羟基氧化酶CYB5A突变体与环系列产品的制备方法与流程

本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及一种羟基氧化酶cyb5a突变体与环系列产品的制备方法。

背景技术：

环丁酮、环丙甲醛等环系列产品具有较高的商业价值与较好的应用前景，然而，目前环系列产品的制备方法多为化学合成方法，产率低且生产过程容易造成环境污染。

微生物转化是通过微生物细胞将复杂的底物进行结构修饰，也就是利用微生物谢过程中产生的某个或某一系列的酶对底物特定部位进行修饰的催化反应。

微生物转化技术具有以下优点：

1、反应条件温和、公害少、设备简单且反应速度快；

微生物转化的反应中一般无需高压、强热等比较苛刻的反应条件，只需在常温和ph为7左右的环境下进行反应即可；原料除了普通的培养基和底物外没有其它化学品，普遍认为公害较少；设备简单，反应条件比较温和，生产安全；微生物转化反应是酶催化的反应，在最合适的条件下，一秒内酶能催化底物转化为产物的分子个数数量级是10²～10⁶。

2、反应步骤较少；

随着现代生物技术的迅速发展，酶合成基因构建的基因工程菌可以把需要多步催化合成的中间体在一次发酵中转化完成。

3、回收率高、成本低；

微生物反应可以持续进行、反应量大、回收率高并可以大规模工业化生产，从设备和原料方面来说生产成本低于酶法和化学合成法。

技术实现要素：

本发明的目的首先在于提供一种羟基氧化酶cyb5a突变体，对环系列醇类化合物具有较高的转化率，具有很好的工业化应用前景。

本发明的目的还在于提供一种多聚脱氧核糖核苷酸，包含上述羟基氧化酶cyb5a突变体的遗传信息。

本发明的目的还在于提供一种重组载体，包含上述多聚脱氧核糖核苷酸。

本发明的目的还在于提供一种重组细胞，包含上述重组载体。

本发明的目的还在于提供一种环系列产品的制备方法。

为实现以上目的，本发明首先提供一种羟基氧化酶cyb5a突变体，第83位氨基酸由赖氨酸突变为异亮氨酸，第137位氨基酸由脯氨酸突变为精氨酸，第233位氨基酸由谷氨酸突变为缬氨酸。

在本发明一些实施例中，所述羟基氧化酶cyb5a突变体包括如序列表中序列4所示的氨基酸序列。

本发明还提供一种多聚脱氧核糖核苷酸，包括上述羟基氧化酶cyb5a突变体的dna编码序列以及与所述dna编码序列互补的dna序列中的至少一种。

在本发明一些实施例中，所述dna编码序列包括如序列表中序列3所示的dna序列。

本发明还提供一种重组载体，包含上述多聚脱氧核糖核苷酸。

本发明还提供一种重组细胞，包括宿主细胞以及位于所述宿主细胞内的上述重组载体。

在本发明一些实施例中，所述宿主细胞为大肠杆菌。

优选的，所述大肠杆菌为e.colibl21(de3)。

本发明还提供一种环系列产品的制备方法，利用所述羟基氧化酶cyb5a突变体转化环系列醇类化合物，得到环系列产品；所述环系列醇类化合物为环丁醇或环丙基甲醇，所述环系列产品为环丁酮或环丙甲醛。

在本发明一些实施例中，所述环系列产品的制备方法包括：制备所述羟基氧化酶cyb5a突变体的编码基因的重组载体，将所述重组载体转入宿主细胞中，得到重组细胞，利用所述重组细胞对环系列醇类化合物进行转化。

在本发明一些实施例中，所述dna编码序列为如序列表中序列2所示的dna序列，所述重组载体为包含所述羟基氧化酶cyb5a突变体编码基因的pet-30a质粒，所述宿主细胞为e.colibl21(de3)。

在本发明一些实施例中，当所述环系列醇类化合物为环丁醇时，转化的温度条件为20～50℃下，转化的反应体系包括：环丁醇、含有羟基氧化酶cyb5a突变体的重组细胞以及ph5.5～10.5的缓冲液。

具体的，所述反应体系中环丁醇的初始浓度为10～800mmol/l。

具体的，所述反应体系中重组细胞的用量以细胞湿重计为100～300g/l。

可选的，所述反应体系还包括有机溶剂，例如乙醇、异丙醇等，以提高转化产物的溶解度。

优选的，所述重组细胞对环系列醇类化合物进行转化后，将反应液用适量体积的乙酸乙酯萃取，有机层即为含目标产物(醛类化合物或酮类化合物)的粗品，将粗品提纯即获得目标产物。

采用所述重组细胞来转化环系列醇类化合物的方法具有以下优点：反应条件温和，底物适应性高，环境友好，且能够在不外加任何辅酶的反应体系中高效转化高浓度的环系列醇类化合物，反应高效，绿色环保，不产生固废及废气，具有很好的工业化应用前景。

本发明的有益效果：本发明提供一种羟基氧化酶cyb5a突变体，其突变位点包括：第83位氨基酸由赖氨酸突变为异亮氨酸，第137位氨基酸由脯氨酸突变为精氨酸，第233位氨基酸由谷氨酸突变为缬氨酸。所述羟基氧化酶cyb5a突变体对环系列醇类化合物具有较高的转化率，具有很好的工业化应用前景。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对本发明范围的限定。

图1为实施例2中羟基氧化酶cyb5a突变体基因工程菌k83i表达的羟基氧化酶cyb5a突变体经纯化后的sds-page电泳图；

图2为实施例4中羟基氧化酶cyb5a突变体基因工程菌k83i转化环丁醇的产物的hplc图谱；

图3为实施例4中羟基氧化酶cyb5a突变体基因工程菌k83i转化环丁醇的产物的核磁共振图谱；

图4为实施例5中羟基氧化酶cyb5a突变体基因工程菌k83i转化环丙基甲醇的产物的hplc图谱。

具体实施方式

如本文所用之术语：

“由……制备”与“包含”同义。本文中所用的术语“包含”、“包括”、“具有”、“含有”或其任何其它变形，意在覆盖非排它性的包括。例如，包含所列要素的组合物、步骤、方法、制品或装置不必仅限于那些要素，而是可以包括未明确列出的其它要素或此种组合物、步骤、方法、制品或装置所固有的要素。

连接词“由……组成”排除任何未指出的要素、步骤或组分。如果用于权利要求中，此短语将使权利要求为封闭式，使其不包含除那些描述的材料以外的材料，但与其相关的常规杂质除外。当短语“由……组成”出现在权利要求主体的子句中而不是紧接在主题之后时，其仅限定在该子句中描述的要素；其它要素并不被排除在作为整体的所述权利要求之外。

当量、浓度、或者其它值或参数以范围、优选范围、或一系列上限优选值和下限优选值限定的范围表示时，这应当被理解为具体公开了由任何范围上限或优选值与任何范围下限或优选值的任一配对所形成的所有范围，而不论该范围是否单独公开了。例如，当公开了范围“1～5”时，所描述的范围应被解释为包括范围“1～4”、“1～3”、“1～2”、“1～2和4～5”、“1～3和5”等。当数值范围在本文中被描述时，除非另外说明，否则该范围意图包括其端值和在该范围内的所有整数和分数。

在这些实施例中，除非另有指明，所述的份和百分比均按质量计。

“质量份”指表示多个组分的质量比例关系的基本计量单位，1份可表示任意的单位质量，如可以表示为1g，也可表示2.689g等。假如我们说a组分的质量份为a份，b组分的质量份为b份，则表示a组分的质量和b组分的质量之比a：b。或者，表示a组分的质量为ak，b组分的质量为bk(k为任意数，表示倍数因子)。不可误解的是，与质量份数不同的是，所有组分的质量份之和并不受限于100份之限制。

“和/或”用于表示所说明的情况的一者或两者均可能发生，例如，a和/或b包括(a和b)和(a或b)。

下面将结合具体实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

本发明实施例的目的在于提供一种羟基氧化酶cyb5a突变体，其氨基酸序列中有三个位点实现了定点突变，所述三处定点突变分别为：第83位氨基酸由赖氨酸(k)突变为异亮氨酸(i)，第137位氨基酸由脯氨酸(p)突变为精氨酸(r)，第233位氨基酸由谷氨酸(e)突变为缬氨酸(v)。本发明通过对羟基氧化酶cyb5a的氨基酸序列进行多位点定点突变，得到的羟基氧化酶cyb5a突变体对环系列醇类化合物具有较高的转化率，具有很好的工业化应用前景。

将所述羟基氧化酶cyb5a突变体编码基因转入宿主细胞后，得到重组细胞，所述重组细胞能够对环系列醇类化合物进行转化，得到醛类化合物或酮类化合物转化率较高，具有很好的工业化应用前景。采用所述重组细胞对环系列醇类化合物进行转化的方法具有以下优点：反应条件温和，底物适应性高，环境友好，且能够在不外加任何辅酶的反应体系中高效催化高浓度的环系列醇类化合物(例如环丁醇或环丙基甲醇)的氧化反应，生成高纯度的醛类化合物或酮类化合物产品。

对所述羟基氧化酶cyb5a突变体的突变位点以外的其他氨基酸位点的保守取代形式、增加或缺失一个或几个氨基酸的形式、氨基端截断的形式、羧基端截断的形式，这些形式也都包括在本发明的范围内。

实施例1：羟基氧化酶cyb5a突变体的构建

按照quikchangesite-directedmutagenesis(stratagene,lajolla,ca)方法，以含有突变点的核苷酸序列为突变引物(表1)，以含有羟基氧化酶cyb5a基因的pet-30a重组载体为模板进行pcr扩增。

如表1所示，所述突变引物包括：k83i-f1与k83i-r1、k83i-f2与k83i-r2、k83i-f3与k83i-r3。

具体的，所述pcr扩增分3次进行，第一次扩增为采用引物k83i-f1与k83i-r1对含有羟基氧化酶cyb5a基因的pet-30a重组载体进行pcr扩增，第二次扩增为采用引物k83i-f2与k83i-r2对第一次扩增得到的产物进行pcr扩增，第三次扩增为采用引物k83i-f3与k83i-r3对第二次扩增得到的产物进行pcr扩增。

表1突变引物序列

上述表1的引物序列中，下划线标示处为突变位点。

pcr反应体系：

5×primerstarbuffer(mg²⁺plus)，5μl；

dntps(各2.5mm)，2.0μl；

上游引物(10μm)，1.0μl；

下游引物(10μm)，1.0μl；

模板，15ng；

primerstar^tmhsdnapolymerase(2.5u/μl)，0.5μl；

加ddh2o至总体积为25μl。

pcr程序：

(1)98℃，1min；

(2)98℃，10s；

(3)55℃，10s；

(4)72℃，7min。

步骤(2)-(4)循环20次后，72℃，10min，然后冷却至4℃。

第三次pcr扩增得到的产物经清洗后，利用特异性识别甲基化位点的限制性内切酶dpnⅰ进行消化以降解模板质粒。

酶切反应体系：17μl经清洗处理的pcr产物，2.0μl10×缓冲液，1.0μl限制性内切酶dpnⅰ。其中，缓冲液体系为：50mm醋酸钾，20mmtris醋酸盐，10mm醋酸镁，100μg/ml牛血清白蛋白，ph7.9。

酶切反应条件：37℃保温1h。

将上述经酶切处理的pcr产物转化至e.colibl21(de3)中，得到相应的重组大肠杆菌，涂布于含卡那霉素的平板，37℃下培养过夜，随机挑取单克隆进行菌落pcr鉴定和测序验证，结果表明含有羟基氧化酶cyb5a突变体编码基因的重组载体成功转化至表达宿主e.colibl21(de3)中，最终获得羟基氧化酶cyb5a突变体基因工程菌k83i。对基因工程菌k83i中的羟基氧化酶cyb5a突变体的基因序列进行测序，结果显示，突变之后，羟基氧化酶cyb5a突变体的基因序列如序列表中序列3所示，羟基氧化酶cyb5a突变体的氨基酸序列如序列表中序列4所示。

而突变之前，羟基氧化酶cyb5a的基因序列如序列表中序列1所示，羟基氧化酶cyb5a的氨基酸序列如序列表中序列2所示。

具体的，通过对如序列表中序列1所示的羟基氧化酶cyb5a的基因序列与如序列表中序列3所示的羟基氧化酶cyb5a突变体的基因序列进行对比可以看出，第248位碱基由a突变为t，第249位碱基由a突变为t，第250位碱基由a突变为c，第410位碱基由c突变为g，第411位碱基由g突变为c，第697位碱基由a突变为t，第698位碱基由a突变为t。

通过对如序列表中序列2所示的羟基氧化酶cyb5a的氨基酸序列与如序列表中序列4所示的羟基氧化酶cyb5a突变体的氨基酸序列进行对比可以看出，第83位氨基酸由赖氨酸(k)突变为异亮氨酸(i)，第137位氨基酸由脯氨酸(p)突变为精氨酸(r)，第233位氨基酸由谷氨酸(e)突变为缬氨酸(v)。

实施例2：羟基氧化酶cyb5a突变体基因工程菌k83i的诱导表达

将羟基氧化酶cyb5a突变体基因工程菌k83i接种至50μg/ml卡那霉素的lb培养基中，37℃，200rpm培养过夜，再以1％接种量(v/v)接种至含50μg/ml卡那霉素的lb培养基中，37℃，200rpm培养至菌体浓度od600至0.6左右，加入终浓度为0.1mm的iptg，26℃诱导培养6h后，4℃，8000rpm离心10min收集菌体，-80℃储存备用。

图1为基因工程菌k83i表达的羟基氧化酶cyb5a突变体经纯化后的sds-page电泳图，通过对序列表中序列4所示的氨基酸序列进行计算可知，所述羟基氧化酶cyb5a突变体的理论分子量为38.79kda，从图1可以看出，纯化后的羟基氧化酶cyb5a突变体的分子量在35-50之间，与理论值相符。

实施例3：羟基氧化酶cyb5a突变体基因工程菌k83i的发酵罐培养

将基因工程菌k83i接种至50μg/ml卡那霉素的lb培养基中，37℃，200rpm培养过夜，再以2％接种量(v/v)接种至含50μg/ml卡那霉素的lb培养基中，37℃，200rpm培养，在对数中期时以10％接种量(v/v)接种至含15l50μg/ml卡那霉素的发酵培养基的发酵罐中，37℃，培养14h左右(对数中后期)，加入乳糖进行诱导20h后，利用管式离心机离心收集菌体备用。所述发酵培养基可以为本领域所熟知的能够使基因工程菌生长并表达的培养基，例如lb培养基。

实施例4：羟基氧化酶cyb5a突变体基因工程菌k83i转化环丁醇实验

反应体系(10.0ml)：2g实施例3收集的基因工程菌k83i湿菌体细胞，100mm环丁醇，5.0mlna2hpo4-nah2po4缓冲液(100mm，ph7.0)。

反应条件：于37℃，200rpm条件下反应6h。

将反应液用乙酸乙酯萃取，获得含有环丁酮的粗品，对所述粗品提纯后，采用高效液相色谱法(hplc)和核磁共振方法对提纯后的产物进行检测，获得如图2所示的hplc图谱和如图3所示的核磁共振图谱，通过图2和图3可以确认，实施例4中基因工程菌k83i转化环丁醇的主要产物为环丁酮。

实施例5：羟基氧化酶cyb5a突变体基因工程菌k83i转化环丙基甲醇实验

反应体系(10.0ml)：2g实施例3收集的基因工程菌k83i湿菌体细胞，100mm环丙基甲醇，5.0mlna2hpo4-nah2po4缓冲液(100mm，ph7.0)。

反应条件：于37℃，200rpm条件下反应6h。

将反应液用乙酸乙酯萃取，获得含有环丁酮的粗品，对所述粗品提纯后，采用高效液相色谱法和核磁共振方法对提纯后的产物进行检测，获得如图4所示的hplc图谱，通过图4可以确认，实施例5中基因工程菌k83i转化环丙基甲醇的主要产物为环丙甲醛。

实施例6：羟基氧化酶cyb5a突变体基因工程菌k83i催化活性检测

实验组a

反应体系(10.0ml)：2g实施例3收集的基因工程菌k83i湿菌体细胞，100mm环丁醇，5.0mlna2hpo4-nah2po4缓冲液(100mm，ph7.0)。

反应条件：于37℃，200rpm条件下反应。

实验组b

反应体系(10.0ml)：2g未突变的羟基氧化酶cyb5a基因工程菌湿菌体细胞，100mm环丁醇，5.0mlna2hpo4-nah2po4缓冲液(100mm，ph7.0)。

反应条件：于37℃，200rpm条件下反应。

具体的，所述未突变的羟基氧化酶cyb5a基因工程菌指的是包含未突变的羟基氧化酶cyb5a编码基因(如序列表中序列1所示的序列)的基因工程菌。

结果显示，反应3h时，实验组a中环丁醇的转化率仅有2％，而实验组b中环丁醇的转化率则达到99.9％以上。也即是说，反应3h时，未突变的羟基氧化酶cyb5a基因工程菌对环丁醇的转化率仅有2％，而羟基氧化酶cyb5a突变体基因工程菌k83i对环丁醇的转化率则达到99.9％以上。

实施例7：羟基氧化酶cyb5a突变体基因工程菌k83i转化环丁醇的扩大试验

反应体系(10.0ml)：2g实施例3中的基因工程菌k83i湿菌体细胞，不同浓度的环丁醇(10mm/l，100mm/l，300mm/l，500mm/l，800mm/l)，5.0mlna2hpo4-nah2po4缓冲液(100mm，ph7.0)。

反应条件：于37℃，200rpm条件下反应。

结果显示，羟基氧化酶cyb5a突变体基因工程菌k83i在环丁醇浓度为800mm/l的情况下，仍能在反应6h时实现环丁醇的转化率至99％以上。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

此外，本领域的技术人员能够理解，尽管在此的一些实施例包括其它实施例中所包括的某些特征而不是其它特征，但是不同实施例的特征的组合意味着处于本发明的范围之内并且形成不同的实施例。例如，在上面的权利要求书中，所要求保护的实施例的任意之一都可以以任意的组合方式来使用。公开于该背景技术部分的信息仅仅旨在加深对本发明的总体背景技术的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域技术人员所公知的现有技术。

序列表

<110>浙江泽天精细化工有限公司

<120>羟基氧化酶cyb5a突变体与环系列产品的制备方法

<160>4

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>969

<212>dna

<213>homosapiens

<400>1

accattgcgtttaaacatatgtggacccaggattatatttttggcaacgaatgctttccg60

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aacggcaaaatgcagacccgctgcgaacgctgctataaaatttggctgtgccagaaatgc300

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aacaccaactgcgtgggctggaaccgcatgaactgctttaccgaattttggctgatgatg540

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<210>2

<211>323

<212>prt

<213>homosapiens

<400>2

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151015

glucyspheprolyslysmetphetyrtrpserasnlysglnpheile

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protrptrpmetvalserasnglualapheasnalaphealatrpile

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aspglythrglncysilealaphecysgluphealapheglnalaile

505560

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100105110

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<213>人工序列(artificialsequence)

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phealaargmetthrasnproileilevallyslysileleuglucys

260265270

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275280285

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