一种利用烟草水解液生产2-苯乙醇的方法

1.本发明涉及一种利用烟草水解液生产2-苯乙醇的方法，属于废弃物回收再利用技术领域。


背景技术：

2.我国每年的烟叶的产量450-500万吨，其中约有25％的不能用于卷烟，主要包括烟草堆垛发酵过程中会进行翻垛处理后，散落的碎烟叶；各卷烟企业会积存有大量的烟末，还有就是大量的上部烟叶、烟花和烟草秸秆等烟草废弃物。若对这些烟草废弃物加以“资源化利用”，不仅可以获得符合绿色卫生标准的天然化工原料，而且为企业提供了可持续发展的契机；也可以减轻烟草废弃物带来的土质和土壤结构的改变，避免其中有害成分对环境的污染。
3.苯乙醇(phenylethanol)，也叫2-苯乙醇、2-苯基乙醇或β-苯乙醇，是一种具有玫瑰香气的无色液体。因其具有淡雅、细腻而持久的玫瑰花香气而被广泛应用于食品行业，是目前市场上的第二大香料。同时，由于其不溶于水、在碱性条件下稳定等特点，该化合物也用于皂用和化妆品用香精的调配，在洗涤用品和化妆品行业中有广阔的应用前景；它还可用于对羟基苯乙醇等重要医药中间体的合成，也是大宗化工原料苯乙烯的潜在原料。随着人们对天然香料的需求增多，从植物精油中获取的2-苯乙醇，已不足以满足市场的需要。文献报道得知2-苯乙醇是微生物代谢的产物，所以采用微生物发酵生产2-苯乙醇，是具有周期短，可以大规模应用的潜力。目前研究发现酵母生产2-苯乙醇存在两种途径：一种是从头合成途径，通过合成芳香族氨基酸的莽草酸途径合成，二是通过艾氏途径(ehrlichpathway)，即l-苯丙氨酸通过转氨作用生成苯丙酮酸，再脱羧形成苯乙醛后，经氧化脱氢作用生成2-苯乙醇，通过添加前体物质l-苯丙氨酸使2-苯乙醇的产量大幅提高。研究发现烟草废弃物中含有大量可供利用的蛋白质、氨基酸、糖类、脂和烟碱等非常有利用价值的物质，其中28.3％纤维素，20.3％半纤维素，2.3％木质素，8.8％蛋白质和4.2％灰烬。所以添加合适的酶制剂水解烟草废弃物后，会产生l-苯丙氨酸等氨基酸，以及葡萄糖等小分子的糖类。大多数微生物都具备上述两种途径，其中酿酒酵母(saccharomyces cerevisiae)是目前生产2-苯乙醇的主要出发菌株。产黑色素短梗霉(aureobasidium melanogenum)，该酵母菌株可以更多地将水解物中的物质转化为具有资源化的产物，并且具有较高的2-苯乙醇的耐受性。目前在现有的技术中未有揭示在发酵前通过添加不同种类的酶制剂处理后，并利用烟草水解液发酵生产2-苯乙醇的发酵方法。


技术实现要素：

4.为解决上述烟草废弃物堆积以及菌株利用率低等问题，本发明提供了一种利用烟草水解液生产2-苯乙醇的方法，将产黑色素短梗霉(aureobasidium melanogenum)接种到含有烟草水解液的培养基中进行发酵，所得发酵液经提纯后得到2-苯乙醇；所述烟草水解液为烟草废弃物经纤维素酶、半纤维素酶、漆酶、植酸酶、木聚糖酶、中性蛋白酶、角蛋白酶
和脂肪酶处理后的酶解液。
5.进一步地限定，所述产黑色素短梗霉(aureobasidium melanogenum)为产黑色素短梗霉(aureobasidium melanogenum)a4，菌种保藏编号为cgmcc no.13177。
6.进一步地限定，所述烟草水解液通过如下方法制备获得：调节烟草废弃物溶液ph为3-4，并在105℃条件下加热10-20min；冷却至室温，再调节烟草废弃物溶液ph为10-11，同样在105℃条件下加热10-20min，冷却至室温；再调节烟草废弃物溶液ph为5.0-5.5，以烟草废弃物质量计，添加0.2-0.3g/g的纤维素酶，0.1-0.15g/g的半纤维素酶，0.2-0.25g/g的漆酶，0.05-0.1g/g的植酸酶以及0.15-0.2g/g的木聚糖酶，放置于40-50℃，200rpm/min摇床中酶解3-4天，得到酶解液；然后调节酶解液ph为6.5-7.5，添加0.02-0.05g/g的中性蛋白酶，0.03-0.05g/g的角蛋白酶，0.04-0.05g/g的脂肪酶，放置于40-50℃，200rpm/min摇床中酶解2-3天，得到烟草水解液。
7.进一步地限定，所述烟草废弃物为碎烟叶，烟末，上部烟叶、烟花和烟草秸秆中的一种或多种的混合物。
8.进一步地限定，所述含有烟草水解液的培养基配方为：4.5(wt)％～6.0(wt)％烟草水解液，1.5(wt)％～2.0(wt)％生物质糖，0.1(wt)％～0.3(wt)％k2hpo4，0.2(wt)％～0.4(wt)％kh2po4，0.04(wt)％～0.06(wt)％mgso4·
7h2o，余量为水，ph值为4.5-5.5。
9.进一步地限定，所述生物质糖为葡萄糖、果糖中的一种或两种的混合物。
10.进一步地限定，所述发酵为30℃，180～250rpm/min的摇床中进行培养。
11.进一步地限定，所述利用烟草水解液生产2-苯乙醇的方法，步骤如下：
12.步骤一：产黑色素短梗霉(aureobasidium melanogenum)的种子接种到ypd培养基中培养获得一级种子，将获得的一级种子接种到含有二级种子培养基的摇瓶中培养获得二级种子；
13.步骤二：取步骤一获得的二级种子液接种到含有烟草水解液的培养基中，调节ph值4.5-5.5，发酵24h后，以每升含有烟草水解液的培养基体积计，再加入5.0ml的三烷基氧化磷trpo作为原位萃取剂，继续发酵50-60h；
14.步骤三：取步骤二发酵结束的发酵液，离心后取上清，过滤后进行气相检测，得到2-苯乙醇。
15.更进一步地限定，所述二级种子培养基成分包含如下：1.5(wt)％～2.5(wt)％葡萄糖,1.0(wt)％～1.5(wt)％酵母粉,2.0(wt)％～2.5(wt)％蛋白胨,0.6(wt)％～0.8(wt)％k2hpo4,0.05(wt)％～0.07(wt)％mgso4·
7h2o,1.0(wt)％～1.4(wt)％nacl,0.07(wt)％～0.09(wt)％(nh4)2so4，余量为水，ph为7.0-7.5。
16.更进一步地限定，所述二级种子接种到发酵培养基中是按照15(v/v)％-25(v/v)％的接种量进行的。
17.本发明有益效果：
18.1、本发明提供的菌株利用优化酶处理的烟草水解液作为发酵培养基，完全代替了以氨基酸和蛋白胨为基础氮源的培养基成分的配方，并通过控制发酵工艺发酵生产2-苯乙醇，使烟草得到更加充分地利用，从而进一步提高原料的利用率。
19.2、本发明提供的菌株生产2-苯乙醇生产方法条件温和、环境友好以及产品绿色天然等优点。
20.3、上述方法实现了产黑色素短梗霉菌株利用烟草水解液作为发酵培养基发酵生产2-苯乙醇，使得烟草在额外添加不同种类的酶制剂处理的条件下，转化为菌株可以利用的单糖等小分子量的物质，从而提高了原料的利用率，节约了能源。
21.4.添加生物质糖可以增加烟草水解液中单糖的浓度，有利于菌株的生长，从而更多的利用烟草水解液中的小分子物质转化成苯乙醇。
附图说明
22.图1为2-苯乙醇定性色谱图，横坐标为离子的质量，即离子的质荷比(m/z)值，纵坐标为离子流的强度；最高的峰指的是2-苯乙醇，结构式如图所示。
具体实施方式
23.下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，但本发明不受实施例的限制。
24.本发明中所述用的原料纤维素酶、半纤维素酶、漆酶、植酸酶、木聚糖酶、中性蛋白酶、角蛋白酶和脂肪酶均可通过商业化途径购买获得。
25.本发明所述的烟草废弃物包括：烟草堆垛发酵过程中散落的碎烟叶，各卷烟企业会积存有大量的烟末，上部烟叶、烟花和烟草秸秆等。
26.本发明使用的产黑色素短梗霉(aureobasidium melanogenum)a4，分类名为产黑色素短梗霉(aureobasidium melanogenum)，保藏日期：2016年10月24日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为cgmcc no.13177。
27.实施例1.烟草水解液的制备。
28.烟草水解液的获取方式如下：取一定量废弃烟叶与水混合，利用6m/l的h2so4调节烟草废弃物溶液ph为3，并在105℃条件下加热处理10min；冷却至室温，再利用6m/lnaoh调节ph为10，同样在105℃条件下加热处理10min，冷却至室温；再利用6m/l h2so4调节ph为5.0，以烟草废弃物质量计，添加0.2g/g的纤维素酶，0.1g/g的半纤维素酶，0.2g/g的漆酶，0.05g/g的植酸酶以及0.15g/g的木聚糖酶，放置于40℃，200rpm/min摇床中酶解4天，得到酶解液。然后再利用6m/lnaoh调节ph为6.5，并添加0.02g/g的中性蛋白酶，0.03g/g的角蛋白酶，0.04g/g的脂肪酶，放置于40℃，200rpm/min摇床中酶解3天，得到烟草水解液。
29.实施例2.烟草水解液的制备。
30.烟草水解液的获取方式如下：取一定量废弃烟秸秆与水混合，利用6m/l的h2so4调节烟草废弃物溶液ph为4，并在105℃条件下加热处理20min；冷却至室温，再利用6m/lnaoh调节ph为11，同样在105℃条件下加热处理20min，冷却至室温；再利用6m/l h2so4调节ph为5.5，以烟草废弃物质量计，添加0.3g/g的纤维素酶，0.15g/g的半纤维素酶，0.25g/g的漆酶，0.1g/g的植酸酶以及0.2g/g的木聚糖酶，放置于50℃，200rpm/min摇床中酶解3天，得到酶解液。然后再利用6m/lnaoh调节ph为7.5，并添加0.05g/g的中性蛋白酶，0.05g/g的角蛋白酶，0.05g/g的脂肪酶，放置于50℃，200rpm/min摇床中酶解2天，得到烟草水解液。
31.下面以实施例1制备的烟草水解液为例，描述本发明所述的利用烟草水解液生产2-苯乙醇的方法。
32.对比实施例3：利用烟草水解液生产2-苯乙醇的方法。
33.步骤一：利用接种环从ypd平板上取一环产黑色素短梗霉菌株，接入一级种子培养基中，一级种子培养基的水溶液成分为：1.1(wt)％葡萄糖，1.5(wt)％酵母膏，2.0(wt)％蛋白胨，余量为水，自然ph 7.02；培养基灭菌条件为115℃灭菌25分钟。将试管倾斜放于30℃，180rpm/min的摇床中培养30小时，此时培养液作为一级种子。
34.将上述培养30小时的一级种子，接入二级种子培养基中，接种量为培养基的10％(v/v)，二级种子培养基的水溶液成分为：1.5(wt)％葡萄糖,1.5(wt)％酵母粉,2.5(wt)％蛋白胨,0.6(wt)％k2hpo4,0.06(wt)％mgso4·
7h2o,1.0(wt)％nacl,0.8(wt)％(nh4)2so4，余量为水，自然ph 7.23；培养基灭菌条件为115℃灭菌25分钟。按照10％(v/v)接种量加入；然后将摇瓶放于30℃，200rpm/min的摇床中培养40小时，此时得到二级种子液；
35.步骤二：将上述二级种子液按照15％(v/v)的接种量接种到50ml发酵培养基中，发酵培养基的组成成分如下：4.5(wt)％烟草水解液，0.3(wt)％k2hpo4，0.4(wt)％kh2po4，0.05(wt)％mgso4·
7h2o，余量为水，ph值为5，培养基灭菌条件为115℃灭菌30分钟。发酵24h后，并添加5.0ml的三烷基氧化磷(trpo)作为原位萃取剂，将接种后的发酵培养基放于30℃，220rpm/min的摇床中培养55小时。
36.步骤三：发酵结束后，分别量取25ml发酵液，10000rpm/min离心10min，此时发酵液分为3层，取上清进行气相检测；测量2-苯乙醇的含量为2.9mg/l；
37.实施例4：利用烟草水解液生产2-苯乙醇的方法。
38.步骤一：利用接种环从ypd平板上取一环产黑色素短梗霉菌株，接入一级种子培养基中，一级种子培养基的水溶液成分为：1.1(wt)％葡萄糖，1.5(wt)％酵母膏，2.0(wt)％蛋白胨，余量为水，自然ph 7.02；培养基灭菌条件为115℃灭菌25分钟。将试管倾斜放于30℃，180rpm/min的摇床中培养30小时，此时培养液作为一级种子；
39.将上述培养30小时的一级种子，接入二级种子培养基中，接种量为培养基的10％(v/v)，二级种子培养基的水溶液成分为：1.5(wt)％葡萄糖,1.8(wt)％酵母粉,2.5(wt)％蛋白胨,0.6(wt)％k2hpo4,0.06(wt)％mgso4·
7h2o,0.5(wt)％nacl,1.0(wt)％(nh4)2so4，余量为水，自然ph 7.23；培养基灭菌条件为115℃灭菌25分钟。然后将摇瓶放于30℃，200rpm/min的摇床中培养20小时，此时得到二级种子液；
40.步骤二：将上述二级种子液按照20％(v/v)的接种量接种到50ml的发酵培养基中，发酵培养基的组成成分如下(wt)：4.5(wt)％烟草水解液，1.5(wt)％葡萄糖，0.3％k2hpo4，0.4％kh2po4，0.05％mgso4·
7h2o，余量为水，ph值为5.5，培养基灭菌条件为115℃灭菌30分钟。发酵24h后，添加5.0ml的三烷基氧化磷(trpo)作为原位萃取剂，将接种后的发酵培养基放于30℃，220rpm/min的摇床中培养55小时。
41.步骤三：发酵结束后，分别量取20ml发酵液，12000rpm/min离心10min，此时发酵液分为3层，取上清进行气相检测；测量2-苯乙醇的含量为21.2mg/l。
42.实施例5：利用烟草水解液生产2-苯乙醇的方法。
43.步骤一：利用接种环从ypd平板上取一环产黑色素短梗霉菌株，接入一级种子培养基中，一级种子培养基的水溶液成分为：1.1(wt)％葡萄糖，1.5(wt)％酵母膏，2.0(wt)％蛋白胨，余量为水，自然ph 7.02；培养基灭菌条件为115℃灭菌25分钟。将试管倾斜放于28℃，180rpm/min的摇床中培养30小时，此时培养液作为一级种子。
44.将上述培养30小时的一级种子，接入二级种子培养基中，接种量为培养基的10％
(v/v)，二级种子培养基的水溶液成分为：1.0(wt)％葡萄糖,1.0(wt)％酵母粉,2.5(wt)％蛋白胨,0.6(wt)％k2hpo4,0.06(wt)％mgso4·
7h2o,1.0(wt)％nacl,0.8(wt)％(nh4)2so4，余量为水，自然ph 7.23；培养基灭菌条件为115℃灭菌25分钟。按照5％(v/v)接种量加入；然后将摇瓶放于28℃，200rpm/min的摇床中培养38小时，此时得到二级种子液；
45.步骤二：将上述二级种子液按照16％(v/v)的接种量接种到50ml的发酵培养基中，发酵培养基的组成成分如下(wt)：6.0(wt)％烟草水解液，2.0％果糖，0.1％k2hpo4，0.2％kh2po4，0.06％mgso4·
7h2o，余量为水，ph值为4.5，培养基灭菌条件为115℃灭菌30分钟。发酵24h后，并添加5.0ml的三烷基氧化磷(trpo)作为原位萃取剂，将接种后的发酵培养基放于30℃，220rpm/min的摇床中培养60小时。
46.步骤三：发酵结束后，分别量取25ml发酵液，12000rpm/min离心10min，取上清进行气相检测；测量2-苯乙醇的含量为22.2mg/l。
47.实施例6：2-苯乙醇定性检测。
48.(1)以实施例4为例，将发酵结束后的发酵液，加入10％(v/v)正己烷，放于25℃摇床中过夜萃取12小时，1000转离心10min，上清液通过过滤膜，进行气相色谱质谱联用仪检测2-苯乙醇。
49.(2)将检测出的色谱图，如图1得知，得知该菌株可以生产2-苯乙醇。
50.虽然本发明已以较佳的实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明精神和范围内，都可以做各种的改动与修饰，因此，本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。