本发明涉及癌症基因检测方法，尤其涉及一种用于检测肺癌驱动性基因突变的探针及试剂盒。
背景技术：
：根据2018年世界癌症报告数据统计显示，全球肺癌的发病率和致死率在所有癌种中排首位，且逐年呈上升趋势，其中肺癌的全球发病率占癌症总发病人口的11.6％，致死率占癌症总发病人口的18.4％。在中国，肺癌的发病数位居所有癌症的榜首，发病数达78.7万。在男性中，发病比例较高；在女性中，肺癌的发病率仅次于乳腺癌，位居第二。但男女肺癌的死亡率均居癌症死亡榜首，对患者及社会造成了严重的负担。在临床肿瘤治疗过程中发现，人体肿瘤千差万别，即使是同一个部位的肿瘤，治疗效果和方法也应因人而异。此外，肿瘤的异质性高，即使是同一个人的同一部位的肿瘤也有可能包含了多种突变类型的肿瘤细胞，所以给临床治疗带来了很大的挑战。“驱动基因”这一名词的出现是在2012年亚洲肿瘤大会上，广东省人民医院副院长吴一龙教授提出的。他指出与癌症发生发展相关的基因可称为驱动基因，其决定了这个癌症的最主要原因。我们知道了驱动基因，就知道可以采用哪些药物来对抗它，就可以进行个体化治疗。也正是由于这种观念上的巨大改变，基因检测及肿瘤的个体化治疗越来越广泛的引起重视，短短几年之间发展飞速。基因检测技术主要依赖于高通量测序仪，目前第二代测序(nextgenerationsequencing，ngs)平台主要以illumina公司的hiseq，miseq，nextseq系列及life公司的iontorrenttm系列测序仪为代表，已被广泛应用于生物学研究、产前诊断、基因诊断和治疗方面。然而肿瘤患者往往携带的是一小片段基因的改变或单个碱基的改变，如果选择全基因组测序会造成成本的浪费，且给患者带来更沉重的经济负担。目标序列捕获测序技术的应用解决了上述问题，该技术可将感兴趣的基因组区域定制成特异性探针与基因组dna进行杂交，将目标基因组区域的dna片段进行富集后再利用第二代测序技术进行测序。这种方法与传统聚合酶链式反应(pcr)及基因芯片相比，通量高，准确度高，且可一次性检测已知和未知基因，可以有效检测到样本的高频突变及低频甚至超低频突变。随着对肺癌基因层面的深入研究，越来越多的与肺癌相关的驱动基因被挖掘，进而开发出多种靶向特异基因突变的药物。目前已知驱动基因如egfr、kras、braf、met、nras、pik3ca等等，还有化疗药的相关基因如tp53和ugt1a1等。常见靶向药物有：egfr靶药-吉非替尼、厄洛替尼、埃克替尼、阿法替尼、奥希替尼、azd9291；met靶药-赛可瑞；braf靶药-达拉非尼。化疗药物如：伊立替康、5-fu、卡培他滨、铂类药物等。目前，临床上最常用的基因突变检测方法有sanger测序技术、荧光原位杂交技术(fish)，扩增阻碍突变系统技术(arms-pcr)、荧光pcr技术等。sanger测序技术作为基因检测的金标准，主要用于寻找与疾病有关的特定的基因突变，难以完成没有明确候选基因或候选基因数量较多的大样本病例的筛查。荧光定量pcr检测目的基因仅需检测样本是否具有扩增信号即可，可检测微小突变，但通量低。arms-pcr技术可用于对已知突变基因进行检测，对未知突变基因不可行。fish技术虽然采用几种不同颜色的荧光素单独或者混合标记的探针进行原位杂交,能同时检测多个基因，但在进行大量位点的检测仍然有限。本发明提供的一种用于检测肺癌驱动性基因突变的探针及检测试剂盒。可以联合检测肺癌多种基因的突变，大大节省了患者的样本和等待检测的时间，为肺癌患者的个体化治疗提供一种依据和指导，同时也可监测治疗后的疗效及预测预后。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种用于检测肺癌驱动性基因突变的探针及检测试剂盒，包括braf、egfr、kras、met、nras和pik3ca驱动性基因突变的探针及tp53和ugt1a1化疗药物相关基因的探针，通过对这些基因的检测实现肺癌的个体化治疗和预测预后，本发明提供的一种用于检测肺癌驱动性基因突变的探针，包括下列6组共248条探针：braf驱动突变特异性探针序列：其序列为seqidno.1至seqidno.3；egfr驱动突变特异性探针序列：其序列为seqidno.4至seqidno.98；kras驱动突变特异性探针序列：其序列为seqidno.99至seqidno.148；met驱动突变特异性探针序列：其序列为seqidno.149至seqidno.150；nras驱动突变特异性探针序列：其序列为seqidno.151至seqidno.193；pik3ca驱动突变特异性探针序列：其序列为seqidno.194至seqidno.248；还包括下列2组共28条探针：tp53特异性探针核苷酸序列：其序列为seqidno.249至seqidno.272；ugt1a1特异性探针序列：其序列为seqidno.273至seqidno.276。以上特异性探针的序列具体如下：1.braf驱动突变探针序列seqidno.1gatgatcttcatctgctggtcggaagggctgtggaattggaatggattttgaaggagacggactggtgagaatttggggcctggaaaaatgaagtcattggaagataagattcagagtaaseqidno.2acttggtttttttttagttctagcaatgctggatacttacatcaatattgacaggttctattgtgtttatatgcacattgggagctgatgaggatcggtctcgttgcccaaattgatttcseqidno.3catgccactttcccttgtagactgttccaaatgatccagatccaattctttgtcccactgtaatctgcccatcaggaatctcccaatcatcactcgagtcccgtctaccaagtgttttct2.egfr驱动突变探针序列seqidno.4gcagcctccgccccccgcacggtgtgagcgcccgacgcggccgaggcggccggagtcccgagctagccccggcggccgccgccgcccagaccggacgacaggccacctcgtcggcgtccgseqidno.5cccgagtccccgcctcgccgccaacgccacaaccaccgcgcacggccccctgactccgtccagtattgatcgggagagccggagcgagctcttcggggagcagcgatgcgaccctccgggseqidno.6acggccggggcagcgctcctggcgctgctggctgcgctctgcccggcgagtcgggctctggaggaaaagaaaggtaagggcgtgtctcgccggctcccgcgccgcccccggatcgcgcccseqidno.7tgcatttctcagtatttcatgtgatatctgtctttttcttccagtttgccaaggcacgagtaacaagctcacgcagttgggcacttttgaagatcattttctcagcctccagaggatgttseqidno.8caataactgtgaggtggtccttgggaatttggaaattacctatgtgcagaggaattatgatctttccttcttaaaggttggtgactttgattttcctacacaaataaaattggagaaaatseqidno.9atcacgcatttatgttttctcttcttagaccatccaggaggtggctggttatgtcctcattgccctcaacacagtggagcgaattcctttggaaaacctgcagatcatcagaggaaatatseqidno.10gtactacgaaaattcctatgccttagcagtcttatctaactatgatgcaaataaaaccggactgaaggagctgcccatgagaaatttacagggtgagaggctgggatgccaaggctggggseqidno.11ggaatttaaaggagctggaaagagtgctcaccgcagttccattctcccgcagaaatcctgcatggcgccgtgcggttcagcaacaaccctgccctgtgcaacgtggagagcatccagtggseqidno.12cgggacatagtcagcagtgactttctcagcaacatgtcgatggacttccagaaccacctgggcagctgtaagtgtcgcatacacactatctctgcctccagctcctatgggggacagctcseqidno.13atgcatctattacttttacatttcaggccaaaagtgtgatccaagctgtcccaatgggagctgctggggtgcaggagaggagaactgccagaaacgtaagtcagtgaacagcctcagaccseqidno.14tgaccaaaatcatctgtgcccagcagtgctccgggcgctgccgtggcaagtcccccagtgactgctgccacaaccagtgtgctgcaggctgcacaggcccccgggagagcgactgcctggseqidno.15gctgagtgtacttacctcacttgcccagcgtgtcctctctcctccataggtctgccgcaaattccgagacgaagccacgtgcaaggacacctgccccccactcatgctctacaaccccacseqidno.16cacgtaccagatggatgtgaaccccgagggcaaatacagctttggtgccacctgcgtgaagaagtgtccccgtgagtcctcctctgtgggccctctaactggtcaggcatccttgtcccgseqidno.17aggtaattatgtggtgacagatcacggctcgtgcgtccgagcctgtggggccgacagctatgagatggaggaagacggcgtccgcaagtgtaagaagtgcgaagggccttgccgcaaaggseqidno.18agctattcttaatccaacaaatgtgaacggaatacacgtctctcttatctctgcagtgtgtaacggaataggtattggtgaatttaaagactcactctccataaatgctacgaatattaaseqidno.19acacttcaaaaactgcacctccatcagtggcgatctccacatcctgccggtggcatttagggggtgagtcacaggttcagttgcttgtataaagaaaaacaaaatctgcctttttaactgseqidno.20aatcaccctgttgtttgtttcagtgactccttcacacatactcctcctctggatccacaggaactggatattctgaaaaccgtaaaggaaatcacaggtttgagctgaattatcacatgaseqidno.21catctgccttacagggtttttgctgattcaggcttggcctgaaaacaggacggacctccatgcctttgagaacctagaaatcatacgcggcaggaccaagcaacagtaagttgaccacagseqidno.22ttttcttctctccaatgtagtggtcagttttctcttgcagtcgtcagcctgaacataacatccttgggattacgctccctcaaggagataagtgatggagatgtgataatttcaggaaacseqidno.23aaaaatttgtgctatgcaaatacaataaactggaaaaaactgtttgggacctccggtcagaaaaccaaaattataagcaacagaggtgaaaacagctgcagta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acaaaccacttcseqidno.177ttattaagtgaaattattcatgtgctttcagtttcatctttctcctgggaaagccccaaaacaggcctctggaaaaccaatttcatacatgtacaaaatggcatctgctctcaaatagatseqidno.178cacaaatttgaatacaaatggaagttcattgaatattaggtttatcagtaagctaggggaaacaaattacatacattgtataggtagtaacctatgaaaaaagtggagattaggtaaaaaseqidno.179tgtaatttgttaatatactatatttgaggtttgaaaatcactgatcacagctattaaataacaatgcaccaaagttttacaatatttgaacatctgcaaatgtagagctttctggtatgaseqidno.180tttactcaactgaaataatcaagcccctattgctgtgggggaagctgtagagggtggggtgagaaggggattgaaggcaattatatacatcattaagataccatgatatacagtgaaaaseqidno.181aaattaacaggaatgagaatacatttccaaacttgtcctaccttgaaagtggctcttttctgacaaaactttaaaagtatctgtaaaaaaagaacagaaaccatgtccttattaactagtseqidno.182agttttttcattcggtactggcgtatttctcttaccagtgtgtaaaaagcatcttcaacaccctataaaaggaaaaaatgaaaaaaaatgagagagctagctcaacggacacaatccaaaseqidno.183aaattgcccaatactatatactaagatttgtaattatgccaagaaaccatatgctcaccttgttacatcaccacacatggcaatcccatacaaccctgagtcccatcatcactgctgttgseqidno.184tccttgttggcaaatcacacttgtttcccactagcaccataggtacatcatccgagtcttttactcgcttaatctgctccctaaaaacgggaatatattatcagaacataagaaaaacaaseqidno.185gatgcaaactcttgcacaaatgctgaaagctgtaccatacctgtctggtcttggctgaggtttcaatgaatggaatcccgtaactcttggccagttcgtgggcttgttttgtatcaactgseqidno.186ccttgttggcaaatcacacttgtttcccactagcaccataggtacatcatccgagtcttttactcgcttaatctgctccctaaaaacgggaatatattatcagaacataagaaaaacaagseqidno.187atgcaaactcttgcacaaatgctgaaagctgtaccatacctgtctggtcttggctgaggtttcaatgaatggaatcccgtaactcttggccagttcgtgggcttgttttgtatcaactgtseqidno.188atggcactgtactcttcttgtccagctgtatccagtatgtccaacaaacaggtttcaccatctataaccacttgttttctgtaagaatcctgggggtgtggagggtaagggggcagggagseqidno.189tcctttcagagaaaataatgctcctagtacctgtagaggttaatatccgcaaatgacttgctattattgatggcaaatacacagaggaagccttcgcctgtcctcatgtattggtctctcseqidno.190ttcccaacaccacctgctccaaccaccaccagtttgtactcagtcatttcacaccagcaagaacctgttggaaaccagtaatcagggttaattggcgagccacatctacagtactttaaaseqidno.191gatgatccgacaagtgagagacaggatcaggtcagcgggctaccactgggcctcacctctatggtgggatcatattcatctacaaagtggttctggattagctggattgtcagtgcgcttseqidno.192ctacgtaatcagtcggcgccccaggcgcctgagtccccgccccggccacgtgggcctccgaaccacgagtcatgcggcaggccgcacccagacccgcccctcccacacgggacgtttcaaseqidno.193cctcaagctccactgcctctgctttggacagatttaggaccacagccgggaaaaatgttggagaccccggaaccgccatgaacagcccccaccaaggagcggcacttccggccccgcccg6.pik3ca驱动突变探针序列seqidno.194gttttataatttagactagtgaatatttttctttgttttttaaggaacactgtccattggcatggggaaatataaacttgtttgattacacagacactctagtatctggaaaaatggcttseqidno.195tgaatctttggccagtacctcatggattagaagatttgctgaaccctattggtgttactggatcaaatccaaataaagtaaggtttttattgtcataaattagatattttttatggcagtseqidno.196atccagaggggaaaaatatgacaaagaaagctatataagatattattttattttacagagtaacagactagctagagacaatgaattaagggaaaatgacaaagaacagctcaaagcaatseqidno.197ttctacacgagatcctctctctgaaatcactgagcaggagaaagattttctatggagtcacaggtaagtgctaaaatggagattctctgtttctttttctttattacagaaaaaataactseqidno.198tttgagcaaagacctgaaggtattaacatcatttgctccaaactgaccaaactgttcttattacttataggtttcaggagatgtgttacaaggcttatctagctattcgacagcatgccaseqidno.199aatctcttcataaatcttttctcaatgatgcttggctctggaatgccagaactacaatcttttgatgacattgcatacattcgaaagaccctagccttagataaaactgagcaagaggctseqidno.200tttggagtatttcatgaaacaaatgaatgatgcacatcatggtggctggacaacaaaaatggattggatcttccacacaattaaacagcatgcattgaactgaaaagataactgagaaaaseqidno.201atgaaagctcactctggattccacactgcactgttaataactctcagcaggcaaagaccgattgcataggaattgcacaatccatgaacagcattagaatttacagcaagaacagaaataseqidno.202aaaatactatataatttaaataatgtaaacgcaaacagggtttgatagcacttaaactagttcatttcaaaattaagctttagaataatgcgcaatttcatgttatgccttaagtccaaaseqidno.203aaaggtaaactttgaagattgtttgtatctttttttaaaaaacaaaacaaaacaaaaatccccaaaatatatagaaatgatggagaaggaaaaagtgatggttttttttgtcttgcaaatseqidno.204tgttctatgttttgaaatgtggacacaacaaaggctgttattgcattaggtgtaagtaaactggagtttatgttaaattacattgattggaaaagaatgaaaatttcttatttttccattseqidno.205tgctgttcaatttatagtttgaagtgggtttttgactgcttgtttaatgaagaaaaatgcttggggtggaagggactcttgagatttcaccagagactttttctttttaataaatcaaacseqidno.206ccttttgatgatttgaggttttatctgcagttttggaagcagtcacaaatgagacctgttataaggtggtatttttttttttcttctggacagtatttaaaggatcttattcttatttccseqidno.207ccagggaaattctgggctcccacaaagtaaaaaaaaaaaaaaatcatagaaaaagaatgagcaggaatagttcttattccagaattgtacagtattcaccttaagttgattttttttctcseqidno.208ccttctgcaattgaactgaatacatttttcatgcatgttttccagaaaatagaagtattaatgttattaaaaagattattttttttattaaaggctatttatattatagaaactatcattseqidno.209taatatatattctttatttacatgatctgtcccatagtcatgcattgttttgcaccccaaattttttattgttcatagcagcatggtcagctttcttcttgatctatagatgaggctcagseqidno.210ggcactatcccatttataccaataaccagtgtataactacttaaggaaaacataaaaacttcatcttctttccttttatttcttatgtgaatctcccgtcttccattctcttttataattseqidno.211tgagaatgtctcaatcatatgaaattagttaccagaattaacacaatttagactatcttcctgattccttaaacccctttactgaagtatactcatgaataatactttaaaatatgggggseqidno.212gaatagaaaccatgaactttttacctttttaaactatttatccatatctccaaagtagaacattaaaccattttaagatatgtctcattcccaagtagtcagagctcactctccaactttseqidno.213tattaaatactatttgagcacaggacacattcttaaacattttgaaaaacattaacccaagatgtagaggctactgctagtcgtcattctagaatctgatattttactctgtatttgaaaseqidno.214atgaatgattaatgtcctaggaaattagctttagcagatgtccaggtgccacatcaaaaaagtgcaataattattgacagttttttagattaggcatattattggaaaacaactttataaseqidno.215aagagtgaacattgtatactctagtaaaacagcatcactttaaaaatattcatttatgaaatctgttacctatagttgaagtcttgagtagtgaacaagggactctaataccaatactctseqidno.216ttaatatctggctattttagatcccttaaagggcataattattggaaatttaggtatttcactaaagcatgtatataatattgccaacaagaaaagtaaatttgaagattaagggaacttseqidno.217tacttctgcaaactgtcttgcgatagttaagcagaatttaaactctgttttaagcaggaaaccagaaagattattttgcagttgtagaagatttcataacttattaaaacttattaacatseqidno.218ttttgtgttgtttagatataggcagttgatacatactaacatcccagccttttcaatatcagggttaaattataggaaaactcagtaaaatggtacaaatctgaaagtttgatggtagaaseqidno.219aactgaagatttaacagagaactgtgttttacccgagtgccaaaaatgctgtgagcctccttgcacaaaatttataccacttttgcatttttatctatcagtccagatagttgtctccccseqidno.220ctccttctcccaggacctctccaccattaaaatgcacaaaccacatggccgatttcaccatttacatttattttcaaaagttactacaaccaaattaattctattagaagaaatgtagacseqidno.221caaattctataaagactatagattgtgacctaagaaagaaatgaggcaaagaaccaaacattgaattaaatgctacatgggtgactaagatctgtttcaagtcagtgataatatagccacseqidno.222cttctgggtacttcagtatcagagatcagttctcgtggtttagacagttcctatctatagctgactatccttgtccttgaatatggtgtaactgactattggctctacagttttattgggseqidno.223gccacttaagaaatatttccttgaataattattttgagaaaaagtctaaaagtaataaaaataattttaaacacactgtagtaagaaatgactgttggaaaattatgctttcactttctaseqidno.224accatattctcagctatacaaaaccatttattttgaagatttttagactactgttaatttgaaatctgttactcttattgtggaatttgtttttttaaaaaagatgtttctaattggattseqidno.225ttttaaaagaagaatggaatttggttgctattttacaatagaacctaagctttttgtggttcttagtgtcctatgtaaaacttagtgtcaaagtaatcaactttgagattttcccttctaseqidno.226attctgctttatattaaaagcccattagaaaatgggaacctggtgaatatataatgaattgtaaaatattttaatgtgtaactttttcaactgtgaaactgacttgattttttgatgaaaseqidno.227aacagctgctgataaagtattttgtgtaaagtgtagttcttattaatcaggaaaatgatgacttgattagactgtatatgccctcttggattttattttaaatggattggtgactttcacseqidno.228cataggtaaaacacagtccatctgtattcttttttccatcaaaaatcgagtgatttggaattataaaaaaattgtgagcagcctatttgaaaggcatcatggaaatttcacagcacaataseqidno.229aacacggatttgttttttcttaatgatgtaaatccgtttaattcatactttgatcaatagcccatgcttgccaactctgaagaaatttaatttccagcagtattttaaagctagcctgttseqidno.230taactttttctgaatatttaaagttcctcttttttctatgtctgcacaaactgcagacctgggctggacccacatactcaagagtccaccttaagaaattattttgatgtccaagacatcseqidno.231cactaaaatatttaagtttaaagataatatgtggtgttaatagattgtggtgcttttactatttaaagacaactttcatacttcagatgtttttgagaagaggggaatgtgaggggagggseqidno.232gggcagaacagggaggagttgtttgaatgaattacattctttatatccatcctgctcatttggggcatgtctttaagagaaggctgaaagttgtgagagtatattgtataccgtaagagaseqidno.233aatcaactcttcatcatggatgggattgtgaaggctgaactataaaattcagcattgacagcatcctcaattaataattcttggtgacagaataatacagctgggctgttttttaaaataseqidno.234cattaaaaattgtaaatatatctatgtgccatggcctgggaagcctgctttcttttttcataaaaattatttttactgtatgaaaagatcatggggtttagctcaaaatatctgtggtccseqidno.235tgataaaattggattggtaactctacctcagaaggaaaatgggaaaaaaaaatagatgagtcacaattcaatacttcaagctcagaaactgtgcagatcactgaattttagatttataaaseqidno.236gtcagagttggcatgccttgtttttaatgatatggaagaccttaagaaaaaaacttggctgaagtttaatcgttggtccagccatttgaaaaaggcaatagtttgaggaggttcccgaatseqidno.237tcggcatttgaaattcattttgttctctcttcttcattattagtgcatttggtgtgtgtatacttgcacacaattctgtttgtgtacacactgcttgcttagccctagtcaagaggcatcseqidno.238ttttataaaaggtgtaaagaaatatcaaggttctaaaattcggaagagtttagaatttattaggagtttcccaagttgggatgttagtctttaaataaacttcatgcacctattccacttseqidno.239aaggttttgcacctcctttttattagtgcagtgccatttcttctgcttgattttaggtatgttaatattccagccttgctagttagcataaagtgacaggtgtgagccatgaggaaatttseqidno.240tctgacttaatttgtacacaactacatataagagttttagtggaggaaaaaaattagtcccttgtgcgtatacagtagttaggtaaatgatttttctaccaacagtatactccattcctcseqidno.241atgtaggtaagtacagaaaaggtttttaaatgtatttttttagccagttaaagtctatgaatctatctgcaaccttatttaatctgtcactataataattttgtggttatgctaagaaccseqidno.242atgtatacttttaggtattcttatttttgtcaatttttctaggttggcaaggaggcagaaaaccttcattgtttcatattaaaatataattagactaaacttaattctagtatgaatttcseqidno.243caaaatcattatctatttatttcatttttatttaattttgtttttatttcatttttaaaagtcccttgttcaatttaacttatgttcctaagagaggttggagaacttggccttcatctgseqidno.244atttcaaaaatgttttgagtttcaaatgaagttaatggtttcagtgtgattcagtcctcagacctaattgggttgaataaaatctaaaagaatatacccttttggagcataacattttaaseqidno.245taccttggggaatgtggcactaccaaaagaagactactaacacgtcagatgttcacctggaagctttatcaagaaattcgaaccacccttttggccccattaattgtagcaagtttatttseqidno.246ctctatattttgtcattcagtgaattgaagtcctgtggtatactgcattcattagaagaaaaacgtttttaatgtccttttaatgatggcccagaaagcatttgacacagcaagatgcatseqidno.247gtgttactatattgagaatatagaataataacagtatcactaaatttaagacctcttcccagtcttgctgttcctagcaagaagtttggcctgtgactgcacttactgtttatgctcatcseqidno.248agaaactgtcaatgtctgcttttctttaactctgcagtctgtaacatcacgctgtttattaaaaaaaaaaagaaaaattactttttgtgtccaaacaatccttagtgtactacataagca7.tp53化疗药物基因探针seqidno.249gatcgatataaaaatgggatataaaaagggagaaggaggggaagggtggggtgaaaatgcagatgtgcttgcagaatgtaaaagatgttgacccttccagctggacgtggtggctcacaaseqidno.250tcaggtggctgcttcccagcacctcctcactcacccctgcacctgctgaccccagtagcctgcactggcgttcacccctcagacacacaggtggcagcaaagttttattgtaaaataagaseqidno.251gctgcccaactgtagaaactaccaacccaccgaccaacagggagagggaacaagcaccctcaagggggtcaagttctagaccccatgtaataaaaggtggtttcaaggccagatgtacatseqidno.252gggatggggtgagatttccttttaggtactaaggttcaccaagaggttgtcagacagggtttggctgggccagcagagacttgacaactccctctacctaaccagctgcccaactgtagaseqidno.253gaaaaaaaaaaaaaaaaaagaaaaaagaaattgaccctgagcataaaacaagtcttggtggatccagatcatcatatacaagagatgaaatcctccagggtgtgggatggggtgagattseqidno.254cagtggggaacaagaagtggagaatgtcagtctgagtcaggcccttctgtcttgaacatgagttttttatggcgggaggtagactgaccctttttggacttcaggtggctgtaggagacaseqidno.255gccccgggacaaagcaaatggaagtcctgggtgcttctgacgcacacctattgcaagcaagggttcaaagacccaaaacccaaaatggcaggggagggagagatgggggtgggaggctgtseqidno.256atttcttacatctcccaaacatccctcacagtaaaaaccttaaaatctaagctggtatgtcctactccccatcctcctccccacaacaaaacaccagtgcaggccaacttgttcagtggaseqidno.257tatgggccttgaagttagagaaaattcaacagtgagggacagcttccctggttagtacggtgaagtgggcccctacctagaatgtggctgattgtaaactaacccttaactgcaagaacseqidno.258cactcacctggagtgagccctgctcccccctggctccttcccagcctgggcatccttgagttccaaggcctcattcagctctcggaacatctcgaagcgctcacgcccacggatctgcagseqidno.259taagaggtcccaagacttagtacctgaagggtgaaatattctccatccagtggtttcttctttggctggggagaggagctggtgttgttgggcagtgctaggaaagaggcaaggaaaggtseqidno.260tgcgccggtctctcccaggacaggcacaaacacgcacctcaaagctgttccgtcccagtagattaccactactcaggataggaaaagagaagcaagaggcagtaaggaaatcaggtcctaseqidno.261gcataactgcacccttggtctcctccaccgcttcttgtcctgcttgcttacctcgcttagtgctccctgggggcagctcgtggtgaggctcccctttcttgcggagattctcttcctctgseqidno.262ctgacctggagtcttccagtgtgatgatggtgaggatgggcctccggttcatgccgcccatgcaggaactgttacacatgtagttgtagtggatggtggtacagtcagagccaacctaggseqidno.263gacctcaggcggctcatagggcaccaccacactatgtcgaaaagtgtttctgtcatccaaatactccacacgcaaatttccttccactcggataagatgctgaggaggggccagacctaaseqidno.264cgggtgccgggcgggggtgtggaatcaacccacagctgcacagggcaggtcttggccagttggcaaaacatcttgttgagggcaggggagtactgtaggaagaggaaggagacagagttgseqidno.265tgtcgtctctccagccccagctgctcaccatcgctatctgagcagcgctcatggtgggggcagcgcctcacaacctccgtcatgtgctgtgactgcttgtagatggccatggcgcggacgseqidno.266cctgggtcttcagtgaaccattgttcaatatcgtccggggacagcatcaaatcatccattgcttgggacggcaagggggactgtagatgggtgaaaagagcagtcagaggaccaggtcctseqidno.267gaagggacagaagatgacaggggccaggagggggctggtgcaggggccgccggtgtaggagctgctggtgcaggggccacggggggagcagcctctggcattctgggagcttcatctggaseqidno.268cattgaagtctcatggaagccagcccctcagggcaactgaccgtgcaagtcacagacttggctgtcccagaatgcaagaagcccagacggaaaccgtagctgccctggtaggttttctggseqidno.269cctccaggtccccagccctccaggtccccagcccaacccttgtccttaccagaacgttgttttcaggaagtctgaaagacaagagcagaaagtcagtcccatggaattttcgcttcccacseqidno.270tccactcacagtttccataggtctgaaaatgtttcctgactcagagggggctcgacgctaggatctgactgcggctcctccatggcagtgacccggaaggcagtctggctgctgcaagagseqidno.271ctgctccctggacggtggctctagacttttgagaagctcaaaacttttagcgccagtcttgagcacatgggaggggaaaaccccaatcccatcaacccctgcgaggctcctggcacaaagseqidno.272gactcagagaggactcatcaagttcagtcaggagcttacccaatccagggaagcgtgtcaccgtcgtggaaagcacgctcccagcccgaacgcaaagtgtccccggagcccagcagctac8.ugt1a1化疗药物基因探针seqidno.273tggcacttggtaagcacgcaatgaacagtcatagtaagctggccaagggtagagttcagtttgaacaaagcaatttgagaacatcaaaggaagtttggggaacagcaagggatccagaatseqidno.274ggggtacagttgtgttcttttctttctaaaaggctttctaaaaagccttctgtttaatttctggaaaagaagcctaacttgttcactacatagtcgtccttcttcctctctggtaacactseqidno.275tagtcacgtgacacagtcaaacattaacttggtgtatcgattggtttttgccatatatatatatataagtaggagagggcgaacctctggcaggagcaaaggcgccatggctgtggagtcseqidno.276cagcagaggggacatgaaatagttgtcctagcacctgacgcctcgttgtacatcagagacggagcattttacaccttgaagacgtaccctgtgccattccaaagggaggatgtgaaagag该检测试剂盒的用药指导方案，包括：braf、egfr、kras、met、nras、pik3ca驱动性基因突变及tp53和ugt1a1化疗药物相关基因突变的用药指导方案。(1)携带brafv600e突变的非小细胞肺癌对braf抑制剂达拉非尼联合mek抑制剂曲美替尼敏感。但携带brafg466v、g469a、y472c等非v600e突变的非小细胞肺癌可能对当前选择性braf抑制剂不敏感。(2)携带egfr活化突变(如外显子18、19、20和21)的非小细胞肺癌对第一代和第二代egfr-tki敏感。携带egfrt790m突变的非小细胞肺癌可能对第一代和第二代egfr-tki耐药，但对第三代egfr-tki敏感。携带egfr20号外显子插入突变的非小细胞肺癌可能对现有egfr-tki都不敏感。携带egfr扩增的肺鳞癌可能对抗egfr抗体联合化疗vs单纯化疗更加敏感。(3)携带kras突变的非小细胞肺癌可能对egfr-tki等目前靶向治疗药物耐药。(4)携带met14号外显子可变剪切突变的晚期非小细胞肺癌对met抑制剂敏感。携带met拷贝数高水平扩增的非小细胞肺癌可能对met抑制剂敏感。(5)携带nras突变的可能对mek抑制剂敏感。(6)携带pik3ca基因突变(如外显子9和20)，主要靶向药是brparlisib(bkm120)。如果pik3ca发生激活突变，则可能对egfr靶点、her2靶点耐药，赫赛汀和易瑞沙、特罗凯效果欠佳。(7)tp53的rs1042522位点可预测对顺铂、卡培他滨、紫杉醇和奥沙利铂的敏感性。(8)ugt1a1的rs8175347和rs4148323可预测对伊立替康的毒副作用风险的高低。本发明还提供一种检测肺癌驱动性基因突变的检测试剂盒，包括：上述的6组共248条探针和2组共28条探针。本发明的有益效果是：本发明提供的探针特异性高，准确性好，最低检测限可达0.1％。可为寻找靶向治疗药物的肺癌患者提供用药依据；还可以为治疗过程中发生严重毒副作用、耐药等的肺癌患者更换治疗方案。具体实施方式下面通过具体实施例对本发明进行描述，应当指出的是下面实施例只用于对本发明的进一步说明，但并不能用作对本发明保护范围的限制，本领域的技术人员应当理解，基于本发明的技术前提下，做出的改进和变型也视为本发明的保护范围。本实施例中检测2例肺癌患者的新鲜全血样本及3种不同突变频率的标准品(0.1％、1％和5％)。本发明中样本的形式是可以提取核酸的任意形式的肿瘤样本，其中全血样本为优，包括但不限于组织样本，穿刺样本、血清和血浆；且组织样本包括但不限于石蜡包埋组织、新鲜组织和冰冻切片组织。本实施例中，与肺癌相关的基因筛选自nccn指南、cosmic数据库及药物相关数据库。具体基因如下：braf、egfr、kras、met、nras、pik3ca、tp53和ugt1a1。探针序列参考seqidno.1-seqidno.276。本发明采用建库杂交捕获的方法对本发明所涉及的探针进行验证，具体步骤如下：1样本的准备1.1分离血浆和血细胞将2例肺癌患者的新鲜全血样本分别离心3000rpm，5min，取上清至新的离心管中，再次将上清离心3000rpm,5min，取上清(血浆)保存于新的离心管中备用，做好标记(如不立即使用可放-20℃冻存)。1.2cfdna的提取严格按照磁珠法大体积游离核酸提取试剂盒说明书(天根，货号：dp710-01)从血浆中提取cfdna，qubit3.0检测浓度，无需进一步片段化。1.3gdna的提取和片段化1.3.1gdna的提取严格按照qiaampdnabloodminikit(qiagen，货号：163026054)从血细胞中提取gdna，qubit3.0检测浓度，琼脂糖凝胶电泳检测dna完整性。1.3.2gdna的片段化1.3.2.1提前打开打断仪，使其温度降至4℃。1.3.2.2取300ng的gdna加入到打断管中，使用1xidtebuffer补齐至80μl，涡旋混匀，瞬时离心1-3s。1.3.2.3设置5(run30s,stop30s)×3次的程序进行打断。1.3.2.4agilent2200检测打断后dna的片段大小(一般为200-300bp)。1.3.2.5将室温平衡30min后的ampurexpbeads(磁珠)涡旋混匀后取144μl至新的1.5ml离心管中，做好标记。1.3.2.6将片段化后的产物转移至步骤1.3.2.5中的1.5ml离心管中，涡旋混匀，室温孵育5min。1.3.2.7将步骤1.3.2.6的1.5ml离心管置于磁力架，静置直至溶液完全澄清，吸弃上清，注意避免吸到磁珠。1.3.2.8加入200μl新鲜配制的80％乙醇，室温孵育30sec，吸弃上清。1.3.2.9重复1.3.2.8。1.3.2.10将步骤1.3.2.9的1.5ml离心管微离心后静置于磁力架，吸弃残留溶液，开盖室温晾干直至乙醇完全挥发。1.3.2.11加入52μlnfw，涡旋混匀，室温孵育2min，置于磁力架，待溶液完全澄清后转移50μl上清至新的已标记好的0.2mlpcr管进入下一步反应。1.3.2.12取1μl用qubit3.0检测浓度。2文库构建2.1末端修复和3'端加“a”2.1.1取30ngcfdna/40ng标准品，用nfw补齐至50μl，涡旋混匀并离心。2.1.2在0.2mlpcrtube中配制以下反应体系:组分体积(μl)cfdna/gdna50endrepair&a-tailingbuffer7endrepair&a-tailingenzymemix3总体积602.1.3涡旋混匀，离心后进行以下反应:2.2加adapter2.2.1将上一步反应产物先离心，然后配制以下反应体系：组分体积(μl)endrepairanda-tailingreactionproduct60nfw5ligationbuffer30duplexseqadapters(3μm)5dnaligase10总体积1102.2.2涡旋混匀，离心后进行以下反应：步骤反应温度反应时间adapterligation20℃15minhold4℃∞2.3连接后纯化2.3.1将室温平衡30min后的ampurexpbeads(磁珠)涡旋混匀后取88μl至新的1.5ml离心管中，做好标记。2.3.2将接头连接后的产物转移至步骤2.3.1中的1.5ml离心管中，涡旋混匀，室温孵育5min。2.3.3将步骤2.3.2的1.5ml离心管置于磁力架，静置直至溶液完全澄清，吸弃上清，注意避免吸到磁珠。2.3.4加入200μl新鲜配制的80％乙醇，室温孵育30sec，吸弃上清。2.3.5重复2.3.4。2.3.6将步骤2.3.5的1.5ml离心管微离心后静置于磁力架，吸弃残留溶液，开盖室温晾干直至乙醇完全挥发。2.3.7加入22μlnfw，涡旋混匀，室温孵育2min，置于磁力架，待溶液完全澄清后转移20μl上清至新的已标记好的0.2mlpcr管。2.4pcr扩增2.4.1在0.2mlpcrtube中，配制以下反应体系：组分体积(μl)2xkapahifihotstartreadymix25udiprimermix(5μm/primer)5adapter-ligatedlibrary20总体积502.4.2涡旋离心，离心后进行以下反应2.5pcr产物纯化2.5.1将室温平衡30min后的ampurexpbeads(磁珠)涡旋混匀后取50μl至新的1.5ml离心管中，做好标记。2.5.2将pcr产物转移至步骤2.5.1中的1.5ml离心管中，涡旋混匀，室温孵育5min。2.5.3将步骤2.5.2的1.5ml离心管置于磁力架，静置直至溶液完全澄清吸弃上清，注意避免吸到磁珠。2.5.4加入200μl新鲜配制的80％乙醇，室温孵育30sec，吸弃上清。2.5.5重复2.5.4。2.5.6将步骤2.5.5中的1.5ml离心管微离心后静置于磁力架，吸弃残留溶液，开盖室温晾干直至乙醇完全挥发。2.5.7加入22μlnfw，涡旋混匀，室温孵育2min，置于磁力架，待溶液完全澄清后转移20μl上清至新的已标记好的1.5ml离心管中。2.5.8质检取1μldna文库溶液用qubit荧光定量仪检测浓度。3杂交3.1在1.5mlep管中配置如下反应：blockercomponentvolumeperreaction(μl)humancotdna5xgenblockingoligosbasedonyourlibraryadapters23.2混合文库2ug，加至步骤3.1的混合液中。3.3真空抽干。3.4配置下列体系于已真空干燥的样本ep管中hybridizationmastermixcomponentvolumeperreaction(μl)xgen2xhybridizationbuffer8.5xgenhybridizationbufferenhancer2.7xgenlockdownpanelorcustomprobes4nuclease-freewater1.8total173.5振荡,离心，重复两次。3.6进行以下pcr反应程序:4捕获。按照下表配置清洗buffer：按照下表配置beadresuspensionmixbeadresuspensionmixcomponentvolumeperreaction(μl)xgen2xhybridizationbuffer8.5xgenhybridizationbufferenhancer2.7nuclease-freewater5.8total174.1清洗链霉亲和素磁珠4.1.1振荡混匀磁珠，按每个捕获50μl吸取磁珠至同一1.5mlep管中。4.1.2按每个捕获加入100μlbeadwashbuffer，用枪吹打10次以上，放于磁力架静置，直至完全澄清，弃去上清。4.1.3重复4.1.2操作两次。4.1.4加入已配置的beadresuspensionmix，按照每个捕获17μl，吹打混匀，移至0.2mlpcr管中。4.2捕获4.2.1探针杂交结束后，迅速将梯度pcr仪程序调至下表4.2.2迅速将杂交后的样本全部转入步骤4.1.4中的含有beadresuspensionmix的0.2mlpcr管中，吹打混匀并离心。4.2.3将样本放入步骤4.2.1已设置好程序的pcr仪中，放置45min，每隔10-12min，取出快速振荡混匀，确保磁珠处于重悬状态。4.3热洗4.3.1恒温仪65℃预热1xwashbuffer1和1xstringentwashbuffer至少15min。4.3.2加入100μl预热的1xwashbuffer1至4.2.3的样本中，用枪快速吹打混匀，避免产生气泡。4.3.3置于磁力架至澄清，弃上清，移除磁力架。4.3.4加入150μl预热的1xstringentwashbuffer至样本，用枪快速吹打混匀，避免产生气泡。65℃孵育5min，置于磁力架至澄清，弃上清。4.3.5重复步骤4.3.4。4.4室温洗4.4.1向热洗步骤4.3.5中的样本加入150μlwashbuffer1，振荡离心。室温孵育2min，每30s振荡一次(不要太剧烈)，确保磁珠处于重悬状态。4.4.2孵育结束后，微离心。置于磁力架1min，至澄清，弃上清。4.4.3加入150μlwashbuffer2，振荡混匀。室温孵育2min，每30s振荡一次(不要太剧烈)，确保磁珠处于重悬状态。4.4.4孵育结束后，微离心。置于磁力架1min，至澄清，弃上清。4.4.5加入150μlwashbuffer3，振荡混匀。室温孵育2min，30s振荡一次(不要太剧烈)，确保磁珠处于重悬状态。4.4.6孵育结束后，微离心。置于磁力架1min，至澄清，弃上清。4.4.7用枪吸弃残余的washbuffer3，移除磁力架。4.4.8每个捕获加入20μlnfw，用枪吹打混匀，并转移至0.2mlpcr管中。5pcr扩增和纯化5.1pcr扩增5.1.1在各个捕获中加入如下体系5.1.2进行如下的pcr扩增5.2pcr产物纯化5.2.1提前配置好80％乙醇，每个捕获需要250μl。5.2.2每个捕获加入75μlampurexpbeads(amp)，用枪吹打混匀，室温孵育5-10min。置磁力架2-5min，至澄清，弃上清。5.2.3加入125μl80％乙醇，室温静置1min，弃上清。5.2.4重复步骤5.2.3。5.2.5室温干燥磁珠，大约1-3min。5.2.6待磁珠干燥完毕，移除磁力架，加入22μlte，吹打混匀。5.2.7室温孵育5min。置磁力架至澄清，转移20μl至新的1.5mlep管中保存。5.2.8文库质检使用qubit3.0和agilent2200进行检测。6.nextseq上机测序。7.数据分析结果两位患者样本的主要质量控制如表1所示：dna质量评估和测序质量评估均合格，可进行下一步数据分析。肺癌患者和标准品的数据分析结果如下：(1)一位肺癌患者的测序数据分析结果显示：(1)检测到egfr基因exon20存在c.2294t>g突变，导致所编码第765位上的缬氨酸(v)变为甘氨酸(g)。目前尚无专门针对该变异位点的药物，有被fda或cfda批准的该基因靶向药物。(2)ugt1a1基因的rs8175347位点基因型为杂合型，提示使用伊立替康的毒副作用风险较大(中性粒细胞减少症，腹泻，无力)。另外一位肺癌患者的测序数据分析结果显示：ugt1a1基因rs8175347位点(*28)基因型为杂合型，提示使用伊立替康的毒副作用风险较大；tp53基因的rs1042522位点基因型为杂合型，提示使用顺铂、卡培他滨、紫杉醇、奥沙利铂的敏感性可能较低。(2)三种标准品的检测结果如表2所示：等位基因频率分别为0.1％、1％和5％的已知突变位点均被检测出来。说明该检测试剂盒可以检测超低频突变的基因位点，最低检测限可达0.1％。表1：表2：基因已知突变位点预期的等位基因频率(％)检测的等位基因频率(％)egfrt790m5.04.7egfrdele746-a7505.01.8egfrl858r5.03.9egfrv769-d770insasv5.03.0pik3cae545k6.35.9krasg12d6.35.0egfrt790m1.00.52egfrdele746-a7501.00.19egfrl858r1.00.58egfrv769-d770insasv1.00.39pik3cae545k1.30.25krasg12d1.30.25egfrt790m0.10.0021当前第1页12