胚胎干细胞的高效诱导分化培养方法与流程

本发明涉及一种胚胎干细胞的高效诱导分化培养方法，属于细胞培养
技术领域：
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背景技术：
：具有自我更新、高度增殖和多向分化的能力的胚胎干细胞(embryonicstemcell,esc)在体内外可以成功地分化为肝细胞,为多种难治性肝病、代谢性肝病的细胞替代治疗提供了源源不断的种子细胞来源,但是其诱导分化的低效率一直是难以解决的关键问题.目前,esc分化为肝细胞的方法主要有自发分化、体外诱导分化和体内诱导分化。体外诱导esc分化为肝细胞是研究的重点,单层定向分化操作简便,培养体系简单,添加适当的细胞因子易获得高比率的分化细胞,是esc定向分化和研究早期胚胎发育的理想平台。构建一种高效诱导胚胎干细胞向肝脏细胞分化的培养方法是本领域急需解决的问题。本发明旨在提供一种高效诱导胚胎干细胞向肝脏细胞分化的培养方法。技术实现要素：本发明的目的是提供一种高效诱导胚胎干细胞向肝脏细胞分化的培养方法。无柄灵芝素f是从无柄灵芝中分离得到的一种化合物，经检索，该化合物的活性尚无过多研究，其分子式为，c20h28o6，分子结构如下：。本发明人发现，无柄灵芝素f具有显著的促进胚胎干细胞向肝脏细胞分化的功能。本发明所需要解决的技术问题可以通过以下技术方案来实现。一种诱导胚胎干细胞向肝脏细胞分化的培养方法，其包括：培养过程中应用了无柄灵芝素f，其分子式为，c20h28o6，结构式如下：。进一步优选，所述诱导培养步骤如下：（1）选用小鼠esc系，首先用斯丹赛品牌的人类胚胎干细胞条件培养液培养液培养中3d；（2）在培养液中加入30-40ng/ml无柄灵芝素f诱导6d以向肝细胞方向分化；（3）继续培养分化的肝细胞4d，每天换液1次。对照组以无饲养层高糖dmem培养基,其中添加10%胎牛血清、0.1mmol/lβ-巯基乙醇、1mmol/l谷氨酰胺、非必需氨基酸等,esc复苏后于明胶预处理的6孔板中贴壁自发分化13d。本发明的研究方法：细胞免疫荧光检测:所用一抗分别为alb(1∶100),甲胎蛋白(1∶100)、细胞角蛋白ck18(1∶100)、fitc标记的羊抗兔igg(1∶100)和tritc标记的羊抗鼠igg(1∶100).详细步骤参考各抗体说明书.荧光显微镜下观察。pas糖原染色-过碘酸schiff反应:将诱导18d的细胞,40g/l的甲醛固定30min.甲醇固定.1%的过碘酸氧化5min,pbs洗涤5次,然后用希夫氏试剂染色15min.常规脱水、透明、中性树胶封片.红紫色染色的积聚物看作糖原储存。分化效率的检测:每个试验组随机选择6个孔,每孔随机选择5个视野(不重叠),每个视野统计alb绿色荧光阳性细胞占整个视野dapi对染细胞总数的比例,3次重复所得alb荧光阳性细胞比率的平均数即为该组的肝细胞诱导分化率。本发明的优点：本发明人发现，无柄灵芝素f具有微弱的促进胚胎干细胞向肝脏细胞分化的功能，右旋糖酐铁注射液几乎没有促进胚胎干细胞向肝脏细胞分化的功能，然而两者合用却能显著促进胚胎干细胞向肝脏细胞分化。本发明提供了一种简单易行的干细胞向肝脏细胞高效分化的培养方法，在肝脏治疗领域具有广阔的应用前景。附图说明图1为甲胎蛋白afp荧光染色图，呈阳性。图2为alb白蛋白荧光染色图，呈阳性。图3为ck18细胞角蛋白荧光染色图，呈阳性。具体实施方式下面详细描述本发明的实施例，所述实施例仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。本发明的具体实施例如以下说明。实施例1本发明所用小鼠esc系为按照常规制备鉴定得到的小鼠esc，保存于郑州大学第一附属医院。实验组1：（1）选用小鼠esc系，首先用斯丹赛品牌的人类胚胎干细胞条件培养液培养液培养中3d；（2）在培养液中加入30ng/ml无柄灵芝素f，20ng/ml右旋糖酐铁注射液联合诱导6d以向肝细胞方向分化；（3）继续培养分化的肝细胞4d，每天换液1次。实验组2：（1）选用小鼠esc系，首先用斯丹赛品牌的人类胚胎干细胞条件培养液培养液培养中3d；（2）在培养液中加入35ng/ml无柄灵芝素f，20ng/ml右旋糖酐铁注射液联合诱导6d以向肝细胞方向分化；（3）继续培养分化的肝细胞4d，每天换液1次。实验组3：（1）选用小鼠esc系，首先用斯丹赛品牌的人类胚胎干细胞条件培养液培养液培养中3d；（2）在培养液中加入40ng/ml无柄灵芝素f，20ng/ml右旋糖酐铁注射液联合诱导6d以向肝细胞方向分化；（3）继续培养分化的肝细胞4d，每天换液1次。空白对照组：对照组以无饲养层高糖dmem培养基,其中添加10%胎牛血清、0.1mmol/lβ-巯基乙醇、1mmol/l谷氨酰胺、非必需氨基酸等,esc复苏后于明胶预处理的6孔板中贴壁自发分化13d。对照组1：（1）选用小鼠esc系，首先用斯丹赛品牌的人类胚胎干细胞条件培养液培养液培养中3d；（2）在培养液中加入30ng/ml无柄灵芝素f诱导6d以向肝细胞方向分化；（3）继续培养分化的肝细胞4d，每天换液1次。对照组2：（1）选用小鼠esc系，首先用斯丹赛品牌的人类胚胎干细胞条件培养液培养液培养中3d；（2）在培养液中加入20ng/ml右旋糖酐铁注射液诱导6d以向肝细胞方向分化；（3）继续培养分化的肝细胞4d，每天换液1次。实施例2诱导培养第13d,行免疫荧光染色检测afp、alb、ck18的表达.可见实验组afp、alb、ck18均为阳性,发红色或绿色荧光。图1为:甲胎蛋白afp荧光染色图，呈阳性。图2为alb白蛋白荧光染色图，呈阳性。图3为ck18细胞角蛋白荧光染色图，呈阳性。各组诱导肝脏细胞分化率由细胞免疫荧光alb阳性率统计而得,经各组随机挑取30张alb免疫荧光照片,alb阳性细胞数和dapi核染色数经image-proplus软件记数，统计。结果如表1所示。统计学处理：使用spss16.0,进行统计学分析，计量资料的结果表示为均值±标准差,采用组间t检验。表1各组肝脏细胞分化率分化率(x̅±s,%)实验组147.44±5.89实验组249.54±4.92实验组352.04±7.28空白对照组16.15±3.33对照组124.51±6.31对照组215.34±3.11自发分化对照组分化率仅仅为4.58%,而实验组达69%以上，无柄灵芝素f具有显著的促进胚胎干细胞向肝脏细胞分化的功能，右旋糖酐铁注射液几乎没有促进胚胎干细胞向肝脏细胞分化的功能，其和无柄灵芝素f合用也不能进一步促进胚胎干细胞向肝脏细胞分化。需要说明的是，以上所述仅为本发明的优选具体的实施例，若依本发明的构想所作变动，其产生的功能作用，仍未超出说明书所涵盖的精神时，均应在本发明的范围内。在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。尽管已经示出和描述了本发明的实施例，本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。当前第1页1 2 3