一种慢病毒表达载体的设计及应用的制作方法

本发明属于分子生物学及细胞生物学领域，具体涉及一种慢病毒表达载体的设计及应用。

背景技术：

慢病毒载体(lentiviralvector)是在hiv-1病毒基础上改造而成的病毒载体系统，它能高效的将目的基因导入动物和人的原代细胞或细胞系。慢病毒载体介导的基因表达持续且稳定，原因是插入基因整合到宿主细胞基因组中，并随细胞基因组的分裂而分裂。另外，慢病毒有广泛的宿主，可感染分裂和不分裂的细胞，几乎可以感染所有类型的细胞，特别适合质粒载体转染效率低的细胞。

目前，有多种形式的慢病毒表达载体，都是以慢病毒载体骨架，加载不同的基因操控元件设计而成。进行基因过表达时，可通过不同的实验目的选择不同元件组成的慢病毒表达载体。美国systembiosciences公司开发的具有双启动子的pcdh系列慢病毒载体，载体大小不超过9000bp，允许插入较大片段的基因，具有抗生素抗性基因和荧光蛋白双重筛选基因，可通过抗生素筛选获得稳转细胞株和通过荧光蛋白检测转染效率，这些独特优势特性使其成为主流的慢病毒表达载体之一。然而，发明人在实验中发现，pcdh系列载体的插入基因的表达水平并不很高，不能满足一些实验要求。而市场上同类型慢病毒表达载体，又不具备pcdh载体的优势特性。因此，很有必要设计一种兼具载体小、双重筛选标记、高水平表达插入基因等三个特征的慢病毒表达载体。

技术实现要素：

针对上述问题本发明提供了一种慢病毒表达载体的设计及应用。

为了达到上述目的，本发明采用了下列技术方案：

一种慢病毒表达载体，慢病毒表达载体的核苷酸序列为seqidno.1。

进一步，所述载体的图谱为图1，序列见seqidno.1。

进一步，所述序列，含有以下载体元件：

a.ampicillin抗性基因：允许载体在e.coli中使用ampicillin筛选的序列；

b.pucori：允许载体在e.coli中高拷贝复制的序列；

c.rsvpromoter：促进病毒rna在包装细胞中的转录的序列；

d.5'ltr-deltau3：病毒基因组整合进入宿主基因组的整合位点序列；

e.3'ltr-deltau3：病毒基因组整合进入宿主基因组的整合位点序列；病毒rna在包装细胞中的转录终止序列；

f.ψ:病毒rna包装为病毒的信号序列；

g.rre：hiv-1的rev蛋白响应元件序列，允许病毒rna通过rev蛋白途径出核；

h.cppt：hiv-1富含嘌呤的片段序列，促进病毒感染宿主细胞过程中病毒rna转入宿主细胞核；

i.cmvenhancer/promoter：促进目的基因的高效表达的增强子和启动子序列；

j.bamhi/sali/xhoi/xbai：酶切位点序列，便于外源基因插入；

k.ef-1acorepromoter：促进筛选基因的表达的启动子序列；

m.egfp:t2a:puro:筛选基因嘌呤霉素和gfp的表达序列；

l.wpre：病毒转录后修饰元件序列，增强病毒rna在包装细胞中的稳定性；一种慢病毒载体的应用，所述载体用于插入基因的高效表达；

n.sv40earlypa：进一步增强病毒rna在包装细胞中的转录终止序列。

一种慢病毒表达载体的应用，基于其核苷酸序列，可应用于下述五个方面：可插入目的基因、可包装为慢病毒感染目的细胞、可高水平表达插入目的基因、可通过嘌呤霉素筛选获得稳转细胞株、可通过gfp检测转染效率。

一种慢病毒表达载体的应用方法：

(1)插入目的基因：通过pcr技术获得插入目的基因的片段，采用酶切连接的方法将目的基因片段插入慢病毒表达载体的多克隆位点；

(2)包装为慢病毒感染目的细胞：

慢病毒表达载体在293t细胞中转录生成病毒基因组rna，包装载体在293t细胞中转录翻译生成病毒蛋白，然后病毒基因组rna与病毒蛋白在细胞中组装成慢病毒，慢病毒从293t细胞中释放到培养基中，收集慢病毒，将慢病毒与目的细胞共孵育，感染目的细胞；

(3)通过嘌呤霉素筛选步骤(2)中慢病毒感染后的细胞获得稳转细胞株：慢病毒感染目的细胞48h后，加入嘌呤霉素至2-10μg/ml，培养3代以上，直至细胞不再死亡，获得稳定细胞株，收集稳定细胞株，通过westernblot检测插入目的基因的表达量；

(4)高水平表达插入目的基因：通过westernblot检测，慢病毒感染48h后的目的细胞或稳转细胞中，目的基因的表达，判定是否高水平表达；

(5)通过gfp检测转染效率：该慢病毒转染293t细胞后，或者包装好的慢病毒感染目的细胞后，都可以通过荧光显微镜观察gfp的强度判定转染效率。

进一步，所述酶切连接中酶切位点为bamhi、sali、xhoi、xbai。

进一步，所述包装载体可选用pspax2和pmd2.g，也可选用rev、vsv-g和pmdl。

进一步，所设计载体应用于目的基因在哺乳动物细胞中的高效表达。

与现有技术相比本发明具有以下优点：本发明设计了一种慢病毒表达载体，命名为prsv-cmv-flag-ef1-puro-t2a-gfp，具有嘌呤霉素抗性基因和gfp双重筛选基因，可通过嘌呤霉素筛选获得稳转细胞株和通过gfp检测转染效率，与具有同类特征的慢病毒表达载体pcdh-cmv-mcs-ef1-copgfp-t2a-puro相比，可高效表达插入基因。

1.本发明设计的载体，采用cmvenhancer和cmvpromoter作为插入基因的转录起始元件，能够高水平表达插入基因。

2.本发明设计的载体，采用嘌呤霉素抗性基因和gfp作为筛选基因，有利于获得稳定细胞株，能够利用gfp随时监测转染效率。

3.本发明设计的载体，载体长度小，插入片段较大的基因后，对重组质粒转染效率和病毒包装效率的影响小，有利于分子量较大蛋白的过表达。

4.本发明设计的载体，在兼具益处1、2、3的基础上，通过慢病毒转染的方式实现插入基因的高效表达。

附图说明

图1为prsv-cmv-flag-ef1-puro-t2a-gfp载体结构图谱；

图2为分别采用慢病毒表达载体pcdh-cmv-mcs-ef1-copgfp-t2a-puro(pcdh)和prsv-cmv-flag-ef1-puro-t2a-gfp(prsv)在hct116细胞中过表达插入基因insert的westernblot检测图；

图3为图2中westernblot检测条带的相对定量分析图，(a)为过表达插入基因细胞中的过表达的insert相对于空载细胞中的倍数；(b)为过表达插入基因细胞中的总insert相对于空载细胞中的倍数。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

载体的设计和构建：

按照载体图谱(图1)，将该载体所需的各个元件按图谱顺序排列，设计成prsv-cmv-flag-ef1-puro-t2a-gfp载体。根据元件的名称，在ncbi数据库中，查询各个元件的序列，将各个元件的序列按载体图谱信息拷贝入相应的位置，形成载体的序列信息(seqidno.1)。然后，将载体的核酸序列信息交给第三方公司，按照载体序列合成，载体构建完成。

实施例2

载体的应用，根据实施例1设计完成的载体，在cmvpromoter后插入了四个酶切位点(bamhi、sali、xhoi、xbai)和两个flag标签，可以根据需要表达n端flag、c端flag、两端flag或其它标签的插入基因表达载体。重组载体的连接建议采用非典型酶切连接、pcr、同源重组、单链退火拼接等原理发展起来的各种dna克隆和组装技术。

重组载体构建成功后，将重组慢病毒载体和包装载体共同转染293t细胞，包装载体可选用pspax2和pmd2.g，也可选用rev、vsv-g和pmdl。转染72h后，收集病毒，转染目的细胞，通过荧光显微镜观察转染率。在细胞转染率较高的情况下，根据细胞系加入相应浓度的嘌呤霉素，培养3代以上，直至细胞不再死亡，westernblot检测插入基因的表达量。

实施例3

为了验证本发明设计的慢病毒载体在高效表达插入基因方面的优势，选取目前最为流行的同类型特征的载体pcdh-cmv-mcs-ef1-copgfp-t2a-puro(pcdh)作比较。

通过rt-pcr，从目的细胞hct116中获得插入基因insert的序列，通过pcr技术，在insert的n端加ha标签，获得ha-insert序列，采用gibson拼接的方法将ha-insert插入pcdh-cmv-mcs-ef1-copgfp-t2a-puro(pcdh)和prsv-cmv-flag-ef1-puro-t2a-gfp(prsv)的多克隆位点。

测序正确后，用慢病毒表达载体和包装载体(pspax2、pmd2.g)转染293t细胞，转染72h后，收集病毒，用peg8000/nacl浓缩病毒，转染hct116细胞，转染48h后，取一部分细胞用于检测蛋白表达水平，剩余细胞加入嘌呤霉素至2μg/ml，筛选3代以上，直至细胞不再死亡，获得稳定细胞株，收集细胞检测蛋白表达水平。

用westernblot检测蛋白表达水平，用ha抗体检测插入基因insert在hct116细胞中的过表达水平，用insert抗体检测插入基因insert在hct116细胞中的总体表达水平。

结果如图2的westernblot检测图所示，采用prsv表达插入基因，插入基因insert的表达水平要显著高于pcdh。进一步，对westernblot条带定量分析，如图3a的相对定量分析图所示，采用prsv的稳定转染细胞株中插入基因insert的过表达量是空载的550倍，而采用pcdh的稳定转染细胞株中插入基因insert的过表达量是空载的150倍。进一步，定量分析目的基因insert总体的表达量，如图3b的相对定量分析图所示，采用prsv的稳定转染细胞株中目的基因insert总体的表达量是空载的7倍，而采用pcdh的稳定转染细胞株中目的基因insert总体的表达量是空载的2倍。综上可得，采用prsv的稳定转染细胞株中插入基因的表达量是采用pcdh的稳定转染细胞株中的3.5倍，表明本发明设计的prsv-cmv-flag-ef1-puro-t2a-gfp要优于美国systembiosciences公司的pcdh-cmv-mcs-ef1-copgfp-t2a-puro。

以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点,对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。

此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。

序列表

<110>山西大学

<120>一种慢病毒表达载体的设计及应用

<160>1

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>8463

<212>dna

<213>人类免疫缺陷病毒-1(humanimmunodeficiencyvirustype1)

<400>1

aatgtagtcttatgcaatactcttgtagtcttgcaacatggtaacgatgagttagcaaca60

tgccttacaaggagagaaaaagcaccgtgcatgccgattggtggaagtaaggtggtacga120

tcgtgccttattaggaaggcaacagacgggtctgacatggattggacgaaccactgaatt180

gccgcattgcagagatattgtatttaagtgcctagctcgatacataaacgggtctctctg240

gttagaccagatctgagcctgggagctctctggctaactagggaacccactgcttaagcc300

tcaataaagcttgccttgagtgcttcaagtagtgtgtgcccgtctgttgtgtgactctgg360

taactagagatccctcagacccttttagtcagtgtggaaaatctctagcagtggcgcccg420

aacagggacttgaaagcgaaagggaaaccagaggagctctctcgacgcaggactcggctt480

gctgaagcgcgcacggcaagaggcgaggggcggcgactggtgagtacgccaaaaattttg540

actagcggaggctagaaggagagagatgggtgcgagagcgtcagtattaagcgggggaga600

attagatcgcgatgggaaaaaattcggttaaggccagggggaaagaaaaaatataaatta660

aaacatatagtatgggcaagcagggagctagaacgattcgcagttaatcctggcctgtta720

gaaacatcagaaggctgtagacaaatactgggacagctacaaccatcccttcagacagga780

tcagaagaacttagatcattatataatacagtagcaaccctctattgtgtgcatcaaagg840

atagagataaaagacaccaaggaagctttagacaagatagaggaagagcaaaacaaaagt900

aagaccaccgcacagcaagcggccgctgatcttcagacctggaggaggagatatgaggga960

caattggagaagtgaattatataaatataaagtagtaaaaattgaaccattaggagtagc1020

acccaccaaggcaaagagaagagtggtgcagagagaaaaaagagcagtgggaataggagc1080

tttgttccttgggttcttgggagcagcaggaagcactatgggcgcagcgtcaatgacgct1140

gacggtacaggccagacaattattgtctggtatagtgcagcagcagaacaatttgctgag1200

ggctattgaggcgcaacagcatctgttgcaactcacagtctggggcatcaagcagctcca1260

ggcaagaatcctggctgtggaaagatacctaaaggatcaacagctcctggggatttgggg1320

ttgctctggaaaactcatttgcaccactgctgtgccttggaatgctagttggagtaataa1380

atctctggaacagatttggaatcacacgacctggatggagtgggacagagaaattaacaa1440

ttacacaagcttaatacactccttaattgaagaatcgcaaaaccagcaagaaaagaatga1500

acaagaattattggaattagataaatgggcaagtttgtggaattggtttaacataacaaa1560

ttggctgtggtatataaaattattcataatgatagtaggaggcttggtaggtttaagaat1620

agtttttgctgtactttctatagtgaatagagttaggcagggatattcaccattatcgtt1680

tcagacccacctcccaaccccgaggggacccgacaggcccgaaggaatagaagaagaagg1740

tggagagagagacagagacagatccattcgattagtgaacggatctcgacggtatcgcta1800

gcttttaaaagaaaaggggggattggggggtacagtgcaggggaaagaatagtagacata1860

atagcaacagacatacaaactaaagaattacaaaaacaaattacaaaaattcaaaatttt1920

actagtatcaactttgtatagaaaagttgtagttattaatagtaatcaattacggggtca1980

ttagttcatagcccatatatggagttccgcgttacataacttacggtaaatggcccgcct2040

ggctgaccgcccaacgacccccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttcccatagta2100

acgccaatagggactttccattgacgtcaatgggtggagtatttacggtaaactgcccac2160

ttggcagtacatcaagtgtatcatatgccaagtacgccccctattgacgtcaatgacggt2220

aaatggcccgcctggcattatgcccagtacatgaccttatgggactttcctacttggcag2280

tacatctacgtattagtcatcgctattaccatggtgatgcggttttggcagtacatcaat2340

gggcgtggatagcggtttgactcacggggatttccaagtctccaccccattgacgtcaat2400

gggagtttgttttggcaccaaaatcaacgggactttccaaaatgtcgtaacaactccgcc2460

ccattgacgcaaatgggcggtaggcgtgtacggtgggaggtctatataagcagagctggt2520

ttagtgaaccgtcagatccaagtttgtacaaaaaagcaggctgccaccatgggatccgac2580

tacaaagacgatgacgacaaggtcgacgaattcctcgaggactacaaagacgatgacgac2640

aagtagtctagagggcagagcgcacatcgcccacagtccccgagaagttggggggagggg2700

tcggcaattgaacgggtgcctagagaaggtggcgcggggtaaactgggaaagtgatgtcg2760

tgtactggctccgcctttttcccgagggtgggggagaaccgtatataagtgcagtagtcg2820

ccgtgaacgttctttttcgcaacgggtttgccgccagaacacagacccagctttcttgta2880

caaagtgggccaccatggtgagcaagggcgaggagctgttcaccggggtggtgcccatcc2940

tggtcgagctggacggcgacgtaaacggccacaagttcagcgtgtccggcgagggcgagg3000

gcgatgccacctacggcaagctgaccctgaagttcatctgcaccaccggcaagctgcccg3060

tgccctggcccaccctcgtgaccaccctgacctacggcgtgcagtgcttcagccgctacc3120

ccgaccacatgaagcagcacgacttcttcaagtccgccatgcccgaaggctacgtccagg3180

agcgcaccatcttcttcaaggacgacggcaactacaagacccgcgccgaggtgaagttcg3240

agggcgacaccctggtgaaccgcatcgagctgaagggcatcgacttcaaggaggacggca3300

acatcctggggcacaagctggagtacaactacaacagccacaacgtctatatcatggccg3360

acaagcagaagaacggcatcaaggtgaacttcaagatccgccacaacatcgaggacggca3420

gcgtgcagctcgccgaccactaccagcagaacacccccatcggcgacggccccgtgctgc3480

tgcccgacaaccactacctgagcacccagtccgccctgagcaaagaccccaacgagaagc3540

gcgatcacatggtcctgctggagttcgtgaccgccgccgggatcactctcggcatggacg3600

agctgtacaagggctccggagagggcaggggaagtcttctaacatgcggggacgtggagg3660

aaaatcccggccccatgaccgagtacaagcccacggtgcgcctcgccacccgcgacgacg3720

tccccagggccgtacgcaccctcgccgccgcgttcgccgactaccccgccacgcgccaca3780

ccgtcgatccggaccgccacatcgagcgggtcaccgagctgcaagaactcttcctcacgc3840

gcgtcgggctcgacatcggcaaggtgtgggtcgcggacgacggcgccgcggtggcggtct3900

ggaccacgccggagagcgtcgaagcgggggcggtgttcgccgagatcggcccgcgcatgg3960

ccgagttgagcggttcccggctggccgcgcagcaacagatggaaggcctcctggcgccgc4020

accggcccaaggagcccgcgtggttcctggccaccgtcggcgtctcgcccgaccaccagg4080

gcaagggtctgggcagcgccgtcgtgctccccggagtggaggcggccgagcgcgccgggg4140

tgcccgccttcctggagacctccgcgccccgcaacctccccttctacgagcggctcggct4200

tcaccgtcaccgccgacgtcgaggtgcccgaaggaccgcgcacctggtgcatgacccgca4260

agcccggtgcctgacaactttattatacatagttgatcaattccgataatcaacctctgg4320

attacaaaatttgtgaaagattgactggtattcttaactatgttgctccttttacgctat4380

gtggatacgctgctttaatgcctttgtatcatgctattgcttcccgtatggctttcattt4440

tctcctccttgtataaatcctggttgctgtctctttatgaggagttgtggcccgttgtca4500

ggcaacgtggcgtggtgtgcactgtgtttgctgacgcaacccccactggttggggcattg4560

ccaccacctgtcagctcctttccgggactttcgctttccccctccctattgccacggcgg4620

aactcatcgccgcctgccttgcccgctgctggacaggggctcggctgttgggcactgaca4680

attccgtggtgttgtcggggaagctgacgtcctttccatggctgctcgcctgtgttgcca4740

cctggattctgcgcgggacgtccttctgctacgtcccttcggccctcaatccagcggacc4800

ttccttcccgcggcctgctgccggctctgcggcctcttccgcgtcttcgccttcgccctc4860

agacgagtcggatctccctttgggccgcctccccgcatcgggaattcccgcggttcgctt4920

taagaccaatgacttacaaggcagctgtagatcttagccactttttaaaagaaaaggggg4980

gactggaagggctaattcactcccaacgaagacaagatctgctttttgcttgtactgggt5040

ctctctggttagaccagatctgagcctgggagctctctggctaactagggaacccactgc5100

ttaagcctcaataaagcttgccttgagtgcttcaagtagtgtgtgcccgtctgttgtgtg5160

actctggtaactagagatccctcagacccttttagtcagtgtggaaaatctctagcagta5220

gtagttcatgtcatcttattattcagtatttataacttgcaaagaaatgaatatcagaga5280

gtgagaggaacttgtttattgcagcttataatggttacaaataaagcaatagcatcacaa5340

atttcacaaataaagcatttttttcactgcattctagttgtggtttgtccaaactcatca5400

atgtatcttatcatgtctggctctagctatcccgcccctaactccgcccatcccgcccct5460

aactccgcccagttccgcccattctccgccccatggctgactaattttttttatttatgc5520

agaggccgaggccgcctcggcctctgagctattccagaagtagtgaggaggcttttttgg5580

aggcctagggacgtacccaattcgccctatagtgagtcgtattacgcgcgctcactggcc5640

gtcgttttacaacgtcgtgactgggaaaaccctggcgttacccaacttaatcgccttgca5700

gcacatccccctttcgccagctggcgtaatagcgaagaggcccgcaccgatcgcccttcc5760

caacagttgcgcagcctgaatggcgaatgggacgcgccctgtagcggcgcattaagcgcg5820

gcgggtgtggtggttacgcgcagcgtgaccgctacacttgccagcgccctagcgcccgct5880

cctttcgctttcttcccttcctttctcgccacgttcgccggctttccccgtcaagctcta5940

aatcgggggctccctttagggttccgatttagtgctttacggcacctcgaccccaaaaaa6000

cttgattagggtgatggttcacgtagtgggccatcgccctgatagacggtttttcgccct6060

ttgacgttggagtccacgttctttaatagtggactcttgttccaaactggaacaacactc6120

aaccctatctcggtctattcttttgatttataagggattttgccgatttcggcctattgg6180

ttaaaaaatgagctgatttaacaaaaatttaacgcgaattttaacaaaatattaacgctt6240

acaatttaggtggcacttttcggggaaatgtgcgcggaacccctatttgtttatttttct6300

aaatacattcaaatatgtatccgctcatgagacaataaccctgataaatgcttcaataat6360

attgaaaaaggaagagtatgagtattcaacatttccgtgtcgcccttattcccttttttg6420

cggcattttgccttcctgtttttgctcacccagaaacgctggtgaaagtaaaagatgctg6480

aagatcagttgggtgcacgagtgggttacatcgaactggatctcaacagcggtaagatcc6540

ttgagagttttcgccccgaagaacgttttccaatgatgagcacttttaaagttctgctat6600

gtggcgcggtattatcccgtattgacgccgggcaagagcaactcggtcgccgcatacact6660

attctcagaatgacttggttgagtactcaccagtcacagaaaagcatcttacggatggca6720

tgacagtaagagaattatgcagtgctgccataaccatgagtgataacactgcggccaact6780

tacttctgacaacgatcggaggaccgaaggagctaaccgcttttttgcacaacatggggg6840

atcatgtaactcgccttgatcgttgggaaccggagctgaatgaagccataccaaacgacg6900

agcgtgacaccacgatgcctgtagcaatggcaacaacgttgcgcaaactattaactggcg6960

aactacttactctagcttcccggcaacaattaatagactggatggaggcggataaagttg7020

caggaccacttctgcgctcggcccttccggctggctggtttattgctgataaatctggag7080

ccggtgagcgtgggtctcgcggtatcattgcagcactggggccagatggtaagccctccc7140

gtatcgtagttatctacacgacggggagtcaggcaactatggatgaacgaaatagacaga7200

tcgctgagataggtgcctcactgattaagcattggtaactgtcagaccaagtttactcat7260

atatactttagattgatttaaaacttcatttttaatttaaaaggatctaggtgaagatcc7320

tttttgataatctcatgaccaaaatcccttaacgtgagttttcgttccactgagcgtcag7380

accccgtagaaaagatcaaaggatcttcttgagatcctttttttctgcgcgtaatctgct7440

gcttgcaaacaaaaaaaccaccgctaccagcggtggtttgtttgccggatcaagagctac7500

caactctttttccgaaggtaactggcttcagcagagcgcagataccaaatactgttcttc7560

tagtgtagccgtagttaggccaccacttcaagaactctgtagcaccgcctacatacctcg7620

ctctgctaatcctgttaccagtggctgctgccagtggcgataagtcgtgtcttaccgggt7680

tggactcaagacgatagttaccggataaggcgcagcggtcgggctgaacggggggttcgt7740

gcacacagcccagcttggagcgaacgacctacaccgaactgagatacctacagcgtgagc7800

tatgagaaagcgccacgcttcccgaagagagaaaggcggacaggtatccggtaagcggca7860

gggtcggaacaggagagcgcacgagggagcttccagggggaaacgcctggtatctttata7920

gtcctgtcgggtttcgccacctctgacttgagcgtcgatttttgtgatgctcgtcagggg7980

ggcggagcctatggaaaaacgccagcaacgcggcctttttacggttcctggccttttgct8040

ggccttttgctcacatgttctttcctgcgttatcccctgattctgtggataaccgtatta8100

ccgcctttgagtgagctgataccgctcgccgcagccgaacgaccgagcgcagcgagtcag8160

tgagcgaggaagcggaagagcgcccaatacgcaaaccgcctctccccgcgcgttggccga8220

ttcattaatgcagctggcacgacaggtttcccgactggaaagcgggcagtgagcgcaacg8280

caattaatgtgagttagctcactcattaggcaccccaggctttacactttatgcttccgg8340

ctcgtatgttgtgtggaattgtgagcggataacaatttcacacaggaaacagctatgacc8400

atgattacgccaagcgcgcaattaaccctcactaaagggaacaaaagctggagctgcaag8460

ctt8463