一种用于弓形虫感染预防的疫苗及其制备方法和应用与流程

本发明属于免疫学和分子生物学技术领域，具体一种用于弓形虫感染预防的疫苗及其制备方法和应用。

背景技术：

本发明背景技术中公开的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

弓形虫(t.gondii)是世界上一种流行的寄生虫病，是一种细胞内寄生虫。刚地弓形虫在不同程度上影响了全世界三分之一的人。最近几年，使用抗弓形虫dna疫苗的工作取得了重大进展。

许多弓形虫dna被广泛用作基因疫苗的候选基因。弓形虫的弓形虫棒状体蛋白(rhoptryprotein，rop)基因表达重要的蛋白质，这些蛋白质在寄生虫的生命周期中起决定性作用。此外，这些基因被认为是抗弓形虫dna疫苗的杰出候选者。研究者证明了弓形虫的rop1，rop16，rop18等基因可以引起小鼠体内的细胞和体液免疫反应。但是并没有达到所期望的完全保护性效果。

究其原因，由于弓形虫生活史复杂，形态多样，宿主范围广泛，不同性质的抗原其免疫原也不同，而其包囊和速殖子的致病机制也存在差异，虽然能找到各种不同的单一抗原成分为基础的疫苗候选抗原，但是由于其含有的淋巴细胞结合位点少、受机体主要组织相容性复合体限制性大，因此难以形成有效的抵抗力对抗弓形虫不同形态的攻击感染。此外，目前现有重组抗原性疫苗通常免疫原性较差，需要共同的佐剂才能诱导阳性免疫反应。因此，寻求更多、更好的来源于不同弓形虫阶段的dna候选抗原，尤其是与弓形虫毒力相关的抗原基因，同时配合适宜的佐剂是研发抗弓形虫疫苗的一个关键。

技术实现要素：

针对现有技术中的不足，本发明提供一种用于弓形虫感染预防的疫苗及其制备方法和应用。本发明根据genbank发表的弓形虫rop47序列(geneid,tgme49_252500)设计合成一对引物，通过pcr扩增rop47基因，构建重组质粒pegfp-c1-rop47(prop47)，提取的含目的基因的重组质粒获得弓形虫rop47dna疫苗，并以单磷酰脂质a(mpla)作为佐剂，制备重组弓形虫rop47dna和mpla联合疫苗，有效提高小鼠针对弓形虫的免疫保护性反应，减少脑组织内包囊的形成，因此具有良好的实际应用之价值。

为实现上述技术目的，本发明采用的技术方案如下：

本发明的第一个方面，提供一种用于弓形虫感染预防的核苷酸序列，其含有选自以下1)-3)中任意一种或多种的核苷酸序列：

1)seqidno.1所示棒状体蛋白rop47的核苷酸序列；

2)与1)中核苷酸序列互补的核苷酸序列；

3)对上述1)或2)所示的核苷酸序列进行一个或多个碱基的取代、缺失或添加修饰的核苷酸序列。

有研究指出，rop47对于弓形虫的慢性感染很重要，基于生物信息学分析，本发明研究表明rop47含有良好的b细胞抗原表位和t细胞抗原表位，进一步说明弓形虫rop47基因具备成为优良dna疫苗的潜力。

本发明的第二个方面，提供一种载体，所述载体包含上述核苷酸序列。

本发明的第三个方面，提供一种重组质粒，所述重组质粒为rop47基因插入真核表达载体pegfp-c1中获得，更进一步的，所述重组质粒为rop47基因插入真核表达载体pegfp-c1中kpni和bamhi位点间构建即得pegfp-c1-rop47(prop47)。

本发明的第四个方面，提供一种蛋白，所述氨基酸序列由上述重组质粒编码获得。

本发明的第五个方面，提供一种疫苗，所述疫苗包含上述核苷酸序列、上述载体和/或上述重组质粒，还包括药学上可接受的载体。

所述药学上可接受的载体为佐剂，所述佐剂为tlr激动剂，进一步优选为单磷酰脂质a(mpla)。单磷酰脂质a是减毒的细菌脂多糖(lps)的脂质a衍生物。其为有效诱导体液抗体反应和细胞介导的免疫应答的有力的免疫刺激剂。本发明通过将单磷酰脂质a作为重组弓形虫rop47dna疫苗的佐剂，能够有效提高小鼠针对弓形虫的免疫保护性反应，减少脑组织内包囊的形成。

本发明的第六个方面，提供上述疫苗的制备方法，所述制备方法包括：

构建重组弓形虫rop47重组质粒；将rop47重组质粒与药学上可接受的载体混合。

其中，所述构建重组弓形虫rop47重组质粒的具体方法包括：以弓形虫cdna为模板pcr扩增rop47基因，将纯化的扩增产物与pegfp-c1质粒载体连接构成重组质粒。

其中，扩增rop47基因的引物如下所示：

上游引物：5’-ggggtacctccgcaagctccagtt-3’(seqidno.2)

下游引物：5’-cgggatccgattcggacccgcag-3’(seqidno.3)

扩增rop47基因的pcr条件如下：

95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min，共30个循环。

所述药学上可接受的载体为佐剂，所述佐剂为tlr激动剂，进一步优选为单磷酰脂质a。

本发明的第七个方面，提供上述核苷酸序列、载体、重组质粒、蛋白和/或疫苗中的任一种在如下a)-c)中的应用：

a)弓形虫感染预防；

b)提高接种者对弓形虫的免疫保护性反应；

c)控制弓形虫慢性感染过程中脑组织包囊形成。

所述接种者包括人和非人动物，所述非人动物为哺乳动物，进一步包括小鼠。

本发明的有益技术效果：

本发明首次报道一种重组弓形虫rop47dna疫苗，同时配合佐剂单磷酰脂质a对小鼠进行注射免疫，经试验证明，本发明制备得到的疫苗能够有效提高小鼠针对弓形虫的免疫保护性反应，特别适用于控制弓形虫慢性感染过程中脑组织包囊的形成，因此具有良好的实际应用之价值。

附图说明

构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。

图1：弓形虫棒状体蛋白rop47的b细胞表位和t细胞表位分析。

图2：重组prop47质粒蛋白表达鉴定；(a)在白光下检测被prop47转染的细胞；(b)在蓝色光下观察被prop47转染的细胞；(c)在白光下观察被pegfp-c1转染的细胞；(d)在蓝光下观察被pegfp-c1转染的细胞；(e)在白光下观察未转染的细胞；(f)蓝光下观察未转染的细胞；(g)蛋白质印迹分析，未转染的细胞(泳道1)，pegfp-c1转染的细胞(泳道2)，使用prop47转染的细胞(泳道3)。

图3：免疫小鼠血清中特异性igg抗体的检测；(a)在每次免疫前两天收集血清并用elisa检测结果；(b)在最后一次免疫后六周收集血清的elisa检测结果。

图4：elisa检测免疫小鼠的igg1和igg2a抗体水平的结果。在最后一次免疫后2周(a)和后6周(b)收集免疫血清，并利用elisa检测。

图5：免疫小鼠脾细胞中细胞因子含量的测定相关图。其中，(a)中待测细胞因子为ifn-γ；(b)中待测细胞因子为il-2；(c)中待测细胞因子为il-4，(d)中待测细胞因子为il-10。

图6：重组dna疫苗针对弓形虫的免疫保护性。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。

现结合具体实例对本发明作进一步的说明，以下实例仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。如果实施例中未注明的实验具体条件，通常按照常规条件，或按照试剂公司所推荐的条件；下述实施例中所用的试剂、耗材等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

如前所述，寻求更多、更好的来源于不同弓形虫阶段的dna候选抗原，尤其是与弓形虫毒力相关的抗原基因，同时配合适宜的佐剂是研发抗弓形虫疫苗的一个关键。

有鉴于此，本发明提供用于预防人和动物弓形虫病重组弓形虫rop47基因的dna疫苗，通过iedb预测同时具有人类及balb/c小鼠mhc分子限制性的弓形虫rop47t细胞优势表位，用dnastar-protean软件综合分析预测rop47的b细胞的优势表位，通过pcr扩增rop47基因，将其插入真核表达载体pegfp-c1中kpni和bamhi位点间构建重组质粒pegfp-c1-rop47(prop47)，大量提取的含目的基因的重组质粒获得弓形虫rop47dna疫苗。本发明的疫苗，可作为预防人或动物弓形虫感染，特别是控制宿主脑组织中包囊形成的有效候选疫苗。

本发明的重组弓形虫rop47dna疫苗，对balb/c小鼠进行肌肉注射免疫。通过测定细胞和体液免疫反应指标来评价疫苗的免疫原性，通过计数pru株弓形虫攻击实验后小鼠大脑中包囊的数量来评估疫苗的免疫保护性。结果表明与对照组相比，重组弓形虫rop47dna疫苗组能有效地降低免疫小鼠在弓形虫pru株(ii型)攻击后大脑包囊的形成率。本发明的突出效果是：该疫苗可作为控制弓形虫慢性感染过程中脑组织包囊形成的有效的候选疫苗。

本发明的疫苗，评估该疫苗的的免疫原性的方式为：将dna与mpla联合疫苗经肌肉注射免疫balb/c小鼠3次，间隔2周。分别于第一次免疫前，第一次免疫后2周，第2次免疫后2周，和第三次免疫后2周，于免疫鼠眼内眦静脉取血，分离血清，测定血样中的igg浓度。于末次免疫后4周，无菌取免疫鼠的脾脏，通过200目铜网研磨制备脾单细胞悬液，加入rop47复合表位肽刺激培养后检测细胞因子来评估该疫苗的免疫原性。

本发明的疫苗，评估该疫苗的的免疫保护性的方式为：小鼠于末次免疫后4周，每只实验小鼠用20个ii型弓形虫pru虫株包囊攻击。8周后处死小鼠，无菌条件下取脑，物理研磨制备脑组织匀浆液。显微镜下包囊计数。通过比较实验组和对照组小鼠脑的包囊数来评价疫苗的免疫保护性。

本发明提供重组弓形虫rop47dna和mpla联合疫苗，经试验证明，能够有效提高小鼠针对弓形虫的免疫保护性反应，减少脑组织内包囊的形成。

以下通过实施例对本发明做进一步解释说明，但不构成对本发明的限制。应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中为注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件进行。

实施例1.弓形虫rop47抗原表位预测

通过dnastar-protean软件综合分析预测rop47的b细胞优势表位；用iedb预测同时具有人类及balb/c小鼠mhc分子限制性的弓形虫rop47t细胞优势表位。

实施例2.重组弓形虫rop47质粒的构建

用制备的弓形虫cdna为模板扩增rop47基因，反应条件为：95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min，共30个循环。扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳后切胶回收目的片段，回收纯化后的pcr产物和pegfp-c1质粒载体分别酶切1h后电泳，分别将酶切后的pcr纯化产物和pegfp-c1质粒载体回收纯化，回收片段以5∶1的比例混合后在t4连接酶作用下4摄氏度连接过夜。取连接混合物转化感受态细菌，后均匀涂于lk培养基平板上培养过夜，挑单个菌落于lk液体培养基培养，8h后提取质粒获得含有目的基因的重组质粒。

实施例3.弓形虫重组基因疫苗免疫balb/c鼠

spf级雌性balb/c小鼠(6-8周)购自山东大学实验动物中心。100只小鼠随机分成5组，实验组每组小鼠经后腿肌肉注射100μg重组疫苗prop47加20μgmpla，其它四组分别注射100μgpegfp-c1、100μgpbs、20μgmpla和100μgprop47。小鼠共免疫三次，间隔两周。

实施例4.免疫鼠体液免疫和细胞免疫水平的测定

分别在每次免疫前2天及最后免疫后6周对小鼠内眼眦取血，血样先在室温下静置2h，然后4000rpm，离心15min，收集血清。后elisa法检测血清中总抗弓形虫免疫球蛋白(igg)的水平。结果如图4所示。在两次免疫接种后，与其它组相比，prop47/mpla疫苗免疫组的抗体滴度水平明显高，在最后免疫后6周，prop47/mpla免疫组小鼠中检测到最高水平的弓形虫特异性igg抗体(p<0.05)。

在末次免疫后2周和6周，无菌取免疫鼠的脾脏，通过200目铜网研磨制备脾单细胞悬液。使用红细胞裂解缓冲液除去脾细胞中的红细胞后，重悬于含有10％胎牛血清的1640培养基中，调整细胞悬浮液的浓度为5×10⁷个细胞/ml，加入rop47复合表位肽刺激培养后流式细胞术检测细胞因子的含量。如图5所示，与pbs，mpla，pegfp-c1或prop47组相比，prop47/mpla疫苗免疫组的细胞因子含量显著增加(p<0.05)，且prop47/mpla免疫组的小鼠脾细胞中检测出最高水平的ifn-γ(p<0.01)。

实施例5.弓形虫重组dna基因疫苗保护性研究

末次免疫后2周，对实验小鼠进行虫体攻击实验。小鼠经口感染悬浮于0.1毫升pbs中的弓形虫包囊20个。感染1个月后，所有小鼠均被处死，分离小鼠大脑进行物理研磨，制备脑组织匀浆液。将脑组织匀浆液混均，取10微升于显微镜下计数三次取平均值，小鼠脑的包囊数为10倍的平均值。如图6所示，虫体攻击实验表明：与pbs，mpla，pegfp-c1或prop47组相比，prop47/mpla疫苗免疫组的小鼠脑中检测到包囊数量最少(p<0.01)。

综上，prop47/mpla基因疫苗可以有效的诱导小鼠产生特异性的体液和细胞免疫应答。疫苗不仅可以成功地提升体液免疫和细胞免疫反应，有效地保护免疫小鼠抵抗弓形虫包囊的攻击，减少免疫小鼠的大脑包囊形成的数量。该疫苗可作为控制弓形虫慢性感染的有效的候选疫苗，适用于人和动物对弓形虫感染的预防。

本发明未尽事宜为公知技术。

上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

sequencelisting

<110>山东第一医科大学（山东省医学科学院）

<120>一种用于弓形虫感染预防的疫苗及其制备方法和应用

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