体特异性的催化剂合成光学活性醇。度洛西汀是一种药物活性化合物，旨在用于抑郁症和尿失禁的适应症领域；s-3-二甲胺基-1-(2-噻吩基)-1-丙醇是一种重要的手性醇，是度洛西汀合成中的组成单元；一些文献和专利中描述了度洛西汀的合成路线；这些合成路线的缺点是先合成产生外消旋醇混合物，需要随后通过与光学活性抗衡离子形成盐，将外消旋物转化成非对映体混合物来拆分外消旋物，然后将非对映体物理分离；由于固体和液体的重复分离，这导致了高的工艺成本，并且由于添加了用于分离的光学活性盐，增加了起始化合物的使用；而本发明的3-甲氨基-1-(2-噻吩基)-丙酮的立体定向还原将提供一种较便宜的度洛西汀的途径。中国专利cn103421854a公布了一种(s)-3-(二甲胺基)-1-(噻吩-2-基)-1-丙醇的生物制备方法，该方法以3-(二甲胺基)-1-(噻吩-2-基)-1-丙酮或其盐为底物，使该底物在生物催化剂、辅因子及氢供体的存在下发生不对称还原反应生成(s)-3-(二甲胺基)-1-(噻吩-2-基)-1-丙醇，生物催化剂为酮还原酶(kred)与葡萄糖脱氢酶的组合，所述的氢供体为葡萄糖；该专利所用的的葡萄糖脱氢酶循环体系为行业内熟知的，关键的酮还原酶序列并未随专利公布，且体系用到的ph为7.0，实际生产中二甲基-3-酮基-3-(2-噻吩基)-1-丙胺在此ph下会发生消去反应，从而产生例如1-(噻吩-2-基)丙-2-烯-1-酮)等杂质，随后的酶促还原会产生更多额外的副产物，例如1-(噻吩-2-基)丙-1-酮、1-(噻吩-2-基)丙-1-醇和1-(噻吩-2-基)丙-2-醇等。美国专利us8426178公布了改善性质的工程酮还原酶，还提供了编码工程酮还原酶的多核苷酸、能够表达工程酮还原酶的宿主细胞以及使用工程酮还原酶合成多种手性化合物的方法；工程酮还原酶多肽被优化用于催化n，n-二甲基-3-酮-3-(2-噻吩基)-1-酮丙胺转化为(s)-n，n-二甲基-3-羟基-3-(2-噻吩基)-1-丙胺；该方案使用异丙醇做为辅酶循环方式，但反应同时需要抽滤形成负压以除去反应的副产物丙酮，才能使反应有效进行，在生产放大时会增大操作难度及成本。技术实现要素：本发明的主要目的是为了提供一种活性增强的酮还原酶突变体及其应用。本发明的目的可以通过采用如下技术方案达到：一种活性增强的酮还原酶突变体，其源于lactobacillusparabuchneri的野生型酮还原酶，能将3-二甲胺基-1-(2-噻吩基)-1-丙酮盐酸盐转化生成s-3-二甲胺基-1-(2-噻吩基)-1-丙醇，与野生型序列相比具有更高的醇脱氢酶活性，与seqidno.8具有90％以上相似性且具有以下特征中的一个或多个突变：k49r，a68t，e101d，f147e，t152a，s169v，a235s，其序列为seqidno.6。其酮还原酶活性比野生型酮还原酶的活性至少增强2-10倍。一种多核苷酸，其编码由序列为seqidno.6的酮还原酶重组的多肽。一种多核苷酸，其序列为seqidno.5。一种重组质粒，其包括表达载体连接序列为seqidno.5的多核苷。一种宿主细胞，其包含所述的重组质粒。一种宿主细胞，该细胞是一种大肠杆菌。一种宿主细胞，其中所述重组质粒的密码子已经为在所述宿主细胞中表达而进行了优化。本发明的有益技术效果：其源于lactobacillusparabuchneri的野生型酮还原酶，能将3-二甲胺基-1-(2-噻吩基)-1-丙酮盐酸盐转化生成s-3-二甲胺基-1-(2-噻吩基)-1-丙醇，与野生型序列相比具有更高的醇脱氢酶活性，具有k49r，a68t，e101d，f147e，t152a，s169v，a235s的一个或多个突变。本发明的酮还原酶突变体具有明显的高比酶活，比野生型酮还原酶提高了2-10倍，利用该酶可生物催化3-二甲胺基-1-(2-噻吩基)-1-丙酮盐酸盐转化生成s-3-二甲胺基-1-(2-噻吩基)-1-丙醇；反应条件温和，对设备要求低，生产过程无需高温或者冷却，能耗低，由于酶催化具有高效，专一的选择性，故以此法生产抗抑郁药物度洛西汀关键医药中间体s-3-二甲胺基-1-(2-噻吩基)-1-丙醇无副产物产生，纯化方便；此外反应绝大部分溶剂为水，三废排放低，制备过程绿色环保。本专利提供一种抗抑郁药物度洛西汀中间体s-3-二甲胺基-1-(2-噻吩基)-1-丙醇的制备方法，整个体系使用单酶催化，使用醇类用于辅酶循环，底物浓度高达100g/l-160g/l，手性纯度大于99％，底物用量/辅酶用量高达6000:1，辅酶循环次数高，使得s-3-二甲胺基-1-(2-噻吩基)-1-丙醇生产成本有效降低。微生物lactobacillusparabuchneri中天然存在的野生型酮还原酶，具有很好的有机溶剂耐受性及醇脱氢酶活性，具有将3-二甲胺基-1-(2-噻吩基)-1-丙酮盐酸盐转化生成s-3-二甲胺基-1-(2-噻吩基)-1-丙醇的潜力。本公开内容的发明人已发现包括在一定位置突变的酮还原酶与lactobacillusparabuchneri产生的野生型酮还原酶(seqidno：7)相比表现出增加的催化活性。“野生型酮还原酶”、“野生型kred酶”及“野生型kred酮还原酶”指由源自lactobacillusparabuchneri的具有seqidno：7氨基酸序列的酮还原酶。该酶可将3-二甲胺基-1-(2-噻吩基)-1-丙酮盐酸盐转化生成s-3-二甲胺基-1-(2-噻吩基)-1-丙醇。“野生型”指与自然中所发现的一样的材料或物质的形式。例如野生型的蛋白质或核酸序列是可以从自然界中的分离并且未经过人为修饰的，在生物体中存在的原始序列形式。“增加的催化活性”指在体外或体内试验中所测量的与野生型酮还原酶相比，表现出使底物(例如3-二甲胺基-1-(2-噻吩基)-1-丙酮盐酸盐或者3-二甲胺基-1-(2-噻吩基)-1-丙酮)向产物(例如s-3-二甲胺基-1-(2-噻吩基)-1-丙醇)转化速率增加的酮还原酶。该酮还原酶突变体，其源于lactobacillusparabuchneri的野生型酮还原酶，表现出使底物(例如3-二甲胺基-1-(2-噻吩基)-1-丙酮盐酸盐)向产物(例如s-3-二甲胺基-1-(2-噻吩基)-1-丙醇)转化速率增加的酮还原酶。所述酮还原酶突变体，与seqidno.7的野生型酮还原酶相比表现出更强的催化活性。酮还原酶突变体和编码这种突变体的多核苷酸可以使用本领域技术人员通常使用的方法制备。突变体可以通过使编码该酶的体外重组、多核苷酸诱变、dna改组、易错pcr和定向进化方法等获得。上述酮还原酶突变体，具有选自以下特征中的一个或多个突变：k49r，a68t，e101d，f147e，t152a，s169v，a235s。上述酮还原酶突变体，优先自序列seqidno.6，全长突变的酮还原酶对于保持酶的催化活性并不是必需的。相应地，应考虑酮还原酶突变体的截短的类似物和有催化活性的片段。例如，在一些实施方案中，c端或n端的数个氨基酸可以被删去。任何特定的截短的类似物或片段可以利用相应的试验来评估催化活性。同样的，额外的氨基酸残基可以被添加到一个或两个末端而不影响催化活性。额外序列可以是功能性的或非功能性的。例如，额外氨基酸序列可以被用来帮助纯化，做为标记，或执行一些其它的功能。因此，本公开内容的酮还原酶突变体可以是融合蛋白的形式，其中酮还原酶突变体(或其片段)诸如通过助溶标签(如sumo蛋白)、纯化标签(如结合金属的his标签)和细菌定位信号(如分泌信号)的实施例而非限制的方式被融合到其它蛋白质。本发明提供一种酮还原酶突变体，其酮还原酶活性比野生型酮还原酶的活性至少增强2-10倍。上述酮还原酶突变体编码序列，其优选自seqidno.5，其已经过序列优化以适于在大肠杆菌中表达。在一些实施方案中，多核苷酸包括被优化用于在特定类型的宿主细胞中表达的密码子。用于各种不同类型的微生物的密码子的使用和偏好性是已知的，因为其是用于在这些微生物的表达特定的氨基酸的优化的密码子。本发明提供一种重组质粒，在一些实施方案中，控制序列包括启动子、前导序列、多腺苷酸化序列、前肽序列、信号肽序列和转录终止子等。对于细菌宿主细胞，指导编码序列的转录的适合的启动子包括但不限于从噬菌体t5、噬菌体t7、噬菌体lambda、大肠杆菌lacuv5操纵子、大肠杆菌trp操纵子、大肠杆菌tac操纵子等。附图说明图1为lpa-3的表达质粒图谱；图2为lpa-1，lpa-2，lpa-3，lpa-ck生物转化反应3小时的tlc图谱，从左至右1-5道依次为底物产物标准品混合物，实施例7，实施例8，实施例9，实施例10样品，上方条带为底物，下方条带为产物。具体实施方式为使本领域技术人员更加清楚和明确本发明的技术方案，下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。如图1所示，本实施例提供的用于抗抑郁药物度洛西汀中间体制备的酶、生物催化方法及其应用，通过以下是实施例实现。实施例1：通过全基因合成的方法，对基因的二级结构以及密码子偏好性进行调整，以实现在大肠杆菌中的高表达。利用primerpremier(http://primer3.ut.ee/)和optimizer(http://genomes.urv.es/optimizer/)进行设计，并保证tm差异控制在3℃以内，引物长度控制在60base以内，并将获得的引物加双蒸水溶解后，加到如下的反应体系中，使得各引物的终浓度为30nm，首尾引物的终浓度为0.6μm。2mmdntpmix(2mmeachdntp)5μl10×pfubuffer5μlpfudnapolymerase(10u/μl)0.5μlddh2o使得反应体系总体积至50μl将配制好的pcr反应体系置于博日xpcycler基因扩增仪中，按下列程序进行扩增：98℃30s，55℃45s，72℃120s，35x。将pcr得到的dna片段进行切胶纯化，利用同源重组的方法克隆进pet30a的ndei/xhoi位点。挑取单克隆进行测序。测序成功的dna序列为seqidno.1，命名为lpa-1，其对应的氨基酸序列为seqidno.2。实施例2：通过全基因合成的方法，对基因的二级结构以及密码子偏好性进行调整，以实现在大肠杆菌中的高表达。利用primerpremier(http://primer3.ut.ee/)和optimizer(http://genomes.urv.es/optimizer/)进行设计，并保证tm差异控制在3℃以内，引物长度控制在60base以内，并将获得的引物加双蒸水溶解后，加到如下的反应体系中，使得各引物的终浓度为30nm，首尾引物的终浓度为0.6μm。2mmdntpmix(2mmeachdntp)5μl10×pfubuffer5μlpfudnapolymerase(10u/μl)0.5μlddh2o使得反应体系总体积至50μl将配制好的pcr反应体系置于博日xpcycler基因扩增仪中，按下列程序进行扩增：98℃30s，55℃45s，72℃120s，35x。将pcr得到的dna片段进行切胶纯化，利用同源重组的方法克隆进pet30a的ndei/xhoi位点。挑取单克隆进行测序。测序成功的dna序列为seqidno.3，命名为lpa-2，其对应的氨基酸序列为seqidno.4。实施例3：通过全基因合成的方法，对基因的二级结构以及密码子偏好性进行调整，以实现在大肠杆菌中的高表达。利用primerpremier(http://primer3.ut.ee/)和optimizer(http://genomes.urv.es/optimizer/)进行设计，并保证tm差异控制在3℃以内，引物长度控制在60base以内，并将获得的引物加双蒸水溶解后，加到如下的反应体系中，使得各引物的终浓度为30nm，首尾引物的终浓度为0.6μm。2mmdntpmix(2mmeachdntp)5μl10×pfubuffer5μlpfudnapolymerase(10u/μl)0.5μlddh2o使得反应体系总体积至50μl将配制好的pcr反应体系置于博日xpcycler基因扩增仪中，按下列程序进行扩增：98℃30s，55℃45s，72℃120s，35x。将pcr得到的dna片段进行切胶纯化，利用同源重组的方法克隆进pet30a的ndei/xhoi位点。挑取单克隆进行测序。测序成功的dna序列为seqidno.5，命名为lpa-3，其对应的氨基酸序列为seqidno.6。实施例4：参考蛋白lpa-ck基因序列的合成：根据wp_084973575所示源自lactobacillusparabuchneri的序列，委托上海捷瑞生物对该蛋白的编码序列进行全基因合成，并克隆至pet30a中，得到对照蛋白表达质粒lpa-ck，其对应的氨基酸序列为seqidno.7。实施例5：摇瓶表达测试：挑取含有表达载体的大肠杆菌单菌落接种于10ml高压灭菌后的培养基中：胰蛋白胨10g/l，酵母提取物5g/l，磷酸氢二钠3.55g/l，磷酸二氢钾3.4g/l，氯化铵2.68g/l，硫酸钠0.71g/l，七水硫酸镁0.493g/l，六水氯化铁0.027g/l，甘油5g/l，葡萄糖0.8g/l，添加卡那霉素至50mg/l。30℃，250rpm过夜培养。次日取1l三角瓶，按1：100的接种比例接入到100ml高压灭菌后的培养基中：胰蛋白胨10g/l，酵母提取物5g/l，磷酸氢二钠3.55g/l，磷酸二氢钾3.4g/l，氯化铵2.68g/l，硫酸钠0.71g/l，七水硫酸镁0.493g/l，六水氯化铁0.027g/l，甘油5g/l，葡萄糖0.3g/l，添加卡那霉素至50mg/l。于30℃中培养至菌体od5-6，立刻将三角瓶置于25℃摇床中，250rpm培养1小时。加iptg至终浓度0.1mm，并于25℃，250rpm继续培养16小时。培养结束后，将培养液于4℃，12000g下离心20分钟收集湿菌体。然后将菌体沉淀用蒸馏水清洗两次，收集菌体，-70℃保存。同时取2克菌体加入6ml纯水超声破碎后进行sds-page检测，并将粗酶液-20℃保存。实施例6：分批补料发酵：分批补料发酵在计算机控制的生物反应器(上海国强)中进行，反应器容量为15l，工作体积为8l，所用到的培养基为酵母抽提物24g/l,蛋白胨12g/l,葡萄糖0.4％,2.31g/l磷酸二氢酶和12.54g/l磷酸氢二钾,ph7.0。初级接种菌种制备200ml培养物，od2.0时接入。在整个发酵过程中，温度保持在37℃，发酵过程中溶解氧浓度由搅拌速率(rpm)和通气供应级联控制在30％自动控制，而培养基的ph值由50％(v/v)正磷酸和30％(v/v)氨水维持在7.0。发酵过程中，当出现大幅的溶氧回升时，开始补料。补料溶液含有9％w/v蛋白胨、9％w/v酵母提取物、14％w/v甘油。当od600约为35.0(湿重约为60g/l)时，用0.2mmiptg诱导16小时。取2克菌体加入6ml纯水超声破碎后进行sds-page检测，并将粗酶液-20℃保存。实施例7：生物转化反应：在3l的三口烧瓶中依次加入380ml0.1m三乙醇胺缓冲液，620ml异丙醇，188g3-二甲胺基-1-(2-噻吩基)-1-丙酮盐酸盐，混匀预溶解底物；取800ml上述反应体系，加入25mg/lnadp，50mllpa-1粗酶液，混匀后调节水浴37℃搅拌反应过夜。并在3小时取中间样保存。实施例8：生物转化反应：在3l的三口烧瓶中依次加入380ml0.1m三乙醇胺缓冲液，620ml异丙醇，188g3-二甲胺基-1-(2-噻吩基)-1-丙酮盐酸盐，混匀预溶解底物；取800ml上述反应体系，加入25mg/lnadp，50mllpa-2粗酶液，混匀后调节水浴37℃搅拌反应过夜。并在3小时取中间样保存。实施例9：生物转化反应：在3l的三口烧瓶中依次加入380ml0.1m三乙醇胺缓冲液，620ml异丙醇，188g3-二甲胺基-1-(2-噻吩基)-1-丙酮盐酸盐，混匀预溶解底物；取800ml上述反应体系，加入25mg/lnadp，50mllpa-3粗酶液，混匀后调节水浴37℃搅拌反应过夜。并在3小时取中间样保存。实施例10：对照酶lpa-ck生物转化反应：在3l的三口烧瓶中依次加入380ml0.1m三乙醇胺缓冲液，620ml异丙醇，188g3-二甲胺基-1-(2-噻吩基)-1-丙酮盐酸盐，混匀预溶解底物；取800ml上述反应体系，加入25mg/lnadp，50mllpa-ck粗酶液，混匀后调节水浴37℃搅拌反应过夜。并在3小时取中间样保存。实施例11：薄层色谱分析：取少量反应液用乙酸乙酯按照1:10比例进行萃取，并取1ul在硅胶板上点样，展开剂为二氯甲烷/甲醇(10：1)，加热干燥后高锰酸钾显色。结果见图2。实施例12：酶活检测：取6个5ml离心管，分别标号1-6，分别加入3mm的nadph溶液0ul，40ul，80ul，100ul，120ul，160ul，然后每管补加0.1m，ph7.0的磷酸盐缓冲液补足3ml，混匀后在340nm下检测并记录吸光度的值；根据上述测得值，得到nadph的标准曲线y＝k*x，其中y为吸光度的值，x为nadph的浓度(mm)，曲线的r2>99.5％；用纯水按一定的倍数稀释酶液(参考稀释倍数：600-1000倍)，稀释的倍数使每分钟吸光值变化0.02-0.04之间为合适；取5ml离心管，按以下比例取样加入离心管，迅速混合，立即倒入比色皿。检测试剂用量异丙醇500ul2％nadp100ul100mmpbs(ph7.0)2.35ml稀释后的酶液50ul在340nm处检测吸光度的变化，每隔1min记录一个值，每分钟的变化率基本相同，其中0min的吸光度为s0，3min的吸光度为s3；酶活计算公式：酶活(u/ml)＝[(s0-s3)*3ml*n]/[k×时间(t/min)×加酶量(ml)]其中，n为酶液的稀释倍数。检测结果如下：待测样突变点酶活u/mllpa-1k49r，a68t，f147e560lpa-2a68t，e101d，s169v，a235s1120lpa-3k49r，f147e，t152a，s169v1550lpa-ck－160可见，本发明提供的活性增强的酮还原酶突变体，其酮还原酶活性比野生型酮还原酶的活性至少增强2-10倍。与野生型酮还原酶相比，使底物3-二甲胺基-1-(2-噻吩基)-1-丙酮盐酸盐向产物s-3-二甲胺基-1-(2-噻吩基)-1-丙醇转化速率增加，且进一步的增加了单位体积的底物浓度，利于工业放大时提高生产效率。以上所述，仅为本发明进一步的实施例，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本
技术领域：
的技术人员在本发明所公开的范围内，根据本发明的技术方案及其构思加以等同替换或改变，都属于本发明的保护范围。序列表<110>南京朗恩生物科技有限公司<120>一种活性增强的酮还原酶突变体及其应用<130>2019<160>7<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>759<212>dna<213>人工序列()<400>1atgaccgaccgtctgaaaggtaaagttgctatcgttaccggtggtaccctgggtatcggt60ctggctatcgctgacaaattcgttgaagaaggtgctaaagttgttatcaccggtcgtcac120gctgacgttggtgaaaaagctgctcgttctatcggtggtccggacgttatccgtttcgtt180cagcacgacgcttctgacgaaaccggttggaccgaactgttcgacaccaccgaaaacgct240ttcggtccggttaccaccgttgttaacaacgctggtatcgctgtttctaaatctgttgaa300gaaaccaccaccgaagaatggcgtaaactgctgtctgttaacctggacggtgttttcttc360ggtacccgtctgggtatccagcgtatgaaaaacaaaggtctgggtgcttctatcatcaac420atgtcttctatcgaaggtgaagttggtgacccgaccctgggtgcttacaacgcttctaaa480ggtgctgttcgtatcatgtctaaatctgctgctctggactgcgctctgaaagactacgac540gttcgtgttaacaccgttcacccgggttacatcaaaaccccgctggttgacgacctggaa600ggtgctgaagaaatgatgtctcagcgtaccaaaaccccgatgggtcacatcggtgaaccg660aacgacatcgcttggatctgcgtttacctggcttctgacgaagctaaattcgctaccggt720gctgaattcgttgttgacggtggttacaccgctcagtaa759<210>2<211>252<212>prt<213>人工序列()<400>2metthraspargleulysglylysvalalailevalthrglyglythr151015leuglyileglyleualailealaasplysphevalglugluglyala202530lysvalvalilethrglyarghisalaaspvalglyglulysalaala354045argserileglyglyproaspvalileargphevalglnhisaspala505560seraspgluthrglytrpthrgluleupheaspthrthrgluasnala65707580pheglyprovalthrthrvalvalasnasnalaglyilealavalser859095lysservalglugluthrthrthrgluglutrparglysleuleuser100105110valasnleuaspglyvalphepheglythrargleuglyileglnarg115120125metlysasnlysglyleuglyalaserileileasnmetserserile130135140gluglygluvalglyaspprothrleuglyalatyrasnalaserlys145150155160glyalavalargilemetserlysseralaalaleuaspcysalaleu165170175lysasptyraspvalargvalasnthrvalhisproglytyrilelys180185190thrproleuvalaspaspleugluglyalagluglumetmetsergln195200205argthrlysthrprometglyhisileglygluproasnaspileala210215220trpilecysvaltyrleualaseraspglualalysphealathrgly225230235240alagluphevalvalaspglyglytyrthralagln245250<210>3<211>759<212>dna<213>人工序列()<400>3atgaccgaccgtctgaaaggtaaagttgctatcgttaccggtggtaccctgggtatcggt60ctggctatcgctgacaaattcgttgaagaaggtgctaaagttgttatcaccggtcgtcac120gctgacgttggtgaaaaagctgctaaatctatcggtggtccggacgttatccgtttcgtt180cagcacgacgcttctgacgaaaccggttggaccgaactgttcgacaccaccgaaaacgct240ttcggtccggttaccaccgttgttaacaacgctggtatcgctgtttctaaatctgttgaa300gacaccaccaccgaagaatggcgtaaactgctgtctgttaacctggacggtgttttcttc360ggtacccgtctgggtatccagcgtatgaaaaacaaaggtctgggtgcttctatcatcaac420atgtcttctatcgaaggtttcgttggtgacccggctctgggtgcttacaacgcttctaaa480ggtgctgttcgtatcatgtctaaagttgctgctctggactgcgctctgaaagactacgac540gttcgtgttaacaccgttcacccgggttacatcaaaaccccgctggttgacgacctggaa600ggtgctgaagaaatgatgtctcagcgtaccaaaaccccgatgggtcacatcggtgaaccg660aacgacatcgcttggatctgcgtttacctggcttctgacgaatctaaattcgctaccggt720gctgaattcgttgttgacggtggttacaccgctcagtaa759<210>4<211>252<212>prt<213>人工序列()<400>4metthraspargleulysglylysvalalailevalthrglyglythr151015leuglyileglyleualailealaasplysphevalglugluglyala202530lysvalvalilethrglyarghisalaaspvalglyglulysalaala354045lysserileglyglyproaspvalileargphevalglnhisaspala505560seraspgluthrglytrpthrgluleupheaspthrthrgluasnala65707580pheglyprovalthrthrvalvalasnasnalaglyilealavalser859095lysservalgluaspthrthrthrgluglutrparglysleuleuser100105110valasnleuaspglyvalphepheglythrargleuglyileglnarg115120125metlysasnlysglyleuglyalaserileileasnmetserserile130135140gluglyphevalglyaspproalaleuglyalatyrasnalaserlys145150155160glyalavalargilemetserlysvalalaalaleuaspcysalaleu165170175lysasptyraspvalargvalasnthrvalhisproglytyrilelys180185190thrproleuvalaspaspleugluglyalagluglumetmetsergln195200205argthrlysthrprometglyhisileglygluproasnaspileala210215220trpilecysvaltyrleualaseraspgluserlysphealathrgly225230235240alagluphevalvalaspglyglytyrthralagln245250<210>5<211>759<212>dna<213>人工序列()<400>5atgaccgaccgtctgaaaggtaaagttgctatcgttaccggtggtaccctgggtatcggt60ctggctatcgctgacaaattcgttgaagaaggtgctaaagttgttatcaccggtcgtcac120gctgacgttggtgaaaaagctgctcgttctatcggtggtccggacgttatccgtttcgtt180cagcacgacgcttctgacgaagctggttggaccgaactgttcgacaccaccgaaaacgct240ttcggtccggttaccaccgttgttaacaacgctggtatcgctgtttctaaatctgttgaa300gaaaccaccaccgaagaatggcgtaaactgctgtctgttaacctggacggtgttttcttc360ggtacccgtctgggtatccagcgtatgaaaaacaaaggtctgggtgcttctatcatcaac420atgtcttctatcgaaggtgaagttggtgacccggctctgggtgcttacaacgcttctaaa480ggtgctgttcgtatcatgtctaaagttgctgctctggactgcgctctgaaagactacgac540gttcgtgttaacaccgttcacccgggttacatcaaaaccccgctggttgacgacctggaa600ggtgctgaagaaatgatgtctcagcgtaccaaaaccccgatgggtcacatcggtgaaccg660aacgacatcgcttggatctgcgtttacctggcttctgacgaagctaaattcgctaccggt720gctgaattcgttgttgacggtggttacaccgctcagtaa759<210>6<211>252<212>prt<213>人工序列()<400>6metthraspargleulysglylysvalalailevalthrglyglythr151015leuglyileglyleualailealaasplysphevalglugluglyala202530lysvalvalilethrglyarghisalaaspvalglyglulysalaala354045argserileglyglyproaspvalileargphevalglnhisaspala505560seraspglualaglytrpthrgluleupheaspthrthrgluasnala65707580pheglyprovalthrthrvalvalasnasnalaglyilealavalser859095lysservalglugluthrthrthrgluglutrparglysleuleuser100105110valasnleuaspglyvalphepheglythrargleuglyileglnarg115120125metlysasnlysglyleuglyal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