一种HBV基因组扩增的研究方法与流程

本发明涉及细胞生物学领域，尤其涉及一种hbv基因组扩增的研究方法。

背景技术：

乙型肝炎病毒(hepatitisbvirus，hbv)简称乙肝病毒，属嗜肝双链dna病毒，hbv基因组在宿主细胞中可合成共价闭合环状dna(covalentlyclosedcircular，cccdna)，作为乙肝病毒扩增模板稳定的存在，同时也是hbv持续感染的关键因素；hbv病毒与慢性肝炎、肝硬化、肝细胞癌等多种疾病相关，据估计，全球有3.5-4亿人感染hbv,每年有50万～120万人死于hbv感染导致的肝衰竭、肝硬化、原发性肝癌等肝脏疾病；目前，hbv的致病机制尚不完全清楚，在其扩增周期中，hbvcccdna作为一个独特的扩增中间体，是乙肝病毒扩增水平最特异的指标，它既能转录产生3.5kb前基因组mrna，又能转录出病毒mrna并翻译产生包括hbsag在内的病毒蛋白，然而hbvcccdna并不通过类似半保留扩增的方式进行自主扩增，而是由rcdna这一逆转录产物转变而成，这种特殊逆转录形式对hbvdna的扩增至关重要；然而，现有抗病毒治愈方法不能根除hbv扩增周期中的cccdna，这也是临床上慢性乙型肝炎经久不愈的根本原因，因此，认识hbv的致病机制，寻找新的治愈方法迫在眉睫；在潘万龙，方岩，许舸等,结构特异性核酸酶fen1对hbv扩增的影响[j]中，提到了fen1可将rcdna修复成cccdna,以此促进hbvdna的扩增,但其具体调控机制仍不甚明了；

mirna是一种高度保守，长度为20-25nt的内源性非编码rna，参与转录后基因表达调控；目前研究表明，部分mirna能调节hbv的扩增周期，如mir-146a，mir-122，mir-548ah；其中，mir-146a是一种与炎症关系密切的mirna，其对固有免疫应答、炎症反应及调控hbv扩增起到重要的作用；

另外，研究显示，ago2可作为载体协同mirna发挥功能作用，其不同于传统的ago蛋白家族(ago1-4)与mirna形成免疫复合物促进mirna的加工及成熟作用，但ago2在mir-146a发挥调控作用不甚明确，因此，对于ago2在mir-146a中发挥的调控功能的研究变成了一个重要的研究课题，其研究结果对于乙肝病毒的防治有着重要作用。

技术实现要素：

针对上述现有技术存在的问题，本发明旨在提供一种hbv基因组扩增的研究方法，通过应用过表达及干扰mir-146a观察fen1及hbvdna水平，得到ago2协同mir-146a通过下游靶基因irak1/traf6调控fen1蛋白基因的转录，从而促进hbv基因组的扩增；通过ago2sirna及ago2rip来分析其具体功能机制，得到ago2以载体形式协同mir-146a发挥调控作用，从而促进基因组的扩增，为理解hbv发病机制并开拓新的治愈靶点及方案提供理论依据，并为清除细胞内cccdna库，完全阻断hbv扩增这一治愈目标创造条件。

为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案如下：

一种hbv基因组扩增的研究方法，该研究方法的具体步骤包括：

步骤一：通过mir-146a调控hbv基因组扩增的研究，得到mir-146a通过下游靶基因irak1/traf6调控fen1蛋白基因的转录，从而促进hbv扩增；

步骤二：在步骤一的基础上，利用ago2作为载体协同mir-146a调控hbv基因组扩增的研究，得到并证实了一种新的mir-146a→fen1→hbvdna调节轴。

进一步的，步骤一所述的mir-146a调控hbv基因组扩增的研究的具体步骤包括：

s1.在hepg2细胞系和hbv稳定扩增细胞系hepg2.2.15中，采用逆转录定量pcr技术检测mir-146a在亲本细胞hepg2和hbv稳定扩增细胞系hepg2.2.15细胞中的表达水平差异；

s2.在hepg2.2.15细胞中分别转染mir-146amimic和mir-146ainhibitor，48小时后，采用实时定量pcr方法检测hbvdna的表达水平，westernblot方法检测结构特异性核酸内切酶的表达水平；

s3.提取hbv扩增中间体，将步骤s2经mir-146amimic和mir-146ainhibitor转染后的hepg2.2.15分别收集后，加入hbv病毒核心颗粒dna提取液400ul，37℃孵育15min，15000g×，离心3min后，将上清转移至新ep管中，加入peg8000200ul冰上静置40min，12000g×，4℃离心7min，弃去上清加入消化液400ul、蛋白酶k15ul，45℃消化过夜；酚氯仿抽提dna，利用异丙醇和乙醇对其进行沉淀，定容hbvdna；

s4.实时定量pcr检测，以上述s3样本为模板，利用ultrasybrgreen试剂盒说明书配置标准pcr反应体系，所述pcr反应条件为：95℃预变性10min，95℃变性15s，60℃退火/延伸1min，重复37个循环，进行溶解曲线分析；

s5.westernblot检测，利用ripa蛋白提取试剂裂解上述步骤s2的hepg2.2.15细胞，沉淀提取总蛋白，12000g×，离心3min，收集上清；将提取的总蛋白在12％sds-page的缓冲液中电泳，电转至pvdf膜，5％脱脂牛奶封闭3h，分别加入小鼠抗人fen1、鼠抗人ago2和鼠抗β-actin单抗，4℃过夜，利用tbst缓冲溶液洗膜后，再加入抗鼠igg，利用tbst缓冲溶液洗膜后，ecl试剂盒化学发光，凝胶成像系统显影；

s6.在步骤s2所述的hepg2.2.15细胞中外源性转入fen1质粒，48小时后分别检测hbvdna载量以及mir-146a水平；

s7.在步骤s2所述的hepg2.2.15细胞中分别转染mir-146amimic和mir-146ainhibitor后，利用生物信息学软件筛选分析mir-146a的下游潜在靶基因irak1和traf6，采用逆转录定量pcr技术检测irak1和traf6的表达水平。

进一步的，经mir-146a调控hbv基因组扩增的研究得到：

(1)mir-146a可以促进hbv基因组的扩增和表达；

(2)mir-146a能促进fen1扩增和翻译，同时fen1可促进mir-146a水平和hbv-dna扩增；

(3)mir-146a可以抑制hbv基因组细胞中下游靶基因irak1/traf6的表达水平。

进一步的，步骤二所述的ago2作为载体协同mir-146a调控hbv基因组扩增的研究的具体步骤包括：

s1.取hepg2.2.15和hepg2进行培养，将hepg2细胞培养于含10％胎牛血清的dmem培养基中，hepg2.2.15细胞培养于含10％胎牛血清的dmem培养基中，在培养基中另外再加入筛选的抗生素g418对hepg2.2.15细胞进行培养；

s2.利用ago2sirna转染s1培养的hepg2.2.15细胞24小时后，继而转染外源性mir-146amimic，24h后，采用逆转录定量pcr和westernblot技术检测ago2蛋白水平；ago2经rip技术处理后，利用逆转录定量pcr检测mir-146a的表达水平；ago2sirna转染mir-146amimic后，检测fen1及hbvdna表达水平；

s3.提取hbv扩增中间体，将步骤s2处理的hepg2.2.15收集后，加入hbv病毒核心颗粒dna提取液400ul，37℃孵育15min，15000g×，离心3min后，将上清转移至新ep管中，加入peg8000200ul冰上静置40min，12000g×，4℃离心7min，弃去上清加入消化液400ul、蛋白酶k15ul，45℃消化过夜；酚氯仿抽提dna，利用异丙醇和乙醇对其进行沉淀，定容hbvdna；

s4.实时定量pcr检测，以上述s3样本为模板，利用ultrasybrgreen试剂盒说明书配置标准pcr反应体系，所述pcr反应条件为：95℃预变性10min，95℃变性15s，60℃退火/延伸1min，重复37个循环，进行溶解曲线分析；

s5.westernblot检测，利用ripa蛋白提取试剂裂解上述步骤s2的hepg2.2.15细胞，沉淀提取总蛋白，12000g×，离心3min，收集上清；将提取的总蛋白12％sds-page电泳，电转至pvdf膜，5％脱脂牛奶封闭3h，分别加入小鼠抗人fen1、鼠抗人ago2和鼠抗β-actin单抗，4℃过夜，利用tbst缓冲溶液洗膜后，再加入抗鼠igg，利用tbst缓冲溶液洗膜后，ecl试剂盒化学发光，凝胶成像系统显影；

s6.rip检测，上述步骤s2中48小时后收集经ago2sirna转染hepg2.2.15的细胞，采用magnarip试剂盒，首先裂解细胞，然后应用免疫磁珠包被ago2抗体，4℃与样本孵育过夜，利用磁力架分离共沉淀ago2结合的rna，最后trizol提取分离样本中的rna，逆转录成cdna，以cdna为模板荧光定量pcr检测mir-146a的表达，反应条件：95℃预变性10min，95℃变性15s，60℃退火/延伸1min，重复37个循环；

s7.统计学处理采用spss22.0统计软件，每组实验至少重复3次，实验数据以表示，两组间比较采用两个独立样本t检验，检验水准：α＝0.05，分析两组间各检测值的差异程度，差异有统计学意义说明各检测指标与对照组比较是表达或水平明显升高或降低的。

进一步的，经ago2协同mir-146a调控hbv基因组扩增的研究得到：

(1)ago2协同mir-146a调控hbv扩增；

(2)ago2作为重要的辅助成分在mir-146a功能调节中起作用。

本发明的有益效果是：本发明公开了一种hbv基因组扩增的研究方法，与现有技术相比，本发明的改进之处在于：

1.本发明所述hbv基因组扩增的研究方法，包括mir-146a调控hbv基因组扩增的研究和ago2作为载体协同mir-146a调控hbv基因组扩增的研究，证明ago2协同mir-146a通过下游靶基因irak1/traf6调控fen1蛋白基因的转录，从而促进hbv复制的作用；

2.通过hbv基因组扩增的研究方法，在hbv扩增感染中得到并证实了一种新的mir-146a→fen1→hbvdna调节轴，该调节轴对hbv基因组扩增提供了必要条件，进一步说明了hbvdna复制的具体分子机制，为理解hbv发病机制并开拓新的治愈靶点及方案提供理论依据；为今后深入细致的研究可彻底阐明hbv复制的分子机制，并为清除细胞内cccdna库，完全阻断hbv复制这一治愈目标创造了条件。

附图说明

图1为本发明hepg2.2.15与hepg2细胞中的mir-146a表达水平的差异性分析的柱状图。

图2为本发明mir-146a促进hbv的扩增的柱状图。

图3为本发明hepg2.2.15细胞转染mir-146amimic和mir-146ainhibitor后对fen1扩增水平的影响的柱状图。

图4-1为本发明hepg2.2.15细胞中转染fen1后对mir-146a水平影响的柱状图。

图4-2为本发明hepg2.2.15细胞中转染fen1后对hbvdna载量影响的柱状图。

图5-1为本发明hepg2.2.15细胞中转染mir-146amimic和mir-146ainhibitor后对itak1的表达水平的影响的柱状图。

图5-2为本发明hepg2.2.15细胞中转染mir-146amimic和mir-146ainhibitor后对traf6的表达水平的影响的柱状图。

图6为本发明逆转录定量pcr和westernblot检测hepg2.2.15细胞中转染mir-146amimic和ago2sirna对ago2表达水平的影响的柱状图。

图7为本发明hepg2.2.15细胞中转染mir-146amimic和ago2sirna，rip技术分离ago2后，mir-146a表达水平的柱状图。

图8-1为本发明ago2sirna及mir-146a转染hepg2.2.15细胞后fen1表达水平的柱状图。

图8-2为本发明ago2sirna及mir-146a转染hepg2.2.15细胞后hbv-dna拷贝数的柱状图。

图9为本发明mir-146a→fen1→hbvdna调节示意图。

具体实施方式

为了使本领域的普通技术人员能更好的理解本发明的技术方案，下面结合附图和实施例对本发明的技术方案做进一步的描述。

参照附图1、图2、图3、图4-1、图4-2、图5-1、图5-2、图6、图7、图8-1、图8-2和图9所示的一种hbv基因组扩增的研究方法，所述该研究方法的具体步骤包括：

步骤一：通过mir-146a调控hbv基因组扩增的研究，得到mir-146a通过下游靶基因irak1/traf6调控fen1蛋白基因的转录，从而促进hbv扩增；

步骤二，在步骤一的基础上，利用ago2作为载体协同mir-146a调控hbv基因组扩增的研究，得到并证实了一种新的mir-146a→fen1→hbvdna调节轴，更进一步说明了hbvdna复制的具体分子机制，为理解hbv发病机制并开拓新的治愈靶点及方案提供理论依据；为今后深入细致的研究可彻底阐明hbv复制的分子机制，并为清除细胞内cccdna库，完全阻断hbv复制这一治愈目标创造了条件。

步骤一所述mir-146a调控hbv基因组扩增的研究的具体步骤包括：

s1.为验证mir-146a在hbv扩增中的作用，在hepg2细胞系和hbv稳定扩增细胞系hepg2.2.15中，采用逆转录定量pcr技术检测mir-146a在亲本细胞系hepg2与hbv稳定扩增细胞系hepg2.2.15细胞中的表达水平差异，判断hbv稳定细胞系hepg2.2.15与亲本细胞hepg2间的差异性，研究结果如附图1所示，mir-146a水平在hepg2.2.15中相对表达量为11.755±0.069，mir-146a水平在亲本细胞hepg2中相对表达量为1.000±0.038，可以看出hbv稳定扩增细胞系hepg2.2.15中mir-146a呈高水平表达，mir-146a在hepg2.2.15细胞中相对表达量较hepg2组明显升高，其升高倍数为11，差异有统计学意义(p<0.05)，hbv扩增与mir-146a水平相关；

s2.在hepg2.2.15细胞中分别转染mir-146amimic和mir-146ainhibitor，48小时后，采用实时定量pcr方法检测hbvdna的表达水平，westernblot方法检测结构特异性核酸内切酶(fen1)的表达水平；检测到的结果为：mir-146amimic组hbv-dna载量为3.215±0.001、mir-146ainhibitor组hbv-dna载量为2.623±0.083，较对照组2.813±0.015，mir-146amimic组hbv-dna载量明显升高，mir-146ainhibitor组hbv-dna载量明显降低，研究结果如附图2所示；mir-146amimic组结构特异性核酸内切酶(fen1)的表达水平为1.678±0.131，mir-146ainhibitor组结构特异性核酸内切酶(fen1)的表达水平为0.344±0.045，较对照组1.017±0.194，mir-146amimic组结构特异性核酸内切酶(fen1)的含量明显增高，二者间差异有统计学意义(p<0.05)，mir-146ainhibitor组结构特异性核酸内切酶(fen1)含量明显降低，二者间差异有统计学意义(p<0.05)，研究结果如附图3所示，结果显示mir-146a能促进hbv的扩增；

s3.提取hbv扩增中间体，将步骤s2处理的hepg2.2.15收集后，加入hbv病毒核心颗粒dna提取液400ul，37℃孵育15min，15000g×(15000g×表示离心转速，g表示重力加速度)，离心3min后，将上清转移至新ep管中，加入peg8000200ul冰上静置40min，12000g×(12000g×表示离心转速，g表示重力加速度)，4℃离心7min，弃去上清加入消化液400ul、蛋白酶k15ul，45℃消化过夜；酚氯仿抽提dna，利用异丙醇：乙醇对其进行沉淀，定容hbvdna；

s4.实时定量pcr检测，以上述s3样本为模板，利用ultrasybrgreen试剂盒说明书配置标准pcr反应体系，反应条件为：95℃预变性10min，95℃变性15s，60℃退火/延伸1min，重复37个循环，进行溶解曲线分析；mir-146a及内参u6引物由成都优泰森生物工程有限公司设计合成，反应条件为：95℃预变性10min，95℃变性10s，52℃退火30s，60℃延伸30s，重复45个循环；每组设置3个复孔，重复三次实验，

s5.westernblot检测，利用ripa蛋白提取试剂裂解上述s2细胞沉淀提取总蛋白，12000g×(12000g×表示离心转速，g表示重力加速度)，离心3min，收集上清(含蛋白质)；将提取的总蛋白12％sds-page电泳，电转至pvdf膜，5％脱脂牛奶封闭3h，分别加入小鼠抗人fen1(1:5000)、鼠抗人ago2(1：5000)和鼠抗β-actin单抗(1：10000)，4℃过夜，利用tbst缓冲溶液洗膜，再分别加入抗鼠igg(1：5000)，利用tbst缓冲溶液洗膜后，ecl试剂盒化学发光，凝胶成像系统显影；

s6.在s2所述的hepg2.2.15细胞中外源性转入fen1质粒，48小时后分别检测hbvdna载量以及mir-146a水平；在s2所述的hepg2.2.15细胞中外源性转入fen1质粒，48小时后分别检测hbvdna载量以及mir-146a水平；检测到的结果为：hbv-dna载量为3.431±0.004、较对照组2.661±0.009明显升高，二者间差异有统计学意义(p<0.05)；mir-146a相对表达水平为5.712±0.371，较对照组1.023±0.224明显升高，二者间差异有统计学意义(p<0.05)，其结果如附图4-1和附图4-2所示，实验结果证明提示mir-146a能促进fen1扩增和翻译，同时fen1亦可促进mir-146a水平和hbv-dna扩增；

s7.将s2所述的hepg2.2.15细胞中分别转染mir-146amimic和mir-146ainhibitor后，利用生物信息学软件targetscan等筛选分析mir-146a的下游潜在靶基因irak1和traf6，在hepg2.2.15细胞中转染mir-146amimic，采用逆转录定量pcr技术检测irak1和traf6的表达水平；检测到的结果为：mir-146amimic组irak1和traf6相对表达水平分别为0.114±0.013、0.390±0.014，mir-146ainhibitor组irak1/traf6相对表达水平分别为1.222±0.073、2.145±0.271，较对照组irak1/traf6相对表达水平1.000±0.038、1.007±0.119，mir-146amimic组irak1/traf6相对表达水平明显降低，差异有统计学意义(p<0.05)；mir-146ainhibitor组irak1/traf6相对表达水平明显伸高，差异有统计学意义(p<0.05)，其结果如附图5-1和附图5-2所示，结果显示mir-146a通过下游靶基因irak1和traf6调控fen1表达，进而影响hbv的扩增。

经上述mir-146a调控hbv基因组扩增的研究得到：

(1)mir-146a可以促进hbv基因组的扩增和表达；

(2)mir-146a能促进fen1扩增和翻译，同时fen1可促进mir-146a水平和hbv-dna扩增；

(3)mir-146a可以抑制hbv基因组细胞中下游靶基因irak1/traf6的表达水平。

步骤二所述的ago2作为载体协同mir-146a调控hbv基因组扩增的研究的具体步骤包括：

s1.取hepg2.2.15和hepg2进行培养，将hepg2细胞培养于含10％胎牛血清的dmem培养基中，hepg2.2.15细胞培养于含10％胎牛血清的dmem培养基中，在培养基中另外再加入筛选的抗生素g418对hepg2.2.15细胞进行培养，加入g418主要是为维持hbv稳定复制细胞系hepg2.2.15中的病毒dna，故需持续性加入，细胞培养时间与后续实验应用有关，一般情况稳定培养3-5天即可；

s2.利用ago2sirna转染hepg2.2.15细胞24小时后，继而转染外源性mir-146amimic，24h后，采用逆转录定量pcr和westernblot技术检测ago2蛋白水平；ago2经rip后，利用逆转录定量pcr检测mir-146a的表达水平；ago2sirna转染mir-146amimic，检测fen1及hbvdna表达水平；

检测到ago2sirna组相对表达量(0.688±0.099)较对照组(1.002±0.069)降低，差异有统计学意义(p<0.05)，其结果如附图6所示，结果显示ago2sirna沉默了ago2蛋白表达；

检测到mir-146a相对表达水平(0.105±0.002)较对照组(1.000±0.041)降低，差异有统计学意义(p<0.05)，其结果如附图7所示，结果显示ago2可作为载体协同mir-146a调控hbv复制；

检测到ago2sirna组fen1表达水平(0.485±0.100)与对照组(1.000±0.023)比较，显著减少，差异有统计学意义(p<0.05)，如附图8-1所示；ago2sirna组hbvdna拷贝数与对照组比较亦显著减少，差异有统计学意义，如附图8-2所示；结果显示若无ago2蛋白辅助，成熟mir-146a不发挥hbv复制调控作用，因此，ago2作为重要的辅助成分在mir-146a功能调节中起作用；

s3.提取hbv扩增中间体，将步骤s2处理的hepg2.2.15收集后，加入hbv病毒核心颗粒dna提取液400ul，37℃孵育15min，15000g×(15000g×表示离心转速，g表示重力加速度)，离心3min后，将上清转移至新ep管中，加入peg8000200ul冰上静置40min，12000g×，4℃离心7min，弃去上清加入消化液400ul、蛋白酶k15ul，45℃消化过夜；酚氯仿抽提dna，利用异丙醇和乙醇对其进行沉淀，定容hbvdna；

s4.实时定量pcr检测，以上述s3样本为模板，利用ultrasybrgreen试剂盒说明书配置标准pcr反应体系，反应条件为：95℃预变性10min，95℃变性15s，60℃退火/延伸1min，重复37个循环，进行溶解曲线分析；mir-146a及内参u6引物由成都优泰森生物工程有限公司设计合成，反应条件为：95℃预变性10min，95℃变性10s，52℃退火30s，60℃延伸30s，重复45个循环；每组设置3个复孔，重复三次实验，引物序列如下表1所示：

表1：表引物序列

s5.westernblot检测，利用ripa蛋白提取试剂裂解上述s2细胞沉淀提取总蛋白，12000g×(12000g×表示离心转速，g表示重力加速度)，离心3min，收集上清(含蛋白质)；将提取的总蛋白12％sds-page电泳，电转至pvdf膜，5％脱脂牛奶封闭3h，分别加入小鼠抗人fen1(1:5000)、鼠抗人ago2(1：5000)和鼠抗β-actin单抗(1：10000)，4℃过夜，利用tbst缓冲溶液洗膜，再分别加入抗鼠igg(1：5000)，利用tbst缓冲溶液洗膜后，ecl试剂盒化学发光，凝胶成像系统显影；

s6.rip检测，上述步骤s2中48小时后收集经ago2sirna转染的hepg2.2.15细胞，采用magnarip试剂盒，首先裂解细胞，然后应用免疫磁珠包被ago2抗体，4℃与样本孵育过夜，利用磁力架分离共沉淀ago2蛋白，最后利用trizol提取ago2蛋白样本中结合的rna(样本中加入0.7mltrizol，用量参考贴壁细胞提取总rna)，孵育5min使充分裂解，按比例加入0.2ml氯仿(每1mltrizol裂解液)，孵育2-3min，12000g×(12000g×表示离心转速，g表示重力加速度)，4℃离心15min，小心转移上清水相至新的ep管中；按比例加入0.5ml异丙醇(每1mltrizol)于裂解液上方，室温孵育10min，12000g×，4℃离心10min，弃去上清，沉淀用75％乙醇洗涤，7500g×，4℃离心5min，弃去上清，干燥后定容，逆转录成cdna，以cdna为模板荧光定量pcr检测mir-146a的表达，反应条件：95℃预变性10min，95℃变性15s，60℃退火/延伸1min，重复37个循环；

s7.统计学处理采用spss22.0统计软件，每组实验至少重复3次，实验数据以表示，两组间比较采用两个独立样本t检验，检验水准:α＝0.05，分析两组间各检测值的差异程度，差异有统计学意义说明各检测指标与对照组比较是表达或水平明显升高或降低的；

采用spss22.0统计软件具体处理数据指标包括：1.mir-146a在亲本细胞hepg2和hbv稳定扩增细胞系hepg2.2.15细胞中的表达；2.特异性核酸内切酶的表达水平；3.hbvdna病毒载量；4.irak1表达水平；5.traf6表达水平；6.ago2表达水平。

通过ago2协同mir-146a调控hbv基因组扩增的研究得到：

(1)ago2协同mir-146a调控hbv扩增；

(2)ago2作为重要的辅助成分在mir-146a功能调节中起作用。

通过上述hbv基因组扩增的研究方法得到：

(1)通过比对hepg2细胞系与hbv稳定复制细胞系hepg2.2.15中mir-146a表达水平，我们发现，在hepg2.2.15细胞系中mir-146a明显升高，提示mir-146a似能调控并促进hbvdna表达及复制；在此基础上，我们通过过表达与干扰hepg2.2.15细胞系中mir-146a，采用实时定量pcr检测hbvdna及逆转录定量pcr检测fen1的表达水平，显示mir-146amimic组hbvdna拷贝数及fen1表达水平均明显升高，表明mir-146a确能促进hbv的复制，并影响和调控fen1的表达；

(2)研究本研究方法发现，fen1是hbvdna复制中起调控作用的关键酶，而当mir-146a增强hbvdna复制的同时，fen1水平亦升高，这说明mir-146a是通过调控fen1这一关键酶来影响hbvdna复制的；

(3)fen1是一种结构特异性的金属核酸酶，存在于线粒体及细胞核中，fen1具有多种功能，包括促进dna的成熟与复制并调节蛋白质间代谢等作用，fen1促进hbvdna复制的原因是hbvrcdna到hbvcccdna结构修复及转化阶段，hbvrcdna负链为不闭合且5'及3'端含有冗余序列的dna结构，这一发夹结构必须被修复才能顺利完成复制，在形成cccdna中由于hbvrcdna负链的特殊结构，fen1发挥间隔依赖核酸内切酶活性，将hbvrcdna结构中两端各约9nt的冗余序列形成的发夹结构(即假“y”结构)剪切修复，并在聚合酶和连接酶作用下形成完整的闭合环状结构，从而促进了病毒dna的复制；另外，对于hbvrcdna正链5'端的rna引物，fen1亦可借助其5'-3'flap核酸内切酶活性将rna引物切除，进而延伸闭合，形成完整的共价闭合环状dna分子；因此，我们将外源性fen1质粒转入hepg2.2.15细胞系，观察mir-146a和hbvdna水平,发现两者均较对照组明显上升，说明fen1能升高mir-146a并促进hbvdna的复制；同时，过表达和干扰mir-146a，观察fen1的表达水平，发现mir-146a过表达组与干扰组较对照组明显升高与降低，说明mir-146a与fen1存在相互调控作用；因此，在hbv感染时，mir-146a水平表达上调，通过增强fen1表达，间接促进cccdna的形成，进而增强hbvdna复制，同时，mir-146a可能提供了一个更适合fen1发挥核酸内切酶活性的宿主环境，使其能够更有效的调控hbv复制；

与此同时，我们利用生物信息学软件分析发现，irak1/traf6是mirna-146a的潜在下游靶基因，逆转录定量pcr结果显示，在mir-146amimic和inhibitor作用于靶细胞后，irak1/traf6的相对表达水平较对照组明显降低或升高，即mir-146a通过抑制下游靶基因irak1/traf6的表达来促进hbvdna的复制；其原因是mir-146a基因的启动子区存在多个核因子-κb(nuclearfactor-kappab,nf-κb)结合位点，mir-146a可靶向抑制nf-κb之间的衔接分子白介素-1受体相关激酶-1(il-1receptor-associatedkinase1,irak1)和肿瘤坏死因子受体相关因子-6(tnfreceptor-associatedfactor6,traf6)表达，从而降低nf-κb的活性，防止过度免疫炎症反应的发生，并且通过研究分析表明，在nf-κb信号通路中，fen1显著富集，即其表达水平明显升高，这充分说明mir-146a抑制下游靶基因后通过nf-κb信号通路调控fen1的表达从而影响hbv复制；

ago2可作为载体协同mirna发挥功能作用，其不同于传统的ago蛋白家族(ago1-4)与mirna形成免疫复合物促进mirna的加工及成熟作用；因此，我们拟通过ago2sirna及ago2rip来分析其具体功能机制；我们在hepg2.2.15细胞系中过表达mir-146a，同时转入ago2sirna，48小时后，rip分离ago2蛋白，逆转录定量pcr检测mir-146a水平，发现ago2sirna组较正常对照组mir-146a水平显著下降，说明ago2确与mir-146a形成复合体发挥调控作用，当外源性调高mir-146a并干扰ago2蛋白时，fen1及hbvdna表达水平均显著降低，这充分说明ago2以载体形式协同mir-146a发挥调控作用；

总之，通过上述研究方法，我们在hbv扩增感染中发现并证实了一种新的mir-146a→fen1→hbvdna调节轴，如附图9所示，从而更进一步说明了hbvdna复制的具体分子机制，为理解hbv发病机制并开拓新的治愈靶点及方案提供理论依据；为今后深入细致的研究可彻底阐明hbv复制的分子机制，并为清除细胞内cccdna库，完全阻断hbv复制这一治愈目标创造了条件。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

序列表

<110>川北医学院

<120>一种hbv基因组扩增的研究方法

<160>1

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>3215

<212>dna

<213>hepatitisbvirus

<400>1

ctccaccactttccaccaaactcttcaagatcccagagtcagggccctgtactttcctgc60

tggtggctccagttcaggaacagtgagccctgctcagaatactgtctctgccatatcgtc120

aatcttatcgaagactggggaccctgtaccgaacatggagaacatcgcatcaggactcct180

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