一种应用于酵母细胞中HCP残留的去除方法与流程

本发明涉及生物工程技术领域，尤其涉及一种应用于酵母细胞中hcp残留的去除方法。

背景技术：

hcp为宿主细胞残留蛋白，是生物制品的关键质量属性(cqa)，直接影响着生物制品的安全性，有效性和稳定性。因此，在整个生物制品的生产环节中，我们需要将hcp去除或者使其达到可控的尽量低的水平。

目前，夹心法elisa检测试剂盒是检测hcp残留的金标准。然而，这种方法高度依赖于试剂盒中抗hcp抗体对于总宿主细胞蛋白的覆盖率。若elisa检测中使用的抗体覆盖率不足，可能在最终产品中漏检某些残留的hcp，进而可能在用药患者中引起免疫反应和其他药物安全性的问题。

同时我们也看到，因为注射剂中残留hcp引发患者不良反应，而导致项目搁置的事件也时有发生。美国药典和欧洲药典在2016和2017年相继对hcp抗体覆盖率检测提出了新的要求。

hcp大部分的等电点在3-6之间，因此可以通过相关工艺和参数进行去除，但目前还没有专门针对生物制品中hcp残留的去除，现有的大部分报道主要是针对动物细胞中hcp残留的去除，比如说cho细胞中hcp残留的去除，主要是通过亲和方法去除的，没有专门针对酵母细胞中残留的去除，比如说毕赤酵母中hcp残留的去除。hcp残留在发酵液中普遍存在，尤其是在胞内较多，但是随着下游工艺的进行大部分该残留会被慢慢去除，但是有些是去不掉的，因此需要特殊的工艺路线和参数进行去除。

本发明主要是通过工艺路线和参数去除毕赤酵母中hcp残留，尤其是胞外表达的蛋白，虽然没有细胞破碎这一步骤，但是可以针对目前很多由于hcp和目的蛋白化学性质相近比如等电点和分子量等因素，不容易去除的问题，本发明对于该问题的解决方法进行开发，能够去除该残留以便达到相关标准。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种应用于酵母细胞中hcp残留的去除方法，能够很好的去除酵母细胞中hcp的残留，达到相关标准。

为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：

一种应用于酵母细胞中hcp残留的去除方法，该方法包括如下：

(1)对酵母细胞液进行阳离子交换层析，洗脱，收集洗脱峰，得洗脱样液；

(2)对步骤(1)所得洗脱样液进行疏水层析，洗脱，收集洗脱峰，得洗脱样液；

(3)对步骤(2)所得洗脱样液进行cht层析，洗脱，收集洗脱峰，得洗脱样液；

(4)对步骤(3)所得洗脱样液进行阳离子层析，洗脱，收集洗脱峰，即可。

对步骤(4)所得洗脱样液hcp的检测：采用毕赤酵母hcp检测试剂盒f640检测hcp残留，该残留浓度至100ppm(ng/mg)以内，即符合相关标准。

进一步的，该方法具体包括如下步骤：

(1)对酵母细胞液进行阳离子层析，先用平衡缓冲液平衡层析柱，上样阶段用平衡缓冲液继续冲洗2个柱体积，分别以2.8～3.6％，8.2～11.8％，23.8～27.3％，47.9～51.5％，100％梯度的洗脱缓冲液，以2.0ml/min流速洗脱，收集洗脱峰，检测于280nm波长，得洗脱样液；

所述平衡缓冲液：52mm醋酸钠-醋酸，ph4.2；

所述洗脱缓冲液：52mm醋酸钠-醋酸，1.5m氯化钠，ph4.2；

该步骤主要作用是捕获目的蛋白，首次去除hcp，原理为根据蛋白的带电性质不同进行，阳离子层析蛋白带正电荷，能被填料吸附，而带负电荷的蛋白会流穿掉，即可去除非目标蛋白和部分hcp。

(2)对步骤(1)所得洗脱样液进行疏水层析，先用平衡缓冲液平衡层析柱，上样阶段，用平衡缓冲液继续冲洗2个柱体积，以0-100％的洗脱缓冲液洗进行线性洗脱，以2.0ml/min流速洗脱，收集洗脱峰，检测于280nm波长，得洗脱样液；

平衡缓冲液：21mmnaac-hac，1m(nh4)2so4ph5.5；

洗脱缓冲液：21mmnaac-hac，ph5.5；

该步骤主要通过高盐上样，以高盐改变蛋白的暴露的基团，让蛋白的疏水基团暴露，因此会结合于疏水填料上，后期通过降低盐浓度进行洗脱，盐浓度降低后，蛋白的亲水基团会暴露，疏水基团会隐藏到蛋白内部，根据极性相容原理，蛋白会随着溶液的极性变化而流动，可以进一步去除hcp。

(3)对步骤(2)所得洗脱样液进行cht层析，先用平衡缓冲液平衡层析柱，上样阶段，用平衡缓冲液继续冲洗2个柱体积，以2.0ml/min流速用洗脱平衡液进行洗脱，收集流穿峰，检测于280nm波长，得洗脱样液；

进一步的，所述平衡缓冲液：20mmpb缓冲液，ph7.2；

进一步的，所述洗脱平衡液：400mmpb缓冲液，1.0m氯化钠，ph7.2；

该步骤采用金属螯合与阳离子交换的组合的原理进行分离，主要作用为金属螯合，可以分离性质相近的蛋白，某些蛋白上样的时候无法挂载填料上，但是在流穿阶段目的蛋白流穿掉，而hcp则会挂在填料上，因而可进行hcp的去除。

(4)对步骤(3)所得洗脱样液进行阳离子交换层析，先用平衡缓冲液平衡层析柱，上样阶段，用平衡缓冲液继续冲洗2个柱体积，分别以2.1～4.8％，5.9～8.6％，9.3～12.7％，23.5～27.6％，100％的洗脱缓冲液，以2.0ml/min流速洗脱，收集洗脱峰，检测于280nm波长；

进一步的，所述平衡缓冲液：50mm醋酸钠-醋酸，ph4.2；

进一步的，所述洗脱平衡液：50mm醋酸钠-醋酸，1.5m氯化钠，ph4.2。

进一步的，所述步骤(1)～(4)都采用aktapure150层析系统、所用层析柱均为bxp16/30。

进一步的，所述步骤(1)中的层析柱填料：nanosp30l、nuvia、hr-s中的任意一种；

进一步的，所述步骤(2)中的层析柱填料：phenylbestaroseff(hs)；

进一步的，所述步骤(3)中的层析柱填料：cht；

进一步的，所述步骤(4)中的层析柱填料：spbestrosehp。

综上所述，由于采用了上述技术方案，本发明的有益效果是：

本发明可以针对酵母中胞外分泌蛋白残留的hcp(与目的蛋白性质相近)进行去除，去除之后经过检测可以达到相关标准，有利于相关生物工艺的开发和整个生物行业的进步。

附图说明

图1是本发明的一较佳实施例中经步骤(1)洗脱所得层析谱图；

图2是本发明图1实施例中经步骤(2)洗脱所得层析谱图；

图3是本发明图1实施例中经步骤(3)洗脱所得层析谱图；

图4是本发明图1实施例中经步骤(4)洗脱所得层析谱图；

附图标记：1、蛋白峰；2、洗脱电导峰；3、洗脱液比例峰。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。

一种应用于酵母细胞中hcp残留的去除方法，包括如下步骤：

(1)对毕赤酵母细胞液进行阳离子交换层析，采用aktapure150层析系统，先用平衡缓冲液平衡层析柱，上样阶段用平衡缓冲液继续冲洗2个柱体积，收集洗脱峰，测定蛋白收率，层析过程条件如下：

层析柱：bxp16/30；

梯度：2.8～3.6％，8.2～11.8％，23.8～27.3％，47.9～51.5％，100％；

流速：2.0ml/min；

检测波长：280nm；

所述层析柱填料：nanosp30l、nuvia、hr-s中的任意一种；

所述平衡缓冲液：52mm醋酸钠-醋酸，ph4.2；

所述洗脱缓冲液：52mm醋酸钠-醋酸，1.5m氯化钠，ph4.2；

该步骤主要作用是捕获目的蛋白，首次去除hcp，原理为根据蛋白的带电性质不同进行，阳离子层析蛋白带正电荷，能被填料吸附，而带负电荷的蛋白会流穿掉，即可去除非目标蛋白和部分hcp。

(2)对步骤(1)所得洗脱样液进行疏水层析：

仪器：aktapure150层析系统；

层析柱：bxp16/30；

填料：phenylbestaroseff(hs)；

平衡缓冲液：21mmnaac-hac，1m(nh4)2so4ph5.5；

洗脱缓冲液：21mmnaac-hac，ph5.5；

先用平衡缓冲液平衡层析柱，上样阶段，用平衡缓冲液继续冲洗2个柱体积；

线性洗脱：0-100％的洗脱缓冲液；

流速：2.0ml/min；

检测：280nm波长；

收集洗脱峰，测定蛋白收率。

该步骤主要通过高盐上样，以高盐改变蛋白的暴露的基团，让蛋白的疏水基团暴露，因此会结合于疏水填料上，后期通过降低盐浓度进行洗脱，盐浓度降低后，蛋白的亲水基团会暴露，疏水基团会隐藏到蛋白内部，根据极性相容原理，蛋白会随着溶液的极性变化而流动，可以进一步去除hcp。

(3)对步骤(2)所得洗脱样液进行cht层析，先用平衡缓冲液平衡层析柱，层析条件：

仪器：aktapure150层析系统；

填料：cht；

层析柱：bxp16/30；

平衡缓冲液：20mmpb缓冲液，ph7.2；

洗脱平衡液：400mmpb缓冲液，1.0m氯化钠，ph7.2；

上样阶段参数及要求如下：

流速：2.0ml/min；

检测：280nm波长；

收集：流穿峰；

该步骤采用金属螯合与阳离子交换的组合的原理进行分离，填料可以螯合蛋白中的金属钙离子，可以分离性质相近的蛋白，某些蛋白上样的时候无法挂载填料上，但是在流穿阶段目的蛋白流穿掉，而hcp则会挂在填料上，因而可进行hcp的去除。

(4)对步骤(3)所得洗脱样液进行阳离子交换层析，先用平衡缓冲液平衡层析柱，上样阶段，用平衡缓冲液继续冲洗2个柱体积，分别以2.1～4.8％，5.9～8.6％，9.3～12.7％，23.5～27.6％，100％的洗脱缓冲液，以2.0ml/min流速洗脱，收集洗脱峰，检测于280nm波长，得洗脱样液；

仪器：aktapure150层析系统；

层析柱为bxp16/30；

填料：spbestrosehp；

平衡缓冲液：50mm醋酸钠-醋酸，ph4.2；

洗脱平衡液：50mm醋酸钠-醋酸，1.5m氯化钠，ph4.2；

该步骤与步骤(1)相似，再次阳离子交换层析对hcp进行去除；

(5)对步骤(4)所得洗脱样液hcp的检测：采用毕赤酵母hcp检测试剂盒f640检测hcp残留，该残留浓度至100ppm(ng/mg)以内，即符合相关标准。

实施例1

一种应用于酵母细胞中hcp残留的去除方法(采用毕赤酵母hcp检测试剂盒f640检测每个步骤的hcp残留)，包括如下步骤：

(1)对毕赤酵母细胞液(初始蛋白浓度为2.5(mg/ml))，初始hcp残留量为5000ppm(ng/mg))进行阳离子层析，采用aktapure150层析系统，先用平衡缓冲液平衡层析柱，上样阶段用平衡缓冲液继续冲洗2个柱体积，收集洗脱峰，测定蛋白收率，层析过程条件如下：

层析柱：bxp16/30；

梯度：2.8％，8.9％，26.3％，50.5％，100％；

流速：2.0ml/min；

检测波长：280nm；

所述层析柱填料：nanosp30l、nuvia、hr-s中的任意一种；

所述平衡缓冲液：52mm醋酸钠-醋酸，ph4.2；

所述洗脱缓冲液：52mm醋酸钠-醋酸，1.5m氯化钠，ph4.2；

收样蛋白浓度为1.6(mg/ml)，所得蛋白收率在64％，hcp残留量为2000ppm(ng/mg)；

该步骤主要作用是捕获目的蛋白，首次去除hcp，原理为根据蛋白的带电性质不同进行，阳离子层析蛋白带正电荷，能被填料吸附，而带负电荷的蛋白会流穿掉，即可去除非目标蛋白和部分hcp。

请参阅图1，由于目的蛋白和hcp性质相近，所以在捕获目的蛋白的过程中会残留有一部分hcp蛋白，而大部分的杂蛋白和大部分的hcp会流穿，从峰形上能看出比较杂乱，则说明了在捕获目的蛋白的阶段，也会捕获一部分杂质，该杂质能够通过后续的层析步骤进行去除。

(2)对步骤(1)所得洗脱液进行疏水层析：

仪器：aktapure150层析系统；

层析柱：bxp16/30；

填料：phenylbestaroseff(hs)；

平衡缓冲液：21mmnaac-hac，1m(nh4)2so4ph5.5；

洗脱缓冲液：21mmnaac-hac，ph5.5；

先用平衡缓冲液平衡层析柱，上样阶段，用平衡缓冲液继续冲洗2个柱体积，

线性洗脱：0-100％的洗脱缓冲液；

流速：2.0ml/min；

检测：280nm波长；

收集洗脱峰，测定蛋白收率。

收样蛋白浓度为(1.4mg/ml)，所得蛋白收率在87.5％，hcp残留量为800(ng/mg)。

该步骤主要通过高盐上样，以高盐改变蛋白的暴露的基团，让蛋白的疏水基团暴露，因此会结合于疏水填料上，后期通过降低盐浓度进行洗脱，盐浓度降低后，蛋白的亲水基团会暴露，疏水基团会隐藏到蛋白内部，根据极性相容原理，蛋白会随着溶液的极性变化而流动，可以进一步去除hcp。

请参阅图2，上样阶段会有一小部分杂蛋白流穿(图中的第一个小鼓包)，而大部分目的蛋白和一小部分hcp与疏水填料结合，在洗脱的过程中会有一小部分hcp残留在填料上，无法被洗脱下来，而大部分目的蛋白留在层析柱填料上，完成对hcp的分离。

(3)对步骤(2)所得洗脱液进行cht层析，先用平衡缓冲液平衡层析柱，层析条件：

仪器：aktapure150层析系统；

填料：cht；

层析柱：bxp16/30；

平衡缓冲液：20mmpb缓冲液，ph7.2；

洗脱平衡液：400mmpb缓冲液，1.0m氯化钠，ph7.2；

上样阶段参数及要求如下：

流速：2.0ml/min；

检测：280nm波长；

收集：流穿峰；

该步骤采用金属螯合与阳离子交换的组合的原理进行分离，主要作用为金属螯合，可以分离性质相近的蛋白，某些蛋白上样的时候无法挂载填料上，但是在流穿阶段目的蛋白流穿掉，而hcp会挂在填料上，因而可进行hcp的去除。

收样蛋白浓度为(0.9mg/ml)，所得蛋白收率在64.3％，hcp残留量为231(ng/mg)。

请参阅图3，上样阶段流穿一部分hcp，会减小hcp残留含量，线性洗脱阶段分为两部分，第一部分为大部分的目的蛋白以及少量hcp蛋白，而第二步出现的峰更多的是hcp蛋白，本步骤在上一步骤的基础上进一步减少了hcp含量。

(4)对步骤(3)所得洗脱液进行阳离子交换层析，先用平衡缓冲液平衡层析柱，

仪器：aktapure150层析系统；

层析柱为bxp16/30；

填料：spbestrosehp；

平衡缓冲液：50mm醋酸钠-醋酸，ph4.2；

洗脱平衡液：50mm醋酸钠-醋酸，1.5m氯化钠，ph4.2；

上样阶段，用平衡缓冲液继续冲洗2个柱体积，分别以3.2％，7.5％，11.2％，24.5％，100％的洗脱缓冲液，以2.0ml/min流速洗脱，收集洗脱峰，检测于280nm波长；

该步骤与步骤(1)相似，再次对hcp进行去除；

收样蛋白浓度为0.8(mg/ml)，所得蛋白收率为88.9％，hcp残留量为89ppm(ng/mg)。

请参阅图4，本步骤根据cht的层析原理即螯合金属钙离子，能吸附大量的hcp蛋白和少量的目的蛋白，而大部分的目的蛋白无法吸附填料，从而流穿下来，进行收集即可得到hcp含量较低的目的蛋白。

区别于现有技术，本发明可以针对酵母中胞外分泌蛋白残留的hcp(与目的蛋白性质相近)进行去除，去除之后经过检测可以达到相关标准，有利于相关生物工艺的开发和整个生物行业的进步。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。