本发明属于微生物领域，特别涉及一种纤维素酶、木聚糖酶和果胶酶的制备方法。
背景技术：
为了尽可能地保留凉茶中风味成分，凉茶多采用低温提取，使凉茶渣与原药材具有相似的营养与活性成分。谢月琴等报道凉茶渣干物质含量为20.55％，其中粗纤维28.83％、粗蛋白9.78％、粗脂肪3.52％、粗灰分6.68％。凉茶渣具有较好的营养和药用价值，是一类未被充分利用的生物资源。近年来，随着凉茶产业的快速发展，凉茶渣的排放也在逐年增加，凉茶渣日产量达到680t。传统的凉茶渣多采用直接堆放、填埋等方式处理，造成了严重资源浪费和环境污染。由于场地限制而不能及时处理，凉茶渣甚至对企业生产也产生较大影响。对凉茶渣进行资源化、高值化利用已经成为企业和社会必须面临的重大问题。
黑曲霉(aspergillusniger)属于真核生物子囊菌亚门丝孢目丛梗孢科，是一种常见的安全无毒性的曲霉属真菌，是制酱、酿酒、制醋、糖化饲料的主要工业菌种，广泛分布于世界各地的粮食、植物性产品和土壤中。黑曲霉可用于生产淀粉酶、酸性蛋白酶、纤维素酶、果胶酶、葡萄糖氧化酶、柠檬酸、葡糖酸和没食子酸等。
纤维素酶、木聚糖酶和果胶酶是降解植物细胞壁的主要酶类，是提高饲料和食品利用率的重要酶类。利用黑曲霉等固态发酵生产的纤维素酶等酶类，经过干燥后依然具有较强的酶活性。
焦巧芳等以筛选的棘孢木霉为菌种，利用黄芪渣、麸皮和淀粉等组成的培养基同时生产纤维素酶、木糖酶和果胶酶，三种酶活力分别约为1200u/ml、1000u/ml、1000u/ml。本发明与该文献相比，不用添加麸皮和淀粉，且加入较少的水进行固态发酵，使工艺更简单，成本更低。
根据现有问题，本发明致力于研究以黑曲霉为菌种，利用凉茶渣固态发酵生产这三种酶的廉价高效的工艺，具有重要的社会意义和经济价值。
技术实现要素：
本发明的首要目的在于提供一种纤维素酶、木聚糖酶和果胶酶的制备方法。
为达到上述目的，本发明所采取的技术方案是：
本发明的第一方面，提供了一种生产纤维素酶、木聚糖酶和果胶酶的方法，包含以下步骤：将黑曲霉菌种制备成菌悬液，接种到凉茶渣培养基上发酵；所述凉茶渣包括鸡蛋花、金银花、菊花、凉粉草、夏枯草、甘草和布渣叶。
根据本发明的实施例，还包括预先将黑曲霉菌活化、传代，所述活化将黑曲霉菌接种到pda固体培养基培养。
根据本发明的实施例，培养条件为50％～90％湿度，28℃～37℃，培养24～240h。
根据本发明的实施例，所述传代为1～3次。
根据本发明的实施例，所述菌悬液浓度为105～109cfu/ml，优选2×107cfu/ml的黑曲霉菌悬液。
根据本发明的实施例，接种量为5％～25％，发酵温度为28℃～37℃，发酵时间为3～7天。
根据本发明的实施例，发酵时的含水量为65％～85％。
根据本发明的实施例，所述凉茶渣培养基包括：凉茶渣粉末1～5份，加入硫酸铵0.04～0.20份，葡萄糖0～0.1份，磷酸二氢钾0.005～0.02份，磷酸氢二钾0.002～0.020份，水5.5～8.5份。
根据本发明的实施例，凉茶渣粉末2份，加入硫酸铵0.08份，葡萄糖0.04份，磷酸二氢钾0.01份，磷酸氢二钾0.008份，水7份。
根据本发明的实施例，所述凉茶渣粉末制备方法：将鸡蛋花、金银花、菊花、凉粉草、夏枯草、甘草和布渣叶混合，煎制后得到的凉茶渣，再干燥粉碎。
本发明使用黑曲霉为单一菌种，在计算各种酶活力时，扣除酶液中原有的还原糖的影响，且使用酶的原液进行计算。
本发明的有益效果是：
本发明公开了使用黑曲霉固态发酵凉茶渣生产的纤维素酶、木聚糖酶和果胶酶的工艺，当硫酸铵用量为4％，葡萄糖用量为2％，菌种浓度为2×107cfu/ml，接种量为10％时，含水量为70％，浸泡液ph为9，发酵温度为31℃，发酵7天，是纤维素酶、木聚糖酶和果胶酶的最佳生产工艺。本发明涉及一种利用黑曲霉固态发酵凉茶渣生产的纤维素酶、木聚糖酶和果胶酶的工艺，首次公开了利用黑曲霉固态发酵凉茶渣生产的纤维素酶、木聚糖酶和果胶酶的高效廉价方法。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明中的技术方案进行清楚、完整的说明，但并不局限于此。
预先准备
1.菌种活化：
(1)菌种活化在pda固体培养基上，于电热恒温恒湿培养箱80％的湿度，30℃培养120h；
(2)将黑曲霉菌种连续传代两次后，用生理盐水制成2×107cfu/ml的菌悬液；
pda固体培养基：马铃薯200g去皮，切成块，煮沸30min，纱布过滤，再加蔗糖20g，溶化后补水至1000ml。加入琼脂20g，加热溶解，然后121℃湿热灭菌20min。
2.凉茶渣培养基的制备：
取6～8份水，加入硫酸铵0.08份，葡萄糖0.04份，磷酸二氢钾0.01份，磷酸氢二钾0.008份，用氢氧化钾将ph调节至5.0～9.0，加入2份凉茶渣，121℃，湿热灭菌20分钟；
凉茶渣：鸡蛋花、金银花、菊花、凉粉草、夏枯草、甘草和布渣叶共7种植物药物混合，煎制后的凉茶渣。
实施例1～8的设置：
一种纤维素酶、木聚糖酶和果胶酶活力的制备方法
按照10％的接种量接种(即1g干凉茶渣接种0.1ml的黑曲霉孢子悬液)将黑曲霉菌接种在凉茶渣培养基上，具体发酵条件如表1所示。
发酵后纤维素酶、木聚酶、果胶酶的测量：
1)发酵结束后，在发酵物中加入15ml的生理盐水，摇匀后过夜静置；
2)15000g高速离心，取上层，检测上清液中纤维素酶、木聚糖酶和果胶酶活力。
表1实施例1～8的设置和酶活力测试结果
注：因素a为含水量，含水量为当体系仅含有凉茶渣和水时，水的百分含量；
因素b为浸泡液ph值，浸泡液是指，一定体积水按照比例要求加入磷酸二氢钾和磷酸氢二钾后，再用3摩尔每升的氢氧化钾调节至固定ph值的溶液；
因素c为发酵温度；
因素d为发酵时间，单位为天。
实施例9
一种纤维素酶、木聚糖酶和果胶酶活力的制备方法
按照10％的接种量接种(即1g干凉茶渣接种0.1ml的黑曲霉孢子悬液)将黑曲霉菌接种在凉茶渣培养基上，在含水量为70％，浸泡液ph为9.0，发酵温度为31℃，发酵7天。
结果：纤维素酶活力为(1.00±0.04)×103u/g，木聚糖酶活力为(5.78±0.37)×103u/g，果胶酶活力为(5.71±0.13)×103u/g，三种酶活力的平均值为(4.16±0.17)×103u/g。
实施例10
一种纤维素酶、木聚糖酶和果胶酶活力的制备方法
按照10％的接种量接种(即1g干凉茶渣接种0.1ml的黑曲霉孢子悬液)将黑曲霉菌接种在凉茶渣培养基上，在含水量为70％，浸泡液ph为9.0，发酵温度为31℃的设置下发酵5天。
结果：纤维素酶活力为(1.05±0.06)×103u/g，木聚糖酶活力为(6.21±0.1)×103u/g，果胶酶活力为(4.11±0.0.02)×103u/g，三种酶活力的平均值为(3.79±0.04)×103u/g。
根据上述实施例，发现实施例9和实施例10的效果较好，能够有效生产三种酶(纤维素酶、木聚糖酶和果胶酶)。当硫酸铵用量为4％，葡萄糖用量为2％，菌种浓度为2×107cfu/ml，接种量为10％时，含水量为70％，浸泡液ph为9，发酵温度为31℃，发酵7天，是三种饲用酶的最佳生产工艺。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。