本发明属于微生物领域，具体涉及一种由黑曲霉和酵母菌联合发酵降解凉茶渣并生产益生菌的工艺。
背景技术：
为了尽可能地保留凉茶中风味成分，凉茶多采用较低温度提取，而且提取次数少，这样造成凉茶渣与原药材具有相似的营养与活性成分。因此，凉茶渣具有较好的营养和药用价值，是一类未被充分利用的生物资源。近年来，随着凉茶产业的快速发展，凉茶渣的排放也在逐年增加，凉茶渣日产量达到680吨。传统的凉茶渣多采用直接堆放、填埋等方式处理，造成了严重资源浪费和环境污染。由于场地限制而不能及时处理，凉茶渣甚至对企业生产也产生较大影响。对凉茶渣进行资源化、高值化利用已经成为企业和社会必须面临的重大问题。
益生菌是通过定殖在人或动物体内，改变宿主某一部位菌群组成的一类对宿主有益的活性微生物，主要有酵母菌、益生芽孢菌、丁酸梭菌、乳杆菌、双歧杆菌、放线菌等。黑曲霉(aspergillusniger)属于真核生物子囊菌亚门丝孢目丛梗孢科，是一种常见的安全无毒性的曲霉属真菌，广泛分布于世界各地的粮食、植物性产品和土壤中。黑曲霉是制酱，酿酒，制醋，糖化饲料主要工业菌种，是生产酶制剂和单细胞蛋白的主要工业菌种，也是一种重要的饲料添加剂。酵母菌则被广泛应用于食品行业，可作为肉类、果酱、汤类、乳酪、面包类食品、蔬菜及调味料的添加剂。本专利所指的益生菌包括黑曲霉和酵母菌。
根据现今存在的问题，本发明致力于研制一种黑曲霉和酵母菌联合发酵降解凉茶渣并生产益生菌的工艺方法。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种由黑曲霉和酵母菌联合发酵降解凉茶渣并生产益生菌的工艺。
本发明所采取的技术方案是：
本发明的第一方面，提供了一种制备益生菌的方法，包含以下步骤：将黑曲霉和酵母菌混合制备悬液，将悬液接种在凉茶渣培养基上；所述凉茶渣包括鸡蛋花、金银花、菊花、凉粉草、夏枯草、甘草和布渣叶。
根据本发明的实施例，还包括预先将黑曲霉和酵母菌活化、传代，所述活化将黑曲霉和酵母菌分别接种到pda固体培养基培养。
根据本发明的实施例，所述酵母菌选自产朊假丝酵母、酿酒酵母、德尔布有孢圆酵母、毕赤酵母、布拉氏酵母。
根据本发明的实施例，所述黑曲霉培养条件为50％～90％湿度、28℃～37℃培养120～160h；所述酵母菌活化条件为50％～90％湿度、28℃～40℃培养24～30h。
根据本发明的实施例，所述菌悬液浓度为105～109cfu/ml，优选菌悬液浓度为2×107cfu/ml。
根据本发明的实施例，接种量为5％～25％，发酵温度为28℃～40℃，发酵时间为2～10天。
根据本发明的实施例，所述传代为传代1～3次。
根据本发明的实施例，发酵时的含水量为50％～90％，浸泡液ph为5～10。
根据本发明的实施例，所述凉茶渣培养基包括：凉茶渣粉末1～5份，加入硫酸铵0.04～0.20份，葡萄糖0～0.1份，磷酸二氢钾0.005～0.02份，磷酸氢二钾0.002～0.020份，水5.0～9.0份。
根据本发明的实施例，凉茶渣粉末2份，加入硫酸铵0.08份，葡萄糖0.04份，磷酸二氢钾0.01份，磷酸氢二钾0.008份，水8份。
根据本发明的实施例，所述凉茶渣粉末制备方法：将鸡蛋花、金银花、菊花、凉粉草、夏枯草、甘草和布渣叶混合，煎制后得到的凉茶渣，再干燥粉碎。
本发明的有益效果是：
本发明充分利用了凉茶渣的剩余价值，能够有效降解了大量凉茶渣。同时，利用凉茶渣生产益生菌：硫酸铵用量为4％，葡萄糖用量为2％，菌种浓度为2×107cfu/ml，接种量为10％时。合理设置含水量为70％，浸泡液ph为7，发酵温度为37℃，发酵7天，能够得到最佳的发酵效果。该工艺下益生菌产量最高，降解率也较高，有利于益生菌的工业生产。同时也有利于凉茶渣的降解，对解决凉茶渣污染问题中具有重要的意义。
具体实施方式
下面结合具体的实施例对本发明的具体实施方式进一步阐述：
预先准备
1.菌种活化：
(1)黑曲霉活化在pda固体培养基上，于电热恒温恒湿培养箱80％的湿度，30℃培养120h，依此方法再传代2次；
(2)酵母菌活化在pda固体培养基上，于电热恒温恒湿培养箱80％的湿度，30℃培养25h，依此方法再传代2次；
pda固体培养基：马铃薯200g去皮，切成块，煮沸30min，纱布过滤，再加蔗糖20g，溶化后补水至1000ml。加入琼脂20g，加热溶解，然后121℃湿热灭菌20min，趁热制备平板培养基。
2.凉茶渣培养基的制备：
取6～8份水，加入硫酸铵0.08份，葡萄糖0.04份，磷酸二氢钾0.01份，磷酸氢二钾0.008份，用氢氧化钾将ph调节至5.0～9.0，加入2份凉茶渣，121℃，湿热灭菌20分钟；
凉茶渣：鸡蛋花、金银花、菊花、凉粉草、夏枯草、甘草和布渣叶共7种植物药物混合，煎制后的凉茶渣。
实施例1～8的具体操作如下：
将黑曲霉和酵母菌混合制备混合悬液，悬液浓度为2×107cfu/ml，将混合悬液按10％接种量接种在凉茶渣培养基上，具体发酵条件如表1所示。
发酵后统计活菌数：
1.发酵结束后，在发酵物中加入15ml的生理盐水；
2.摇匀，取混悬液20μl稀释1.25×105倍后，取50μl涂板培养，进行活菌计数，计算活菌数；
3.剩余混悬液经过15000g离心10分钟，取沉淀，烘干，称量；
4.计算活菌数和降解率，降解率公式＝(总重量-剩余重量)/总重量。
实施例1～8的设置以及活菌数见表1：
表1实施例1～8的发酵因素设置以及活菌数和降解率
注：含水量为当体系仅含有凉茶渣和水时，水的百分含量。
浸泡液是指，一定体积水按照比例要求加入磷酸二氢钾和磷酸氢二钾后，再用3mol/l的氢氧化钾调节至固定ph值的溶液。
实施例9
将黑曲霉和酵母菌混合制备混合悬液，悬液浓度为2×107cfu/ml，将混合悬液接种在凉茶渣培养基上，发酵体系中的含水量为70％，浸泡液的ph为7.0，发酵温度为37℃，发酵时间为7天。
结果：经过分析处理试验结果，使用实施例9的方法后，益生菌的活菌数为(1111.45±240.32)×109cfu/g；凉茶渣的降解率为18.03％±0.80％。
实施例10
将黑曲霉和酵母菌混合制备混合悬液，悬液浓度为2×107cfu/ml，将混合悬液接种在凉茶渣培养基上，发酵体系中的含水量为80％，浸泡液的ph为9.0，发酵温度为34℃，发酵时间为7天。
结果：经过分析处理试验结果，使用实施例10的方法后，益生菌的活菌数为(671.27±49.47)×109cfu/g；凉茶渣的降解率为23.87％±0.21％。
根据以上实施例的设置，发现实施例9～10的效果最好。以优化益生菌的生产工艺为目的，发现当含水量为70％，浸泡液ph为7，发酵温度为37℃，发酵7天，活菌数最高。如果以优化凉茶渣降解工艺为目的，发现含水量为80％，浸泡液ph为9，发酵温度为34℃，发酵7天，降解率最大。