本发明属于核苷酸合成技术领域，尤其涉及一种亚磷酰化试剂及其在寡核苷酸合成中的应用。
背景技术：
亚磷酰化试剂在寡核苷酸合成中的应用始于上世纪七十年代中期，通过亚磷酰化试剂上两个活性基团依次与保护核苷反应得到寡核苷酸。使用亚磷酰化试剂合成寡核苷酸的方法称为亚磷酰胺法，早期也称作“亚磷酸三酯法”，是目前寡核苷酸合成中最常用的方法，其中亚磷酰化试剂是亚磷酰胺法的关键原料。
二氯亚磷酸单酯为早期使用的亚磷酰化试剂。氯亚磷酸单酯为反应过程中的活性中间体，活性很高，在反应结束后不能进行分离纯化，也不能长期保存，同样的条件下氯亚磷酸单酯能与保护核苷继续反应生成亚磷酸三酯，反应的选择性较差。在上世纪八十年代初，beaucage和caruthers开发出亚磷酰胺单酯类亚磷酰化试剂，在试剂稳定性和反应活性两方面取得平衡。亚磷酰胺单酯试剂的两个酰胺键需在不同的活化剂作用下依次与保护核苷反应，反应的选择性好。中间体亚磷酰胺二酯稳定性好，能够进行分离提纯，并可以长期保存，非常适合寡核苷酸的合成。在此后几十年，亚磷酰胺单酯通过改变酰胺取代基或酯基陆续发展出系列试剂，其中以二(二异丙基胺基)亚磷酸(2-腈乙基)酯为最为常用。
这些目前常用的亚磷酰单酯类亚磷酰化试剂非常适合于寡核苷酸的固相合成。通过亚磷酰胺法寡核苷酸已经能够在自动合成仪上实现快速合成。但固相合成法为固液两相反应，反应物接触面小，传质速度受限，反应效率低；反应的原料试剂大大过量，原料成本高；中间步骤的反应情况无法监控、中间体的结构及纯度无法分析，反应结果的可控性差，由于设备限制也很难进行规模放大，因而不适合工业化生产。
与固相相比，目前常用的亚磷酰单酯类亚磷酰化试剂在液相合成的应用中存在几个问题：1)随着链增长，反应原料和产物在反应溶剂中的溶解度下降导致反应速度和转化率降低；2)后处理过程萃取或结晶等常用的提取纯化方法逐渐失去作用，无法进行有效的纯化。
为了优化寡核苷酸的液相合成方法，日本味之素公司和武田公司分别开发出类固相合成法。在3′-oh、5′-oh或碱基上胺基引入非极性大基团保护基提高寡核苷酸三酯中间体在有机溶剂中的溶解度，使合成过程可以通过萃取提取产物，并通过改变溶剂组成进行沉析进行纯化，但也存在以下问题：1)使用3′-oh、5′-oh保护的原料进行反应时，由于只是在一端进行保护，随着链增长，溶解度快速下降，不利于长链的合成，中间产物的性质差异大，无法形成通用的工艺方法；2)碱基保护的方法，需要制备的核苷原料种类较多，制备过程复杂；3)3′-oh、5′-oh和碱基保护配合使用，虽然可以很好解决溶解的问题，但工艺更为复杂。
技术实现要素：
本发明的目的在于解决现有合成寡核苷酸过程中中间体溶解度降低导致分子链增长反应困难的问题，提供一种亚磷酰化试剂及其制备方法，并利用该亚磷酰化试剂合成寡核苷酸。
本发明的亚磷酰化试剂具有如下通式(1)所示结构：
其中，r1、r2至少有一个为c10～c50的直链或支链烷基、c10～c50的直链或支链烯基或通式(2)表示的基团；
通式(2)中，k为0～5的整数；q选自o、nh、nhco、co、conh、s、so或so2(即砜基：-s(＝o)2-)中的任意一种；n选自1～5的整数；r选自c6～c50的直链或支链烷基、c6～c50的直链或支链烯基；*表示键合位置；环a为六元环；
r3、r4至少有一个选自cl、br和**nr5r6中的任意一种，其中，**表示与p的键合位置，r5、r6分别表示含有1～5个c的基团。
进一步，r5与r6之间通过单键或杂原子连接成环。
进一步，所述通式(2)中，环a表示含有或不含有双键的六元环，环a除了具有n个qr取代基外，还可以含有选自卤素原子、含有卤素原子取代的c1～c5烷基、不含卤素原子取代的c1～c5烷基、含有卤素原子取代的c1～c5烷氧基、不含卤素原子取代的c1～c5烷氧基中的任意一种或多种取代基。
进一步，所述k优选自0～3的整数，特别优选0～1的整数。
进一步，所述q优选自o或nh。
进一步，所述n优选自1～3的整数，特别优选2或3。
进一步，所述通式(2)中，所述r优选自c7～c20的直链或支链烷基、c7～c20的直链或支链烯基。
进一步，所述环a优选自苯环或环己环，特别优选自苯环。
进一步，所述r3、r4至少有一个优选自氯、二甲基氨基、二乙基氨基、二(二异丙基)氨基、四氢吡咯-n-基，哌啶-n-基和吗啡啉-n-基中的任意一种，特优选自氯或二(二异丙基)氨基。
进一步，r1、r2选自以下任一基团：
3,5,5-三甲基-己基、异构十烷基、正十二烷基、异构十三烷基、3,7,11-三甲基-十二烷基、3,7,11,15-四甲基-十六烷基、3,7,11,15-四甲基-2-十六烯-1-基、3,7,11-三甲基-2,6,10-十二碳三烯-1-基、3,4-二(正辛烷氧基)-苄基、2,4-二(正辛烷氧基)-苄基、3,4,5-三(正辛烷氧基)-苄基、3,5-二(正辛烷氧基)-苄基、3,4-二(2-乙基-己烷氧基)-苄基、2,4-二(2-乙基-己烷氧基)-苄基、3,4,5-二(2-乙基-己烷氧基)-苄基、3,5-二(2-乙基-己烷氧基)-苄基、3,4-二(3,5,5-三甲基-己烷氧基)-苄基、2,4-二(3,5,5-三甲基-己烷氧基)-苄基、3,4,5-二(3,5,5-三甲基-己烷氧基)-苄基、3,5-二(3,5,5-三甲基-己烷氧基)-苄基、3,4-二(异构十烷氧基)-苄基、2,4-二(异构十烷氧基)-苄基、3,4,5-二(异构十烷氧基)-苄基、3,5-二(异构十烷氧基)-苄基、3,4-二(正十二烷氧基)-苄基、2,4-二(正十二烷氧基)-苄基、3,4,5-二(正十二烷氧基)-苄基、3,5-二(正十二烷氧基)-苄基、3,4-二(异构十三烷氧基)-苄基、2,4-二(异构十三烷氧基)-苄基、3,4,5-二(异构十三烷氧基)-苄基、3,5-二(异构十三烷氧基)-苄基、3,4-二(3,7,11-三甲基-十二烷氧基)-苄基、2,4-二(3,7,11-三甲基-十二烷氧基)-苄基、3,4,5-二(3,7,11-三甲基-十二烷氧基)-苄基、3,5-二(3,7,11-三甲基-十二烷氧基)-苄基、3,4-二(3,7,11,15-四甲基-十六烷氧基)-苄基、2,4-二(3,7,11,15-四甲基-十六烷氧基)-苄基、3,4,5-二(3,7,11,15-四甲基-十六烷氧基)-苄基、3,5-二(3,7,11,15-四甲基-十六烷氧基)-苄基、3,4-二(3,7,11,15-四甲基-2-十六烯-1-氧基)-苄基、2，4-二(3,7,11,15-四甲基-2-十六烯-1-氧基)-苄基、3,4,5-二(3,7,11,15-四甲基-2-十六烯-1-氧基)-苄基、3,5-二(3,7,11,15-四甲基-2-十六烯-1-氧基)-苄基。
本发明所述亚磷酰化试剂可通过如下列所示的方法合成：
本发明的亚磷酰化试剂通过2-氰基醇类化合物与活性基亚磷酰类化合物发生取代反应生成(步骤1.2)。
其中2-氰基醇类化合物通式如结构式1-3所示，通用的合成方法为腈-醛缩合反应，腈在拔氢试剂的作用下与醛缩合直接生成2-氰基醇(步骤1.1)，常用的拔氢试剂为有机锂化合物；
其它结构简单一些的2-氰基醇类化合物(如化合物1-7和化合物1-11)，化合物1-7通过腈(化合物1-1)与碳酸二酯缩合生成2-羧酯基腈(步骤1.3)，再还原生成2-氰基醇(步骤1.4)。
化合物1-11通过醛(化合物1-8，ra-ch2-表示r1范围内的基团)与腈基乙酸酯(化合物1-9)缩合丙烯烯腈衍生物(化合物1-10)(步骤1.5)，然后还原双键和酯基生成2-氰基醇(步骤1.6)。
本发明还提供一种利用上述亚磷酰化试剂合成寡核苷酸的方法，包括如下步骤：
s1：在活化剂作用下，使亚磷酰化试剂(化合物1)与5′-oh被在酸性条件下可除去的临时保护基保护的、3′-oh游离的q聚(q为≥1的整数)核苷酸(化合物2-1)发生亚磷酰化反应生成3′-o-亚磷酰化-q聚核苷酸中间体(化合物2-2)；
s2：使3′-o-亚磷酰化-q聚核苷酸中间体与3′-oh被非酸性条件下可除去的临时保护基保护的、5′-oh游离的p聚(p为≥1的整数)核苷酸(化合物2-3)在活性剂作用下反应生成q+p聚核苷亚磷酸三酯中间体(化合物2-4)；
s3：在q+p聚核苷亚磷酸三酯中间体中加入硫化剂或氧化剂，反应生成q+p聚核苷磷酸三酯中间体；
s4：通过酸去除q+p聚核苷磷酸三酯中间体的q聚核苷酸基团中的5′-oh的临时保护基，得到3′-oh被非酸性条件下可除去的临时保护基保护的、5′-oh游离的q+p聚核苷磷酸三酯中间体；
s5：以3′-oh被非酸性条件下可除去的临时保护基保护的、5′-oh游离的q+p聚核苷磷酸三酯中间体替代步骤s2中的3′-oh被非酸性条件下可除去的临时保护基保护的、5′-oh游离的p聚(p为≥1的整数)核苷酸，与步聚s1所制备将3′-o-亚磷酰化-q聚核苷酸中间体或其它3′-o-亚磷酰化-核苷试剂反应，重复若干次步骤s2～s4，得到3′-oh被非酸性条件下可除去的临时保护基保护的、5′-oh游离的m+q+p聚核苷磷酸三酯中间体，其中m为≥1的正数；
s6：最后去除所有临时保护基，得到寡核苷酸。
上述制备方法的合成路线为：
其中x＝o或s，[o]表示氧化剂，[s]表示硫化剂，r6为可非酸性条件下除去的临时保护基，r7表示在酸性条件下可除去的临时保护基，rcn为取代腈乙基。
进一步，所述活化剂选自唑类化合物、羧酸类化合物、路易斯酸类化合物或复合有机盐类化合物。
其中唑类化合物优选1h-四唑、5-乙巯基-1h-四唑、5-苄巯基-1h-四唑和5-(3,5-二(三氟甲基)苯基)-1h-四唑、4,5-二腈基咪唑中的任意一种；羧酸类化合物选自甲酸、乙酸、二氯乙酸、3,5-二硝基苯甲酸中的任意一种，路易斯酸类化合物选自二氯化锌、三氯化锡、三氯化铝、三氟化硼中的任意一种，所述复合有机盐类化合物选自三氟甲磺酸咪唑盐、三氟甲磺酸苯并咪唑盐、高氯酸咪唑盐、n-苯基咪唑三氟甲磺酸盐、n-甲基咪唑糖精盐、二异丙胺四唑盐中的任意一种。
进一步，上述所有反应均在反应溶剂中进行，所述反应溶剂选自卤代烃类有机溶剂、烃类有机溶剂、芳香烃类有机溶剂、酯类有机溶剂、醚类有机溶剂和水溶性非质子类极性有机溶剂中的至少一种。优选地，所述卤代烃类有机溶剂选自二氯甲烷、二氯乙烷、三氯甲烷和二溴乙烷中的至少一种；优选地，所述烃类有机溶剂选自庚烷、己烷、石油醚和环己烷中的至少一种；优选地，所述芳香烃类有机溶剂选自甲苯、乙苯、二甲苯和三甲苯中的至少一种；优选地，所述酯类有机溶剂选自乙酸异丙酯、乙酸叔丁酯和乙酸乙酯中的至少一种；优选地，所述醚类有机溶剂选自乙醚、异丙醚、甲基叔丁基醚、甲基环戊基醚、四氢呋喃、甲基四氢呋喃、1,4二氧六环和1,3二氧六环中的至少一种；优选地，所述水溶性非质子类极性有机溶剂选自乙腈、n,n-二甲基甲酰胺、n,n-二乙基甲酰胺、n,n-二甲基乙酰胺、n-甲基-吡咯烷酮、n-乙基-吡咯烷酮、二甲基亚砜、环丁砜、1,3-二甲基咪唑啉酮和1,3-二甲基-3,4,5,6-四氢-2-嘧啶酮中的至少一种。
进一步，步骤s2前还包括步骤：采用极性溶剂和非极性溶剂对所述3′-o-亚磷酰化q聚核苷酸中间体进行萃取纯化；步骤s5前还包括步骤：采用极性溶剂和非极性溶剂对3′-oh被非酸性条件下可除去的临时保护基保护的、5′-oh游离的q+p聚核苷磷酸三酯中间体进行萃取纯化。
其中非极性溶剂选自烃类有机溶剂、芳香烃类有机溶剂、酯类有机溶剂和醚类有机溶剂中的至少一种；优选地，所述烃类有机溶剂选自庚烷、己烷、石油醚和环己烷中的至少一种；优选地，所述芳香烃类有机溶剂选自甲苯、乙苯、二甲苯和三甲苯中的至少一种；优选地，所述酯类有机溶剂选自乙酸异丙酯、乙酸叔丁酯和乙酸乙酯中的至少一种；优选地，所述醚类有机溶剂选自乙醚、异丙醚、甲基叔丁基醚、甲基环戊基醚和四氢呋喃中的至少一种。
极性溶剂选自水溶性非质子类极性有机溶剂或水溶性质子类极性有机溶剂。优选地，所述水溶性非质子类极性有机溶剂选自乙腈、n,n-二甲基甲酰胺、n,n-二乙基甲酰胺、n,n-二甲基乙酰胺、n-甲基-吡咯烷酮、n-乙基-吡咯烷酮、二甲基亚砜、环丁砜、1,3-二甲基咪唑啉酮和1,3-二甲基-3,4,5,6-四氢-2-嘧啶酮中的至少一种；优选地，所述水溶性质子类极性有机溶剂选自甲醇、乙醇和异丙醇中的至少一种。
相对于现有技术，本发明的亚磷酰化试剂能与核苷单体或核苷酸片段3′-oh或5′-oh反应生成亚磷酰二酯。亚磷酰二酯在合适的活化剂作用下与另一组核苷单体或核苷酸片段3′-oh或5′-oh继续反应生成亚磷酰三酯，经过氧化或硫化得到磷酸三酯或硫代磷酸三酯，去保护得到寡核苷酸。制备寡核苷酸过程中在合适的位置使用本发明的亚磷酰化试剂，使整个过程中所有亚磷酸酯中间体或磷酸酯中间体易溶于中低极性的溶剂，在高极性溶剂中溶解度却很低，而其它的反应原料或副产物如核苷原料、活化剂、氧化剂、硫化剂等却易溶于高极性溶剂，因而能通过非极性/极性溶剂萃取进行纯化，使得后续的链增长反应不受阻碍，既适用于逐个核苷酸接入也适用于片段法接入的反应。制备寡核苷酸过程中使用的原料大部分为固相合成常用的原料，反应过程能够通过合适的手段进行跟踪分析，每个核苷或核苷片段接入的反应条件和后处理条件基本一致。
从以上特点可以看出使用本发明的亚磷酰化试剂制备寡核苷酸的工艺是一种操作简便、重复性好、成本低、适合规模化生产的方法。
具体实施方式
以下结合具体实施例进一步说明本发明的技术方案。
本说明书中和以下的实施例中，下述缩写所代表的物质为：
dcm：二氯甲烷
dmf：n，n-二甲基甲酰胺
ea：乙酸乙酯
pe：石油醚
diea：二异丙基乙胺
lah：氢化铝锂
lda：二异丙基氨基锂
实施例1
本实施例提供一种亚磷酰化试剂：双(二异丙基氨基)(2-氰基-2-(异构十烷基)乙氧基)膦，其结构式为：
合成该亚磷酰化试剂的路线如下：
具体合成方法包括如下步骤：
1-a)将异构十醇(化合物1.1，100ml)和37％hbr(300ml)在三口烧瓶中混合，在机械搅拌下，缓慢加入浓硫酸(30ml)后将混合反应液加热至115～120℃进行反应反应。gc分析异构十醇<0.5％后停止反应。然后降温至50℃以下，加入石油醚(100ml)萃取，石油醚层用水先至中性，减压除去石油醚后得到异构十烷基溴(化合物1.2)120.0g。
1-b)将异构十烷基溴(化合物1.2，22.1g，0.1mol)和氰基乙酸乙酯(化合物1.3，34.0g，0.3mol)溶解于无水乙醇(150ml)中，加热至50℃。然后滴加20％的乙醇钠/乙醇溶液(102g，0.3mol)，保温40～50℃反应24h。反应结束后降至室温，滴加1n盐酸调ph值至3～4，减压回收乙醇，加入水(150ml)和乙酸乙酯(150ml)萃取。乙酸乙酯层用水洗(50ml)、饱和食盐水(50ml)洗，浓缩回收乙酸乙酯，剩余物真空蒸馏(100℃，8～10mmhg)回收过量的氰基乙酸乙酯得2-(异构十烷基)-2-氰基乙酸乙酯(化合物1.4)粗品，经柱层析纯化(100％pe→ea:pe＝1:3)得18.0g纯化的2-(异构十烷基)-2-氰基乙酸乙酯。
1-c)将libh4(0.22g，0.1mol)分散于四氢呋喃(30ml)中，降温至0～5℃。加入2-(异构十烷基)-2-氰基乙酸乙酯(化合物1.4，18.0g，0.07mol)的四氢呋喃(50ml)溶液，加毕升至室温反应2h。接着重新降温至0～5℃，滴加乙酸乙酯(100ml)中止反应，过滤除去固体，滤液浓缩得2-腈基-2-(异构十烷基)-1-丙醇(化合物1.5)粗品14.8g，直接用于下一步反应。
1-d)将三(二异丙基氨基)膦(24.4g，0.074mol)溶解于无水二氯甲烷(50ml)，降温至0～5℃，然后加入二异丙基乙胺(9.03g，0.07mol)、滴加2-腈基-2-(异构十烷基)-1-丙醇(化合物1.5)(14.5g，0.07mol)二氯甲烷(50ml)溶液，保温反应1h。反应结束后，浓缩得粗品，最后经柱层纯化(100％pe→ea:pe＝1:2)得29.4g产物，即双(二异丙基氨基)(2-氰基-2-(异构十烷基)乙氧基)膦(化合物p-001)。
对产物进行1h-nmr、ms测试，结果如下：
1h-nmr(400mhz，cdcl3)：δ0.8-1.65(m,45h)，2.50-2.65(m,1h)，3.40-3.65(m,4h)，3.65-3.75(m,1h)，3.95-4.05(m,1h)。
ms-esi[m+1]+：442.40。
实施例2
本实施例提供一种亚磷酰化试剂：双(二异丙基氨基)(1-丙基-2-氰基-2-(异构十烷基)乙氧基)膦，其结构式为：
合成该亚磷酰化试剂的路线如下：
具体合成方法包括如下步骤：
2-a)将2-(异构十烷基)-2-氰基乙酸乙酯(化合物1.4，50.7g，0.2mol)溶解于dmf(100ml)中，加入醋酸钾(19.6g，0.2mol)和水(7.2g，0.2mol)，加热回流反应5h。冷却到室温，加入乙酸乙酯(150ml)和水(200ml)萃取，乙酸乙酯层用水(100ml)和饱和食盐水(50ml)洗，浓缩得2-异构十烷基-乙腈(化合物2.1)粗品，柱层析纯化得31.0g。
2-b)在氮气保护下，将二异丙胺(10.2g，0.1mol)溶解于无水四氢呋喃(200ml)中，用干冰-丙酮浴冷却至-78℃。然后加入1nn-buli正己烷溶液(100ml)，保温-78℃反应30min。接着加入2-异构十烷基-乙腈(化合物2.1，17.2g，0.095mol)无水四氢呋喃(100ml)溶液。加毕，保温-78℃反应10min。然后滴加丁醛(6.8g，0.095mol)无水四氢呋喃(20ml)溶液，保温-78℃反应10min后升温至-45℃反应30min；接着升至室温反应5h。最后加入乙酸乙酯(200ml)和水(200ml)萃取，乙酸乙酯层依次用水(200ml)和饱和食盐水(100ml)洗，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩得到2-异构十烷基-3-丙基-3-羟基-丙腈粗品(化合物2.2)，柱层析纯化得21.0g。
2-c)将三(二异丙基氨基)膦(24.4g，0.074mol)溶解于无水二氯甲烷(50ml)，降温至0～5℃，然后加入二异丙基乙胺(9.03g，0.07mol)、滴加2-异构十烷基-3-丙基-3-羟基-丙腈粗品(化合物2.2，0.07mol)二氯甲烷(50ml)溶液，保温反应1h。反应结束后，浓缩得粗品，最后经柱层纯化(100％pe→ea:pe＝1:2)得29.4g产物，即双(二异丙基氨基)(1-丙基-2-氰基-2-(异构十烷基)乙氧基)膦(p-002)。
对产物进行1h-nmr、ms测试，结果如下：
1h-nmr(400mhz，cdcl3)：δ0.8-1.65(m,52h)，2.50-2.65(m,1h)，3.35-3.45(m,1h)，3.50-3.65(m,4h)。
ms-esi[m+1]+：484.44。
实施例3
本实施例提供一种亚磷酰化试剂：双(二异丙基氨基)(1-苯基-2-氰基-2-(异构十烷基)乙氧基)膦，其结构式为：
合成该亚磷酰化试剂的路线如下：
具体合成方法与实施例2相似，不同之处在于：在步骤2-b)中使用苯甲醛替代丁醛。
对产物p-003进行1h-nmr、ms测试，结果如下：
1h-nmr(400mhz，cdcl3)：δ0.8-1.65(m,45h)，2.50-2.65(m,1h)，3.50-3.65(m,4h)，4.80-4.90(m,1h)，7.30-7.45(m,5h)。
ms-esi[m+1]+：518.40。
实施例4
本实施例提供一种亚磷酰化试剂：双(二异丙基氨基)(2-氰基-2-(3，4-二(异构十烷氧基)苄基)乙氧基)膦，其结构式为：
合成该亚磷酰化试剂的路线如下：
具体合成方法包括如下步骤：
4-a)将3,4-二羟基苯甲醛(化合物4.1，13.8g，0.1mol)、异构十烷基溴(化合物1.2，48.6g，0.22mol)、碳酸钾(41.4g，0.3mol)和碘化钾(0.83g，0.005mol)溶解于dmf(250ml)中，加热至80～90℃反应5h。冷却至室温，过滤除去固体，滤液加入庚烷(200ml)和水(200ml)；分去水层，庚烷层用水(200ml)洗，浓缩得3,4-二(异构十烷氧基)苯甲醛粗品(化合物4.2)42.0g，直接用于下一步反应。
4-b)将3,4-二(异构十烷氧基)苯甲醛粗品(化合物4.2，42.0g)溶解于无水乙醇(100ml)中，加入氰乙酸乙酯(化合物1.3，11.3g，0.1mol)和dmap(1.2g，0.01mol)，加热升温至60℃反应5h。然后降温到0～5℃，分批加入硼氢化钠(7.6g，0.2mol)。加毕，自然升至室温反应1h。接着冰水浴保温15-20℃，加入1n盐酸淬灭反应，减压除去乙醇，残留物加入二氯甲烷(200ml)和水(200ml)萃取。二氯甲烷层水洗(100ml×2)，浓缩得2-氰基-2-(3,4-二(异构十烷氧基)苄基)乙醇粗品(化合物4.4)，柱层析纯化(100％pe→ea:pe＝1:5)得38.0g。
4-c)以2-氰基-2-(3，4-二(异构十烷氧基)苄基)乙醇(化合物4.4)为原料按步骤1-d(实施例1)的方法制得双(二异丙基氨基)(2-氰基-2-(3,4-二(异构十烷氧基)苄基)乙氧基)膦(p-004)。
对产物进行1h-nmr、ms测试，结果如下：
1h-nmr(400mhz，cdcl3)：δ0.8-1.75(m,58h)，1.65-1.85(m,4h)，2.85-3.40(m,4h),3.50-3.95(m,4h)，3.95-4.10(m,5h)，6.70-6.85(m,3h)。
ms-esi[m+1]+:704.56。
实施例5
本实施例提供一种亚磷酰化试剂：双(二异丙基氨基)(1-(3,4-二异构十烷氧基苯基)-2-氰基-乙氧基)膦(化合物p-005)，其合成路线为：
具体合成方法包括如下步骤：
5-a)以化合物4.2和乙腈为原料，按步骤2-b(实施例2)的方法合成化合物5.1；
5-b)以化合物5.1为原料，按步骤1-d(实施例1)的方法得到产物双(二异丙基氨基)(1-(3,4-二异构十烷氧基苯基)-2-氰基-乙氧基)膦(p-005)。
对产物进行1h-nmr、ms测试，结果如下：
1h-nmr(400mhz，cdcl3)：δ0.8-1.75(m,58h)，1.65-1.85(m,4h)，2.85-3.00(m,2h)，3.50-3.95(m,3h)，3.95-4.10(m,5h)，4.50-4.55(m,1h)，6.70-6.85(m,3h)。
ms-esi[m+1]+:690.58。
实施例6
本实施例提供一种亚磷酰化试剂：双(二异丙基氨基)(1-(3，4-二异构十烷氧基苯基)-2-氰基-2-(异构十烷基)乙氧基)膦(化合物p-006)，其合成路线为：
具体合成方法为：以化合物4.2和化合物2.1为原料，按步骤2-b(实施例2)和步骤1-d(实施例1)的方法得到产物双(二异丙基氨基)(1-(3,4-二异构十烷氧基苯基)-2-氰基-2-(异构十烷基)乙氧基)膦(化合物p-006)。
对产物进行1h-nmr、ms测试，结果如下：
1h-nmr(400mhz，cdcl3)：δ0.8-1.75(m,79h)，1.65-1.85(m,4h)，2.95-3.05(m,1h)，3.05-3.30(m,2h)，3.50-3.95(m,2h)，3.95-4.10(m,4h)，4.50-4.55(m,1h)，6.72-6.85(m,3h)。
ms-esi[m+1]+：830.70。
实施例7
本实施例提供一种亚磷酰化试剂：双(二异丙基氨基)(1-异构九烷基-2-氰基-2-(异构十烷基)乙氧基)膦(化合物p-007)，其合成路线为：
具体合成方法包括如下步骤：
7-a)将异构十醇(exxal10)(31.6g，0.2mol)溶解于二氯甲烷(500ml)中，冷却至0-5℃，分批加入pcc(64.7g，0.3mol)。加毕保温反应1h，用硅藻土过滤除去固体，母液浓缩得到异构十醛(化合物7.1)30g，直接应用于下一步反应。
7-b)以异构十醛和化合物2.1为原料按步骤2-b(实施例2)和步骤1-d(实施例1)的方法制得产物双(二异丙基氨基)(1-异构九烷基-2-氰基-2-(异构十烷基)乙氧基)膦(化合物p-007)。
对产物进行1h-nmr、ms测试，结果如下：
1h-nmr(400mhz，cdcl3)：δ0.8-1.75(m,64h)，2.95-3.05(m,1h)，3.45-3.95(m,5h)。
ms-esi[m+1]+:568.54。
实施例8
本实施例提供一种亚磷酰化试剂：双(二异丙基氨基)(1-丙基-2-氰基-2-(3，4-二异构十烷氧基苄基)乙氧基)膦(化合物p-008)，其合成路线为：
具体合成方法包括如下步骤：
8-a)将化合物4.2(41.9g，0.1mol)溶解于无水乙醇(200ml)中，冷却至0～5℃。然后分批加入硼氢化钠(3.8g，0.1mol)，保温反应半h。然后加入1n盐酸淬灭反应，加入石油醚(200ml)和水(200ml)萃取，石油醚层用水(100ml)和饱和食盐水(100ml)清洗，无水硫酸钠干燥。将干燥液冷却至0～5℃，滴加socl2(12g，0.1mol)，滴毕升至温室反应1h。最后将反应体系浓缩得3,4-二异构十烷氧基苄基氯(化合物8.1)41.5g。
8-b)以3,4-二异构烷氧基苄基氯(化合物8.1)和氰基乙酸乙酯为原料依次按步骤1-b(实施例1)制得化合物8.2，然后采用与步骤2-a(实施例2)相同的方法合成3,4-二异构十烷氧基苯丙腈(化合物8.3)。
8-c)以化合物8.3和丁醛为原料依次按步骤2-b(实施例2)和步骤1-d(实施例1)的方法合成产物双(二异丙基氨基)(1-丙基-2-氰基-2-(3,4-二异构十烷氧基苄基)乙氧基)膦(p-008)。
对产物进行1h-nmr、ms测试，结果如下：
1h-nmr(400mhz，cdcl3)：δ0.8-1.75(m,65h)，1.65-1.85(m,4h)，2.85-3.40(m,3h)，3.50-3.95(m,5h)，3.95-4.10(m,4)，6.70-6.85(m,3h)。
ms-esi[m+1]+：746.66。
当以异构十三醇(exxal13)代替异构十醇(exxal10)，按实施例1～8的方法，可合成以下实施例9～16的亚磷酰化试剂：
实施例9
双(二异丙基氨基)(2-氰基-2-(异构十三烷基)乙氧基)膦(化合物p-009)：
其1h-nmr和ms数据为：
1h-nmr(400mhz，cdcl3)：δ0.8-1.65(m,51h)，2.50-2.65(m,1h)，3.50-3.65(m,4h)，3.65-3.75(m,1h)，3.95-4.05(m,1h)。
ms-esi[m+1]+:484.42。
实施例10
双(二异丙基氨基)(1-丙基-2-氰基-2-(异构十三烷基)乙氧基)膦(化合物p-010)：
其1h-nmr和ms数据为：
1h-nmr(400mhz，cdcl3)：δ0.8～1.65(m,58h)，2.50～2.65(m,1h)，3.35～3.45(m,1h)，3.50～3.65(m,4h)。
ms-esi[m+1]+：526.50。
实施例11
双(二异丙基氨基)(1-苯基-2-氰基-2-(异构十三烷基)乙氧基)膦(化合物p-011)：
其1h-nmr和ms数据为：
1h-nmr(400mhz，cdcl3)：δ0.8-1.65(m,51h)，2.50-2.65(m,1h)，3.50-3.65(m,4h)，4.80-4.90(m,1h)，7.30-7.45(m,5h)。
ms-esi[m+1]+：560.46。
实施例12
双(二异丙基氨基)(2-氰基-2-(3，4-二(异构十三烷氧基)苄基)乙氧基)膦(化合物p012)：
其1h-nmr和ms数据为：
1h-nmr(400mhz，cdcl3)：δ0.8-1.75(m,70h)，1.65-1.85(m,4h)，2.85-3.40(m,4h)，3.50-3.95(m,4h)，3.95-4.10(m,5)，6.70-6.85(m,3h)。
ms-esi[m+1]+：788.66。
实施例13
双(二异丙基氨基)(1-(3,4-二异构十三烷氧基苯基)-2-氰基-乙氧基)膦(化合物p-013)：
其1h-nmr和ms数据为：
1h-nmr(400mhz，cdcl3)：δ0.8-1.75(m,70h)，1.65-1.85(m,4h)，2.85-3.00(m,2h)，3.50-3.95(m,3h)，3.95-4.10(m,5h)，4.50-4.55(m,1h)，6.70-6.85(m,3h)。
ms-esi[m+1]+:774.60。
实施例14
双(二异丙基氨基)(1-(3,4-二异构十三烷氧基苯基)-2-氰基-2-(异构十烷基)乙氧基)膦(化合物p-014)：
1h-nmr(400mhz，cdcl3)：δ0.8-1.75(m,97h)，1.65-1.85(m,4h)，2.95-3.05(m,1h)，3.50-3.95(m,4h)，3.95-4.10(m,4h)，4.50-4.55(m,1h)，6.72-6.85(m,3h)。
ms-esi[m+1]+:956.80。
实施例15
双(二异丙基氨基)(1-异构十二烷基-2-氰基-2-(异构十三烷基)乙氧基)膦(p-015)：
1h-nmr(400mhz，cdcl3)：δ0.8-1.75(m,76h)，2.95-3.05(m,1h)，3.45-3.95(m,5h)。
ms-esi[m+1]+:652.62。
实施例16
双(二异丙基氨基)(1-丙基-2-氰基-2-(3,4-二异构十三烷氧基苄基)乙氧基)膦(p-016)：
1h-nmr(400mhz，cdcl3)：δ0.8-1.75(m,77h)，1.65-1.85(m,4h)，2.85-3.40(m,3h)，3.50-3.95(m,5h)，3.95-4.10(m,4)，6.70-6.85(m,3h)。
ms-esi[m+1]+:830.74。
实施例17
以异壬醇(3,5,5-三甲基-己基醇)代替异构十醇(exxal10)按实施例4的方法合成双(二异丙基氨基)(2-氰基-2-(3,4-二(异壬烷氧基)苄基)乙氧基)膦(p-017)。
1h-nmr(400mhz，cdcl3)：δ0.8-1.75(m,54h)，1.65-1.85(m,4h)，2.85-3.40(m,4h)，3.50-3.95(m,4h)，3.95-4.10(m,5h)，6.70-6.85(m,3h)。
ms-esi[m+1]+:676.56。
实施例18
以正十二烷基溴为原料按实施例1的方法合成双(二异丙基氨基)(2-氰基-2-(正十二烷基)乙氧基)膦(p-018)。
1h-nmr(400mhz，cdcl3)：δ0.8-0.95(t,3h)，1.0-1.65(m,46h)，2.50-2.65(m,1h)，3.50-3.65(m,4h)，3.65-3.75(m,1h)，3.95-4.05(m,1h)。
ms-esi[m+1]+:470.40。
实施例19
以植醇[(e)-3,7,11,15-四甲基-2-十六碳烯-1-醇]代替异构十醇(exxal10)，按实施例1的方法可合成亚磷酰化试剂双(二异丙基氨基)(2-氰基-2-((e)-3,7,11,15-四甲基-2-十六碳烯-1-基)乙氧基)膦(p-019)。
其中(e)-3,7,11,15-四甲基-2-十六碳烯-1-br的合成方法为：
将(e)-3,7,11,15-四甲基-2-十六碳烯-1-oh(29.6g，0.1mol)溶解于二氯甲烷300ml，冷却至-10℃，滴加pbr3(27.1g,0.1mol)。加毕，保温0～5℃反应1h。加入水(100ml)淬灭反应，分去水层，二氯甲烷层用水(100ml)和饱和食盐水(50ml)洗，浓缩得(e)-3,7,11,15-四甲基-2-十六碳烯-1-br32g。
p-019的1h-nmr和ms数据如下：
1h-nmr(400mhz，cdcl3)：δ0.8-1.65(m,55h)，1.90-2.05(m,5h)，2.40-2.55(m,3h)，3.50-3.65(m,4h)，3.75-4.05(m,2h)，5.20-5.30(m,1h)。
ms-esi[m+1]+:580.5440。
实施例20
以2,3-二氢植醇(3,7,11,15-四甲基-十六-1-醇)代替异构十醇(exxal10)，按实施例1的方法可合成亚磷酰化试剂双(二异丙基氨基)(2-氰基-2-(3,7,11,15-四甲基-十六烷基)乙氧基)膦(p-020)。
其中2,3-二氢植醇(3,7,11,15-四甲基-十六-1-醇)的合成方法为：
将(e)-3,7,11,15-四甲基-2-十六碳烯-1-oh(29.6g，0.1mol)溶解于无水乙醇(200ml)中，加入30g雷尼镍，常温3mpa压力下氢化反应12h。反应结束后过滤除去催化剂，滤液浓缩得2,3-二氢植醇(3,7,11,15-四甲基-十六-1-醇)30.0g。
p-020的1h-nmr和ms数据如下：
1h-nmr(400mhz，cdcl3)：δ0.8-1.65(m,65h)，2.50-2.65(m,1h)，3.50-3.65(m,4h)，3.65-3.75(m,1h)，3.95-4.05(m,1h)。
ms-esi[m+1]+:582.53。
以金合欢醇(3，7，11-三甲基-2，6，10-十二碳三烯-1-醇)和氢化金合欢醇(3,7,11-三甲基-十二-1-醇)代替异构十醇(exxal10)按实施例1和实施例19-20的方法，可分别得到实施例21和实施例22的亚磷酰化试剂。
实施例21
双(二异丙基氨基)(2-氰基-2-(3,7,11-三甲基-2,6,10-十二碳三烯-1-基)乙氧基)膦(p-021)：
1h-nmr(400mhz，cdcl3)：δ0.8-1.35(m,24h)，1.70-2.05(m,21h)，2.40-2.55(m,3h)，3.40-3.65(m,4h)，3.75-4.05(m,2h)，5.15-5.35(m,3h)。
ms-esi[m+1]+:506.40。
实施例22
双(二异丙基氨基)(2-氰基-2-(3,7,11-三甲基-十二烷基)乙氧基)膦(p-022)：
1h-nmr(400mhz，cdcl3)：δ0.9-1.65(m,55h)，2.50-2.65(m,1h)，3.50-3.65(m,4h)，3.65-3.75(m,1h)，3.95-4.05(m,1h)。
ms-esi[m+1]+:502.48。
实施例23
以3,5-二羟基苯甲醛为原料，按实施例4的方法可合成亚磷酰化试剂双(二异丙基氨基)(2-氰基-2-(3,5-二(异构十烷氧基)苄基)乙氧基)膦(p-023)：
1h-nmr(400mhz，cdcl3)：δ0.8-1.75(m,58h)，1.65-1.85(m,4h)，2.85-3.40(m,4h)，3.50-3.95(m,4h)，3.95-4.10(m,5h)，6.20-6.30(s,1h)，6.70-6.80(s,2h)。
ms-esi[m+1]+:704.60。
实施例24
本实施例提供一种亚磷酰化试剂：双(二异丙基氨基)(2-氰基-2-(3，4，5-三(异构十烷氧基)苄基)乙氧基)膦(p-024)，其合成路线为：
具体合成方法包括如下步骤：
24-a)将3,4,5-三羟基苯甲酸甲酯(化合物24.1，18.4g，0.1mol)、异构十烷基溴(化合物1.2，73.6g，0.33mol)、碳酸钾(55.2g，0.4mol)和dmf(150ml)常温混合，加热至110～120℃反应12h。冷却至室温，搅拌下倒入石油醚(150ml)和水(150ml)混合液中。分去下层，上层石油醚溶液用水(200ml×2)洗涤，浓缩得油状化合物24.2粗品。
24-b)将上一步所得化合物24.2粗品溶解于无水四氢呋喃(500ml)，冷却至5～10℃。然后分批加入四氢铝锂(3.8g，0.1mol)。加毕升至室温反应2h。重新冷却至5～10℃，滴加饱和硫酸钠溶液淬灭反应，过滤除去固体。将滤液浓缩得3,4,5-三(异构十烷氧基)苯甲醇(化合物24.3)。
24-c)将3,4,5-三(异构十烷氧基)苯甲醇与socl2进行氯取代反应生成化合物24.4后，按照实施例1相同的方法可合成双(二异丙基氨基)(2-氰基-2-(3，4，5-三(异构十烷氧基)苄基)乙氧基)膦(p-024)。
p-024的1h-nmr和ms数据如下：
1h-nmr(400mhz，cdcl3)：δ0.8-1.75(m,75h)，1.65-1.85(m,6h)，2.85-3.40(m,4h)，3.50-3.95(m,4h)，3.95-4.10(m,7h)，6.40-6.50(s,2h)。
ms-esi[m+1]+:860.75。
实施例25
本实施例提供一种合成寡核苷酸的方法，包括如下步骤：
s1：在活化剂作用下，使亚磷酰化试剂与5′-oh被在酸性条件下可除去的临时保护基保护的、3′-oh游离的q聚(q为≥1的整数)核苷酸发生亚磷酰化反应生成3′-o-亚磷酰化-q聚核苷酸中间体，并将3′-o-亚磷酰化-q聚核苷酸中间体纯化。
具体地，将实施例1的亚磷酰化试剂p-001(1g，2.26mmol)和无水二氯甲烷(20ml)加入反应瓶中，在氮气保护下再加入5′-o-(4,4-二甲氧基三苯甲基)-3′-oh-n4-乙酰基-脱氧胞苷(2.2g，3.9mmol)和四氮唑(0.18g，2.26mmol)，室温下反应1h。反应完毕后旋蒸除掉二氯甲烷，加入15ml的庚烷溶解，再用10ml的dmf和5ml的水进去洗涤3次，分出庚烷层，无水硫酸钠干燥，旋干得到纯化后的油状物(化合物25-a，1.95g，96％)，即3′-o-亚磷酰化-q聚核苷酸中间体。
s2：使纯化后的3′-o-亚磷酰化-q聚核苷酸中间体与3′-oh被非酸性条件下可除去的临时保护基保护的、5′-oh游离的p聚(p为≥1的整数)核苷酸在活性剂作用下反应生成q+p聚核苷亚磷酸三酯中间体。
具体地，将化合物25-a(1g，1.09mmol)和无水二氯甲烷(20ml)加入到反应瓶中，氮气保护下再加入3’-o-lev-5’-oh-脱氧胸苷(0.56g，1.64mmol)和四氮唑(76mg，1.09mmol)，升温到40℃反应3h。
s3：在q+p聚核苷亚磷酸三酯中间体中加入硫化剂或氧化剂，反应生成q+p聚核苷磷酸三酯中间体。
即，步骤s2反应完毕后降温到25℃，加入85％的过氧叔丁醇溶液(氧化剂，0.46g，4.36mmol)搅拌反应20min。
s4：通过酸去除q+p聚核苷磷酸三酯中间体的q聚核苷酸基团中的5′-oh的临时保护基，得到3′-oh被非酸性条件下可除去的临时保护基保护的、5′-oh游离的q+p聚核苷磷酸三酯中间体。
具体地，待步骤s3反应结束后，再加入三氯乙酸(0.89g，5.45mmol)和巯基乙酸(0.3g，3.27mmol)进去搅拌30min。反应完毕后，加入10ml水进去洗涤一次，10ml饱和碳酸氢钠洗涤一次，旋干二氯甲烷，加入15ml的庚烷溶解，再用10ml的dmf和5ml的水进去洗涤3次，分出庚烷层，无水硫酸钠干燥，旋干得到油状物(化合物25-b，0.88g，94％)，即3′-oh被非酸性条件下可除去的临时保护基保护的、5′-oh游离的q+p聚核苷磷酸三酯中间体。
s5：以3′-oh被非酸性条件下可除去的临时保护基保护的、5′-oh游离的q+p聚核苷磷酸三酯中间体替代步骤s2中的3′-oh被非酸性条件下可除去的临时保护基保护的、5′-oh游离的p聚(p为≥1的整数)核苷酸，重复若干次步骤s2～s4，得到3′-oh被非酸性条件下可除去的临时保护基保护的、5′-oh游离的m+q+p聚核苷磷酸三酯中间体，其中m为≥1的正数；
该步骤具体如下：
将化合物25-b(0.87g，1.0mmol)和无水二氯甲烷(20ml)加入到反应瓶中，氮气保护下再加入5′-o-(4,4-二甲氧基三苯甲基)-3′-[o-(2-氰乙基)-亚磷酰-(二异丙基氨基)]-n2-异丁酰基-脱氧鸟苷(1.68g，2mmol)和四氮唑(69mg，1.0mmol)，反应3h。反应完毕后，加入85％的过氧叔丁醇溶液(0.42g，4mmol)进去搅拌20min。再加入三氯乙酸(0.82g，5.0mmol)和巯基乙酸(0.32g，3.5mmol)进去搅拌30min。反应完毕后，加入10ml水进去洗涤一次，10ml饱和碳酸氢钠洗涤一次，旋干二氯甲烷，加入15ml的庚烷溶解，再用10ml的dmf和5ml的水进去洗涤3次，分出庚烷层，无水硫酸钠干燥，旋干得到油状物(化合物25-c，1.27g，98％)。
将化合物25-c(1g，0.76mmol)和无水二氯甲烷(20ml)加入到反应瓶中，氮气保护下再加入5′-o-(4,4-二甲氧基三苯甲基)-3′-[o-(2-氰乙基)亚磷酰-(二异丙基氨基)]-脱氧胸苷(1.11g，1.5mmol)和四氮唑(52mg，0.76mmol)，反应3h。反应完毕后，加入85％的过氧叔丁醇溶液(0.32g，3mmol)进去搅拌20min，再加入三氯乙酸(0.62g，3.8mmol)和巯基乙酸(0.24g，2.7mmol)进去搅拌30min。反应完毕后，加入10ml水进去洗涤一次，10ml饱和碳酸氢钠洗涤一次，旋干二氯甲烷，加入15ml的庚烷溶解，再用10ml的dmf和5ml的水进去洗涤3次，分出庚烷层，无水硫酸钠干燥，旋干得到油状物(化合物25-d，1.25g，98％)。
化合物25-d(1g，0.6mmol)和无水二氯甲烷(20ml)加入到反应瓶中，氮气保护下再加入5′-o-(4,4-二甲氧基三苯甲基)-3′-[o-(2-氰乙基)亚磷酰-(二异丙基氨基)]-脱氧胸苷(0.89g，1.2mmol)和四氮唑(42mg，0.61mmol)，反应3h。反应完毕后，加入85％的过氧叔丁醇溶液(0.25g，2.4mmol)进去搅拌20min。加入三氯乙酸(0.5g，3.1mmol)和巯基乙酸(0.19g，2.1mmol)进去搅拌30min。反应完毕后，加入10ml水进去洗涤一次，10ml饱和碳酸氢钠洗涤一次，旋干二氯甲烷，加入15ml的庚烷溶解，再用10ml的dmf和5ml的水进去洗涤3次，分出庚烷层，无水硫酸钠干燥，旋干得到油状物(化合物25，1.17g，96％)，即3′-o-lev-脱氧胸苷-3′-(2-氰基-2-(异构十烷基)乙氧基)磷酰基-n4-乙酰基-脱氧胞苷-3′-[o-(2-氰乙基)]磷酰基-n2-异丁酰基-脱氧鸟苷-3′-[o-(2-氰乙基)]磷酰基-脱氧胸苷-3′-[o-(2-氰乙基)]磷酰基-脱氧胸苷，ms-esi[m+2]+/2:1016.30。
s6：最后进行全脱保护，得到寡核苷酸。
具体地，将化合物25(1g)和15ml无水二氯甲烷加入到反应瓶中，加入2ml吡啶和1.5ml醋酸。再加入水合肼(2eq)，室温下搅拌2h。加入5ml丙酮进去，搅拌15min后用15ml水洗涤三次，干燥，旋干，得到油状物。最后加入30ml30％的氨水，升温到60℃反应15h。反应结束后过滤掉不溶物，滤液冷冻干燥，得到产物3′-oh-脱氧胸苷-磷酰基-脱氧胞苷-磷酰基-脱氧鸟苷-磷酰基-脱氧胸苷-磷酰基-5′-oh-脱氧胸苷。ms-esi[m+1]+:1469.32。
实施例26
本实施例提供一种合成寡核苷酸的方法，包括如下步骤：
26-a)将亚磷酰化试剂p-004(1g，1.42mmol)和无水二氯甲烷(15ml)加入到反应瓶中，氮气保护下再加入5′-o-(4,4-二甲氧基三苯甲基)-3′-oh-n4-乙酰基-脱氧胞苷(1.2g，2.1mmol)和4,5-二氰基咪唑(0.14g，1.21mmol)，室温下反应40min，反应完毕后旋蒸除掉二氯甲烷，加入15ml的庚烷溶解，再用10ml的dmf和5ml的水进去洗涤3次，分出庚烷层，无水硫酸钠干燥，旋干得到油状物(化合物26-a，1.61g，97％)。
26-b)将化合物26-a(1g，0.53mmol)和无水二氯甲烷(15ml)加入到反应瓶中，氮气保护下再加入3′-o-lev-5′-oh-脱氧胸苷(0.27g，1.64mmol)和4,5-二氰基咪唑(62mg，0.53mmol)，升温到40℃反应2h。反应完毕后降温到25℃，加入85％的过氧叔丁醇溶液(0.22g，2.1mmol)进去搅拌20min，加入10ml亚硫酸钠水溶液进去洗涤一次，分出二氯甲烷层，再加入二氯乙酸(0.52g，3.2mmol)和巯基乙酸(0.27g，2.12mmol)进去搅拌30min。反应完毕后，10ml饱和碳酸氢钠洗涤一次，旋干二氯甲烷，加入15ml的庚烷溶解，再用10ml的dmf和5ml的水进去洗涤3次，分出庚烷层，无水硫酸钠干燥，旋干得到油状物(化合物26-b，0.58g，97％)。
26-c)将化合物26-b(0.56g，0.5mmol)和无水二氯甲烷(10ml)加入到反应瓶中，氮气保护下再加入5′-o-(4,4-二甲氧基三苯甲基)-3′-[o-(2-氰乙基)-亚磷酰-(二异丙基氨基)]-n2-异丁酰基-脱氧鸟苷(0.84g，1mmol)和四氮唑(34.5mg，0.5mmol)，反应3h。反应完毕后，加入85％的过氧叔丁醇溶液(0.21g，2mmol)进去搅拌20min。加入10ml亚硫酸钠水溶液进去洗涤一次，分出二氯甲烷层，再加入二氯乙酸(0.32g，2.5mmol)和巯基乙酸(0.16g，1.7mmol)进去搅拌30min。反应完毕后，加入10ml水进去洗涤一次，10ml饱和碳酸氢钠洗涤一次，旋干二氯甲烷，加入15ml的庚烷溶解，再用10ml的dmf和5ml的水进去洗涤3次，分出庚烷层，无水硫酸钠干燥，旋干得到油状物(化合物26-c，0.78g，98.2％)。
26-d)将化合物26-c(1g，0.63mmol)和无水二氯甲烷(20ml)加入到反应瓶中，氮气保护下再加入5′-o-(4,4-二甲氧基三苯甲基)-3′-[o-(2-氰乙基)亚磷酰-(二异丙基氨基)]-脱氧胸苷(0.93g，1.26mmol)和4,5-二氰基咪唑(74mg，0.63mmol)，反应3h。反应完毕后，加入85％的过氧叔丁醇溶液(0.27g，2.5mmol)进去搅拌20min。加入10ml亚硫酸钠水溶液进去洗涤一次，分出二氯甲烷层，再加入二氯乙酸(0.51g，3.1mmol)和巯基乙酸(0.22g，2.5mmol)进去搅拌30min。反应完毕后，加入10ml水进去洗涤一次，10ml饱和碳酸氢钠洗涤一次，旋干二氯甲烷，加入15ml的庚烷溶解，再用10ml的dmf和5ml的水进去洗涤3次，分出庚烷层，无水硫酸钠干燥，旋干得到油状物(化合物26-d，1.19g，98％)。
26-e)将化合物26-d(1g，0.51mmol)和无水二氯甲烷(15ml)加入到反应瓶中，氮气保护下再加入5′-o-(4,4-二甲氧基三苯甲基)-3′-[o-(2-氰乙基)亚磷酰-(二异丙基氨基)]-脱氧胸苷(0.76g，1.02mmol)和4,5-二氰基咪唑(60mg，0.51mmol)，反应3h。反应完毕后，加入85％的过氧叔丁醇溶液(0.25g，2.4mmol)进去搅拌20min。加入10ml亚硫酸钠水溶液进去洗涤一次，分出二氯甲烷层，再加入二氯乙酸(0.33g，2.6mmol)和巯基乙酸(0.19g，2.1mmol)进去搅拌30min。反应完毕后，加入10ml水进去洗涤一次，10ml饱和碳酸氢钠洗涤一次，旋干二氯甲烷，加入15ml的庚烷溶解，再用10ml的dmf和5ml的水进去洗涤3次，分出庚烷层，无水硫酸钠干燥，旋干得到油状物(化合物26，1.14g，97.5％)，即3′-o-lev-脱氧胸苷-3′-(2-氰基-2-(3，4-二(异构十烷氧基)苄基)乙氧基)磷酰基-n4-乙酰基-脱氧胞苷-3′-[o-(2-氰乙基)]磷酰基-n2-异丁酰基-脱氧鸟苷-3′-[o-(2-氰乙基)]磷酰基-脱氧胸苷-3′-[o-(2-氰乙基)]磷酰基-脱氧胸苷，ms-esi[m+2]+/2:1147.90。
26-f)：最后进行全脱保护，得到寡核苷酸。
参考实施例25步骤s6对化合物26进行全脱保护，即可得到寡核苷酸。
实施例27
本实施例提供一种合成寡核苷酸的方法，包括如下步骤：
27-a)将亚磷酰化试剂p-005(1g，1.42mmol)和无水二氯甲烷(15ml)加入到反应瓶中，氮气保护下再加入5′-o-(4,4-二甲氧基三苯甲基)-3′-oh-n4-乙酰基-脱氧胞苷(1.2g，2.1mmol)和4,5-二氰基咪唑(0.14g，1.21mmol)，室温下反应40min。反应完毕后旋蒸除掉二氯甲烷，加入15ml的庚烷溶解，再用10ml的dmf和5ml的水进去洗涤3次，分出庚烷层，无水硫酸钠干燥，旋干得到油状物(化合物27-a，1.56g，94％)。
27-b)将化合物27-a(1g，0.53mmol)和无水二氯甲烷(15ml)加入到反应瓶中，氮气保护下再加入3′-o-lev-5′-oh-脱氧胸苷(0.27g，1.64mmol)和5-苄巯基-1h-四氮唑(84.8mg，0.53mmol)，升温到40℃反应1h。反应完毕后降温到25℃，加入3-((n,n-二甲基氨基亚甲基)氨基)-3h-1,2,4-二噻唑-3-硫酮(0.43g，2.1mmol)进去搅拌30min，再加入二氯乙酸(0.52g，3.2mmol)和巯基乙酸(0.27g，2.12mmol)进去搅拌30min。反应完毕后，10ml饱和碳酸氢钠洗涤一次，旋干二氯甲烷，加入15ml的庚烷溶解，再用10ml的dmf和5ml的水进去洗涤3次，分出庚烷层，无水硫酸钠干燥，旋干得到油状物(化合物27-b，0.56g，95％)。
27-c)将化合物27-b(0.56g，0.5mmol)和无水二氯甲烷(10ml)加入到反应瓶中，氮气保护下再加入5′-o-(4,4-二甲氧基三苯甲基)-3′-[o-(2-氰乙基)-亚磷酰-(二异丙基氨基)]-n2-异丁酰基-脱氧鸟苷(0.84g，1mmol)和5-苄巯基-1h-四氮唑(80mg，0.5mmol)，反应3h。反应完毕后，加入3-((n,n-二甲基氨基亚甲基)氨基)-3h-1,2,4-二噻唑-3-硫酮(0.41g，2.0mmol)进去搅拌30min，再加入二氯乙酸(0.32g，2.5mmol)和巯基乙酸(0.19g，2mmol)进去搅拌30min。反应完毕后，加入10ml水进去洗涤一次，10ml饱和碳酸氢钠洗涤一次，旋干二氯甲烷，加入15ml的庚烷溶解，再用10ml的dmf和5ml的水进去洗涤3次，分出庚烷层，无水硫酸钠干燥，旋干得到油状物(化合物27-c，0.8g，95.2％)。
27-d)将化合物27-c(1g，0.63mmol)和无水二氯甲烷(20ml)加入到反应瓶中，氮气保护下再加入5′-o-(4,4-二甲氧基三苯甲基)-3′-[o-(2-氰乙基)亚磷酰-(二异丙基氨基)]-脱氧胸苷(0.93g，1.26mmol)和5-苄巯基-1h-四氮唑(114mg，0.63mmol)，反应3h。反应完毕后，加入3-((n,n-二甲基氨基亚甲基)氨基)-3h-1,2,4-二噻唑-3-硫酮(0.51g，2.5mmol)进去搅拌20min，再加入二氯乙酸(0.51g，3.1mmol)和巯基乙酸(0.22g，2.5mmol)进去搅拌30min。反应完毕后，加入10ml水进去洗涤一次，10ml饱和碳酸氢钠洗涤一次，旋干二氯甲烷，加入15ml的庚烷溶解，再用10ml的dmf和5ml的水进去洗涤3次，分出庚烷层，无水硫酸钠干燥，旋干得到油状物(化合物27-d，1.24g，96.3％)。
27-e)将化合物27-d(0.98g，0.5mmol)和无水二氯甲烷(20ml)加入到反应瓶中，氮气保护下再加入5′-o-(4,4-二甲氧基三苯甲基)-3′-[o-(2-氰乙基)亚磷酰-(二异丙基氨基)]-脱氧胸苷(0.74g，1.0mmol)和5-苄巯基-1h-四氮唑(90.5mg，0.5mmol)，反应3h。反应完毕后，加入3-((n,n-二甲基氨基亚甲基)氨基)-3h-1,2,4-二噻唑-3-硫酮(0.51g，2.5mmol)进去搅拌20min，再加入二氯乙酸(0.41g，2.5mmol)和巯基乙酸(0.22g，2.5mmol)进去搅拌30min。反应完毕后，加入10ml水进去洗涤一次，10ml饱和碳酸氢钠洗涤一次，旋干二氯甲烷，加入15ml的庚烷溶解，再用10ml的dmf和5ml的水进去洗涤3次，分出庚烷层，无水硫酸钠干燥，旋干得到油状物(化合物27，1.12g，96.1％)，即3′-o-lev-脱氧胸苷-3′-[1-(3，4-二异构十烷氧基苯基)-2-氰基-乙氧基)]硫代磷酰基-n4-乙酰基-脱氧胞苷-3′-[o-(2-氰乙基)]硫代磷酰基-n2-异丁酰基-脱氧鸟苷-3′-[o-(2-氰乙基)]硫代磷酰基-脱氧胸苷-3′-[o-(2-氰乙基)]硫代磷酰基-脱氧胸苷。ms-esi[m+2]+/2:1172.90。
27-f)：最后进行全脱保护，得到寡核苷酸。
参考实施例25步骤s6对化合物27进行全脱保护，即可得到寡核苷酸。
实施例28
本实施例提供一种合成寡核苷酸的合成方法，包括如下步骤：
28-a)将亚磷酰化试剂p-012(1g，1.26mmol)和无水二氯甲烷(15ml)加入到反应瓶中，氮气保护下再加入5′-o-(4,4-二甲氧基三苯甲基)-3′-oh-n2-异丁酰基-脱氧鸟苷(1.2g，1.89mmol)和4,5-二氰基咪唑(0.15g，1.26mmol)，室温下反应40min。反应完毕后旋蒸除掉二氯甲烷，加入15ml的庚烷溶解，再用10ml的dmf和5ml的水进去洗涤3次，分出庚烷层，无水硫酸钠干燥，旋干得到油状物(化合物28-a，1.6g，97％)。
28-b)将化合物28-a(0.66g，0.5mmol)和无水二氯甲烷(10ml)加入到反应瓶中，氮气保护下再加入3′-o-lev-n4-乙酰基-脱氧胞苷(0.28g，0.75mmol)和4,5-二氰基咪唑(58mg，0.53mmol)，升温到40℃反应2h。反应完毕后降温到25℃，加入过氧乙酸溶液(0.31g，2mmol)进去搅拌20min，加入10ml亚硫酸钠水溶液进去洗涤一次，分出二氯甲烷层，再加入二氯乙酸(0.4g，3.2mmol)和巯基乙酸(0.32g，2.5mmol)进去搅拌30min。反应完毕后，10ml饱和碳酸氢钠洗涤一次，旋干二氯甲烷，加入15ml的庚烷溶解，再用10ml的dmf和5ml的水进去洗涤3次，分出庚烷层，无水硫酸钠干燥，旋干得到油状物(化合物28-b，0.63g，95.8％)。
28-c)将化合物28-b(1g，0.76mmol)和无水二氯甲烷(20ml)加入到反应瓶中，氮气保护下再加入5′-o-(4,4-二甲氧基三苯甲基)-3′-[o-(2-氰乙基)-亚磷酰-(二异丙基氨基)]-脱氧尿苷(0.83g，1.14mmol)和4,5-二氰基咪唑(89.7mg，0.76mmol)，反应3h。反应完毕后，加入过氧乙酸溶液(0.47g，3mmol)进去搅拌20min，加入10ml亚硫酸钠水溶液进去洗涤一次，分出二氯甲烷层，再加入二氯乙酸(0.48g，3.8mmol)和巯基乙酸(0.2g，2.3mmol)进去搅拌30min。反应完毕后，加入10ml水进去洗涤一次，10ml饱和碳酸氢钠洗涤一次，旋干二氯甲烷，加入15ml的庚烷溶解，再用10ml的dmf和5ml的水进去洗涤3次，分出庚烷层，无水硫酸钠干燥，旋干得到油状物(化合物28-c，1.2g，97.3％)。
28-d)将化合物28-c(1g，0.6mmol)和无水二氯甲烷(20ml)加入到反应瓶中，氮气保护下再加入5′-o-(4,4-二甲氧基三苯甲基)-3′-[o-(2-氰乙基)亚磷酰-(二异丙基氨基)]-n6-乙酰基-脱氧腺苷(0.72g，0.9mmol)和4,5-二氰基咪唑(70mg，0.63mmol)，反应3h。反应完毕后，加入过氧乙酸溶液(0.37g，2.4mmol)进去搅拌20min，加入10ml亚硫酸钠水溶液进去洗涤一次，分出二氯甲烷层，再加入二氯乙酸(0.49g，3.0mmol)和巯基乙酸(0.26g，3mmol)进去搅拌30min。反应完毕后，加入10ml水进去洗涤一次，10ml饱和碳酸氢钠洗涤一次，旋干二氯甲烷，加入15ml的庚烷溶解，再用10ml的dmf和5ml的水进去洗涤3次，分出庚烷层，无水硫酸钠干燥，旋干得到油状物(化合物28-d，1.19g，96.7％)。
28-e)将化合物28-d(1.02g，0.5mmol)和无水二氯甲烷(15ml)加入到反应瓶中，氮气保护下再加入5′-o-(4,4-二甲氧基三苯甲基)-3′-[o-(2-氰乙基)亚磷酰-(二异丙基氨基)]-n4-乙酰基-脱氧胞苷(0.61g，0.75mmol)和4,5-二氰基咪唑(58mg，0.5mmol)，反应3h。反应完毕后，加入过氧乙酸溶液(0.31g，2mmol)进去搅拌20min，加入10ml亚硫酸钠水溶液进去洗涤一次，分出二氯甲烷层，再加入二氯乙酸(0.31g，2.5mmol)和巯基乙酸(0.17g，2mmol)进去搅拌30min。反应完毕后，加入10ml水进去洗涤一次，10ml饱和碳酸氢钠洗涤一次，旋干二氯甲烷，加入15ml的庚烷溶解，再用10ml的dmf和5ml的水进去洗涤3次，分出庚烷层，无水硫酸钠干燥，旋干得到油状物(化合物28，1.16g，95.5％)，即3′-o-lev-n4-乙酰基-脱氧胞苷-3′-[(2-氰基-2-(3，4-二(异构十三烷氧基)苄基)乙氧基)]磷酰基-n2-异丁酰基-脱氧鸟苷-3’-[o-(2-氰乙基)]磷酰基-脱氧尿苷-3′-[o-(2-氰乙基)]磷酰基-n6-乙酰基-脱氧腺苷-3′-[o-(2-氰乙基)]磷酰基-n4-乙酰基-脱氧胞苷。ms-esi[m+2]+/2:1121.92。
28-f)：最后进行全脱保护，得到寡核苷酸。
参考实施例25步骤s6对化合物28进行全脱保护，即可得到寡核苷酸。
实施例29
将实施例25所做得的化合物25以片段缩合的方式延长核苷，结合实施例28的化合物28-d，合成3′-o-lev-脱氧胸苷-3′-(2-氰基-2-(异构十烷基)乙氧基)磷酰基-n4-乙酰基-脱氧胞苷-3′-[o-(2-氰乙基)]磷酰基-n2-异丁酰基-脱氧鸟苷-3′-[o-(2-氰乙基)]磷酰基-脱氧胸苷-3′-[o-(2-氰乙基)]磷酰基-脱氧胸苷-3′-[o-(2-氰乙基)]磷酰基-n4-乙酰基-脱氧胞苷-3′-[(2-氰基-2-(3，4-二(异构十三烷氧基)苄基)乙氧基)]磷酰基-n2-异丁酰基-脱氧鸟苷-3′-[o-(2-氰乙基)]磷酰基-脱氧尿苷-3′-[o-(2-氰乙基)]磷酰基-n6-乙酰基-脱氧腺苷-3′-[o-(2-氰乙基)]磷酰基-n4-乙酰基-脱氧胞苷，该合成过程包括如下步骤：
29-a)将化合物28-d(1.02g，0.5mmol)和无水二氯甲烷(15ml)加入到反应瓶中，氮气保护下再加入5′-o-(4,4-二甲氧基三苯甲基)-3′-[o-(2-氰乙基)亚磷酰-(二异丙基氨基)]-n4-乙酰基-脱氧胞苷(0.61g，0.75mmol)和4,5-二氰基咪唑(58mg，0.5mmol)，反应3h。反应完毕后，加入过氧乙酸溶液(0.31g，2mmol)进去搅拌20min，加入10ml亚硫酸钠水溶液进去洗涤一次，分出二氯甲烷层，再用10ml水进去洗涤一次，10ml饱和碳酸氢钠洗涤一次，旋干二氯甲烷，加入15ml的庚烷溶解，再用10ml的dmf和5ml的水进去洗涤3次，分出庚烷层，无水硫酸钠干燥，旋干得到油状物(化合物29-a，1.33g，97.2％)。
29-b)将化合物29-a(1g)和15ml无水二氯甲烷加入到反应瓶中，加入1.5ml吡啶和1ml醋酸,再加入水合肼(2eq)，室温下搅拌2h，加入3ml丙酮进去,搅拌15min后用15ml水洗涤三次，干燥，旋干，过柱纯化得到油状物(化合物29-b，0.91g，94％)。
29-c)将化合物29-b(0.91g，0.34mmol)和10ml无水二氯甲烷加入到反应瓶中，加入双(二异丙基氨基)(2-氰乙氧基)膦(0.23g，0.68mmol)和四氮唑(21mg，0.3mmol)，室温下反应60min.反应完毕后用10水洗涤两次，干燥，旋干，过柱纯化得到油状物(化合物29-c，0.96g，98％)。
29-d)将化合物25(1g，0.5mmol)和无水二氯甲烷(20ml)加入到反应瓶中，氮气保护下再加入化合物29-c(2.6g，1mmol)和四氮唑(35mg，0.5mmol)，室温下反应3h。反应完毕后，加入过氧乙酸溶液(0.31g，2mmol)进去搅拌20min，加入10ml亚硫酸钠水溶液进去洗涤一次，分出二氯甲烷层，再加入二氯乙酸(0.31g，2.5mmol)和巯基乙酸(0.17g，2mmol)进去搅拌30min。反应完毕后，加入10ml水进去洗涤一次，10ml饱和碳酸氢钠洗涤一次，无水硫酸钠干燥，旋干，过柱纯化得到油状物(化合物29，1.16g，95.5％)，即3′-o-lev-脱氧胸苷-3′-(2-氰基-2-(异构十烷基)乙氧基)磷酰基-n4-乙酰基-脱氧胞苷-3′-[o-(2-氰乙基)]磷酰基-n2-异丁酰基-脱氧鸟苷-3′-[o-(2-氰乙基)]磷酰基-脱氧胸苷-3′-[o-(2-氰乙基)]磷酰基-脱氧胸苷-3′-[o-(2-氰乙基)]磷酰基-n4-乙酰基-脱氧胞苷-3′-[(2-氰基-2-(3，4-二(异构十三烷氧基)苄基)乙氧基)]磷酰基-n2-异丁酰基-脱氧鸟苷-3′-[o-(2-氰乙基)]磷酰基-脱氧尿苷-3′-[o-(2-氰乙基)]磷酰基-n6-乙酰基-脱氧腺苷-3′-[o-(2-氰乙基)]磷酰基-n4-乙酰基-脱氧胞苷，ms-esi[m+3]+/3:1497.83。
实施例30
分别以p-002、p-003、p-007、p-009、p-010、p-015、p-018、p-19、p-020、p-021和p-022为亚磷酰化试剂，参考实施例25的合成步骤，可依次制备得如下化合物：
30-a)3′-o-lev-脱氧胸苷-3′-[1-丙基-2-氰基-2-(异构十烷基)乙氧基]磷酰基-n4-乙酰基-脱氧胞苷-3′-[o-(2-氰乙基)]磷酰基-n2-异丁酰基-脱氧鸟苷-3′-[o-(2-氰乙基)]磷酰基-脱氧胸苷-3′-[o-(2-氰乙基)]磷酰基-脱氧胸苷。ms-esi[m+2]+/2:1037.91。
30-b)3′-o-lev-脱氧胸苷-3′-[1-苯基-2-氰基-2-(异构十烷基)乙氧基]磷酰基-n4-乙酰基-脱氧胞苷-3′-[o-(2-氰乙基)]磷酰基-n2-异丁酰基-脱氧鸟苷-3′-[o-(2-氰乙基)]磷酰基-脱氧胸苷-3′-[o-(2-氰乙基)]磷酰基-脱氧胸苷。ms-esi[m+2]+/2:1054.3。
30-c)3′-o-lev-脱氧胸苷-3′-[1-异构九烷基-2-氰基-2-(异构十烷基)乙氧基]磷酰基-n4-乙酰基-脱氧胞苷-3′-[o-(2-氰乙基)]磷酰基-n2-异丁酰基-脱氧鸟苷-3′-[o-(2-氰乙基)]磷酰基-脱氧胸苷-3′-[o-(2-氰乙基)]磷酰基-脱氧胸苷。ms-esi[m+2]+/2:1079.88。
30-d)3′-o-lev-脱氧胸苷-3′-[2-氰基-2-(异构十三烷基)乙氧基]磷酰基-n4-乙酰基-脱氧胞苷-3′-[o-(2-氰乙基)]磷酰基-n2-异丁酰基-脱氧鸟苷-3′-[o-(2-氰乙基)]磷酰基-脱氧胸苷-3′-[o-(2-氰乙基)]磷酰基-脱氧胸苷。ms-esi[m+2]+/2:1037.94。
30-e)3′-o-lev-脱氧胸苷-3′-[1-丙基-2-氰基-2-(异构十三烷基)乙氧基]磷酰基-n4-乙酰基-脱氧胞苷-3′-[o-(2-氰乙基)]磷酰基-n2-异丁酰基-脱氧鸟苷-3′-[o-(2-氰乙基)]磷酰基-脱氧胸苷-3′-[o-(2-氰乙基)]磷酰基-脱氧胸苷。ms-esi[m+2]+/2:1008.40。
30-f)3′-o-lev-脱氧胸苷-3′-[1-异构十二烷基-2-氰基-2-(异构十三烷基)乙氧基]磷酰基-n4-乙酰基-脱氧胞苷-3′-[o-(2-氰乙基)]磷酰基-n2-异丁酰基-脱氧鸟苷-3′-[o-(2-氰乙基)]磷酰基-脱氧胸苷-3′-[o-(2-氰乙基)]磷酰基-脱氧胸苷。ms-esi[m+2]+/2:1058.38。
30-g)3′-o-lev-脱氧胸苷-3′-[2-氰基-2-(正十二烷基)乙氧基]磷酰基-n4-乙酰基-脱氧胞苷-3′-[o-(2-氰乙基)]磷酰基-n2-异丁酰基-脱氧鸟苷-3′-[o-(2-氰乙基)]磷酰基-脱氧胸苷-3′-[o-(2-氰乙基)]磷酰基-脱氧胸苷。ms-esi[m+2]+/2:1030.32(m+1)。
30-h)3′-o-lev-脱氧胸苷-3′-[2-氰基-2-((e)-3,7,11,15-四甲基-2-十六碳烯-1-基)乙氧基]磷酰基-n4-乙酰基-脱氧胞苷-3′-[o-(2-氰乙基)]磷酰基-n2-异丁酰基-脱氧鸟苷-3′-[o-(2-氰乙基)]磷酰基-脱氧胸苷-3′-[o-(2-氰乙基)]磷酰基-脱氧胸苷。ms-esi[m+2]+/2:1085.88。
30-i)3′-o-lev-脱氧胸苷-3′-[2-氰基-2-(3,7,11,15-四甲基-十六烷基]磷酰基-n4-乙酰基-脱氧胞苷-3′-[o-(2-氰乙基)]磷酰基-n2-异丁酰基-脱氧鸟苷-3′-[o-(2-氰乙基)]磷酰基-脱氧胸苷-3′-[o-(2-氰乙基)]磷酰基-脱氧胸苷。ms-esi[m+2]+/2:1086.40。
30-j)3′-o-lev-脱氧胸苷-3′-[2-氰基-2-(3,7,11-三甲基-2,6,10-十二碳三烯-1-基)乙氧基]磷酰基-n4-乙酰基-脱氧胞苷-3’-[o-(2-氰乙基)]磷酰基-n2-异丁酰基-脱氧鸟苷-3′-[o-(2-氰乙基)]磷酰基-脱氧胸苷-3′-[o-(2-氰乙基)]磷酰基-脱氧胸苷。ms-esi[m+2]+/2:1048.40。
30-k)3′-o-lev-脱氧胸苷-3′-[2-氰基-2-(3,7,11-三甲基-十二烷基)乙氧基]磷酰基-n4-乙酰基-脱氧胞苷-3′-[o-(2-氰乙基)]磷酰基-n2-异丁酰基-脱氧鸟苷-3′-[o-(2-氰乙基)]磷酰基-脱氧胸苷-3′-[o-(2-氰乙基)]磷酰基-脱氧胸苷。ms-esi[m+2]+/2:1051.40。
实施例31
分别以p-008、p-016、p-017、p-023和p-024为亚磷酰化试剂，参考实施例28的合成步骤，可依次制备得如下化合物：
31-a)3′-o-lev-n4-乙酰基-脱氧胞苷-3′-[1-丙基-2-氰基-2-(3,4-二异构十烷氧基苄基)乙氧基]磷酰基-n2-异丁酰基-脱氧鸟苷-3′-[o-(2-氰乙基)]磷酰基-脱氧尿苷-3′-[o-(2-氰乙基)]磷酰基-n6-乙酰基-脱氧腺苷-3′-[o-(2-氰乙基)]磷酰基-n4-乙酰基-脱氧胞苷。ms-esi[m+2]+/2:1200.90。
31-b)3′-o-lev-n4-乙酰基-脱氧胞苷-3′-[1-丙基-2-氰基-2-(3,4-二异构十三烷氧基苄基]磷酰基-n2-异丁酰基-脱氧鸟苷-3′-[o-(2-氰乙基)]磷酰基-脱氧尿苷-3′-[o-(2-氰乙基)]磷酰基-n6-乙酰基-脱氧腺苷-3′-[o-(2-氰乙基)]磷酰基-n4-乙酰基-脱氧胞苷。ms-esi[m+2]+/2:1242.80。
31-c)3′-o-lev-n4-乙酰基-脱氧胞苷-3′-[2-氰基-2-(3,4-二(异壬烷氧基)苄基]磷酰基-n2-异丁酰基-脱氧鸟苷-3′-[o-(2-氰乙基)]磷酰基-脱氧尿苷-3′-[o-(2-氰乙基)]磷酰基-n6-乙酰基-脱氧腺苷-3′-[o-(2-氰乙基)]磷酰基-n4-乙酰基-脱氧胞苷。ms-esi[m+2]+/2:1165.90。
31-d)3′-o-lev-n4-乙酰基-脱氧胞苷-3′-[2-氰基-2-(3,5-二(异构十烷氧基)苄基)乙氧基]磷酰基-n2-异丁酰基-脱氧鸟苷-3′-[o-(2-氰乙基)]磷酰基-脱氧尿苷-3′-[o-(2-氰乙基)]磷酰基-n6-乙酰基-脱氧腺苷-3’-[o-(2-氰乙基)]磷酰基-n4-乙酰基-脱氧胞苷。ms-esi[m+2]+/2:1179.90。
31-e)3′-o-lev-n4-乙酰基-脱氧胞苷-3′-[2-氰基-2-(3,4,5-三(异构十烷氧基)苄基)乙氧基]磷酰基-n2-异丁酰基-脱氧鸟苷-3′-[o-(2-氰乙基)]磷酰基-脱氧尿苷-3′-[o-(2-氰乙基)]磷酰基-n6-乙酰基-脱氧腺苷-3′-[o-(2-氰乙基)]磷酰基-n4-乙酰基-脱氧胞苷。ms-esi[m+2]+/2:1258.02。
实施例32
分别以p-006、p-011、p-013和p-014为亚磷酰化试剂，参考实施例27的合成步骤，可依次制备得如下化合物：
32-a)3′-o-lev-脱氧胸苷-3′-[1-(3,4-二异构十烷氧基苯基)-2-氰基-2-(异构十烷基)乙氧基]硫代磷酰基-n4-乙酰基-脱氧胞苷-3′-[o-(2-氰乙基)]硫代磷酰基-n2-异丁酰基-脱氧鸟苷-3′-[o-(2-氰乙基)]硫代磷酰基-脱氧胸苷-3′-[o-(2-氰乙基)]硫代磷酰基-脱氧胸苷。ms-esi[m+2]+/2:1242.90。
32-b)3′-o-lev-脱氧胸苷-3′-[1-苯基-2-氰基-2-(异构十三烷基)乙氧基]硫代磷酰基-n4-乙酰基-脱氧胞苷-3′-[o-(2-氰乙基)]硫代磷酰基-n2-异丁酰基-脱氧鸟苷-3′-[o-(2-氰乙基)]硫代磷酰基-脱氧胸苷-3′-[o-(2-氰乙基)]硫代磷酰基-脱氧胸苷。ms-esi[m+2]+/2:1107.80。
32-c)3′-o-lev-脱氧胸苷-3′-[1-(3,4-二异构十三烷氧基苯基)-2-氰基-乙氧基]硫代磷酰基-n4-乙酰基-脱氧胞苷-3′-[o-(2-氰乙基)]硫代磷酰基-n2-异丁酰基-脱氧鸟苷-3′-[o-(2-氰乙基)]硫代磷酰基-脱氧胸苷-3′-[o-(2-氰乙基)]硫代磷酰基-脱氧胸苷。ms-esi[m+2]+/2:1214.90。
32-d)3′-o-lev-脱氧胸苷-3′-[1-(3,4-二异构十三烷氧基苯基)-2-氰基-2-(异构十烷基)乙氧基]硫代磷酰基-n4-乙酰基-脱氧胞苷-3′-[o-(2-氰乙基)]硫代磷酰基-n2-异丁酰基-脱氧鸟苷-3′-[o-(2-氰乙基)]硫代磷酰基-脱氧胸苷-3′-[o-(2-氰乙基)]硫代磷酰基-脱氧胸苷。ms-esi[m+2]+/2:1306.10。
实施例33
参考实施例29中a～c的步骤，分别以化合物25、27和31-e为原料，替代化合物28-d进，行脱保护\亚磷酰化，可依次制备得到如下化合物：
33-a)3′-[o-(2-氰乙基)亚磷酰-(二异丙基氨基)]-脱氧胸苷-3′-(2-氰基-2-(异构十烷基)乙氧基)磷酰基-n4-乙酰基-脱氧胞苷-3′-[o-(2-氰乙基)]磷酰基-n2-异丁酰基-脱氧鸟苷-3′-[o-(2-氰乙基)]磷酰基-脱氧胸苷-5′-o-(4,4-二甲氧基三苯甲基)-3′-[o-(2-氰乙基)]磷酰基-脱氧胸苷。ms-esi[m+2]+/2:1218.40。
33-b)3′-[o-(2-氰乙基)亚磷酰-(二异丙基氨基)]-脱氧胸苷-3′-[1-(3,4-二异构十烷氧基苯基)-2-氰基-乙氧基)]硫代磷酰基-n4-乙酰基-脱氧胞苷-3′-[o-(2-氰乙基)]硫代磷酰基-n2-异丁酰基-脱氧鸟苷-3′-[o-(2-氰乙基)]硫代磷酰基-脱氧胸苷-5′-o-(4,4-二甲氧基三苯甲基)-3′-[o-(2-氰乙基)]硫代磷酰基-脱氧胸苷。ms-esi[m+2]+/2:1374.90。
33-c)3′-[o-(2-氰乙基)亚磷酰-(二异丙基氨基)]-n4-乙酰基-脱氧胞苷-3′-[2-氰基-2-(3,4,5-三(异构十烷氧基)苄基)乙氧基]磷酰基-n2-异丁酰基-脱氧鸟苷-3′-[o-(2-氰乙基)]磷酰基-脱氧尿苷-3′-[o-(2-氰乙基)]磷酰基-n6-乙酰基-脱氧腺苷-5′-o-(4,4-二甲氧基三苯甲基)3′-[o-(2-氰乙基)]磷酰基-n4-乙酰基-脱氧胞苷。ms-esi[m+2]+/2:1460.10。
实施例34
参考实施例29中d的步骤，以化合物25与33-a为原料，或以27与33-b为原料，或以31e与33-c为原料，可分别制备得到如下化合物：
34-a)3′-o-lev-脱氧胸苷-3′-(2-氰基-2-(异构十烷基)乙氧基)磷酰基-n4-乙酰基-脱氧胞苷-3′-[o-(2-氰乙基)]磷酰基-n2-异丁酰基-脱氧鸟苷-3′-[o-(2-氰乙基)]磷酰基-脱氧胸苷-3′-[o-(2-氰乙基)]磷酰基-脱氧胸苷-3’-[o-(2-氰乙基)]磷酰基-脱氧胸苷-3′-(2-氰基-2-(异构十烷基)乙氧基)磷酰基-n4-乙酰基-脱氧胞苷-3′-[o-(2-氰乙基)]磷酰基-n2-异丁酰基-脱氧鸟苷-3′-[o-(2-氰乙基)]磷酰基-脱氧胸苷-3′-[o-(2-氰乙基)]磷酰基-脱氧胸苷。ms-esi[m+3]+/3:1360.73。
34-b)3′-o-lev-脱氧胸苷-3′-[1-(3,4-二异构十烷氧基苯基)-2-氰基-乙氧基)]硫代磷酰基-n4-乙酰基-脱氧胞苷-3′-[o-(2-氰乙基)]硫代磷酰基-n2-异丁酰基-脱氧鸟苷-3′-[o-(2-氰乙基)]硫代磷酰基-脱氧胸苷-3′-[o-(2-氰乙基)]硫代磷酰基-脱氧胸苷-3′-[o-(2-氰乙基)]硫代磷酰基-脱氧胸苷-3′-[1-(3,4-二异构十烷氧基苯基)-2-氰基-乙氧基)]硫代磷酰基-n4-乙酰基-脱氧胞苷-3′-[o-(2-氰乙基)]硫代磷酰基-n2-异丁酰基-脱氧鸟苷-3′-[o-(2-氰乙基)]硫代磷酰基-脱氧胸苷-3′-[o-(2-氰乙基)]硫代磷酰基-脱氧胸苷。ms-esi[m+3]+/3:1569.12。
34-c)3′-o-lev-n4-乙酰基-脱氧胞苷-3′-[2-氰基-2-(3,4,5-三(异构十烷氧基)苄基)乙氧基]磷酰基-n2-异丁酰基-脱氧鸟苷-3′-[o-(2-氰乙基)]磷酰基-脱氧尿苷-3′-[o-(2-氰乙基)]磷酰基-n6-乙酰基-脱氧腺苷-3′-[o-(2-氰乙基)]磷酰基-n4-乙酰基-脱氧胞苷-3′-[o-(2-氰乙基)]磷酰基-n4-乙酰基-脱氧胞苷-3′-[2-氰基-2-(3,4,5-三(异构十烷氧基)苄基)乙氧基]磷酰基-n2-异丁酰基-脱氧鸟苷-3′-[o-(2-氰乙基)]磷酰基-脱氧尿苷-3′-[o-(2-氰乙基)]磷酰基-n6-乙酰基-脱氧腺苷-3′-[o-(2-氰乙基)]磷酰基-n4-乙酰基-脱氧胞苷。ms-esi[m+3]+/3:1682.70。
实施例35
参考实施例29中d的步骤，以化合物34-a与33-a为原料，或以34-b与33-b为原料，或以34-c与33-c为原料，可分别制备得到如下化合物：
35-a)3′-o-lev-脱氧胸苷-3′-(2-氰基-2-(异构十烷基)乙氧基)磷酰基-n4-乙酰基-脱氧胞苷-3′-[o-(2-氰乙基)]磷酰基-n2-异丁酰基-脱氧鸟苷-3′-[o-(2-氰乙基)]磷酰基-脱氧胸苷-3′-[o-(2-氰乙基)]磷酰基-脱氧胸苷-3′-[o-(2-氰乙基)]磷酰基-脱氧胸苷-3′-(2-氰基-2-(异构十烷基)乙氧基)磷酰基-n4-乙酰基-脱氧胞苷-3′-[o-(2-氰乙基)]磷酰基-n2-异丁酰基-脱氧鸟苷-3′-[o-(2-氰乙基)]磷酰基-脱氧胸苷-3′-[o-(2-氰乙基)]磷酰基-脱氧胸苷-3′-[o-(2-氰乙基)]磷酰基-脱氧胸苷-3′-(2-氰基-2-(异构十烷基)乙氧基)磷酰基-n4-乙酰基-脱氧胞苷-3′-[o-(2-氰乙基)]磷酰基-n2-异丁酰基-脱氧鸟苷-3′-[o-(2-氰乙基)]磷酰基-脱氧胸苷-3′-[o-(2-氰乙基)]磷酰基-脱氧胸苷。ms-esi[m+4]+/4:1533.20。
35-b)3′-o-lev-脱氧胸苷-3′-[1-(3,4-二异构十烷氧基苯基)-2-氰基-乙氧基)]硫代磷酰基-n4-乙酰基-脱氧胞苷-3′-[o-(2-氰乙基)]硫代磷酰基-n2-异丁酰基-脱氧鸟苷-3′-[o-(2-氰乙基)]硫代磷酰基-脱氧胸苷-3′-[o-(2-氰乙基)]硫代磷酰基-脱氧胸苷-3′-[o-(2-氰乙基)]硫代磷酰基-脱氧胸苷-3′-[1-(3,4-二异构十烷氧基苯基)-2-氰基-乙氧基)]硫代磷酰基-n4-乙酰基-脱氧胞苷-3′-[o-(2-氰乙基)]硫代磷酰基-n2-异丁酰基-脱氧鸟苷-3′-[o-(2-氰乙基)]硫代磷酰基-脱氧胸苷-3′-[o-(2-氰乙基)]硫代磷酰基-脱氧胸苷-3′-[o-(2-氰乙基)]硫代磷酰基-脱氧胸苷-3′-[1-(3,4-二异构十烷氧基苯基)-2-氰基-乙氧基)]硫代磷酰基-n4-乙酰基-脱氧胞苷-3′-[o-(2-氰乙基)]硫代磷酰基-n2-异丁酰基-脱氧鸟苷-3′-[o-(2-氰乙基)]硫代磷酰基-脱氧胸苷-3′-[o-(2-氰乙基)]硫代磷酰基-脱氧胸苷。ms-esi[m+4]+/4:1767.52。
35-c)3′-o-lev-n4-乙酰基-脱氧胞苷-3′-[2-氰基-2-(3,4,5-三(异构十烷氧基)苄基)乙氧基]磷酰基-n2-异丁酰基-脱氧鸟苷-3′-[o-(2-氰乙基)]磷酰基-脱氧尿苷-3′-[o-(2-氰乙基)]磷酰基-n6-乙酰基-脱氧腺苷-3′-[o-(2-氰乙基)]磷酰基-n4-乙酰基-脱氧胞苷-3′-[o-(2-氰乙基)]磷酰基-脱氧胸苷-3′-[2-氰基-2-(3,4,5-三(异构十烷氧基)苄基)乙氧基]磷酰基-n4-乙酰基-脱氧胞苷-3′-[o-(2-氰乙基)]磷酰基-n2-异丁酰基-脱氧鸟苷-3′-[o-(2-氰乙基)]磷酰基-脱氧胸苷-3′-[o-(2-氰乙基)]磷酰基-脱氧胸苷-3′-[o-(2-氰乙基)]磷酰基-脱氧胸苷-3′-[2-氰基-2-(3,4,5-三(异构十烷氧基)苄基)乙氧基]磷酰基-n4-乙酰基-脱氧胞苷-3′-[o-(2-氰乙基)]磷酰基-n2-异丁酰基-脱氧鸟苷-3′-[o-(2-氰乙基)]磷酰基-脱氧胸苷-3′-[o-(2-氰乙基)]磷酰基-脱氧胸苷。ms-esi[m+4]+/4:1895.22。
实施例36
参考实施例25步骤s6进行全脱保护，分别以化合物35-a、35-b或35-c为原料，可依次制备得到如下寡核苷酸：
37-a)3′-oh-脱氧胸苷-磷酰基-脱氧胞苷-磷酰基-脱氧鸟苷-磷酰基-脱氧胸苷-磷酰基-脱氧胸苷-磷酰基-脱氧胸苷-磷酰基-脱氧胞苷-磷酰基-脱氧鸟苷-磷酰基-脱氧胸苷-磷酰基-脱氧胸苷-磷酰基-脱氧胸苷-磷酰基-脱氧胞苷-磷酰基-脱氧鸟苷-磷酰基-脱氧胸苷-磷酰基-5′-oh-脱氧胸苷。ms-esi[m+3]+/3:1577.88。
37-b)3′-oh-脱氧胸苷-硫代磷酰基-脱氧胞苷-硫代磷酰基-脱氧鸟苷-硫代磷酰基-脱氧胸苷-硫代磷酰基-脱氧胸苷-硫代磷酰基-脱氧胸苷-硫代磷酰基-脱氧胞苷-硫代磷酰基-脱氧鸟苷-硫代磷酰基-脱氧胸苷-硫代磷酰基-脱氧胸苷-硫代磷酰基-脱氧胸苷-硫代磷酰基-脱氧胞苷-硫代磷酰基-脱氧鸟苷-硫代磷酰基-脱氧胸苷-硫代磷酰基-5′-oh-脱氧胸苷。ms-esi[m+3]+/3:1574.83。
37-c)3′-oh-脱氧胞苷-磷酰基-脱氧鸟苷-磷酰基-脱氧尿苷-磷酰基-脱氧腺苷-磷酰基-脱氧胞苷-磷酰基-脱氧胸苷-磷酰基-脱氧胞苷-磷酰基-脱氧鸟苷-磷酰基-脱氧胸苷-磷酰基-脱氧胸苷-磷酰基-脱氧胸苷-磷酰基-脱氧胞苷-磷酰基-脱氧鸟苷-磷酰基-脱氧胸苷-磷酰基-5′-oh-脱氧胸苷。ms-esi[m+3]+/3:1490.9。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。