一种四环素类抗生素降解菌及其在土壤污染修复中的应用的制作方法

【技术领域】

本发明涉及一种四环素类抗生素降解菌及其在土壤污染修复中的应用，属于环境污染物生物处理技术领域。

背景技术：

四环素类抗生素价格低廉且抗菌效果好，同时又是一种生长促进剂，常常被广泛应用到畜牧业中，是我国使用最多的抗生素药物添加剂之一。由于其不能被动物完全吸收或代谢，大约有30％-90％以原药或代谢产物的形式经由动物粪便排放到环境中。含有四环素类抗生素及其衍生物的粪肥不经过标准化处理直接施肥于土壤，导致四环素类抗生素大量地进入到畜产品以及农作物中，对人类的健康以及公共卫生构成危害。低剂量的四环素类抗生素长期排入环境中，会造成敏感菌耐药性的增强。并且，耐药基因可以在环境中扩展和演化，对生态环境及人类健康造成潜在威胁，可能会出现大量带有四环素类抗生素抗性基因的病原菌繁殖，进而增加治疗人类疾病的难度。除了能引起细菌的抗药性，四环素类抗生素以母体或代谢产物的方式通过畜禽排泄物进入自然环境中对其它生物也可能产生一定的毒性，影响环境中植物、动物和微生物的生存。因此，探索有效的修复与治理措施已成为环境领域研究的热点之一。

环境中残留四环素类抗生素的处理方法大致分为物理、化学和生物降解三种。随着污染物处理技术的日益成熟，人们意识到用微生物分解代谢的方法来处理日益增加的环境污染物是一种更为安全、有效的手段。微生物降解抗生素残留技术是一种新型的原位生物修复技术，主要是通过微生物的作用，将环境中的有机污染物转化为co2和h2o等无毒无害或毒性较小的物质。微生物修复具有安全有效、环保无害、绿色廉价和无二次污染等特点，被认为是去除环境中持久性有机污染的最有效手段之一。然而，目标污染物的低生物利用度和艰难的环境如缺乏营养物质，土著微生物的竞争，不利土壤条件的侵害和污染物对生物体的生长毒性将大大降低游离微生物降解的效率。

固定化微生物技术始于20世纪70年代，是由固定化酶技术发展起来的一项技术，最初主要应用于生物反应器中或用作生物催化剂。固定化微生物技术主要是指通过物理或化学的方法将特选的微生物固定在选证的载体上，给微生物提供一个耐环境冲击的良好微环境，使特选的微生物高度密集并保持生物活性，在适宜条件下能够快速、大量增殖的生物技术。这种技术应用于环境中残留抗生素的处理，降低极端ph值和污染土壤中有害物质对微生物的毒害，有利于提高生物反应器内微生物(尤其是特殊功能的微生物)的细胞浓度，保持较高的生物活性，而且还能被反复利用；有利于微生物抵抗不利环境的影响；有利于减少特选的微生物与土著菌的恶性竞争、避免其被噬菌体吞噬。鉴于固定化微生物技术的优点，投加到污染土壤中的游离高效降解菌和土著菌的恶性竞争将会得到解决，使其更容易适应环境，从而达到高效修复污染土壤的目的。为此固定化微生物修复有机污染土壤正受到国内外广大学者的广泛关注。

但是有关四环素类抗生素微生物降解的报道并不多，如研究表明人苍白杆菌、氨基杆菌、蜡状芽抱杆菌、黄抱原毛平革菌和乙酸钙不动杆菌等对土霉素等四环素类抗生素具有较好的降解作用。但是，目前发现的土霉素降解菌株还比较少，而且利用微生物实现对抗生素进行降解，机理比较复杂。目前未见硝化还原假单胞菌pseudomonasnitroreducens降解土壤中土霉素等四环素类抗生素的报道。

因此，为了满足日益扩大的四环素类抗生素污染的微生物修复需求，为抗生素污染的微生物修复提供更多菌种资源，开展土霉素等四环素类抗生素污染微生物修复技术研究，筛选不同类型的土霉素等四环素类抗生素的高效降解微生物菌株，扩大抗生素降解微生物菌种库是十分必要的，可为减低水土壤中四环素类抗生素残留提供有效手段，为农田土壤环境安全提供技术支持。

技术实现要素：

本发明目的是为了解决土壤环境中四环素类抗生素污染问题，提供一种四环素类抗生素降解菌。

本发明的另一个目的在于提供该降解菌在土壤污染修复中的应用。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

一种四环素类抗生素降解菌，其特征在所述降解菌为硝化还原假单胞菌pseudomonasnitroreducens。

本发明中的降解菌菌株通过以下步骤得到：

(1)四环素类抗生素耐受菌的筛选、驯化：用土霉素初始浓度10mg/l的筛选培养基从猪粪样品的菌悬液中筛选菌种，并以土霉素浓度依次是10mg/l、50mg/l、100mg/l、150mg/l、200mg/l、250mg/l的筛选培养基每个浓度转接6次，富集培养驯化获得耐受菌株；

(2)四环素类抗生素降解菌的分离和纯化：将驯化获得的耐受菌株制成耐受菌培养液，用无菌水分别稀释至10^-4、10^-5、10^-6和10^-7的稀释液，然后分别采用平板涂布法和平板划线法进行菌株的分离与纯化获得单一菌株；

(3)将分离纯化的每一单一菌株接种到含四环素类抗生素唯一碳源的无机盐培养基中进行降解实验筛选获得对无机盐培养基中四环素类抗生素降解能力最强的菌株，鉴定为硝化还原假单胞菌pseudomonasnitroreducens，简称硝化还原假单胞菌pn1。

本发明中的猪粪样品采集于广州某良种猪场。

本发明步骤(3)中的四环素类抗生素分别为土霉素和四环素。

一种上述四环素类抗生素降解菌在土壤污染修复中的应用，其特征在于以菌悬液和固定化菌剂形式应用。

本发明四环素类抗生素降解菌在土壤污染修复中的应用形式为菌悬液，该菌悬液通过以下方法制备：

将硝化还原假单胞菌pn1活化后，接种于固体培养基中，并于28℃的恒温恒湿培养箱培养48h至微生物的生物量达到最大，然后用无菌生理盐水将细菌冲洗下来配制成od600为0.5±0.01的菌悬液。

本发明中上述四环素类抗生素降解菌在土壤污染修复中的应用，其特征在于所述的固定化微生物菌剂通过以下方法制备：

将已洗净烘干磨碎的固定化载体灭菌处理后加入无菌无机盐培养基，再加入硝化还原假单胞菌pn1的菌悬液作为接种液接种，混匀密封后于28℃恒温恒湿培养箱培养至生物量最大而制得固定化微生物菌剂。一般培养3天即可达到微生物生物量最大，表象为生物质载体长满菌即可。

本发明中的固定化载体为甘蔗渣、花生壳和稻草杆中的一种或几种。

本发明中四环素类抗生素降解菌在土壤污染修复中的应用，当固定化载体为甘蔗渣时，所述无机盐培养基与处理过的甘蔗渣的用量比为7.5ml：1g，当接种液od600为0.5±0.01，所述接种液与处理过的甘蔗渣的用量比为3.5ml：1g。

本发明中四环素类抗生素降解菌在土壤污染修复中的应用，其特征在于所述微生物菌剂的用量为以蔗渣载体1重量份处理其10倍重量份的污染土壤。

与现有技术相比，本发明有如下优点：

在现有技术中，并未见硝化还原假单胞菌pseudomonasnitroreducens菌株能够高效降解土壤中四环素类抗生素的报道。本发明公开的硝化还原假单胞菌pseudomonasnitroreducens菌株对无机盐培养基和土壤中四环素的降解效果最好，其次是土霉素。与现有技术相比，本发明公开的菌株的分类种属、降解底物类型以及抗生素降解效率均不同，为抗生素污染修复提供了重要的微生物菌种资源，为能够根据主要抗生素残留类型、与介质原生微生物菌群兼容情况等具体应用情况选择不同的抗生素降解菌种提供可能。

本发明制备固定化菌剂所用载体生物质材料甘蔗渣成本低，甘蔗渣固定化菌剂修复土壤四环素类抗生素土霉素和四环素污染安全有效、环保无害、绿色廉价，不会造成二次污染，同时可提高四环素类抗生素的生物可利用性，进而提高微生物降解四环素类抗生素的效率。

本发明提供了一种较好的环境适应能力、可高效降解水体和土壤中四环素类抗生素的菌株及含有该菌株的生物菌剂的制备方法，所述菌剂能够有效去除水体和土壤等不同环境介质中的四环素类抗生素污染，与物理吸附和化学降解等方法相比，具有高效节能和环保等优点。尤其是利用甘蔗渣作为载体将菌体固定，快速、大量增殖微生物的技术，使微生物高度密集并保持生物活性，并延长菌体寿命。本发明的固定化生物菌剂作用效果佳，适应环境能力强。

【附图说明】

图1为本发明固定化菌剂和游离细菌(菌悬液)降解土壤中土霉素的效果；

图2为本发明固定化菌剂和游离细菌(菌悬液)降解土壤中四环素的效果；

图3为非灭菌和灭菌土壤对固定化菌剂降解土壤中土霉素的影响；

图4为非灭菌和灭菌土壤对固定化菌剂降解土壤中四环素的影响；

图5为重金属离子pb²和cd²⁺对固定化菌剂降解土壤中土霉素的影响；

图6为重金属离子pb²和cd²⁺对固定化菌剂降解土壤中四环素的影响；

其中，图1～图6中的横轴都为时间(天)轴，纵轴都为降解率(％)轴；

图1中各条曲线代表的意义为：

—■—对照处理

—●—固定化菌剂处理土壤中土霉素的降解率

—▲—游离细菌(菌悬液)处理土壤中土霉素的降解率

图2中各条曲线代表的意义为：

—■—对照处理

—●—固定化菌剂处理土壤中四环素的降解率

—▲—游离细菌(菌悬液)处理土壤中四环素的降解率

图3中各条曲线代表的意义为：

—■—非灭菌土对照处理

—●—灭菌土对照处理

—▲—非灭菌土固定化菌剂处理土壤中土霉素的降解率

—▼—灭菌土固定化菌剂处理土壤中土霉素的降解率

图4中各条曲线代表的意义为：

—■—非灭菌土对照处理

—●—灭菌土对照处理

—▲—非灭菌土固定化菌剂处理土壤中四环素的降解率

—▼—灭菌土固定化菌剂处理土壤中四环素的降解率

图5中各条曲线代表的意义为：

—■—对照处理

—●—固定化菌剂处理土壤中土霉素的降解率

—▲—pb²⁺+固定化菌剂处理土壤中土霉素的降解率

—▼—cd²⁺+固定化菌剂处理土壤中土霉素的降解率

图6中各条曲线代表的意义为：

—■—对照处理

—●—固定化菌剂处理土壤中四环素的降解率

—▲—pb²⁺+固定化菌剂处理土壤中四环素的降解率

—▼—cd²⁺+固定化菌剂处理土壤中四环素的降解率。

【具体实施方式】

本发明一种四环素类抗生素降解菌，该降解菌为硝化还原假单胞菌pseudomonasnitroreducens，以下简称pn1。

本发明四环素类抗生素降解菌pn1菌株是通过以下步骤得到的：

(1)四环素类抗生素耐受菌的筛选、驯化：

称取1.5g的猪粪样品于100ml无菌水并装有玻璃珠的250ml锥形瓶中，振荡约30min，使样品和水充分混合，打散猪粪颗粒，将细胞分散，并形成均匀的菌悬液；配制筛选培养基，土霉素的初始浓度为10mg/l，筛选培养基及各种实验用品实验前均置于高压蒸汽灭菌锅中，121℃灭菌30min，待灭菌锅气压下降后迅速转移至无菌操作台上灭菌60min，灭菌完毕进行接菌操作；往平板中加入筛选培养基冷凝，培养基处于半凝固状态时往每个平板中各滴加菌悬液2滴，用涂布棒涂抹均匀，接种完毕后置于28℃恒温培养箱中进行恒温培养7d，定时每两天观察筛菌情况；将筛得的优活菌转接于固体培养基中，以土霉素10mg/l的浓度转接6次，以使其中的土霉素降解菌在数量上占有绝对优势，接着继续培养驯化，驯化过程除抗生素浓度变化，其它培养条件不变，土霉素的浓度依次是50mg/l、100mg/l、150mg/l、200mg/l、250mg/l，每个浓度转接6次，通过采用在原有土霉素浓度基础上逐渐提高的方法来对所得菌株进行驯化，以最终获得可以耐受并降解较高浓度土霉素的微生物菌株。

(2)四环素类抗生素降解菌的分离和纯化：

将耐受菌株用生理盐水洗至液体培养基中制成耐受菌培养液，取耐受菌培养液1ml，用无菌水分别稀释至10^-4、10^-5、10^-6和10^-7的稀释液，然后分别进行平板涂布培养，培养条件是28℃恒温培养箱，48h后待培养基长出菌落后，从平板上挑取单菌落进行下一步划线分离培养，利用划线法转接培养6次，菌株得以纯化，最终获得单一菌株。

(3)将分离纯化的每一单一菌株接种到含四环素类抗生素唯一碳源的无机盐培养基中进行降解实验，考察单一菌株对无机盐培养基中四环素类抗生素的降解能力，其中的四环素类抗生素选自土霉素和四环素。

本发明中四环素类抗生素降解能力测试方法为：将纯化后的每一单一菌株接种于固体培养基中，并将于28℃的恒温恒湿培养箱培养48h至微生物的生物量达到最大，然后用无菌生理盐水将细菌冲洗下来制成od600为0.5的菌体悬液作为接种液，将接种液接种至分别以250mg/l土霉素和四环素为唯一碳源的无机盐培养基中，其中每100ml无机盐培养基投菌量为1ml/l，置于28℃，摇床转速为160rpm条件下避光培养，定时取样检测无机盐培养基中四环素类抗生素的的残留量，设置3个平行样，根据检测结果可知，编号为otc-1菌株对四环素类抗生素降的具有较强的降解能力，在5d内对浓度为250mg/l四环素去除效率最高，达到95.90％，其次是土霉素，去除率为90.44％。最后筛选获得一株降解能力较好生长性能稳定的四环素类抗生素降解菌作为目标菌株，其编号为otc-1，

菌株otc-1的分子鉴定，委托广州天一辉远基因科技有限公司进行，经过dna提取，pct扩增，序列测序及序列对比，菌株otc-1的16srdna序列与硝化还原假单胞菌pseudomonasnitroreducens的同源性达到99％以上，亲缘关系最近，鉴定为硝化还原假单胞菌pseudomonasnitroreducens，简称硝化还原假单胞菌pn1。

本发明中的实验材料如下：

筛选培养基：k2hpo40.5g，kh2po40.5g，nacl0.2g，mgso40.2g，nh4no31.0g，微量元素溶液10ml，蒸馏水1000ml，ph7.2，四环素类抗生素按实验需要量加入。

液体培养基：k2hpo40.5g，kh2po40.5g，nacl0.2g，mgso40.2g，nh4no31.0g，微量元素溶液10ml，蒸馏水1000ml，ph7.2，四环素类抗生素按实验需要量加入。固体培养基需加20-25g琼脂。

无机盐培养基：k2hpo40.5g，kh2po40.5g，nacl0.2g，mgso40.2g，nh4no31.0g，微量元素溶液10ml，蒸馏水1000ml，ph7.2。

微量元素溶液：feso40.1g/l，mnso40.1g/l，znso40.1g/l，na2moo40.01g/l，cacl20.1g/l，mgso43g/l，cuso40.1g/l。

生理盐水：0.9％的氯化钠溶液，可维持细胞的正常形态。

上述各种实验材料实验前均置于高压蒸汽灭菌锅中，121℃灭菌30min。

下面结合具体实施例对本发明作进一步地详细说明

实施例1：四环素类抗生素降解菌生物菌剂对土壤中土霉素的耐受和土霉素污染土壤的修复试验

将硝化还原假单胞菌pn1活化后，接种于固体培养基中，并将于28℃的恒温恒湿培养箱培养48h至微生物的生物量达到最大，然后用无菌生理盐水分别将细菌冲洗下来制成od600为0.5±0.01的菌悬液作为pn1接种液。

供试赤红壤取自华南农业大学树木园，其质地为粉沙质土壤，ph值(水/土＝2.5/1)为4.52，有机质为0.57g/kg，含水率为0.85％，氮、磷、钾为别0.71g/kg、0.72g/kg、2.61g/kg，土霉素未检出，过2mm筛；在100g过2mm筛的土壤中加入溶解于甲醇的土霉素溶液，搅拌均匀，室内风干后再与900g过2mm筛的土壤混合均匀，即制得人工模拟土霉素污染土壤，暗箱培养污染土壤4周，实验前测定污染土壤中土霉素的初始浓度为100.28mg/kg。

甘蔗渣固定化微生物菌剂的制备：称取已洗净烘干磨碎甘蔗渣1g于100ml烧杯中，每组平行三个，同时准备空的100ml烧杯用作游离微生物的培养，一起置于1.5mpa的高压灭菌锅中灭菌30min，待灭菌锅气压下降后迅速转移至无菌操作台上，在紫外灯下灭菌冷却到室温，然后往每个烧杯中各加入7.5ml无菌的无机盐培养基，再加入3.5ml的pn1接种液，分别混匀，密封贴标，置于28℃的恒温恒湿的培养箱中培养至3天后生物量最大。

然后，分别加入10g土霉素污染土壤进行修复试验，土霉素污染土壤修复试验设置以下2种处理：

处理1：对照处理(不加菌)；

处理2-1：固定化微生物菌剂处理(甘蔗渣1g+3.5mlpn1接种液)；

处理2-2：游离细菌(菌悬液)处理(加3.5mlpn1接种液)。

每种处理下有21个烧杯，分别于第0、5、10、15、20、25和30d取样测定土霉素的残留量，每种处理设置3个平行。试验中通过加入7.5ml无菌的无机盐培养基，保持各处理中受试土壤的含水率为50％左右。处理结束后，根据所测定的各处理污染土壤中土霉素的残留量并计算土霉素的降解率。

对于同等土霉素污染水平的土壤，处理30d后，土霉素的降解率在对照处理(不加菌)、固定化微生物菌剂处理和游离细菌(菌悬液)处理中分别为：4.99％，75.12％和59.22％(见图1)。实验结果表明，pn1菌株可耐受土霉素，且对土霉素有高效的降解活性。以不加菌对照为参比，固定化菌剂的土霉素的降解率高出了70.13％，比游离细菌(菌悬液)的土霉素的降解率高出了15.90％，这说明固定化菌剂对土壤中土霉素的降解效果大大优于游离细菌。

实施例2：四环素类抗生素降解菌生物菌剂对土壤中其他四环素类抗生素(如四环素)的耐受和其他四环素类抗生素污染土壤的修复试验

将硝化还原假单胞菌pn1活化后，接种于固体培养基中，并将于28℃的恒温恒湿培养箱培养48h至微生物的生物量达到最大，然后用无菌生理盐水分别将将细菌冲洗下来制成od600为0.5±0.01的菌悬液作为接种液。

供试赤红壤取自华南农业大学树木园，其质地为粉沙质土壤，ph值(水/土＝2.5/1)为4.52，有机质为0.57g/kg，含水率为0.85％，氮、磷、钾为别0.71g/kg、0.72g/kg、2.61g/kg，四环素未检出，过2mm筛，在100g过2mm筛的土壤中加入溶解于丙酮的四环素溶液，搅拌均匀，室内风干后再与900g过2mm筛的土壤混合均匀，即制得人工模拟四环素污染土壤，暗箱培养污染土壤4周，实验前测定污染土壤中四环素的初始浓度为83.13mg/kg。

甘蔗渣固定化微生物菌剂的制备：同实施例1相同。

然后，分别对1g四环素污染土壤进行修复实验，四环素污染土壤修复试验设置以下2种处理：

处理1：对照处理(不加菌)；

处理2-1：固定化微生物菌剂处理(甘蔗渣1g+3.5mlpn1接种液)；

处理2-2：游离细菌(菌悬液)处理(加3.5mlpn1接种液)。

每种处理下有21个烧杯，分别于第0、5、10、15、20、25和30d取样测定四环素的残留量，每种处理设置3个平行。试验中通过加入7.5ml无菌的无机盐培养基，保持各处理中受试土壤的含水率为50％左右。处理结束后，根据所测定的各处理污染土壤中四环素的残留量并计算四环素的降解率。

对于同等四环素污染水平的土壤，处理30d后，四环素的降解率在对照处理(不加菌)、固定化微生物菌剂处理和游离细菌(菌悬液)处理中分别为：5.40％，78.37％和64.15％(见图2)。实验结果表明，pn1菌株也可耐受其他四环素类抗生素，且对其他四环素类抗生素也有高效的降解活性。相比于不加菌对照组，固定化菌剂的四环素的降解率高出了72.97％，比游离细菌(菌悬液)的四环素的降解率高出了14.22％，这说明固定化菌剂对四环素的降解效果大大优于游离细菌。

基于四环素类抗生素降解菌生物菌剂对降解土壤中土霉素和四环素的效果比较的结果可知，固定化微生物菌剂修复四环素类抗生素污染土壤的效果优于游离细菌。

实施例3：非灭菌和灭菌土壤的影响试验

接种液制备同实施例1，各处理所加菌均为固定化微生物菌剂，供试土壤和甘蔗渣固定化微生物菌剂的制备同实施例1和例2，实验前测定污染土壤中的土霉素和四环素的初始浓度为100.28mg/kg和83.13mg/kg。

本实施例设置以下4个处理：

处理1：非灭菌土对照处理(不加菌)

处理2：灭菌土对照处理(不加菌)

处理3：非灭菌土加固定化微生物菌剂处理

处理4：灭菌土加固定化微生物菌剂处理。

每种处理下有21个烧杯，分别于第0、5、10、15、20、25和30d取样测定土霉素和四环素的残留量，每种处理3个平行。试验中保持各处理中受试土壤的含水率为50％左右。处理结束后，测定各处理污染土壤中土霉素和四环素的残留量并计算土霉素和四环素的降解率。

对于同等土霉素污染水平的土壤，无论土壤灭菌与否加菌处理前15d，土霉素的降解率迅速增加，15d后土霉素的降解率缓慢增大(见图3)。加入加固定化微生物菌剂处理处理30d后，不管土壤是否灭菌，土壤中土霉素的降解率相差很小，非灭菌土中土霉素的降解率达到75.12％，略高于灭菌土中土霉素的降解率72.64％，由此可见，非灭菌和灭菌对固定化菌剂降解土壤中的土霉素的影响较小。

对于同等四环素污染水平的土壤，无论土壤灭菌与否加菌处理前15d，四环素的降解率迅速增加，15d后四环素的降解率缓慢增大，25d后降解率变化趋于平缓(见图4)。加入固定化微生物菌剂处理30d后，不管土壤是否灭菌，土壤中四环素的降解率相差很小，非灭菌土中四环素的降解率达到78.37％，略高于灭菌土中四环素的降解率75.77％，由此可见，非灭菌和灭菌对固定化菌剂降解土壤中的四环素的影响较小。

实施例4：土壤中重金属离子pb²⁺和cd²⁺的影响实验

接种液制备同实施例1，各处理所加菌均为固定化微生物菌剂，供试土壤和甘蔗渣固定化微生物体系的制备同实施例1和例2，此外设置两个不同土壤环境，设置pb²⁺和cd²⁺浓度分别为285.6mg/kg、129.7mg/kg，实验前测定污染土壤中的土霉素和四环素的初始浓度为100.28mg/kg和83.13mg/kg。

本实施例设置以下4个处理：

处理1：对照处理(不加菌)

处理2：加固定化微生物菌剂处理

处理3：pb²⁺+加固定化微生物菌剂处理(pb²⁺+固定化菌剂(1ml：1g))

处理4：cd²⁺+加固定化菌剂处理(cd²⁺+固定化菌剂(1ml：1g))。

每种处理下有21个烧杯，分别于第0、5、10、15、20、25和30d取样测定土霉素和四环素的残留量，每种处理3个平行，试验中保持各处理中受试土壤的含水率为50％左右。处理结束后，测定各处理污染土壤中土霉素和四环素的残留量并计算土霉素和四环素的降解率。

土壤中重金属离子pb²⁺和cd²⁺的存在对固定化菌剂修复土霉素和四环素污染土壤均有一定的影响。

由图5可见，对于同等土霉素污染水平的土壤，加入固定化菌剂处理30d后，无重金属离子加菌处理、pb²⁺+加菌处理和cd²⁺+加菌处理降解率分别为75.12％、71.28％和70.02％，pb²⁺存在时土壤中土霉素的降解率较无pb²⁺存在时的降解率降低了3.84％，cd²⁺存在时土壤中土霉素的降解率较无cd²⁺存在时的降解率降低了5.10％，即便土壤中存在重金属离子pb²⁺和cd²⁺，固定化菌剂对土壤中土霉素的降解率仍可达到70％以上，仅仅比无pb²⁺和cd²⁺存在低了3到5个百分比，可见重金属离子pb²⁺和cd²⁺对固定化菌剂降解土壤中土霉素影响比较小，固定化菌剂具有较好的环境适应能力。

由图6可见，对于同等四环素污染水平的土壤，加入固定化菌剂处理30d后，无重金属离子加菌处理、pb²⁺+加菌处理和cd²⁺+加菌处理降解率分别为78.37％、75.28％和74.49％，pb²⁺存在时土壤中四环素的降解率较无pb²⁺存在时的降解率降低了3.09％，cd²⁺存在时土壤中四环素的降解率较无cd²⁺存在时的降解率降低了3.88％，即便土壤中存在重金属离子pb²⁺和cd²⁺，固定化菌剂对土壤中四环素的降解率仍可达到74％以上，仅仅比无pb²⁺和cd²⁺存在低了3到4个百分比，可见重金属离子pb²⁺和cd²⁺对固定化菌剂降解土壤中四环素的影响比较小，固定化菌剂具有较好的环境适应能力。

可见，本发明提供的固定化菌剂是一种微生物密度大、抗毒性强，对目标污染物毒性的耐受性高，目标污染物的去除效率高，比游离微生物具有更宽的温度和ph范围和耐环境冲击的菌剂。本发明中，将筛选出来的降解菌硝化还原假单胞菌pseudomonasnitroreducens固定在甘蔗渣载体上可以使得微生物能够快速、大量增殖，同时给微生物提供一个良好的生长微环境，从而能够高效降解土壤中的四环素类抗生素。

本发明中以甘蔗渣为载体，构建高效稳定的生物质材料固定化微生物体系。生物质材料甘蔗渣固定化微生物体系的甘蔗渣载体不仅可以屏蔽土著微生物的竞争和克服对微生物存活构成严重威胁的不利土壤环境条件，从而保证接种的高效降解微生物的良好生长，进而提高引入的微生物的存活率和活性，还可吸附富集土壤中的四环素类抗生素污染物，从而增加四环素类抗生素的生物可利用性，提高固定在其表面上的微生物降解四环素类抗生素的效率。同时生物质材料甘蔗渣是农业废弃物，具有多孔性质、机械强度高、含有丰富的c、n等营养元素；能够提供必需的有机物和营养物以支持微生物生长；可向土壤释放天然有机质，改善土壤理化性质，促进土壤微生物存活率和活性，增强四环素类抗生素的去除；对微生物有很高的亲和性；在土壤中可自然降解、易于处理、简单环保，不会造成二次污染；且价格低廉易得。