多巴胺能神经细胞的分离方法及包含利用其分离的多巴胺能神经细胞的用于治疗帕金森氏病的药剂学组合物与流程

本发明涉及多巴胺能神经细胞的分离方法及包含利用其分离的多巴胺能神经细胞的用于治疗帕金森氏病的药剂学组合物。

背景技术：

帕金森氏病(parkinsons'disease，pd)为最适合基于细胞的疗法(cell-basedtherapies)的由中脑多巴胺能(midbraindopaminergic，mda)神经细胞的局灶性变性(focaldegeneration)引起的神经退行性疾病之一。

自20世纪80年代早期以来，已经进行了欲通过将胚胎腹侧中脑(fetalventralmesencephalon，vm)组织移植到患者的纹状体(striatal)来恢复与帕金森氏病相关的运动机能的尝试。

虽然根据这些研究已经确认，通过移植片能够诱导运动技能的恢复，但每个研究机构的细胞移植结果都不一致，并且在某些情况下也会出现副作用，因此，之后已就应进一步改善基于细胞的疗法这一点达成共识。

尤其，在现有研究中已作为问题被指出，将作为移植材料的细胞发展到接近生物体中存在的细胞的水平，并改善胚胎组织有限的可溶性和不一致性(batch-to-batchinconsistency)等缺点，为此持续研究替代方案。

最终，在体外(invitro)表现出无限的增殖能力且对各种神经细胞具有广泛的分化能力的、包括胚胎干细胞(embryonicstemcells，escs)和诱导性多能干细胞(inducedpluripotentstemcells，ipscs)的人多能干细胞(humanpluripotentstemcell，hpscs)备受瞩目。

因此，直到最近，已经开发出各种中脑多巴胺能神经细胞分化技术，已达到可生产高收率细胞的水平，然而，通过最近开发的分化技术也观察到了在由人多能干细胞诱导分化的产物中除中脑多巴胺能神经细胞之外的其他种类细胞高度混合的异质性(heterogeneity)，基于目前的分化技术难以考虑进行临床应用。

因此，对来自各种细胞群的人多能干细胞-来源的中脑多巴胺能神经细胞的鉴别和分离对于移植细胞的标准化以及成功的移植治疗研究都非常重要。

另一方面，早期的用于提纯分离(浓缩)由人多能干细胞分化诱导的中脑多巴胺能神经细胞的方案是以将多表面抗原(multiplesurfaceantigens)作为靶的荧光激活细胞分选法(fluorescence-activatedcellsorting，facs)为基础的。这种接近法增加了用于表达酪氨酸羟化酶(tyrosinehydroxylase，th)的神经细胞群(neuronalpopulation)，但对于这种细胞群是否保留中脑多巴胺能神经细胞特性尚不明确。

最近，进行了发掘可以通过分析小鼠胚胎中脑腹侧组织及小鼠胚胎干细胞(mesc)-来源中脑多巴胺能神经前体细胞的转录物组(transcriptome)，来区分、浓缩中脑多巴胺能神经细胞的特异性表面标记物的研究。

这些研究提出几种潜在的细胞表面标记物，利用其可分离及浓缩多巴胺能神经细胞，但同时，对于应该发掘神经细胞发育过程中哪一阶段的神经细胞所表达的细胞表面标记物尚不清楚。所分离的神经细胞移植后的生存率或分化程度根据发育阶段而不同，业界普遍认为这会影响移植后的机能恢复，因此分化阶段-特异性标记物的发掘仍然是重要的课题。

为此，对于中脑多巴胺能神经细胞及其分化阶段的表面标记物的研究迫在眉睫。

技术实现要素：

本发明人致力于区分中脑多巴胺能神经细胞的分化过程，并开发各阶段的细胞表面标记物。最终，确立lmx1a-egfp及pitx3-mcherry报道人胚胎干细胞细胞株，并将其分化来分离lmx1a⁺中脑多巴胺能神经前体细胞和pitx3⁺中脑多巴胺能神经细胞，由此来发掘与中脑多巴胺能神经细胞相关联的细胞表面标记物(滋养层糖蛋白)，从而完成了本发明。

因此，本发明的目的在于，提供多巴胺能神经细胞(dopaminergicneuralcells)的制备方法。

本发明的再一目的在于，提供包含滋养层糖蛋白(tpbg，trophoblastglycoprotein)-阳性多巴胺能神经细胞的用于治疗帕金森氏病的药学组合物。

本发明的另一目的在于，提供增进用于帕金森氏病细胞移植治疗法的多巴胺能神经细胞的功效并提高移植安全性的方法。

本发明的还有一目的在于，提供包含滋养层糖蛋白(trophoblastglycoprotein)-阳性多巴胺能神经细胞的多巴胺能神经细胞移植用组合物。

本发明人致力于区分中脑多巴胺能(mda)神经细胞的分化过程，并开发各阶段的细胞表面标记物。最终，确立lmx1a-egfp及pitx3-mcherry报告人胚胎干细胞细胞株，并将其分化来分离lmx1a⁺中脑多巴胺能神经前体细胞和pitx3⁺中脑多巴胺能神经细胞，由此来发掘与中脑多巴胺能神经细胞相关联的细胞表面标记物(滋养层糖蛋白)。

更详细地，本发明人分别构建了在作为中脑多巴胺能神经前体细胞(progenitor)阶段-特异性基因的lmx1a表达的同时表达增强绿色荧光蛋白(egfp)的lmx1a-egfp报告人胚胎干细胞细胞株以及在作为早成熟中脑多巴胺能神经细胞(neuronal)阶段-特异性基因的pitx3表达的同时表达红色荧光蛋白(mcherry)的pitx3-mcherry报告人胚胎干细胞细胞株，并且通过对比分析lmx1a⁺中脑多巴胺能神经前体细胞和pitx⁺中脑多巴胺能神经细胞的转录物组，来筛选特异性地表达于中脑多巴胺能神经细胞的前体(神经前体细胞)的细胞表面标记物。其中，作为新的细胞表面标记物，发现了滋养层糖蛋白，并在以滋养层糖蛋白作为靶的细胞分离对结果中确认，中脑多巴胺能神经前体细胞浓缩。并且，在中脑多巴胺能神经前体细胞阶段，将通过磁激活细胞分离法(magnetic-activatedcellsorting，macs)分离的滋养层糖蛋白-阳性细胞移植到6-ohda-损伤帕金森氏病(pd)大鼠模型，结果确认，在帕金森氏病大鼠中，没有肿瘤形成，运动功能异常的症状恢复。

因此，滋养层糖蛋白是用于分离可移植的中脑多巴胺能神经前体细胞的新型表面标记蛋白，预期利用滋养层糖蛋白分离的mda细胞可提供用于治疗帕金森氏病的安全且有效的细胞替代疗法。

本发明涉及多巴胺能神经细胞的分离方法、包含利用其分离的多巴胺能神经细胞的用于治疗帕金森氏病的药剂学组合物、增进用于帕金森氏病的细胞移植治疗法的多巴胺能神经细胞的功效并提高移植安全性的方法以及利用其制备的多巴胺能神经细胞移植用组合物。

以下，对本发明进行更详细的说明。

本发明的一实施方式涉及包括以下步骤的多巴胺能神经细胞(dopaminergicneuralcells)的制备方法。

其中，包括：步骤(a)，使细胞群(population)与滋养层糖蛋白(trophoblastglycoprotein)抗体相接触；以及步骤(b)，对与滋养层糖蛋白抗体相结合的滋养层糖蛋白-阳性多巴胺能神经细胞进行分离。

在本发明中，“神经细胞(neuralcells)”为构成神经系统的细胞，能够以与神经元(neuron)相同的意义来使用，“多巴胺能神经细胞(dopaminergicneuralcells)”是指用于分泌作为神经传导物质的多巴胺(dopamine)的神经细胞。

上述多巴胺能神经细胞可以为多巴胺能神经前体细胞(dopaminergicneuralprogenitors或dopaminergicneuralprecursorcells)或成熟多巴胺能神经细胞(dopaminergicneurons)，但并不限定于此。

在本发明中，“神经前体细胞”是指尚未表达分化性状的未分化前体细胞，能够以与“祖细胞(progenitors)”，“前体(precursors)”及“前体细胞(precursorcell)”完全相同的意义来使用。

上述多巴胺能神经细胞可以为中脑多巴胺能神经细胞。

在本发明中，所谓的“中脑多巴胺能神经细胞”是指在中脑(midbrain)区域所观察到的多巴胺能神经细胞，例如，可以是在中脑腹侧(ventral)所观察到的多巴胺能神经细胞，但并不限定于此。

并且，上述中脑多巴胺能神经细胞可以通过a9区域特异性(a9region-specific)表达。

上述“a9区域”是指相当于中脑腹外侧(ventrolateral)区域中脑黑质(substantianigra)致密部(parscompacta)的部分，可知根据本发明的制备方法制备的细胞是中脑细胞。

并且，上述a9区域为多巴胺能神经细胞密集部位，与运动功能的调节相关，尤其，在帕金森氏病患者的情况下，具有该部位的多巴胺能神经细胞会特异性凋亡的特征，根据本发明的制备方法制备的细胞能够以预防和/或治疗帕金森氏病为目的来使用。

以下，对本发明的多巴胺能神经细胞的制备方法进行详细说明。

步骤(a)

上述“细胞群”可以包含人体干细胞(humanstemcells)、前体细胞(progenitors或precursors)、和/或由人体干细胞或前体细胞分化的多巴胺能神经前体细胞(dopaminergicneuralprogenitors)、成熟多巴胺能神经细胞(dopaminergicneurons)及源于此的神经衍生物(neuralderivatives)，但并不限定于此。

具体地，上述人体干细胞或前体细胞可以为胚胎干细胞(embryonicstemcells)、胚胎生殖细胞(embryonicgermcells)、胚胎癌细胞(embryoniccarcinomacells)、诱导性多能干细胞(inducedpluripotentstemcells，ipscs)、成体干细胞(adultstemcells)或胚胎细胞(fetalcells)，但并不限定于此。

上述胚胎细胞可以来源于胚胎神经组织(fetalneuraltissue)和或其衍生物(derivatives)，例如可以为胚胎腹侧中脑细胞(fetalventralmesencephaliccells，fvmcells)，但并不限定于此。

步骤(b)

上述“滋养层糖蛋白”以与wnt-活化抑制因子1(wnt-activatedinhibitoryfactor1)或waif1相同的意义来使用，已知为wnt/β-连环蛋白(catenin)信号传导通路的拮抗剂，但尚未有关于通过滋养层糖蛋白的表达来分离多巴胺能神经细胞的报道。

将上述基因的核苷酸序列表示在序列号53。并且，上述基因已登记在核苷酸序列的基因库，因此只要是本技术领域技术人员便可轻松得到。

在本发明中，所谓的“滋养层糖蛋白-阳性多巴胺能神经细胞”是指与滋养层糖蛋白抗体相结合的多巴胺能神经细胞。

上述“滋养层糖蛋白抗体”是指与滋养层糖蛋白特异性相结合的抗体。

在本步骤中，分离滋养层糖蛋白-阳性多巴胺能神经细胞的方法可以使用任何方法，只要是确定靶来分离细胞的方法即可，例如，可以使用荧光激活细胞分选法(facs)和/或磁激活细胞分离法(macs)，但并不限定于此。

上述滋养层糖蛋白-阳性多巴胺能神经细胞可以缓解帕金森氏病的症状。

上述滋养层糖蛋白-阳性多巴胺能神经细胞可以提高细胞移植治疗法的安全性。

本发明的再一实施方式涉及包含滋养层糖蛋白-阳性多巴胺能神经细胞的用于治疗帕金森氏病的药学组合物。

除有效成分之外，本发明的药学组合物可包含药剂学上可接受的载体。在此情况下，药剂学上可接受的载体为在制剂时常规使用的，包含乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露醇、淀粉、阿拉伯胶、磷酸钙、藻酸盐、明胶、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水、糖浆、甲基纤维素、苯甲酸盐、丙基羟基苯甲酸盐、滑石、硬脂酸镁和矿物油等，但并不限定于这些。并且，除了上述成分之外，还可包含润滑剂、润湿剂、甜味剂、调味剂、乳化剂、悬浮剂、防腐剂等。

本发明的药学组合物可以根据所意向的方法进行口服给药或非口服给药(例如，静脉、皮下、腹腔内或局部用药)，给药剂量可根据患者的状态、体重、疾病程度、药物形态、给药途径及时间而不同，但可以由本技术领域技术人员适当地选择。

本发明的药学组合物以药学上有效量来给药。在本发明中，“药学上有效量”是指以可用于医学治疗的合理的受益/危险比例来治疗疾病的充足的量。有效量可根据包括患者的疾病种类、疾病程度、药物的活性、药物敏感度、给药时间、给药途径及排出比例、治疗期限、同时服用的药物的要素以及其他医学领域周知的要素来确定。

本发明的药学组合物能够以单独治疗剂来给药或者与其他治疗剂联合给药，可以与现有治疗剂依次或同时给药，也可以单一或多种给药。全部考虑上述多个要素，重要的一点是以能够无副作用的、通过最少的量得到最大效果的量来给药，本领域的普通技术人员可以容易地确定这一点。

具体地，本发明的药学组合物的有效量可以根据患者的年龄、性别、状态、体重、体内活性成分的吸收度、惰性率及排泄速度、疾病种类、同时使用的药物而不同。

本发明的另一实施方式为涉及包括向个体给药上述滋养层糖蛋白-阳性多巴胺能神经细胞的步骤的帕金森氏病治疗方法。

上述“个体”是指需要进行疾病治疗的对象，更详细地，是指人类或非人类的灵长类、如小鼠(mouse)、狗、猫、马及牛等哺乳类。

本发明的还有一实施方式涉及上述滋养层糖蛋白-阳性多巴胺能神经细胞的帕金森氏病治疗用途。

就包含上述滋养层糖蛋白-阳性多巴胺能神经细胞的用于治疗帕金森氏病的药学组合物而言，考虑到本说明书的复杂性，将省略与上述多巴胺能神经细胞的制备方法重复的内容。

本说明的又一实施方式涉及包括以下步骤的增进用于帕金森氏病的细胞移植治疗法的多巴胺能神经细胞的功效并提高移植安全性的方法。

其中，包括：步骤(a)，将细胞群与滋养层糖蛋白-抗体接触；以及步骤(b)，对与滋养层糖蛋白抗体结合的滋养层糖蛋白-阳性多巴胺能神经细胞进行分离。

就增进上述多巴胺能神经细胞的功效并提高移植安全性的方法而言，考虑到本说明书的复杂性，将省略与上述多巴胺能神经细胞的制备方法重复的内容。

本发明的又一实施方式涉及包含滋养层糖蛋白-阳性多巴胺能神经细胞的多巴胺能神经细胞移植用组合物。

上述滋养层糖蛋白-阳性多巴胺能神经细胞可通过多巴胺能神经细胞的制备方法来培养。通过上述方法培养的滋养层糖蛋白-阳性多巴胺能神经细胞可增进细胞功效并提高移植安全性。

另一方面，上述多巴胺能神经细胞的移植可选定本领域普通技术人员公知的合适的移植部位(例如，脑的壳核“putamen”或尾状核“caudatenucleus”、或包括它们的纹状体“striatum”等)，可通过公知的方式(例如，脑立体定位系统“stereotacticsystem”等)在移植部位进行。

本发明的组合物可用于治疗帕金森氏病。

本发明的组合物作为移植细胞可仅包含多巴胺能神经细胞，或者除了有效成分(移植细胞)之外，可包含生物来源和/或生物降解性稳定剂。上述稳定剂用于稳定地分散上述多巴胺能神经细胞，为源自生物体的物质，体内移植时无副作用或者否则应具有生物降解性。在本发明中，生物降解性意味着在体内慢慢地分解、吸收的特性，对于分解速率没有特别意义。

作为上述稳定剂，可包括透明质酸、胶原蛋白、凝血酶、弹性蛋白、硫酸软骨素、白蛋白及其混合物。尤其，上述透明质酸、胶原蛋白、凝血酶、弹性蛋白、硫酸软骨素、白蛋白等作为源自生物体的物质，具有可以在生物体内自然分解的生物降解性性质。但是，在满足生物降解性和在介质中赋予粘度的特性的情况下，合成的化合物也为生物降解性物质，也可用于本发明，因此其不必限于源自生物体的物质。

在同时制剂化上述稳定剂和多巴胺能神经细胞的情况下，多巴胺能神经细胞能够以保留在介质中或不沉淀且均匀分散的方式存在。

就包含上述滋养层糖蛋白-阳性多巴胺能神经细胞的多巴胺能神经细胞移植用组合物而言，考虑到本说明书的复杂性，将省略与上述多巴胺能神经细胞的制备方法重复的内容。

本发明涉及多巴胺能神经细胞的分离方法及包含利用其分离的多巴胺能神经细胞的用于治疗帕金森氏病的药剂学组合物，上述多巴胺能神经细胞的分离方法包括分离滋养层糖蛋白-阳性多巴胺能神经细胞的步骤，根据本发明分离的多巴胺能神经细胞具有增进移植时细胞的功效及提高移植安全性的特征，因此可有效地用于细胞移植以治疗帕金森氏病。

附图说明

图1为本发明的多巴胺能神经细胞的制备方法的示意图。

图2为本发明一制备例的lmx1a-egfp人胚胎干细胞报告细胞株的制备方法的示意图。

图3为本发明一制备例的pitx3-mcherry人胚胎干细胞报告细胞株的制备方法的示意图。

图4为确认根据本发明一制备例制备的lmx1a-egfp人胚胎干细胞报告细胞株的中脑多巴胺能神经前体细胞分化过程的图。

图5为确认根据本发明一制备例制备的pitx3-mcherry人胚胎干细胞报告细胞株的中脑多巴胺能神经细胞(神经元)分化过程的图。

图6a及图6b为确认根据本发明一实施例分化的lmx1a-表达中脑多巴胺能神经前体细胞的特性的图。

图7a及图7b为确认根据本发明一实施例分化的lmx1a-表达中脑多巴胺能神经前体细胞的特性的图。

图8a及图8b为确认根据本发明一实施例分化的lmx1a-表达细胞的最终分化(terminaldifferentiation)后的特性的图。

图9a及图9c为确认根据本发明一实施例分化的pitx3-表达中脑多巴胺能神经细胞(神经元)的特性的图。

图10为确认根据本发明一实施例分化的pitx3-表达中脑多巴胺能神经细胞(神经元)的特性的图。

图11为对根据本发明一实施例分化的lmx1a-表达中脑多巴胺能神经前体细胞与pitx3-表达中脑多巴胺能神经细胞(神经元)的体外(invitro)细胞凋亡程度进行比较的图。

图12为示出对根据本发明一实施例分化的lmx1a-表达中脑多巴胺能神经前体细胞与pitx3-表达中脑多巴胺能神经细胞(神经元)进行转录物组分析的结果的图。

图13为示出对mda标记物的候选群进行鉴别的结果的示意图。

图14及图15为为了鉴别mda标记物的候选群的靶有效性的评价结果。

图16及图17为示出以mda标记物的候选群(corin、滋养层糖蛋白、cd47、alcam)为靶的磁激活细胞分离法结果的图。

图18为对于移植了根据本发明一实施例从人胚胎干细胞分离的滋养层糖蛋白-阳性细胞的帕金森氏病-动物模型，确认滋养层糖蛋白-阳性细胞移植后行为恢复的图。

图19为对于移植了根据本发明一实施例从人胚胎干细胞分离的滋养层糖蛋白-阳性细胞的帕金森氏病-动物模型，确认滋养层糖蛋白-阳性细胞移植后移植片的特性的图。

图20为对于移植了根据本发明一实施例从人胚胎干细胞分离的滋养层糖蛋白-阳性细胞的帕金森氏病-动物模型，确认与滋养层糖蛋白-阳性细胞移植后滋养层糖蛋白-阳性细胞移植片(graft)相比，未分类(unsorted)的细胞移植片中的细胞增殖可能性的图。

图21为确认根据本发明一实施例从人胚胎腹侧中脑细胞分离的滋养层糖蛋白-阳性细胞的特性的图。

图22为确认根据本发明一实施例从人诱导性多能干细胞分离的滋养层糖蛋白-阳性细胞的特性的图。

具体实施方式

以下，将通过实施例更加详细地说明本发明。这些实施例仅用于更详细地说明本发明，对于本领域的普通技术人员来说，根据本发明的要旨，本发明的范围不限定于这些实施例，这是显而易见的。

人胚胎干细胞(humanembryonicstemcells，hesc)培养

在丝裂霉素-c(mitomycin-c；美国西格玛奥德里奇(sigma-aldrich)公司出品，美国)层，以添加了20％的敲除血清替代物(knockout-serumreplacement，ksr；美国英杰(invitrogen)生命技术有限公司出品，美国)、1×非必需氨基酸(吉布科-赛默飞世尔科技(thermofisherscientific)公司出品，美国)、0.1mm的β-巯基乙醇(西格玛奥德里奇公司出品)以及4ng/ml的碱性成纤维细胞生长因子(basicfibroblastgrowthfactor，bfgf；安诺伦(r&dsystem)生物科技有限公司出品，美国)的达尔伯克改良伊格尔培养基(dulbecco'smodifiedeagle'smedium，dmem)/f12培养基(吉布科-赛默飞世尔科技公司出品)来培养未分化的人胚胎干细胞(h9，wicellinc.，美国)。

克隆细胞的基因型分析(genotyping)

使用dneasyblood&tissue试剂盒(凯杰(qiagen)公司出品，德国)根据生产商的提示来提取基因组dna。在geneamppcrsystem2720(应用生物系统-赛默飞世尔科技公司(appliedbiosystems-thermofisherscientific)出品)中，使用emeraldgtpcrmastermix(日本宝(takarabioinc.)公司出品，日本)来进行基因组dna聚合酶链式反应(pcr)。

荧光激活细胞分选法(facs)

使用bdfacsariaiii流式细胞分选仪和facsdiva软件(美国碧迪(bdbioscience)公司出品)来进行细胞分离。增强绿色荧光蛋白-阳性分级利用488nm激光根据荧光程度来确定，mcherry-阳性分级利用561nm激光根据荧光程度来确定。

磁激活细胞分离法(macs)

为了抑制抗体的非特异性结合，将细胞在1％的胎牛血清-磷酸盐缓冲溶液(fbs-pbs)中培养(4℃，30分钟)后，在4℃的温度下与第一抗体(参照下述表1)相结合30分钟。

表1

清洗后，一同培养第一抗体所标记的细胞与每1×10⁷细胞20μl的微珠(美天旎生物(miltenyibiotec)公司出品)。清洗后，将细胞悬浮液载入附着于磁性(magnetic)支架的分离柱(ls柱)(美天旎生物(miltenyibiotec)公司出品)。在柱清洗中将所通过的阴性0标记细胞单独收集到管，从磁性支架去除柱后，将柱内残留的阳性-标记细胞与培养基一同洗脱至另一个管。

免疫细胞化学(immunocytochemistry)分析

首先，将细胞固定在4％的多聚甲醛-磷酸盐缓冲溶液。

然后，为了顺利渗透到抗体的细胞质内，以0.1％的tritonx-100--磷酸盐缓冲溶液处理15分钟后，以2％的牛血清白蛋白(bsa)(bovogen，澳大利亚)--磷酸盐缓冲溶液在室温下反应1小时后，与第一抗体(参照上述表1)在4℃的温度下过夜结合。为了对与上述第一抗体相结合的蛋白质进行可视化，使用合适的荧光-标记第二抗体(molecularprobes-thermofisherscientific和vectorlaboratories，美国)。

最后，为了确认细胞核，封固在包含4'，6-二脒基-2-苯基吲哚的封固剂(vectorlaboratories)，使用安装有dp71数码相机的olympusix71显微镜(奥林巴斯(olympuscorp.)公司出品，日本)、奥林巴斯fsx100系统或lsm710共聚焦显微镜(卡尔蔡司(carlzeiss)公司出品，德国)来获取图像。

流式细胞分析法(flowcytometry)

使用accutase酶(默克密理博(merckmillipore)，德国)将细胞解离成单细胞后，使用4％的多聚甲醛-磷酸盐缓冲溶液进行固定。为了检测细胞内标记物，以1×perm/wash缓冲液(美国碧迪(bdbioscience)公司出品)穿透细胞膜，与核实的抗体一同在2％的牛血清白蛋白-磷酸盐缓冲溶液中培养一小时。使用了适合于上述抗体的荧光-标记第二抗体。以lsrii(美国碧迪(bdbioscience)公司出品)对流式细胞进行计数，从而使用flowjo软件进行分析。

基因表达(geneexpression)分析

使用easy-总提取试剂盒(intron生物科技(intronbiotechnology)有限公司，韩国)分离存在于细胞内的总核糖核酸(totalrna)。使用primescript^tmrtmastermix(日本宝(takarabioinc.)公司出品)从1μg的总核糖核酸合成互补脱氧核糖核酸(cdna)。使用premixextaqtm(日本宝(takarabioinc.)公司出品)和cfx96实时系统(real-timesystem)(伯乐(bio-rad)公司出品，美国)实时通过逆转录-聚合酶链反应(rt-pcr)分析对信使核糖核酸(mrna)水平进行定量化。各个靶基因的ct值根据甘油醛-3-磷酸脱氢酶(gapdh)的值来进行标准化，通过比较ct法来对分类(sorted)/未分类(unsorted)组合对照组进行靶基因的经标准化的表达水平比较。数据通过从3个独立的实验得到的平均相对偏差±平均标准偏差(sem)来表现。用于基因表达分析的引物序列在下述表2示出。

表2

微阵列(microarray)分析：转录物组分析

在macrogen(macrogeninc.，韩国)中处理/分析了各试样的10μg总核糖核酸，以昂飞(affymetrix)的人类u133plus2.0阵列来杂交试样。

实施例.中脑多巴胺能(mda)神经细胞的分化方案

具体的方案在图1示出。

在上述以菌落形态培养中的人胚胎干细胞处理2mg/ml的iv型胶原酶(沃辛顿生化(worthingtonbiochemicalcorp.)公司出品，美国)30分钟，从而诱导形成胚胎体，并在无碱性成纤维细胞生长因子的人胚胎干细胞培养基(拟胚体(eb)培养基)中进行培养。在此情况下，最初处理1.5％的二甲基亚砜(dmso；加州生化(calbiochem)-默克密理博(merckmillipore)公司出品)24小时，然后处理5μm的dorsomorphin(dm)(加州生化(calbiochem)-默克密理博(merckmillipore)公司出品)和5μm的sb431542(sb)(西格玛奥德里奇(sigma-aldrich)公司出品)4天。

从第5天(d5)起，将拟胚体附着于添加了20μg/ml的bfgf和20μg/ml的人胰岛素溶液(西格玛奥德里奇(sigma-aldrich)公司出品)的dmem/f12的1×n2补充培养基(bmn2培养基)内基质胶-涂敷培养碟，并处理图案化因子(1μm的chir99021(美天旎生物(miltenyibiotec)公司出品)及0.5μm的sag(加州生化(calbiochem)-默克密理博(merckmillipore)公司出品)6天。

在第11天(d11)，使用纤细地抽出(pulled)的玻璃吸管机械地断开拟胚体菌落内形成的神经rosetta菌株，所断开的神经rosetta菌株块通过滴管吸取，搓烂，再次附着到基质胶-涂敷培养碟。再次附着的细胞在添加了20ng/mlbfgf的dmem/f12的1×n2和1×b27培养基(bn2b27培养基)中，追加补充1μm的chem99021和0.5μm的sag来进行扩增(expanded)培养，并诱导中脑多巴胺能神经细胞特异性(specified)分化。

在第13天(d13)，利用accutase酶将中脑多巴胺能神经前体细胞簇分离成单细胞，并在无bfgf的n2b27培养基(n2b27培养基)中以3.12×10⁵细胞/cm的密度再次附着到基质胶-涂敷板上。以细胞占板总面积的近90％的程度扩增培养7天。

从第20天(d20)开始，在包含1×n2、0.5×b27和0.5×g21补充剂(geminibio-products，美国)的培养基(nbg培养基)中对具有中脑/腹侧的特性的中脑多巴胺能神经前体细胞进行培养。在此情况下，最初7天内添加1μm的dapt(西格玛奥德里奇(sigma-aldrich)公司出品)，之后添加10ng/ml的脑源性神经营养因子(brain-derivedneurotrophicfactor，bdnf；prospec-tanytechnogene，以色列)，10ng/ml的胶质细胞源性神经营养因子(glialcellline-derivedneurotrophicfactor，gdnf；prospec-tanytechnogene)，200μm的抗坏血酸(aa)及1μm的二丁酰环腺苷酸(db-camp)(西格玛奥德里奇(sigma-aldrich)公司出品)，进行最终分化。

制备例1.lmx1a-egfp报告细胞株(reporterline)的制备

具体的方案在图2示出。

1-1.核酸酶与捐赠者(donor)dna质粒的设计

talen-编码质粒从toolgen(toolgeninc.，韩国)购入。

设计talen位点，以在作为lmx1a基因的外显子9(exon9)的终止密码子的抗甲状腺球蛋白抗体(tga)附近(5'-tccatgcagaattcttactt-3'(左侧)，5'-tcacagaactctaggggaag-3'(右侧))中引起双链断链(double-strandbrsaks，dsb)，并使用cas-offinder(www.rgenome.net/)搜索潜在的脱靶(off-target)位点。

如下所示，通过质粒主链使用puc19在dh5α制作捐赠者dna质粒：5'同源臂(homologyarm)-内源性pitx3基因组片段(endogenouslmx1agenomicfragment)(左臂(leftarm))-t2a-egfp-bghpoly(a)-pgk启动子驱动的嘌呤霉素抗性盒(promoterdrivenpuromycinresistancecassette)-bghpoly(a)-3'同源臂(右臂(rightarm))。

1-2.lmx1a-egfp报告细胞株的制备

将灭活(inactivated)的sto上的人胚胎干细胞菌落移动到由stemmacs^tmips-brewxf完全培养基(默克密理博(merckmillipore)，德国)内人胚胎干细胞-适合基质胶(bdbiosciences，美国)涂敷的板上。然后，以细胞占板总面积的近80-90％的程度隔代培养(splitratio，1：5)。使用accutase酶解离成单细胞(singlecell)后，在最初24小时内移动到添加有rock抑制剂(10μm，y-27632)(calbiochem-merckmillipore)的培养基内基质胶-涂敷板，并每天更换新的培养基。实验中仅使用酶隔代培养小于10次的人胚胎干细胞。

使用accutase酶获取人胚胎干细胞，并制备单细胞悬浮液。然后，在neon转染试剂盒(100μl，invitrogen)的r缓冲液以1.0×10⁷细胞/ml的最终密度柔和地再悬浮。将120μl的经再悬浮的细胞与一对(各6μg)上述制备例1-1的talen-编码质粒和lmx1a捐赠者dna质粒(6μg)相混合，以850mv的电压施加脉冲30ms，从而进行电转染(electroporation)(neon电转染系统(neontransfectionsystem))。

然后，将细胞转移至2～3个预先接种了人胚胎干细胞培养基内小鼠胚成纤维细胞(sto)饲养(feeder)的35mm的板，并在最初48小时内添加rock抑制剂，并在2天后更换培养基，之后每天更换新的培养基。

电转染5天后，在上述人胚胎干细胞培养基处理0.5μg/ml的嘌呤霉素(西格玛奥德里奇(sigma-aldrich)公司出品)。10-14天后，将观察到嘌呤霉素抗性的菌落保留为报告细胞株候选，并对其进行隔代培养，来扩大细胞数量。

最终，通过对克隆性细胞的基因型分析来确定lmx1a-egfp报告细胞株。

制备例2.pitx3-mcherry报告细胞株的制备

具体的方案在图3示出。

2-1.核酸酶与捐赠者dna质粒的设计

从toolgen公司购入cas9-及sgrna(crispr/cas9)-编码质粒。

设计用于制备用于介导pitx3靶向的sgrna的序列，以在作为终止密码子的抗甲状腺球蛋白抗体(tga)附近引起双链断链(dsb)，以横向定位终止密码子抗甲状腺球蛋白抗体(5'-tacgggcggggccgctcatacgg-3'(下划线：pam))。使用cas-offinder(www.rgenome.net/)搜索潜在的脱靶位点。

如下所示，通过质粒主链使用puc19在dh5α制作捐赠者dna质粒：5'同源臂内源性pitx3基因组片段(左臂)-t2a-mcherry-bghpoly(a)-pgk启动子驱动的嘌呤霉素抗性盒-bghpoly(a)-3'同源臂(右臂)。

2-2.pitx3-mcherry报告细胞株的制备

除了使用cas9-及sgrna-编码质粒代替talen-编码质粒，使用pitx3捐赠者dna质粒代替lmx1a捐赠者dna质粒，并以100μg/ml的g418(calbiochem-merckmillipore)代替0.5μg/ml的嘌呤霉素来处理之外，以与上述制备例1-2相同的方法来制备pitx3报告细胞株。

实验例1.前体细胞(progenitor)阶段的鉴别：确认lmx1a-egfp报告细胞株

使用上述实施例的分化方案来分化在上述制备例1制备的lmx1a-egfp报告细胞株后，确认了分化过程(免疫细胞化学(immunocytochemistry)与血细胞计数(cytometry))。

在图4中可确认，在整个分化过程中观察到了中脑位置(区域(regional))标记物en1、中脑底板(floorplate)位置标记物foxa2、多巴胺能神经细胞谱系(lineage)标记物lmx1a以及egfp的表达。尤其，在分化的第20天(d20)，细胞群的～41.1％表现为egfp-阳性(egfp⁺)细胞，egfp⁺细胞同时表达en1和foxa2。也检测到上述3个标记物(en1、foxa2及lmx1a)全部为阳性反应的前体细胞(～46.6％en1⁺egfp⁺，～49.2％foxa2⁺egfp⁺)(参照图6)。

上述结果意味着，表达egfp的细胞为表达lmx1a的细胞(确立lmx1a报告细胞株)，人胚胎干细胞直接分化成呈现底板(foxa2)和中脑(en1)特性的中脑多巴胺能神经前体细胞。

实验例2.神经细胞(neuronal)阶段的鉴别：确认pitx3-mcherry报告细胞株

使用上述实施例的分化方案来分化在上述制备例2制备的pitx3-mcherry报告细胞株后，确认了分化过程(免疫细胞化学与血细胞计数)。

在图5中可确认，截至分化后第30天(d30)未观察到mcherry的表达，在分后后第40天(d40)观察到了mcherry-阳性(mcherry⁺)神经细胞(神经元)簇。另一方面，pitx3基因的表达模式与在整个分化(成熟)过程中报告mcherry相同，尤其，最终分化的中脑多巴胺能神经细胞(神经元)群体的～16％表现为同时表达发生未知和谱系标记物(en1、foxa2及lmx1a)的mcherry⁺细胞(参照图9)。

上述结果意味着，表达mcherry的细胞为表达pitx3的细胞(确立pitx3报告细胞株)，人胚胎干细胞直接分化成呈现底板(foxa2)和中脑(en1)及中脑多巴胺能(lmx1a)特性的中脑多巴胺能神经细胞(神经元)。

实验例3.确认lmx1a⁺细胞的特性

上述实验例1的d20的细胞暴露在10μm的y27632一小时后，使用accutase酶进行解离，然后使用细胞体(cellstrainer，bdscience)收集40μm以下的细胞。在添加有3％牛胚胎血清(fbs)(geminibio-products)和hank's平衡盐溶液(hbss；welgeneinc.，韩国)中的1×青霉素-链霉素(p/s)(gibco-thermofisherscientific)的lmx1a-sorting缓冲液(lmx1a-sb)，以2×10⁶细胞/ml的最终密度对经解离的前体细胞进行再悬浮，并进行细胞分离(facs)。比较未分类(unsorted)组、lmx1a^-组和lmx1a⁺组的mrna表达水平。

在图6a中可以确认，细胞分离后可能生存的细胞的～41.1％表现为lmx1a-egfp⁺(lmx1a⁺)分级。并且，lmx1a⁺和lmx1a-egfp^-(lmx1a^-)前体细胞维持与未分类的细胞相似的形态(morphology)。尤其，所分离的lmx1a⁺的～99.4％全表现为en和foxa2部为阳性。上述结果意味着，通过facs细胞分离的中脑多巴胺能神经前体细胞已分离。

并且，在图6b中可以确认，在lmx1a⁺组中，mda前体细胞-特异性基因(en1，foxa1，foxa2，lmx1a，lmx1b)的表达显著上调，但血清素前体细胞-特异性基因(nkx2.2)和红核(rednucleus，中脑的解剖学部位)前体细胞-特异性基因(sim1，lhx1，nkx6.1)的表达在未分类组和lmx1a^-组上调。上述结果意味着，通过facs细胞分离分离的lmx1a⁺细胞具有中脑多巴胺能神经前体细胞的特性。

进一步地，上述细胞分离(facs)后，对未分类组、lmx1a^-组和lmx1a⁺组额外进行体外(invitro)培养一天。

对于上述所培养的细胞，观察神经系统(neural)-特异性和增殖(proliferative)细胞-特异性标记物，并进行brdu分析，确认了细胞周期。

在图7a中可以确认，3个组全部表现出nestin-、sox1-、sox2-及ki67-阳性细胞相似。上述结果意味着，与未分类组和lmx1a^-组相同，经分类的lmx1a⁺细胞维持了神经前体细胞的特性和细胞增殖能力。

并且，在图7b中可以确认，在lmx1a⁺组中，在中脑多巴胺能神经前体细胞阶段中位于生存细胞的38.5±3.9％和49.5±6.2％位于g0/g1和s阶段，6±2.7％位于g2/m阶段。上述结果意味着，经分类的lmx1a+细胞为实际上循环细胞周期(cellcycle)的增殖细胞。

最后，上述细胞分离(facs)后，对未分类组、lmx1a-组和lmx1a⁺组额外进行最终分化(4周，d52)，之后比较中脑多巴胺能神经细胞-关联标记物的表达。

在图8a中可以确认，最终分化后，比较未分类组和lmx1a^-组，在lmx1a⁺组中，表达中脑多巴胺能神经细胞-关联标记物(th，nurr1，pitx3)的细胞的比例有所增加。上述结果意味着，lmx1a⁺细胞为可分化成中脑多巴胺能神经细胞的中脑多巴胺能神经前体细胞。

进一步地，对于通过上述最终分化而完全成熟的细胞(8周，d75)，确认了多巴胺能释放(release)程度。

具体地，用低kcl溶液(2.5mmcacl2、11mm葡萄糖、20mmhepes-naoh、4.7mmkcl、1.2mmkh2po4、1.2mmmgso4及140mmnacl)清洗细胞，并在低kcl溶液中培养2分钟。然后，用高kcl溶液(2.5mmcacl2、11mm葡萄糖、20mmhepes-naoh、60mmkcl、1.2mmkh2po4、1.2mmmgso4及85mmnacl)代替并再培养15分钟。将溶液收集到15ml的管并以2000rpm圆心分离1分钟来去除碎片(debris)，将上清液收集到1.5ml管，在-80℃的温度下保管。通过多巴胺elisa试剂盒(目录号(cat.no.)ka3838；abnova，中国台湾)根据生产商的提示来检测多巴胺的浓度。

在图8b中可以确认，最终分化后，比较未分类组和lmx1a^-组，在lmx1a⁺组中，多巴胺的释放增加。上述结果意味着，lmx1a⁺细胞为通过最终分化而形成的中脑多巴胺能神经细胞释放多巴胺的功能性中脑多巴胺能神经细胞。

实验例4.确认pitx3⁺细胞的特性

使用添加有5％的海藻糖的木瓜蛋白酶(papain；worthingtonbiochemicalcorp.)将上述实验例2的d40的细胞解离成单细胞后，依次使用70μm和40μm的细胞体来收集40μm以下的细胞。在添加有5％的牛胚胎血清、1×谷氨酰胺(glutamax；gibco-thermofisherscientific)、5％的海藻糖和hank's平衡盐溶液中的1×青霉素-链霉素的pitx3-sorting缓冲液(pitx3-sb)以1×10⁷细胞/ml的最终密度对经解离的前体细胞进行再悬浮，并进行细胞分离(facs)。并且观察了在细胞分离后额外进行36小时的体外培养后存活的细胞的形态。

在图9a中可以确认，细胞分离后可能生存的细胞的～16％表现为pitx3-mcherry⁺(pitx3⁺)分级。并且，在细胞筛选过程中，尽管有细胞消失，但在额外体外培养之后，存活的pitx3⁺和pitx3-mcherry^-(pitx3^-)细胞维持与未分类细胞相似的神经细胞(neuronal)形态。上述结果意味着，通过facs细胞分离的分离pitx3⁺细胞，3个组(未分类组、pitx3⁺组和pitx3^-组)全部表现出神经细胞-特异性形态。

然后，对在未分类组、pitx3^-组及pitx3⁺组中，上述d40细胞的中脑多巴胺能神经细胞-关联标记物的表达进行比较。

在图9b中可以确认，在pitx3⁺组中，神经细胞(神经元)-特异性基因(neun和map2)和中脑多巴胺能神经细胞(神经元)-特异性基因(pitx3、nurr1、th、dat及vmat2)的表达显著上调，但血清素前体细胞-特异性基因(htr2b)的表达下调。并且，在图9c中可以确认，在pitx3⁺组中，表达中脑多巴胺能神经细胞标记物th以及同时表达神经细胞-特异性标记物tubb3(tuj1)和map2的细胞的比例增加。上述结果意味着，pitx3⁺细胞为中脑多巴胺能神经细胞。

最后，上述细胞分离(facs)后，在额外培养未分类组后，在分化的第44天(d44)进行双标记免疫染色。

在图10中可以确认，pitx3⁺细胞表达成熟中脑多巴胺能神经细胞标记物nurr1、aadc、vmat2及dat。并且，表达了a9区域标记物kcnj6(girk2)，但为观察到表达a10区域标记物calb的细胞。上述结果意味着，通过本发明的分化方案分化的pitx3⁺细胞为成熟的中脑多巴胺能神经细胞。

实验例5.确认移植适合性(suitability)

利用上述实施例的分化方案分化上述制备例1的lmx1a-egfp报告细胞株和制备例2的pitx3-mcherry报告细胞株后，分别使用与上述实验例3和4相同的方法来将分化20天(d20)的中脑多巴胺能神经前体细胞及分化50天(d50)的成熟中脑多巴胺能神经细胞分离成单细胞。比较所分离的单细胞的体外(invitro)细胞凋亡程度。在此情况下，使用live/dead^tmfixablevioletdeadcellstain试剂盒(thermofisher)根据生产商的提示来确认了细胞凋亡。

在图11可以确认，在单细胞分离后观察到细胞凋亡的细胞在lmx1a⁺细胞中为约8％，在pitx3⁺细胞中为约30％。即，在分离成单细胞时，与pitx⁺中脑多巴胺能神经细胞相比，lmx1a⁺中脑多巴胺能神经前体细胞维持了较高的生存力，由此可知，lmx1a⁺细胞和pitx3⁺细胞对用于移植的单细胞分离过程表现出敏感性差异。上述结果意味着，与移植作为成熟神经细胞的pitx3⁺细胞相比，移植作为中脑多巴胺能神经前体细胞的lmx1a⁺细胞在细胞凋亡方面更有利。

实验例6.中脑多巴胺能(mda)标记物的鉴别

6-1.分析转录物组

利用上述实施例的分化方案分化上述制备例1的lmx1a-egfp报告细胞株和制备例2的pitx3-mcherry报告细胞株后，对分化20天(d20，中脑多巴胺能神经前体细胞阶段)的lmx1a⁺和lmx1a^-细胞以及分化40天(d40，中脑多巴胺能神经细胞阶段)的pitx3⁺和pitx3^-细胞进行分离，并对其进行了转录物组分析(microarray)(参照图12)。

另一方面，在上述中脑多巴胺能神经前体细胞阶段，观察到了表达egfp和细胞周期标记物(ki67、pcna及ph3)的细胞，在上述中脑多巴胺能神经细胞阶段，观察到了表达mcherry和中脑多巴胺能神经细胞标记物(th)的细胞、表达成熟神经细胞标记物(neun)的细胞，但是为观察到表达未成熟神经细胞标记物(neurod)和增殖细胞标记物(ki67)的细胞。

6-2.确认mda标记物的候选群(candidates)

基于上述结果确认了mda标记物的候选群。具体过程在图13示出。

对于上述所分离的4种细胞进行比较微阵列分析的结果，确认与lmx1a^-细胞相比，在lmx1a⁺细胞中上调(>2-fc)的基因以及与pitx3^-细胞相比，在pitx3⁺细胞中上调(>2-fc)的基因，并通过基因挖掘(genemining)，鉴别了它们中正在编码表面标记物的53个基因。经鉴别的53个基因包含因小鼠中脑多巴胺能神经前体细胞-特异性而众所周知的多个基因(corin、clstn2、kitlg、plxdc2、pcdh7、ferd3l、frem1、alcam及notch2)。

然后，对于上述基因，确认是否在实际分化中的mda细胞中表达，从而评价靶有效性(targetvalidation)。最终，对与lmx1a^-细胞相比在lmx1a⁺细胞中上调的基因中表面标记物基因(图14)以及在lmx1a⁺细胞和pitx3⁺细胞中上调或下调的表面标记物基因(图15)进行了鉴别。在上述图14中的21个基因中，对具有可商业利用的抗体的18个基因进行了筛选。

最终，在上述18个基因中，选定了4个基因(corin、滋养层糖蛋白、cd47、alcam)作为最终表面标记物候选组。

6-3.鉴别中脑多巴胺能神经前体细胞-特异性标记物

基于上述结果，以4个基因(corin、滋养层糖蛋白、cd47、alcam)为靶进行了磁激活细胞分离法(macs)。

在图16和图17中可以确认，corin-和滋养层糖蛋白-靶磁激活细胞分离法具有统计学意义地表现了lmx1a⁺foxa2⁺中脑多巴胺能神经前体细胞的浓缩(enrichment)。尤其，滋养层糖蛋白在中脑多巴胺能神经前体细胞中被广泛表达。

另一方面，上述corin基因用于浓缩中脑多巴胺能神经前体细胞已广为人知，但在mda发育过程中完全没有报告过滋养层糖蛋白，因此选定滋养层糖蛋白作为最终中脑多巴胺能神经前体细胞-特异性标记物。

实验例7.确认从人胚胎干细胞(hesc)分离的滋养层糖蛋白-阳性细胞的体内(invivo)移植效果

7-1.制备6-ohda损伤帕金森氏病(pd)-模型

使用200-250g的雌性斯泼累格·多雷大鼠(orientbioinc.，韩国)作为移植对象。混合30mg/kg的(维克(virbac)公司出品，法国)和10mg/kg的(拜耳(bayer)公司出品，德国)来用作麻醉剂。

根据坐标(tb-0.45，ap-0.40，ml-0.13，dv-0.70)将3μl的30mm6-ohda注入大鼠的内侧前脑(medialforebrain)束，从而诱导了半-帕金森氏病模型(hemi-parkinsonianmodel)。

7-2.确认移植滋养层糖蛋白-阳性细胞后帕金森氏病-模型的行为恢复

利用上述实施例的分化方案对以上述菌落形态培养的人胚胎干细胞进行分化后，在分化20天(d20)，以滋养层糖蛋白为靶进行了磁激活细胞分离法。

将所分离的滋养层糖蛋白-阳性细胞在1×hank's平衡盐溶液悬浮以使最终浓度达到8.75×10⁴细胞/μl，从而制备了细胞悬浮液。在此情况下，使用仅移植了hank's平衡盐溶液的组作为对照组(control)。

在上述实验例7-1的6-ohda损伤4周后，根据坐标(tb-0.24，ap+0.08，ml-0.30，dv-0.40及-0.50)，按照每只大鼠4μl的定位方法来移植所制备的细胞悬浮液(共350000个细胞)。

从移植2天前开始直到大鼠死亡为止，实验期间腹腔内注射10mg/kg的环孢霉素(cyclosporinea；钟根堂，韩国)，来进行免疫抑制(immunosuppressive)处理。

在移植前以及移植后4周、8周、12周或16周，腹腔内注射安非他命(2.5mg/kg，sigmal-aldrich)，并记录30分钟内大鼠是否旋转。

在图18中可以确认，在移植滋养层糖蛋白-阳性细胞后16周，与对照组相比，运动功能显著提升。上述结果意味着，人胚胎干细胞来源的滋养层糖蛋白-阳性中脑多巴胺能神经前体细胞可以在生物体内生存，并改善运动功能。

7-3.确认移植滋养层糖蛋白-阳性细胞后移植片的特性

除了使用移植未分类细胞组作为对照组之外，以与上述实施例7-2相同的方法移植滋养层糖蛋白-阳性细胞和未分类的细胞。

在移植16周后，以25％的聚氨酯溶液麻醉大鼠，以径深灌注来灌注0.9％的盐水和4％的多聚甲醛。将所去除的脑整夜固定，以30％的蔗糖-磷酸盐缓冲溶液进行冻结保护。经冻结保护的脑固定在fsc化合物(leica，nuβloch，德国(germamy))，使用低温恒温器(thermofisherscientific)来制备18μm厚度的冠状切片(coronalsections)。然后，实施以人特异性神经细胞粘附分子(human-specificneuralcelladhesionmolecule，hncam)为靶的免疫组织化学染色诊断。

在图19中可以确认，与未分类组相比，滋养层糖蛋白-阳性细胞组包含更多数量的th⁺hncam⁺和pitx3⁺hncam⁺中脑多巴胺能神经细胞。上述结果意味着，与未分类组相比，滋养层糖蛋白-阳性细胞更适合生物体内向中脑多巴胺能神经细胞的分化。

并且，在图20中可以确认，在未分类组中一个特定大鼠中观察到具有约20％以上的ki67⁺hncam⁺细胞的移植片(graft)，但在滋养层糖蛋白-阳性组中未观察到ki67⁺hncam⁺细胞。上述结果意味着，在未分类的情况下，即使在移植16周后也有可能维持增殖能力，但在以滋养层糖蛋白进行细胞分类时，可以排除增殖细胞。这个结果对于细胞治疗的安全性非常重要。

实验例8.确认从人胚胎腹侧中脑细胞(humanfetalventralmesencephaliccells，fvmcells)分离的滋养层糖蛋白-阳性细胞的特性

对于在神经干细胞维持培养液(rencellnscmaintenancemedium，merck)中，在层粘连蛋白-涂敷板上培养的fvm细胞，在以细胞占板总面积的近80-90％的程度培养的情况下，以滋养层糖蛋白为靶进行磁激活细胞分离法。然后，通过定量即时聚合酶链锁反应(qrt-pcr)方法确认了以人胚胎干细胞(h9)为对照组(h9的表达＝1)在所分离的滋养层糖蛋白-阳性细胞和滋养层糖蛋白-阴性细胞中相对的en1的表达。

在图21中可以确认，与滋养层糖蛋白-阴性细胞相比，在滋养层糖蛋白-阳性细胞中，作为中脑多巴胺能神经细胞的的发生位置标记物的en1的表达有所增加。上述结果意味着，可以利用滋养层糖蛋白来对在fvm细胞中表现出中脑特性的细胞进行浓缩。

实验例9.确认从人诱导性多能干细胞(humaninducedpluripotentstemcells，ipsc)分离的滋养层糖蛋白-阳性细胞的特性

利用上述实施例的分化方案来对以与上述人胚胎干细胞相同的方法培养的人诱导性多能干细胞(hdf-epi3)进行分化后，在分化20天(d20)，以滋养层糖蛋白为靶进行了磁激活细胞分离法。确认了en1、foxa2、lmx1a在所分离的滋养层糖蛋白-阳性细胞中的表达(immunocytochemistry)。

在图22中可以确认，作为中脑发生位置标记物的en1和foxa2的表达在经过磁激活细胞分离法后未表现出差异，但表达作为mda发生谱系标记物的lmx1a的细胞在滋养层糖蛋白-阳性细胞中浓缩。与此同时，观察到上述3个标记物(en1、foxa2及lmx1a)均进行阳性反应的细胞的比例也在滋养层糖蛋白-阳性细胞中显著浓缩。

序列表

<110>s-biomedics

<120>多巴胺能神经细胞的分离方法及包含利用其分离的多巴胺能神经细胞的用于治疗帕金森氏病的药剂学组合物

<130>pp190019

<150>kr10-2018-0050918

<151>2018-05-02

<150>kr10-2019-0048784

<151>2019-04-25

<160>53

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<210>1

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<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>egfp-r

<400>20

cttgtacagctcgtccatgccgagagtgatc31

<210>21

<211>17

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>pitx3-f

<400>21

gccaaccttagtccgtg17

<210>22

<211>17

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>pitx3-r

<400>22

gcaagccagtcaaaatg17

<210>23

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>mcherry-f

<400>23

actacgacgctgaggtcaag20

<210>24

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>mcherry-r

<400>24

gtgtagtcctcgttgtggga20

<210>25

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>otx2-f

<400>25

ggaagcactgtttgccaagacc22

<210>26

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>otx2-r

<400>26

ctgttgttggcggcacttagct22

<210>27

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>foxa1-f

<400>27

gggcagggtggctccaggat20

<210>28

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>foxa1-r

<400>28

tgctgaccgggacggaggag20

<210>29

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>sim1-f

<400>29

aaagggggccaaatcccggc20

<210>30

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>sim1-r

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tccgccccactggctgtcat20

<210>31

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

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<400>31

aggtgaaacactttgctccg20

<210>32

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>lhx1-r

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ctccagggaaggcaaactct20

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<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>lmx1b-f

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aggtgaaacactttgctccg20

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<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>lmx1b-r

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tcaggaggcgaagtaggaac20

<210>35

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>nkx2.2-f

<400>35

ccttctacgacagcagcgacaa22

<210>36

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>nkx2.2-r

<400>36

acttggagcttgagtcctgagg22

<210>37

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>nkx6.1-f

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<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>nkx6.1-r

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ggggatgacagagagtcagg20

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<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<220>

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aaactgcccagtggacaagcgt22

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<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>nurr1-r

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gctcttcggtttcgagggcaaa22

<210>41

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>th-f

<400>41

gctggacaagtgtcatcacctg22

<210>42

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>th-r

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cctgtactggaaggcgatctca22

<210>43

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>dat-f

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cctcaacgacacttttgggacc22

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<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>dat-r

<400>44

agtagagcagcacgatgaccag22

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<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<220>

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gctatgccttcctgctgattgc22

<210>46

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>vmat2-r

<400>46

ccaaggcgattcccatgacgtt22

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<211>23

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>htr2b-f

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gctggttggattgtttgtgatgc23

<210>48

<211>23

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>htr2b-r

<400>48

ccactgaaatggcacagagatgc23

<210>49

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>neun-f

<400>49

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<210>50

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>neun-r

<400>50

tggttccaatgctgtaggtcgc22

<210>51

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>map2-f

<400>51

aggctgtagcagtcctgaaagg22

<210>52

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>map2-r

<400>52

cttcctccactgtgacagtctg22

<210>53

<211>8823

<212>dna

<213>滋养层糖蛋白

<400>53

actaaaggcacatgtcccaggcacaagcctcaggatccttatttgatcttttttaatacg60

accaggtcttaaatttccgaaccatgttttccctaattgccattttctctctaaaatgaa120

gaagcctggaagaaccttcttatcccttcggggaaattatttaattgggacaaaggggat180

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cagatccttccggtaaccaaccattcaatttgtccctctccccaaccccatcctctccat300

caccatctgccagatgccccctgggacaatcgactttgaaaccaaacttctctcccaggt360

cagctcctgcaatccccactcctcatccttggagctttctccacagaagtgacttgacac420

accgcgctacatctggggaggggggcgggtccgctttccgggagactcaagtctttgcta480

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tttctctctctctctctcttaaagttggcgcgctctcttcacaagttccatcactaccca660

agaagtgagggggcgggggggacaggcgggaaggcattaattacacctaaatctgaagtt720

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aatccccctacctacggctgccgaggttggccgcgcgtcgggaatctccccgacagtcct1140

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gcggcctgggagagacccgggaggcgtcgttggggcccctccccatcctcgggtggagag1380

tagggttggttcgggttgccactgtaccccgagtcccactgctgctttgttcccagactc1440

tcccctcctctttggagatgacttgaacccctttgagatccgaggggctggcggggcgcg1500

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tcaaaaagtcctgtaacctgaaacttccctcgcatcctaaccgggacctggtggagaggt1620

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tgtggaactgatcctgaaccacatcgtgccccctgaagatgagcggcagaaccggagctt2940

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ttatgtcttcctgggtattgttttagccctgataggcgctattttcctcctggttttgta3480

tttgaaccgcaaggggataaaaaagtggatgcataacatcagagatgcctgcagggatca3540

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ttctaactcggatgtctgagaaatattagaggacagaccaaggacaactctgcatgagat3660

gtagacttaagctttatccctactaggcttgctccactttcatcctccactatagataca3720

acggactttgactaaaagcagtgaaggggatttgcttccttgttatgtaaagtttctcgg3780

tgtgttctgttaatgtaagacgatgaacagttgtgtatagtgttttaccctcttcttttt3840

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cattcaacaaaagctgcctcaactttttcgagaaaaatactttattcataaatatcagtt4020

ttattctcatgtacctaagttgtggagaaaataattgcatcctataaactgcctgcagac4080

gttagcaggctcttcaaaataactccatggtgcacaggagcacctgcatccaagagcatg4140

cttacattttactgttctgcatattacaaaaaataacttgcaacttcataacttctttga4200

caaagtaaattacttttttgattgcagtttatatgaaaatgtactgatttttttttaata4260

aactgcatcgagatccaaccgactgaattgttaaaaaaaaaaaaaataaagattcttaaa4320

agaattacagtgtgtgcaagtttgctttgaaaaaaggatgaagggcaggagtattcaatg4380

gtcttggttccgatgataattattacttaacatagctgagaatcaaactgtagcaatgtc4440

taatataaatagacttgggagatcgttttgaaatggtggatccttttagtatttaaatgg4500

agagtttgagtattcatgtgactgtatggtcccaaagttaatgctatttatgaaacagtt4560

ttgtaagaacataatgaagttggtaaaagctaagcgttctgcacaataaacagttcccag4620

tttggggctttttcaaggctaatgaagttattgttggtctagaaaaatagtatttactta4680

ataaaactctgtttgaaattgttctgtggatttttagagcagaatttgaaacaaatgtaa4740

tgcaaataaatataaagataaagtgtcttaaagacaatattctgaaataaaagatataaa4800

atataatttaaaaaatatttctcaatgtcttaatgtaaattgaaacttagattttcttga4860

ggatattttcaaaaaaacatttaaagtggaacataaatgttctttagtttatcagagacc4920

cagctaatatgtttaaaaagttgacttgacatggttgaatatgaacttgaggaaataacc4980

acagataaatgtctacatctgtaaacacgtgtctcaagtatttataggttcttatcttca5040

gttcagtgtttaagaatttgaggatattttgattttagctaagctgttcataatgtaagt5100

atatacacctttgtgaagaataaatcacatttaggtgtaaatacaggcaatcattaattg5160

atacatccataatatacaaggcttttattattttttcagtttattatctgtcatttaatc5220

tgaaaagtaaattccattaatcagtcttcaggctcttttatcaagtgatttaaatgtagc5280

cattattgcttaactgaaagtattaggtaaacttgcatcagtaagtcttagggcttgctt5340

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tatttttataaataaaataggatcagatagtattttaggttctagaaatctttgctgatt5460

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ttttataggttagaatatatagtcagaatacaaagctgtaattccttaaattccatcagg5580

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gaaattcctaaactgtctggttgccattatttggtaagaacaatgagatactaatctgtc5760

aaaaatagtgaccactatcttagtaaactgttgatggacttagtaagtcttctgatattg5820

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tgataatctaacagtttaaagtggagctttatctaagaaccagggaagcagtagattcat5940

tagtctagcttttctcatcaactctttgaagcaatgatgaatctgataaagtgaagccaa6000

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ctgtttgttttaaatactgttcttactattaatgcattgttgactctagaaacctgcaag6420

tatccatttttaaaattttattttagttggtaatactctttattactgaacgtaaaattt6480

tcaacataaaacacccttcatttatcctttacaagtttcatttgaagaaagttagaaaaa6540

atacttagaaattcaaggacttgatatatcccttaatttagaaagctattcaactatccc6600

ataaatttctatttaaagtagcaaaaattttaggataatacagctatttggccctgaatt6660

ataactgccccctttgattgtaaccattcagtttgcagcattcgtttttgtaatagcagt6720

ttggctgctatgggtgtgattcaatggtaacctacaaggcaaatttgtacaggagctgac6780

agatttttctaacaaaataaggagactttgaagcacattgaataggagtttttaaatgaa6840

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agcaaatcacaaataataaatcctttagaaataccttgattggcagtaagtgtggattat6960

gctcatctcagtatttaattagaaataacttacctttgtcttttgtctttttaattaaag7020

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ttgcaattctagattgtgattctttcatatcattttagtttttctcccaagactacacta7200

aaggagacatcacgagatttgcaaggttaaaaacaattctgcacgtgcttcctcctgctc7260

ccaaatccggtcatccacctttcagagcagcaccgtaaagtgaagacagacatttattag7320

atgaaattctggtttcacttttacacttgtgcaagcatttttaacagtaaaggagaggaa7380

agggaggaatttatatttctagataatatatgaaaattaccttgatattgtatttttaag7440

atctttcaccaatactgcagtgctgcactagaaataattagtttaagaaaatacattcaa7500

cattgtccaggtgatcctgtcaccttttagatgacgaaaaacatcttgaggatgttttgt7560

acagttattttcccattgttactcttagagacttttgtttcaaaaaggcaggctcatttt7620

attttgttttatcttagaacattttagcagctctttgtcatgggttaaaaaaatctagaa7680

ttaaaaaaatgtttaatatatgatttatataattttgacaagaatacaaattcttagtcg7740

ttcaaaattggaagcgctcttagaagtgtcaagctcagctttccattccacaaatgaagt7800

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ttaccagatgatggcattactaattgcctaccttgaggcctttgaaatcaccatgtctga7980

taaaaacatgcaattgctttggtgaatttgtttgttttattgttgttgctttgagtgaat8040

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agtattttggaaatttaatggtgatatttctttggaaaagaaaaataaaaactctggaat8220

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taaacaaatgagaccaagttcgtgaccattaagtcaatcagtcaccaggtgagacagtca8340

gctttgcattctctgctgtgttctcctagctcacgcccactccaggtgcatgctgccatc8400

ctctaagggcctggaccaaacagggaagttagttaaatcaatgcaaatccattatcaccc8460

tggaaaaccaggggactgaccagccgaacactgccagcttggctgctgaagtgccagttt8520

actgtctttacatatgcaggacacacactacatctcaattttctcacatcatatgtagta8580

tttatgctgcagattgcaaaaggcttataatttatgtgaattttgggaagctagcatgag8640

tacctttcagggtattgcatgggaaattaattaggtttactttattattttaaaaaagtg8700

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tta8823