一种耐盐反硝化细菌菌株、菌液、筛选方法和应用与流程

本发明涉及微生物分离和应用的技术领域，更具体地说，它涉及一种耐盐反硝化细菌菌株、菌液、筛选方法和应用。

背景技术：

近年来，氮素污染已成为我国地表水环境安全的一大隐患，水体中氨氮污染不仅会引起富营养化等一系列环境问题同时也威胁着人类健康。以微生物为主体的生物修复技术以其高效率、低成本的优势在污染水体脱氮中展示出了巨大的应用前景。微生物通过反硝化作用，将no^3-或no^2-还原为气态氮释放至大气，是整个地球氮素循环过程中的关键步骤，在整个氮循环过程中占有重要的地位。

在反硝化过程中一般以有机碳作为电子供体，硝酸盐或亚硝酸盐作为电子受体。除细菌外，古菌、真核生物都能够进行反硝化作用。微生物的生长、繁殖以及代谢活动受外界环境条件的影响较大，如温度、ph、营养物质，不同种类微生物最适生长条件差异非常大。

技术实现要素：

针对现有技术存在的不足，本发明的第一个目的在于提供一种耐盐反硝化细菌菌株，其具有耐受高盐、高硝态氮浓度的优点。

本发明的第二个目的在于提供一种耐盐反硝化细菌菌株的筛选方法，其具有高效、快速筛选耐高盐高硝态氮废水的降解菌，且能够保证该菌耐高盐高硝态氮性质稳定性的优点。

本发明的第三个目的在于提供一种采用上述耐盐反硝化细菌菌株制备的菌液，该菌液应用于高盐高硝态氮废水中，进行硝态氮的高效降解。

本发明的第四个目的在于提供一种耐盐反硝化细菌菌株在高盐高硝态氮废水治理中的应用，该菌种对高盐高硝态氮废水的处理工艺操作简单、出水水质良好、硝态氮和总氮的脱除率高。

为实现上述第一个目的，本发明提供了如下技术方案：一种耐盐反硝化细菌菌株，所述耐盐反硝化细菌菌株为粪产碱菌（alcaligenesfaecalis），命名为hqfxh-11，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心(cgmcc)，地址：中国，北京，保藏编号为：cgmccno.19105，保藏时间：2019年12月6日。

进一步地，所述粪产碱菌单菌落为黄白色、干燥、不规则圆形且不透明状态。

为实现上述第二个目的，本发明提供了如下技术方案：

一种耐盐反硝化细菌菌株的筛选方法，包括以下步骤：

s1反硝化菌株的分离：

菌种驯化：将从高含盐废水排污口附近采集样本，称取适量样本悬浮于无菌水中，在室温下接种至反硝化培养基（nm）中，所述反硝化培养基的成分为：硝酸钾为0.01-1.0g/l，氯化钠为10-60g/l，磷酸二氢钾0.01-1.0g/l，乳酸钠为0.1-5g/l，121℃灭菌20min后冷却至室温后接种；每隔3d检测其中no3^-、no2^-以及nh4⁺，直至硝酸盐去除率为100%且去除速率稳定，得到初筛的水样的菌液；

涂布培养：取1ml经过初筛的水样的菌液均匀涂布于固体显色培养基（gn），涂布，30℃恒温培养箱中培养，得到蓝色的单菌落；

菌种的筛选：挑取固体显色培养基中蓝色的单菌落接种于3ml灭菌的液体显色培养基中，在30℃、150r/min摇床培养，选择能使显色培养基由绿色变成蓝色的菌株作为复筛菌；

s2菌株的分子生物学鉴定：将进一步得到的单一菌落反硝化菌株通过16srrna检测对反硝化菌株进行鉴定；

s3耐盐反硝化菌株的耐盐反硝化性能分析：

将单一菌落的反硝化菌株接种在以柠檬酸三钠为碳源、硝酸钾为唯一氮源的高盐液体培养基中，测定不同培养时间下硝态氮以及总氮的去除率。

通过采用上述技术方案，通过菌种驯化、涂布和筛选分离出了具有在高盐高硝态氮条件下对硝态氮高效处理的反硝化菌株alcaligenesfaecalishqfxh-11，同时高效简便地实现了对菌株alcaligenesfaecalishqfxh-11的耐盐反硝化性能的分析比较。

进一步地，所述反硝化培养基的成分为：硝酸钾为0.6g/l，氯化钠为40g/l，磷酸二氢钾为0.09g/l，乳酸钠2g/l。

通过采用上述技术方案，进一步优化了进行菌种驯化的培养基的配方配比，使其驯化过程更加高效，驯化结果优，得到的菌株的耐盐反硝化性能更好。

进一步地，所述显色培养基的配方为：硝酸钾为1g/l，柠檬酸钠为8.5g/l，氯化钠为40g/l，l-天冬酰胺为1.0g/l，磷酸二氢钾为1g/l，七水合硫酸镁为1g/l，六水合氯化钙为0.2g/l，六水合氯化铁为0.05g/l，0.1%（v/v）的1%（wt）的百里酚蓝，调节ph为7.0；在液体显色培养基中加入2%的琼脂即可制备得到固体显色培养基，121℃高温灭菌20min。

通过采用上述技术方案，由于对鉴定培养基的配方配比进行了限定，在这样的显色培养基的制备配方下，使得反硝化菌株的鉴定结果更加准确。

为实现上述第三个目的，本发明提供了采用上述耐盐反硝化细菌菌株制备的菌液。

进一步地，包括以下步骤：于包含40%nacl的lb培养基中接种耐盐反硝化细菌菌株，在28-32℃、140-160r/min条件下恒温振荡培养10-13h，选取od600为0.4-0.6的菌液为菌株菌液。

通过采用上述技术方案，培养得到具备对高盐高氮环境耐受性好、反硝化能力强的菌株。

为实现上述第四个目的，本发明提供了如下技术方案：一种耐盐反硝化细菌菌株在高盐高硝态氮废水治理中的应用。

进一步地，将所述菌株按照2-10%的接种量添加到高盐高硝态氮的废水中进行硝态氮的去除。

进一步地，所述菌株处理的废水中硝态氮含量为30-120mg/l，氯化钠的含量为40g/l，ph为5.0-9.0。

通过采用上述技术方案，将本发明筛选得到的耐盐反硝化细菌菌株应用于高盐高硝态氮含量的废水处理中，具有高效脱除高盐高硝态氮废水中的硝态氮的效果。

综上所述，本发明具有以下有益效果：本发明通过驯化、筛选、分离得到了耐高盐高硝态氮的菌株，并提供了一种高效筛选耐盐反硝化细菌菌株的方法。同时，优化了耐盐反硝化细菌菌株的培养条件，使得本发明的反硝化细菌菌株在较高盐度环境下有效脱除废水中的硝态氮，硝态氮的去除率高达90%，总氮的去除率达70%。该处理工艺操作简单，出水水质良好，处理成本低，可以在此基础上进行工程应用。

附图说明

图1是不同碳源对菌株alcaligenesfaecalishqfxh-11生长的影响图；

图2是反硝化培养基中菌株alcaligenesfaecalishqfxh-11对硝态氮的利用及生长曲线。

具体实施方式

本发明提供了一种耐盐反硝化细菌菌株，并且提供了该菌种的培养方法及其在降解高盐高硝态氮废水中对硝态氮的最佳处理工艺。该菌株是从福建省泉州市惠安县中化泉州石化有限公司污水排放口附近的污泥中分离，并经过循环驯化得到的。经鉴定该菌株为粪产碱菌（alcaligenesfaecalis），命名为alcaligenesfaecalishqfxh-11，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心(cgmcc)，保藏地址：中国北京，保藏编号为：cgmccno.19105，保藏时间：2019年12月6日。该菌株可以在较高盐度环境下有效脱除废水中的硝态氮，硝态氮的脱除率高达到90%，总氮的去除率也可到达70%。该处理工艺操作简单，出水水质良好，处理成本低，可以在此基础上进行工程应用。

以下结合附图和实施例对本发明作进一步详细说明。

其中，lb培养基市售获得。

制备例一

反硝化培养基的制备

反硝化培养基的配方为：硝酸钾0.01g/l，氯化钠10g/l，磷酸二氢钾0.01g/l，乳酸钠0.1g/l。反硝化培养基的制备步骤为：将各原料的混合后搅拌均匀，于121℃灭菌20min，待培养基冷却至室温后接种。

制备例二

反硝化培养基的制备

反硝化培养基的配方为：硝酸钾1.0g/l，氯化钠60g/l，磷酸二氢钾1.0g/l，乳酸钠5.0g/l。反硝化培养基的制备步骤为：将各原料的混合后搅拌均匀，于121℃灭菌20min，待培养基冷却至室温后接种。

制备例三

反硝化培养基的制备

反硝化培养基的配方为：硝酸钾0.6g/l，氯化钠40g/l，磷酸二氢钾0.09g/l，乳酸钠2.0g/l。反硝化培养基的制备步骤为：将各原料的混合后搅拌均匀，于121℃灭菌20min，待培养基冷却至室温后接种。

制备例四

显色培养基的制备

显色培养基的配方为：硝酸钾1.0g/l，柠檬酸钠8.5g/l，氯化钠40g/l，l-天冬酰胺1.0g/l，磷酸二氢钾1.0g/l，七水合硫酸镁1.0g/l，六水合氯化钙0.2g/l，六水合氯化铁0.05g/l，1%（wt）的百里酚蓝的添加量为0.1%（v/v），调节ph为7.0；在液体显色培养基中加入2%的琼脂即可制备得到固体显色培养基。显色培养基的制备步骤为：将各原料的混合后搅拌均匀，121℃高温灭菌20min，待培养基冷却至室温后接种。

实施例一

耐高盐高硝态氮的反硝化菌株的驯化及筛选步骤如下：

（1）从福建省泉州市惠安县中化泉州石化有限公司采集的样品，以体积为6%的接种量将样本接种在制备例3制备得到的反硝化培养基上，异养反硝化细菌菌株驯化过程中每隔3天检测反硝化培养基中no^3-、no^2-以及nh⁴⁺的含量，直到反硝化性能稳定，即硝酸盐去除率为100%且去除速率稳定，培养基每周更换一次。

（2）涂布培养：取1ml经过初筛的水样的菌液均匀涂布于固体显色培养基上，30℃恒温培养箱中培养24h。

（3）菌种的筛选：为进一步验证所挑取的单菌落具有使显色培养基变蓝的特性，挑取步骤（2）中固体显色培养基中蓝色的单菌落并接种于3ml灭菌的液体显色培养基中，置于摇床中，在30℃、150r/min的条件下培养24h，观察其颜色变化，选择能使显色培养基由绿色变成蓝色的菌株作为复筛菌，其od600为0.4-0.6。在复筛过程中，根据显色培养基的变色程度及产生的气泡量，从表观初步判断菌株alcaligenesfaecalishqfxh-11具有较强的反硝化能力。

实施例二

菌株的分子生物学鉴定

培养24h后反硝化菌株在lb培养基中的形态特征为：单菌落为不规则圆形、干燥、黄白色、不透明状态，通过16srrna鉴定为alcaligenesfaecalis。本发明的菌株的16srrna鉴定中的序列表见附件。

实施例三：菌株alcaligenesfaecalishqfxh-11的培养

（1）不同碳源对菌株alcaligenesfaecalishqfxh-11生长的影响

配置不同的液体培养基，每种培养基以硝酸钾为唯一氮源，加入40g/l氯化钠，分别以葡萄糖、甲醇、乙酸钠、柠檬酸三钠、乳酸钠为唯一碳源，碳源的加入量均为2g/l，在121℃灭菌20min后接种处于对数生长期的菌株alcaligenesfaecalishqfxh-11，按初始接种量（od600为0.1）接种至硝化培养基中振荡培养，测定od600，结果如图1所示：选择碳源为柠檬酸三钠为唯一碳源且柠檬酸三钠的添加量为2g/l的时候，菌株alcaligenesfaecalishqfxh-11的生长状况最好，其od600为2.2。

（2）菌株alcaligenesfaecalishqfxh-11反硝化能力检测

s2-1制备种子液：将实施例一中筛选得到的alcaligenesfaecalishqfxh-11单菌落接种于lb培养基中（含40g/l氯化钠），在30℃、150r/min条件下恒温振荡培养12h，其od600为0.5即可；

s2-2离心收集菌体：2500r/min转速，20min离心时间，弃上清；

s2-3接种：将s2-2收集的alcaligenesfaecalishqfxh-11的菌体重悬液接种至以硝酸钾为唯一氮源的反硝化培养基中，反硝化培养基包含40g/l的氯化钠，随后在30℃、150r/min的条件下摇床培养；

s2-4间隔取样测定：分别于培养时间为2h、6h、12h、24h、30h、36h、48h、60h，测定上清液中no^2--n、no^3--n、nh⁴⁺-n和培养基中od600随时间的变化，结果如下图2所示：培养基中od600随着培养时间的增加，逐渐增大，在培养时间为48h的时候，其od600达到最大值1.0，本发明的菌株alcaligenesfaecalishqfxh-11在培养基中增殖；而上清液中no^3--n的初始含量为52mg/l，其含量随着培养时间的增加逐渐降低，在培养时间为30h的时候，其含量为1.2mg/l，说明在培养时间为0~30h期间，发生的反硝化作用较强，上清液中的no^3--n逐渐在本发明菌株alcaligenesfaecalishqfxh-11的反硝化作用下转化生成no^2--n、nh⁴⁺-n和n2等，最终含量为0.7mg/l；与no^3--n的含量变化相对应的，上清液中no^2--n和nh⁴⁺-n的初始含量较低，分别为0.4mg/l和1.0mg/l，但随着培养时间的增加，no^2--n在上清液中含量先增加，后减小，在培养时间为24h的时候no^2--n的含量最高，为1.6mg/l，而此时nh⁴⁺-n的含量为0.85mg/l，从氮平衡的角度考虑，此时大部分no^3--n转化n2；培养时间大于24h时，随着培养时间的增加，上清液中nh⁴⁺-n的含量逐渐增加，最终为1.9mg/l，上清液中no^2--n的含量逐渐降低，最终为0.95mg/l。综上所述，本发明菌株alcaligenesfaecalishqfxh-11的反硝化效率为98%。

实施例四：菌株alcaligenesfaecalishqfxh-11在高含盐高硝态氮废水治理中的应用

针对菌株alcaligenesfaecalishqfxh-11的反硝化能力，用于降解高含盐高硝态氮工业废水治理。将菌株alcaligenesfaecalishqfxh-11接种至高含盐高硝态氮（调节no^2--n和no^3--n的初始浓度，使得总氮浓度约为65mg/l，ph为7，其中盐浓度为40g/l）废水中，依照实施例三中的方法，选取利用lb培养基进行培养od600为0.5的菌液按照体积6%的接种量接种到高盐高硝态氮废水中，在30℃、150r/min的摇床上进行培养36h后，硝态氮的去除率高达90%，总氮的去除率达70%。

本具体实施例仅仅是对本发明的解释，其并不是对本发明的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本发明的权利要求范围内都受到专利法的保护。

序列表

<110>北京翰祺环境技术有限公司

<120>一种耐盐反硝化细菌菌株、菌液、筛选方法和应用

<130>wzf015pta01f1909975

<160>1

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>860

<212>dna

<213>粪产碱菌(alcaligenesfaecalis)

<400>1

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