切割非神经元SNARE的肉毒杆菌神经毒素的制作方法
介绍
本发明涉及经修饰的具有切割非神经元snare蛋白能力的肉毒杆菌神经毒素(botulinumneurotoxin)蛋白酶，及其在通过切割哺乳动物细胞中的非神经元snare蛋白来抑制所不希望的从该哺乳动物细胞分泌中的用途。
毒素通常落入两种类型之一，即杀伤其天然靶细胞的细胞毒性毒素(例如植物毒素，如蓖麻毒蛋白)和不杀伤其天然靶细胞的非细胞毒性毒素(例如肉毒杆菌神经毒素)。非细胞毒性毒素通过抑制蛋白质合成以外的细胞过程来施加其对靶细胞的作用。
肉毒杆菌神经毒素蛋白酶通过蛋白水解切割称为snare蛋白的胞内转运蛋白(例如snap-25、vamp或突触融合蛋白)发挥作用。首字母缩略词snare源自术语可溶性nsf附着蛋白受体(solublensfattachmentproteinreceptor)，其中nsf指n-乙基马来酰亚胺敏感因子(n-ethylmaleimide-sensitivefactor)。snare蛋白是一个大的蛋白质超家族。snare蛋白的重要功能是介导神经递质分子胞吐至突触后连接。snare蛋白因此是通过小泡运输从细胞分泌分子所不可或缺的。
肉毒梭菌(clostridiumbotulinum)产生在血清学上通过抗血清交叉血清型中和的缺乏来区分的七种(a至g)不同的神经毒素(bont)。bont通过靶向神经元并切割神经元特异性snare蛋白引出神经元特异性松弛性瘫痪。
bont具有150kda的多肽链，包含通过二硫键连接的100kda重链和50kda轻链。bont组织为三个功能结构域：n端蛋白水解轻链(l链)和c端重链(h链)，后者由易位结构域(hn)和c端神经元结合结构域(hc)组成。bont的毒性作用(神经中毒)遵循3步作用机制。第一步，hc部分结合胆碱能神经细胞，并通过受体介导的胞吞作用内化。第二步，hn部分使l链易位跨过内体膜，进入神经细胞的胞质溶胶。第三步，l链结合并切割胞质溶胶内的神经元snare蛋白，由此抑制神经递质从神经细胞释放，导致神经细胞中毒。
七种bont血清型切割三种snare蛋白之一上的特定残基：
血清型b、d、f和g切割vamp-2；
血清型a和e切割snap-25；和
血清型c切割snap-25和突触融合蛋白la。
虽然天然bont能够靶向并切割神经元snare同工型如vamp-2、snap-25和突触融合蛋白la，但所述蛋白酶对大多数非神经元snare蛋白的切割作用很小或无切割作用。这种神经元snare底物特异性与bont所显示的天然神经元细胞结合特异性一致，理解为是bont所显示的天然神经元细胞结合特异性的反映。例如，bont/a切割人snap-25，但不切割人非神经元同工型。
早在1989年，bont/a就被fda批准用于治疗斜视、睑痉挛和偏侧面肌痉挛，然后用于颈部肌张力障碍、美容用途、眉间面线和腋窝多汗。bont/a在肌张力障碍和其他与非自主性骨骼肌活动相关的障碍中的有效性以及令人满意的安全性特征激起了在多种分泌和疼痛及美容障碍(cosmeticdisorders)中的经验性/标签外使用。
bont的临床应用集中在靶向神经肌肉活性相关障碍。最近，由syntaxinltd领导的开拓性研究已允许设计结合独特亚群的神经元(例如伤害性传入－参见wo96/33273，在此以其整体引入)和/或结合非神经元细胞(例如气道上皮细胞－参见wo00/10598，在此以其整体引入)的重靶向bont。此技术称为靶向分泌抑制剂(tsi)技术，涉及用不同的靶向部分(例如生长因子或其他信号分子)替换天然bont结合结构域，打开了新的基于bont的治疗剂和治疗的大门。
但是，bont对神经元特异性snare蛋白的选择性切割限制了在这些非神经元系统中开发新疗法。认为神经元和非神经元snare蛋白对胞内小泡融合并因此对通过小泡运输从细胞分泌分子同等重要。因此，用常规基于bont的治疗剂失活神经元snare蛋白驱动的分泌将不涉及任何相应的非神经元snare驱动的细胞分泌。
因此，存在对改造的有效切割非神经元snare蛋白的bontl链蛋白酶的需要。
本发明通过提供改造的切割主要在非神经元细胞中表达的snare蛋白同工型(即人snap-23(hsnap-23))的bont/al链蛋白酶来解决以上问题中的一个或多个。本发明因此提供一类新的非细胞毒性治疗剂。
发明详述
除非本文中另有定义，结合本发明使用的科学和技术术语具有本领域普通技术人员通常理解的含义。另外，除非上下文另有要求，本文中所用的命名及细胞和组织培养技术是本领域公知且常用的那些。
但是，对于本说明书通篇使用的不同术语，以下定义尤其更适用。
除非文中另有说明，单数术语“一”、“一个”或“该”涵盖复数含义，如“一个或多个”、或“至少一个”。
术语“蛋白酶”在本文中指这样的酶，其能够水解切割蛋白质和/或肽。在本发明的背景中，该蛋白酶更具体地是肉毒杆菌神经毒素(bont)轻链(l-链)蛋白酶，即衍生自肉毒杆菌神经毒素，尤其是衍生自肉毒杆菌神经毒素a(bont/a)的蛋白酶(也描述为蛋白水解结构域)。如熟练的从业者公知，肉毒杆菌神经毒素的轻链提供蛋白酶功能(也称为非细胞毒性蛋白酶功能)，通常具有约50kda的分子量。这类非细胞毒性蛋白酶通常通过蛋白水解切割称为snare蛋白(例如snap-25、vamp或突触融合蛋白)的胞内转运蛋白发挥作用－参见geraldk(2002)"cellandmolecularbiology”(第4版)johnwiley&sons,inc.。如下文进一步解释，天然存在(即野生型)的bont/al链更尤其能够有效切割snap-25，但仅能微弱切割hsnap-23。相反，下文更详细描述的本发明的bont/al链蛋白酶与天然存在的bont/al链的不同在于，它具有改善的切割hsnap-23的能力，在本文中称为“经修饰的切割hsnap-23的bont/al链”。
切割hsnap23的能力可以通过常规测定法确认，如下文实施例2中所述的测定法。“切割hsnap23”在本文中更尤其指本发明的经修饰的bont/al链相对于野生型bont/al链(seqidno:1)显示改善的hsnap-23切割。可以利用任何简单的比较测定法，如实施例2中所列举的hsnap-23测定法。野生型bont/al链仅能够进行微弱(即背景)的hsnap-23切割。
因此，本发明的经修饰的bont/al链显示以下一项或多项(优选二者)：
a)在无细胞测定法(1微摩尔经修饰的bont/al链；20微摩尔hsnap-23；优选在约37℃孵育约1小时)中hsnap-23切割大于0.2％(例如大于0.5％，优选大于1％，更优选大于5％)－参见实施例2，图1；和/或
b)在无细胞测定法(1微摩尔经修饰的bont/al链；20微摩尔hsnap-23；优选在约37℃孵育约1小时)中km小于225(例如小于200，优选小于150)微摩尔－参见实施例2，图1；和/或
c)在无细胞测定法(1微摩尔经修饰的bont/al链；20微摩尔hsnap-23；优选在约37℃孵育约1小时)中kcat(1/min)小于0.2(例如小于0.18，优选小于0.1)－参见实施例2，图1。
本发明的经修饰的bont/al链蛋白酶可以任选地不仅切割hsnap-23，还切割snap-25。snap-25的切割可以通过常规测定法确认，如下文实施例3中所述的测定法。根据此任选的实施方案，“snap-25的切割”在本文中指本发明的经修饰的bont/al链优选相对于野生型bont/al链(seqidno:1)显示至少0.5％、至少1％、至少2％、优选至少3％、还优选至少10％snap-25切割。可以利用任何简单的比较测定法，如实施例3中所列举的snap-25测定法。
在优选的实施方案中，本发明的经修饰的bont/al链蛋白酶切割hsnap-23但不切割snap-25，如hsnap-25。
术语“snap-23”(突触小体相关蛋白23)在本文中指这样的snare蛋白，其能够在细胞中优选在非神经元细胞中结合多种其他snare蛋白，并与这些蛋白形成高亲和力复合物，由此调节该细胞中的胞内细胞膜融合。“hsnap-23”更尤其指人snap-23，优选指序列seqidno:2的蛋白质。
术语“snap-25”(突触小体相关蛋白25)在本文中指snare蛋白，其能够在细胞中优选在神经元细胞中结合多种其他snare蛋白，并形成高亲和力复合物，由此调节该细胞中的胞内细胞膜融合。“hsnap-25”更尤其指人snap-25，优选指序列seqidno:3的蛋白质。
术语“修饰”、“改变”或“突变”在本文中可互换使用，指与参考蛋白质的氨基酸序列相比，即在本文中相对于野生型bont/al链(seqidno:1)，氨基酸序列中的改变。本文中作为seqidno:1列举的氨基酸序列长度为438个氨基酸残基，以k438结束。应理解，k438是活化环的第一个赖氨酸氨基酸残基，最可能代表蛋白水解切割活化环后l链的c末端。因此，seqidno:1代表(天然)活化形式的野生型bont/al链。在这方面，在蛋白水解活化之前，野生型bont/al链长度通常为～448个氨基酸残基，其包括活化环氨基酸残基的短c端延伸。
如下文进一步解释，本发明揭示了野生型bont/al链内为使bont/al链能够进行hsnap-23切割而需合理改变为不同氨基酸残基的关键氨基酸位置的身份。在这方面，可借助氨基酸插入、缺失或取代，优选借助氨基酸取代，实现引入氨基酸改变(即突变)。允许引入这种突变的方法为本领域技术人员已知。例如，可能通过随机或定向诱变，通过使用简并引物的pcr，例如在编码参考蛋白质的核苷酸序列中引入突变。该技术尤其由sambrook等在“molecularcloning:alaboratorymanual”,第4版,coldspringharborlaboratorypress,(2012，及2014年后的更新版本)及ausubel等在“currentprotocolsinmolecularbiology”,johnwiley&sons(2012)中描述。
氨基酸改变相对于野生型bont/al链(seqidno:1)发生在一个或多个l链“结合袋”内。“结合袋”在本文中指bont/al链的区域，其包含一个或多个作为与hsnap-23的相应结合位点结合的接触点(例如通过氢键、盐桥和/或疏水接触)的氨基酸，和/或其提供容纳其他能够结合hsnap-23的底物氨基酸残基(例如通过修饰，如通过取代)的空间。本文中所用的术语“结合”指“适于结合”，并形成申请人对本发明的原理的部分—该原理不构成本发明的必要技术特征。例如，定义为seqidno:1的氨基酸残基e148、t307、a308和y312的bont/al链蛋白酶结合袋指bont/al链蛋白酶的包含氨基酸e148、t307、a308和/或y312的区域，和/或其本文中所述的突变体，申请人认为其协同结合hsnap-23上预测的结合位点(例如结合hsnap-23的p182/d178结合位点)。
术语“结合位点”在本文中指hsnap-23的区域，其包含一个或多个可由相应的bont/al链结合袋结合的氨基酸。例如，hsnap-23的“p182/d178”结合位点包含hsnap-23的氨基酸p182和/或d178。本文中所用的术语“结合位点”仅指“预测的结合位点”(如申请人所预测的)，并形成申请人对本发明的原理的部分—该原理不构成本发明的必要技术特征。
可以通过比较每个序列中的位置来确定氨基酸或核酸序列间的“序列同一性”，该序列可以以比较为目的比对。在所比较的序列中的位置为相同的核苷酸或氨基酸所占据时，则该序列在该位置是同一的。氨基酸序列间的同一性程度是这些序列间所共有的相同氨基酸序列数的函数。核酸间的序列同一性程度是这些序列在位置上共有的相同核苷酸数的函数。
为了确定两个氨基酸序列或两个核酸序列间的“序列同一性百分比”，比对序列进行最佳比较。例如，为了与第二氨基酸序列或第二核酸序列最佳比对，可以在第一氨基酸序列或第一核酸序列的序列中引入缺口。然后比较相应的氨基酸位置或核苷酸位置处的氨基酸残基或核苷酸。在第一序列中的位置为与第二序列中的相应位置相同的氨基酸残基或核苷酸所占据时，该分子在该位置处是同一的。
两个序列间的同一性百分比(％)是这些序列所共有的相同位置数的函数。因此，可以通过将相同位置数乘以100除以包括缺口(仅内部缺口，不是序列末端的缺口)的比对区域(重叠位置)的长度来计算同一性百分比。
在此比较中，序列可以具有相同长度，或者可以具有不同长度。同一性评分仅计数完美匹配，不考虑氨基酸彼此间的相似性程度。
序列的最佳比对在本文中可以优选通过全局同源性比对算法进行，可以用相同或相似长度的序列进行比对，如通过needleman和wunsch(journalofmolecularbiology；1970,48(3):443–53)所述的算法，通过此算法的计算机化执行(例如使用
熟练的从业者可容易地进一步理解，本发明涵盖基本同源且保留切割hsnap-23能力的经修饰的bont/al链，即功能性变体或同源物。这些功能性变体或同源物可以表征为在后文就hsnap-23切割公开的突变之外具有一个或多个氨基酸突变(如氨基酸缺失、添加和/或取代)，且其不显著影响折叠或蛋白酶活性，尤其是hsnap-23切割。例如，这类突变非限制性地包括保守取代、小的缺失(通常为1至约30个氨基酸)、小的氨基端或羧基端延伸(如氨基端甲硫氨酸残基)、添加至多约20-25个残基的小的接头肽或亲和标记。
本发明的功能性变体或同源物优选包含次要性质的突变，如保守氨基酸取代。保守氨基酸取代为熟练的从业者公知，且非限制性地包括：
碱性氨基酸：精氨酸、赖氨酸、组氨酸；
酸性氨基酸：谷氨酸、天冬氨酸；
极性氨基酸：谷氨酰胺、天冬酰胺；
疏水性氨基酸：亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸；
芳香族氨基酸：苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸；
小氨基酸：甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸。
除20种标准氨基酸外，非标准氨基酸(如4-羟脯氨酸、6-n-甲基赖氨酸、2-氨基异丁酸、异缬氨酸和α-甲基丝氨酸)也可以取代本发明的多肽的氨基酸残基。有限数目的非保守氨基酸、不由遗传密码编码的氨基酸和非天然氨基酸可以取代梭菌多肽氨基酸残基。本发明的多肽还可以包含非天然存在的氨基酸残基。
非天然存在的氨基酸非限制性地包括反式-3-甲基脯氨酸、2,4-甲氧基脯氨酸、顺式-4-羟脯氨酸、反式-4-羟脯氨酸、n-甲基甘氨酸、别苏氨酸、甲基苏氨酸、羟乙基半胱氨酸、羟乙基高半胱氨酸、硝基谷氨酰胺、高谷氨酰胺、六氢吡啶羧酸、叔亮氨酸、正缬氨酸、2-氮杂苯丙氨酸、3-氮杂苯丙氨酸、4-氮杂苯丙氨酸和4-氟苯丙氨酸。本领域已知若干用于将非天然存在的氨基酸残基掺入蛋白质的方法。
氨基酸取代可以包含用具有相似或备选特性的氨基酸取代含有某种物理化学特性(例如疏水性)的氨基酸。下文列出这类取代的实例：
酸性氨基酸取代中性极性氨基酸；
极性氨基酸取代非极性氨基酸；
非极性氨基酸取代非极性氨基酸；
非极性氨基酸取代极性氨基酸；
极性氨基酸取代碱性氨基酸；
非极性氨基酸取代酸性氨基酸；
非极性氨基酸取代极性氨基酸。
因此，本发明涵盖包含本文中针对hsnap-23的切割所述的一个或多个突变的所有bont/a亚型的l链，如bont/a1至bont/a8l链中的任一种。该bont/al链还可以包含其他突变，以提供非天然活化切割位点，如肠激酶(seqidno:10)、prescission、xa因子、凝血酶、tev蛋白酶等的切割位点。
其他定义在本说明书通篇中提供。
本发明可描述如下。
在第一方面，本发明提供经修饰的肉毒杆菌神经毒素a(bont/a)l链蛋白酶，其切割人snap-23(hsnap-23)，且相对于野生型bont/al链(seqidno:1)具有经修饰的氨基酸序列，其包含：
a)定位于用于结合hsnap-23的p182/d178结合位点的第一bont/al链蛋白酶结合袋内的至少一个氨基酸残基改变；
b)其中所述第一bont/al链蛋白酶结合袋定义为野生型bont/al链(seqidno:1)的氨基酸残基e148、t307、a308和y312；和
c)其中所述至少一个氨基酸残基改变包含：
i.经修饰的l链蛋白酶氨基酸序列上对应于野生型bont/al链(seqidno:1)的氨基酸残基e148的位置处选自天冬酰胺和酪氨酸的氨基酸残基；和/或
ii.经修饰的l链蛋白酶氨基酸序列上对应于野生型bont/al链(seqidno:1)的氨基酸残基t307的位置处选自苯丙氨酸、异亮氨酸和亮氨酸的氨基酸残基；和/或
iii.经修饰的l链蛋白酶氨基酸序列上对应于野生型bont/al链(seqidno:1)的氨基酸残基a308的位置处选自脯氨酸、天冬酰胺、苏氨酸和异亮氨酸的氨基酸残基；和/或
iv.经修饰的l链蛋白酶氨基酸序列上对应于野生型bont/al链(seqidno:1)的氨基酸残基y312的位置处选自赖氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸和亮氨酸的氨基酸残基。
不希望受限于任何理论，申请人认为，上文定义的bont/al链结合袋与hsnap-23上的识别序列实现了重要的酶-底物结合。
因此，本发明基于这样的惊人发现(例如出乎意料的技术效果)，所要求保护的靶向氨基酸取代允许产生增加hsnap-23切割的bont/al链(相对于野生型bont/al链而言)。本发明人不仅成功鉴定出bont/al链的可以改变(例如取代)以增加hsnap-23切割的适宜的氨基酸位置，还鉴定出了提供此效应的准确氨基酸取代。
在第一方面，本发明提供经修饰的肉毒杆菌神经毒素a(bont/a)l链蛋白酶，其切割人snap-23(hsnap-23)，且相对于野生型bont/al链(seqidno:1)具有经修饰的氨基酸序列，其包含：
a)定位于用于结合hsnap-23的p182/d178结合位点的第一bont/al链蛋白酶结合袋内的至少一个氨基酸残基改变；
b)其中所述第一bont/al链蛋白酶结合袋定义为野生型bont/al链(seqidno:1)的氨基酸残基e148；和
c)其中所述至少一个氨基酸残基改变包含：
i.经修饰的l链蛋白酶氨基酸序列上对应于野生型bont/al链(seqidno:1)的氨基酸残基e148的位置处选自天冬酰胺和酪氨酸的氨基酸残基。
在一方面，本发明提供经修饰的肉毒杆菌神经毒素a(bont/a)l链蛋白酶，其切割人snap-23(hsnap-23)，且相对于野生型bont/al链(seqidno:1)具有经修饰的氨基酸序列，其包含：
a)定位于用于结合hsnap-23的p182/d178结合位点的第一bont/al链蛋白酶结合袋内的至少一个氨基酸残基改变；
b)其中所述第一bont/al链蛋白酶结合袋定义为野生型bont/al链(seqidno:1)的氨基酸残基e148、t307、a308和y312；和
c)其中所述至少一个氨基酸残基改变包含：
i.经修饰的l链蛋白酶氨基酸序列上对应于野生型bont/al链(seqidno:1)的氨基酸残基t307的位置处选自苯丙氨酸、异亮氨酸和亮氨酸的氨基酸残基；和/或
ii.经修饰的l链蛋白酶氨基酸序列上对应于野生型bont/al链(seqidno:1)的氨基酸残基a308的位置处选自脯氨酸、天冬酰胺、苏氨酸和异亮氨酸的氨基酸残基；和/或
iii.经修饰的l链蛋白酶氨基酸序列上对应于野生型bont/al链(seqidno:1)的氨基酸残基y312的位置处选自赖氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸和亮氨酸的氨基酸残基。
经修饰的bont/al链可以包含一个氨基酸取代(相对于野生型seqidno:1)。经修饰的bont/al链可以包含两个氨基酸取代(相对于野生型wtseqidno:1)。经修饰的bont/al链可以包含三个氨基酸取代(相对于野生型seqidno:1)。经修饰的bont/al链可以包含四个氨基酸取代(相对于野生型seqidno:1)。
包含用于hsnap-23上的p182/d178结合位点的结合袋突变的本发明的经修饰的bont/al链一般显示增加至少1.15倍的hsnap-23切割(相对于野生型bont/al链而言)—参见图1a中的第1数据列。这类经修饰的bont/al链(按相对于相应的野生型bont/al链seqidno:1的氨基酸取代提及)的实例包括：
含有取代e148y或e148n的经修饰的bont/al链；
含有取代t307i、a308p和y312v的经修饰的bont/al链；
含有取代t307f、a308n和y312l的经修饰的bont/al链；
含有取代e148n、t307i和a308p、y312v的经修饰的bont/al链；
含有取代e148y、t307f、a308n和y312l的经修饰的bont/al链；
含有取代e148y、t307i、a308p和y312v的经修饰的bont/al链；
含有取代e148y、t307l、a308t和y312m的经修饰的bont/al链；
含有取代e148y、t307l、a308i和y312m的经修饰的bont/al链。
包含用于hsnap-23上的p182/d178结合位点的结合袋突变的本发明的经修饰的bont/al链显示增加至少1.35倍的hsnap-23切割(相对于野生型bont/al链而言)—参见图1a中的第1数据列。这类经修饰的bont/al链(按相对于相应的野生型bont/al链seqidno:1的氨基酸取代提及)的实例包括：
含有取代e148y或e148n的经修饰的bont/al链；
含有取代t307i、a308p和y312v的经修饰的bont/al链；
含有取代t307f、a308n和y312l的经修饰的bont/al链；
含有取代e148n、t307i、a308p和y312v的经修饰的bont/al链；
含有取代e148y、t307f、a308n和y312l的经修饰的bont/al链；
含有取代e148y、t307i、a308p和y312v的经修饰的bont/al链；
含有取代e148y、t307l、a308t和y312m的经修饰的bont/al链；
含有取代e148y、t307l、a308i和y312m的经修饰的bont/al链。
包含用于hsnap-23上的p182/d178结合位点的结合袋突变的本发明的经修饰的bont/al链显示增加至少1.7倍的hsnap-23切割(相对于野生型bont/al链而言)—参见图1a中的第1数据列。这类经修饰的bont/al链(按相对于相应的野生型bont/al链seqidno:1的氨基酸取代提及)的实例包括：
含有取代e148y的经修饰的bont/al链；
含有取代t307f的经修饰的bont/al链；
含有取代t307i的经修饰的bont/al链；
含有取代y312k的经修饰的bont/al链；
含有取代y312k、e148y的经修饰的bont/al链；
含有取代t307i、a308p和y312v的经修饰的bont/al链；
含有取代e148n、t307i、a308p和y312v的经修饰的bont/al链；
含有取代e148y、t307f、a308n和y312l的经修饰的bont/al链；
含有取代e148y、t307l、a308t和y312m的经修饰的bont/al链。
包含用于hsnap-23上的p182/d178结合位点的结合袋突变的本发明的经修饰的bont/al链可以显示增加至少2.0倍的hsnap-23切割(相对于野生型bont/al链而言)—参见图1a中的第1数据列。这类经修饰的bont/al链(按相对于相应的野生型bont/al链seqidno:1的氨基酸取代提及)的实例包括：
含有取代e148y的经修饰的bont/al链；
含有取代e148n、t307i、a308p和y312v的经修饰的bont/al链；
含有取代e148y、t307f、a308n和y312l的经修饰的bont/al链；
含有取代e148y、t307l、a308t和y312m的经修饰的bont/al链。
包含用于hsnap-23上的p182/d178结合位点的结合袋突变的本发明的经修饰的bont/al链可以显示增加至少4.0倍的hsnap-23切割(相对于野生型bont/al链而言)—参见图1a中的第1数据列。这类经修饰的bont/al链(按相对于相应的野生型bont/al链seqidno:1的氨基酸取代提及)的实例包括：
含有取代e148y的经修饰的bont/al链；
含有取代e148n、t307i、a308p和y312v的经修饰的bont/al链；
含有取代e148y、t307f、a308n和y312l的经修饰的bont/al链；
含有取代e148y、t307l、a308t和y312m的经修饰的bont/al链。
在另一实施方案中，包含用于hsnap-23上的p182/d178结合位点的结合袋突变的本发明的经修饰的bont/al链可以显示增加至少6.0倍、优选至少7.0倍、更优选至少8.0倍的hsnap-23切割(相对于野生型bont/al链而言)—参见图1a中的第1数据列。这类经修饰的bont/al链(按相对于相应的野生型bont/al链seqidno:1的氨基酸取代提及)的实例包括：
含有取代e148y的经修饰的bont/al链。
包含用于hsnap-23上的p182/d178结合位点的结合袋突变的本发明的经修饰的bont/al链一般显示大于1.5％的hsnap-23切割(1微摩尔经修饰的bont/al链、20微摩尔hsnap-23、优选在约37℃孵育约1小时的％)—参见图1a中的第2数据列。作为参照，野生型bont/al链(例如seqidno:1)显示小于0.5％的hsnap-23切割(1微摩尔经修饰的bont/al链、20微摩尔hsnap-23、优选在约37℃孵育约1小时的％)。这类经修饰的l链(按相对于相应的野生型bont/al链seqidno:1的氨基酸取代提及)的实例包括：
含有取代e148y的经修饰的bont/al链；
含有取代t307f的经修饰的bont/al链；
含有取代t307i的经修饰的bont/al链；
含有取代y312k的经修饰的bont/al链；
含有取代y312k和e148y的经修饰的bont/al链。
在一个实施方案中，包含用于hsnap-23上的p182/d178结合位点的结合袋突变的本发明的经修饰的bont/al链一般显示大于2％的hsnap-23切割(1微摩尔经修饰的bont/al链、20微摩尔hsnap-23、优选在约37℃孵育约1小时的％)—参见图1a中的第2数据列。这类经修饰的l链(按相对于相应的野生型bont/al链seqidno:1的氨基酸取代提及)包括：
含有取代e148y的经修饰的bont/al链；
含有取代t307i的经修饰的bont/al链；
含有取代y312k的经修饰的bont/al链。
在另一实施方案中，包含用于hsnap-23上的p182/d178结合位点的结合袋突变的本发明的经修饰的bont/al链显示增加至少9％的hsnap-23切割(1微摩尔经修饰的bont/al链、20微摩尔hsnap-23、优选在约37℃孵育约1小时的％)—参见图1a中的第2数据列。这类经修饰的l链(按相对于相应的野生型bont/al链seqidno:1的氨基酸取代提及)的实例包括：
含有取代e148y的经修饰的bont/al链。
具有用于hsnap-23上的p182/d178结合位点的结合袋突变的经修饰的bont/al链突变体的其他实例(按相对于相应的野生型bont/al链seqidno:1的氨基酸取代提及)包括：
含有取代a308l的经修饰的bont/al链；
含有取代a308v的经修饰的bont/al链；
含有取代a308i的经修饰的bont/al链；
含有取代a308p的经修饰的bont/al链；
含有取代a308n的经修饰的bont/al链；
含有取代a308t的经修饰的bont/al链；
含有取代y312v的经修饰的bont/al链；
含有取代y312m的经修饰的bont/al链；
含有取代y312l的经修饰的bont/al链。
具有用于hsnap-23上的p182/d178结合位点的结合袋突变的本发明的经修饰的bont/al链可以相对于野生型bont/al链包含一个或多个前文中定义的氨基酸残基改变。作为举例说明，本发明的经修饰的bont/al链可以具有单个氨基酸残基突变(在上文定义的用于hsnap-23上的p182/d178结合位点的结合袋内)，例如对应于野生型bont/al链(seqidno:1)的氨基酸残基e148的突变。类似地，本发明的经修饰的bont/al链可以具有一个以上氨基酸残基突变(在上文定义的用于hsnap-23上的p182/d178结合位点的结合袋内)，例如对应于野生型bont/al链(seqidno:1)的氨基酸残基t307、a308和y312的突变。
在一个优选的实施方案中，具有一个或多个用于hsnap-23上的p182/d178结合位点的结合袋突变的本发明的经修饰的bont/al链在下文进一步描述的一个或多个不同的用于hsnap-23的bont/al链结合袋内进一步包含一个或多个突变。
该一个或多个不同的用于hsnap-23的bont/al链结合袋包括：用于结合hsnap-23的d189/d192结合位点的第二bont/al链蛋白酶结合袋；用于结合hsnap-23的i198结合位点的第三bont/al链蛋白酶结合袋；用于结合hsnap-23的k185结合位点的第四bont/al链蛋白酶结合袋；用于结合hsnap-23的r186结合位点的第五bont/al链蛋白酶结合袋；用于结合hsnap-23的k206结合位点的第六bont/al链蛋白酶结合袋；用于结合hsnap-23的d210结合位点的第七bont/al链蛋白酶结合袋；用于结合hsnap-23的d168结合位点的第八bont/al链蛋白酶结合袋。
备选地，根据本发明的不同技术特征，经修饰的bont/al链可以在上文定义的用于hsnap23的p182/d178结合位点的结合袋之外的一个或多个bont/al链结合袋内包含一个或多个突变。
下文进一步详述该用于hsnap-23的bont/al链结合袋和相应的目的突变。
因此，作为另一技术特征或作为备选的技术特征，本发明包括在本文中定义的bont/al链结合袋内含有一个或多个突变的bont/al链突变体。作为实例，切割人snap-23(hsnap-23)的本发明的经修饰的bont/al链相对于野生型bont/al链(seqidno:1)具有经修饰的氨基酸序列，其包含：
a)定位在用于结合hsnap-23的r186结合位点的第五bont/al链蛋白酶结合袋内的氨基酸残基改变；
b)其中所述第五bont/al链蛋白酶结合袋定义为野生型bont/al链(seqidno:1)的氨基酸残基s143；和
c)其中所述氨基酸残基改变包含：
i.经修饰的l链蛋白酶氨基酸序列上对应于野生型bont/al链(seqidno:1)的氨基酸残基s143的位置处选自谷氨酰胺、谷氨酸和天冬氨酸的氨基酸残基。
不希望受限于任何理论，申请人认为，上文定义的bont/al链结合袋在hsnap-23上的r186和bont/a上的s143之间提供了稳定化盐桥。
包含用于hsnap-23上的r186结合位点的结合袋突变的本发明的经修饰的bont/al链一般显示对hsnap-23的km小于100微摩尔，例如小于95微摩尔—参见图1a中的第3数据列。作为参照，野生型bont/al链(例如seqidno:1)显示对hsnap-23的km大于150微摩尔，例如大于200微摩尔。这类经修饰的bont/al链(按相对于相应的野生型bont/al链seqidno:1的氨基酸取代提及)的实例包括：
含有取代v304d的经修饰的bont/al链；
含有取代v304e的经修饰的bont/al链；
含有取代g305d的经修饰的bont/al链；
含有取代g305e的经修饰的bont/al链；
含有取代s143d的经修饰的bont/al链；
含有取代s143e的经修饰的bont/al链；
含有取代s143q的经修饰的bont/al链；
含有取代k166f的经修饰的bont/al链。
在优选的实施方案中，具有用于hsnap-23上的r186结合位点的结合袋突变的本发明的经修饰的bont/al链可以在本文中所述的一个或多个不同的bont/al链结合袋内(例如在上文定义的用于hsnap-23上的p182/d178结合位点的结合袋内)进一步包含一个或多个突变。这类突变体一般显示降低至少0.5倍的hsnap-23切割(相对于e148y修饰的bont/al链而言)，或换言之至少增加4.0倍的hsnap-23切割(相对于野生型bont/al链而言)－参见图1b中多结合袋突变体的第1数据列；或至少5％的hsnap-23切割(1微摩尔经修饰的bont/al链、20微摩尔hsnap-23、优选在约37℃孵育约1小时的％)－参见图1b中的第2数据列。这类经修饰的bont/al链(按相对于相应的野生型bont/al链seqidno:1的氨基酸取代提及)的实例包括：
含有取代e148y和s143e的经修饰的bont/al链；
含有取代e148y和s143d的经修饰的bont/al链；
含有取代e148y和s143q的经修饰的bont/al链。
因此，在一个实施方案中，提供经修饰的bont/al链蛋白酶，其切割人snap-23(hsnap-23)，且相对于野生型bont/al链(seqidno:1)具有经修饰的氨基酸序列，其包含：
a)定位在用于结合hsnap-23的p182/d178结合位点的第一bont/al链蛋白酶结合袋内的氨基酸残基改变；其中该第一bont/al链蛋白酶结合袋定义为野生型bont/al链(seqidno:1)的氨基酸残基e148；和
b)定位在用于结合hsnap-23的r186结合位点的第五bont/al链蛋白酶结合袋内的氨基酸残基改变；其中该第五bont/al链蛋白酶结合袋定义为野生型bont/al链(seqidno:1)的氨基酸残基s143；和
c)其中所述氨基酸残基改变包含：
i.经修饰的l链蛋白酶氨基酸序列上对应于野生型bont/al链(seqidno:1)的氨基酸残基e148的位置处选自酪氨酸的氨基酸残基；和
ii.经修饰的l链蛋白酶氨基酸序列上对应于野生型bont/al链(seqidno:1)的氨基酸残基s143的位置处选自谷氨酸的氨基酸残基。
在另一实施方案中，提供经修饰的bont/al链蛋白酶，其切割人snap-23(hsnap-23)，且相对于野生型bont/al链(seqidno:1)具有经修饰的氨基酸序列，其包含：
a)定位在用于结合hsnap-23的p182/d178结合位点的第一bont/al链蛋白酶结合袋内的氨基酸残基改变；其中该第一bont/al链蛋白酶结合袋定义为野生型bont/al链(seqidno:1)的氨基酸残基e148；和
b)定位在用于结合hsnap-23的r186结合位点的第五bont/al链蛋白酶结合袋内的氨基酸残基改变；其中该第五bont/al链蛋白酶结合袋定义为野生型bont/al链(seqidno:1)的氨基酸残基s143；和
c)其中所述氨基酸残基改变包含：
i.经修饰的l链蛋白酶氨基酸序列上对应于野生型bont/al链(seqidno:1)的氨基酸残基e148的位置处选自酪氨酸的氨基酸残基；和
ii.经修饰的l链蛋白酶氨基酸序列上对应于野生型bont/al链(seqidno:1)的氨基酸残基s143的位置处选自天冬氨酸的氨基酸残基。
在另一实施方案中，具有用于hsnap-23上的r186结合位点的结合袋突变的本发明的经修饰的bont/al链在本文中所述的一个或多个不同的bont/al链结合袋内(例如在上文定义的用于hsnap-23上的p182/d178结合位点的结合袋内)进一步包含一个或多个突变。这类突变体一般显示增加至少2.0倍的hsnap-23切割(相对于e148y修饰的bont/al链而言)－参见图1b中多结合袋突变体的第1数据列。这类经修饰的bont/al链(按相对于相应的野生型bont/al链seqidno:1的氨基酸取代提及)的实例包括：
具有取代e148y和s143e的经修饰的bont/al链；
具有取代e148y和s143d的经修饰的bont/al链。
在另一实施方案中，具有用于hsnap-23上的r186结合位点的结合袋突变的本发明的经修饰的bont/al链在本文中所述的一个或多个不同的bont/al链结合袋内(例如在上文定义的用于hsnap-23上的p182/d178结合位点的结合袋内)进一步包含一个或多个突变。这类突变体一般显示增加至少3.0倍的hsnap-23切割(作为相对于e148y修饰的bont/al链而言的百分比)－参见图1b中多结合袋突变体的第1数据列。这类经修饰的bont/al链(按相对于相应的野生型bont/al链seqidno:1的氨基酸取代提及)的实例包括：
含有取代e148y、s143d的经修饰的bont/al链。
作为另一技术特征或作为备选的技术特征，本发明包括在本文中定义的bont/al链结合袋内含有一个或多个突变的bont/al链突变体。作为实例，切割人snap-23(hsnap-23)的本发明的经修饰的bont/al链相对于野生型bont/al链(seqidno:1)具有经修饰的氨基酸序列，其包含：
a)定位在用于结合hsnap-23的k185结合位点的第四bont/al链蛋白酶结合袋内的至少一个氨基酸残基改变；
b)其中所述第四bont/al链蛋白酶结合袋定义为野生型bont/al链(seqidno:1)的氨基酸残基v304和g305；和
c)其中所述至少一个氨基酸残基改变包含：
i.经修饰的l链蛋白酶氨基酸序列上对应于野生型bont/al链(seqidno:1)的氨基酸残基v304的位置处选自谷氨酸和天冬氨酸的氨基酸残基；和/或
ii.经修饰的l链蛋白酶氨基酸序列上对应于野生型bont/al链(seqidno:1)的氨基酸残基g305的位置处选自谷氨酸和天冬氨酸的氨基酸残基。
不希望受限于任何理论，申请人认为，上文定义的bont/al链结合袋在hsnap-23上的k185和bont/a之间提供了稳定化盐桥。
包含用于hsnap-23上的k185结合位点的结合袋突变的本发明的经修饰的bont/al链一般显示对hsnap-23的km小于100微摩尔—参见图1a中的第3数据列。作为参照，野生型bont/al链(例如seqidno:1)显示对hsnap-23的km大于150微摩尔，例如大于200微摩尔。这类经修饰的bont/al链(按相对于相应的野生型bont/al链seqidno:1的氨基酸取代提及)的实例包括：
含有取代v304d的经修饰的bont/al链；
含有取代v304e的经修饰的bont/al链；
含有取代g305d的经修饰的bont/al链；
含有取代g305e的经修饰的bont/al链。
具有用于hsnap-23上的k185结合位点的结合袋突变的本发明的经修饰的bont/al链相对于野生型bont/al链包含一个或多个前文中定义的氨基酸残基改变。作为举例说明，本发明的经修饰的bont/al链可以具有单个氨基酸残基突变(在上文定义的用于hsnap-23上的k185结合位点的结合袋内)，例如对应于野生型bont/al链(seqidno:1)的氨基酸残基g305的突变体。类似地，本发明的经修饰的bont/al链可以具有例如对应于野生型bont/al链(seqidno:1)的氨基酸残基v304和g305的一个以上突变(在上文定义的用于hsnap-23上的k185结合位点的结合袋内)。
在优选的实施方案中，具有用于hsnap-23上的k185结合位点的结合袋突变的本发明的经修饰的bont/al链可以在本文中所述的一个或多个不同的bont/al链结合袋内(例如在上文定义的用于hsnap-23上的p182/d178结合位点的结合袋内)进一步包含一个或多个突变。这类突变体一般显示增加至少2.0倍、优选至少2.5倍的hsnap-23切割(相对于e148y修饰的bont/al链而言)－参见图1b中多结合袋突变体的第1数据列。这类经修饰的bont/al链(按相对于相应的野生型bont/al链seqidno:1的氨基酸取代提及)的实例包括：
具有取代e148y和g305d的经修饰的bont/al链。
因此，在另一实施方案中，提供经修饰的bont/al链蛋白酶，其切割人snap-23(hsnap-23)，且相对于野生型bont/al链(seqidno:1)具有经修饰的氨基酸序列，其包含：
a)定位在用于结合hsnap-23的p182/d178结合位点的第一bont/al链蛋白酶结合袋内的氨基酸残基改变；其中该第一bont/al链蛋白酶结合袋定义为野生型bont/al链(seqidno:1)的氨基酸残基e148；和
b)定位在用于结合hsnap-23的k185结合位点的第四bont/al链蛋白酶结合袋内的氨基酸残基改变；其中该第四bont/al链蛋白酶结合袋定义为野生型bont/al链(seqidno:1)的氨基酸残基g305；和
c)其中所述氨基酸残基改变包含：
i.经修饰的l链蛋白酶氨基酸序列上对应于野生型bont/al链(seqidno:1)的氨基酸残基e148的位置处选自酪氨酸的氨基酸残基；和
ii.经修饰的l链蛋白酶氨基酸序列上对应于野生型bont/al链(seqidno:1)的氨基酸残基g305的位置处选自天冬氨酸的氨基酸残基。
另外，作为另一技术特征或作为备选的技术特征，本发明包括在本文中定义的bont/al链结合袋内含有一个或多个突变的bont/al链突变体。作为实例，切割人snap-23(hsnap-23)的本发明的经修饰的bont/al链相对于野生型bont/al链(seqidno:1)具有经修饰的氨基酸序列，其包含：
a)定位在用于结合hsnap-23的d189/d192结合位点的第二bont/al链蛋白酶结合袋内的氨基酸残基改变；
b)其中所述第二bont/al链蛋白酶结合袋定义为野生型bont/al链(seqidno:1)的氨基酸残基q29；和
c)其中所述氨基酸残基改变包含：
i.经修饰的l链蛋白酶氨基酸序列上对应于野生型bont/al链(seqidno:1)的氨基酸残基q29的位置上的氨基酸残基丙氨酸。
不希望受限于任何理论，申请人认为，上文定义的bont/al链结合袋在hsnap-23上的d189/d192和bont/a的氨基酸29或附近氨基酸之间提供了稳定化相互作用。
这类经修饰的bont/al链(按相对于相应的野生型bont/al链seqidno:1的氨基酸取代提及)的实例包括：
具有取代q29a的经修饰的bont/al链。
在优选的实施方案中，具有用于hsnap-23上的d189/d192结合位点的结合袋突变的本发明的经修饰的bont/al链在本文中所述的一个或多个不同的bont/al链结合袋内(例如在上文定义的用于hsnap-23上的p182/d178结合位点的结合袋内)进一步包含一个或多个突变。这类突变体一般显示增加至少1.50倍％的hsnap-23切割(相对于e148y修饰的bont/al链而言)－参见图1b中针对多结合袋突变体提供的第1数据列。这类经修饰的bont/al链(按相对于相应的野生型bont/al链seqidno:1的氨基酸取代提及)的实例包括：
具有取代e148y、q29a的经修饰的bont/al链。
因此，在另一实施方案中，提供经修饰的bont/al链蛋白酶，其切割人snap-23(hsnap-23)，且相对于野生型bont/al链(seqidno:1)具有经修饰的氨基酸序列，其包含：
a)定位在用于结合hsnap-23的p182/d178结合位点的第一bont/al链蛋白酶结合袋内的氨基酸残基改变；其中该第一bont/al链蛋白酶结合袋定义为野生型bont/al链(seqidno:1)的氨基酸残基e148；和
b)定位在用于结合hsnap-23的d189/d192结合位点的第二bont/al链蛋白酶结合袋内的氨基酸残基改变；其中该第二bont/al链蛋白酶结合袋定义为野生型bont/al链(seqidno:1)的氨基酸残基q29；和
c)其中所述氨基酸残基改变包含：
i.经修饰的l链蛋白酶氨基酸序列上对应于野生型bont/al链(seqidno:1)的氨基酸残基e148的位置处选自酪氨酸的氨基酸残基；和
ii.经修饰的l链蛋白酶氨基酸序列上对应于野生型bont/al链(seqidno:1)的氨基酸残基q29的位置处选自丙氨酸的氨基酸残基。
在另一实施方案中，具有用于hsnap-23上的d189/d192结合位点的结合袋突变的本发明的经修饰的bont/al链可以在本文中所述的至少两个不同的bont/al链结合袋内(例如在用于hsnap-23上的p182/d178结合位点的结合袋内，及在用于hsnap-23上的r186结合位点的结合袋内，二者都如上文所定义)进一步包含一个或多个突变。这类突变体一般显示增加至少2.5倍的hsnap-23切割(相对于e148y修饰的bont/al链而言)－参见图1b中的第1数据列。这类经修饰的bont/al链(按相对于相应的野生型bont/al链seqidno:1的氨基酸取代提及)的实例包括：
含有取代e148y、q29a和s143d的经修饰的bont/al链。
因此，在另一实施方案中，提供经修饰的bont/al链蛋白酶，其切割人snap-23(hsnap-23)，且相对于野生型bont/al链(seqidno:1)具有经修饰的氨基酸序列，其包含：
a)定位在用于结合hsnap-23的p182/d178结合位点的第一bont/al链蛋白酶结合袋内的氨基酸残基改变；其中该第一bont/al链蛋白酶结合袋定义为野生型bont/al链(seqidno:1)的氨基酸残基e148；和
b)定位在用于结合hsnap-23的d189/d192结合位点的第二bont/al链蛋白酶结合袋内的氨基酸残基改变；其中该第二bont/al链蛋白酶结合袋定义为野生型bont/al链(seqidno:1)的氨基酸残基q29；和
c)定位在用于结合hsnap-23的r186结合位点的第五bont/al链蛋白酶结合袋内的氨基酸残基改变；其中该第五bont/al链蛋白酶结合袋定义为野生型bont/al链(seqidno:1)的氨基酸残基s143；和
d)其中所述氨基酸残基改变包含：
i.经修饰的l链蛋白酶氨基酸序列上对应于野生型bont/al链(seqidno:1)的氨基酸残基e148的位置处选自酪氨酸的氨基酸残基；和
ii.经修饰的l链蛋白酶氨基酸序列上对应于野生型bont/al链(seqidno:1)的氨基酸残基q29的位置处选自丙氨酸的氨基酸残基；和
iii.经修饰的l链蛋白酶氨基酸序列上对应于野生型bont/al链(seqidno:1)的氨基酸残基s143的位置处选自天冬氨酸的氨基酸残基。
在另一实施方案中，具有用于hsnap-23上的d189/d192结合位点的结合袋突变的本发明的经修饰的bont/al链可以在本文中所述的至少两个不同的bont/al链结合袋内(例如在用于hsnap-23上的p182/d178结合位点的结合袋内，及在用于hsnap-23上的k185结合位点的结合袋内，如上文所定义)进一步包含一个或多个突变。这类突变体一般显示增加至少3.0倍、优选至少3.4倍的hsnap-23切割(相对于e148y修饰的bont/al链而言)－参见图1b中针对多结合袋突变体提供的第1数据列。这类经修饰的bont/al链(按相对于相应的野生型bont/al链seqidno:1的氨基酸取代提及)的实例包括：
含有取代e148y、q29a和g305d的经修饰的bont/al链。
因此，在另一实施方案中，提供经修饰的bont/al链蛋白酶，其切割人snap-23(hsnap-23)，且相对于野生型bont/al链(seqidno:1)具有经修饰的氨基酸序列，其包含：
a)定位在用于结合hsnap-23的p182/d178结合位点的第一bont/al链蛋白酶结合袋内的氨基酸残基改变；其中该第一bont/al链蛋白酶结合袋定义为野生型bont/al链(seqidno:1)的氨基酸残基e148；和
b)定位在用于结合hsnap-23的d189/d192结合位点的第二bont/al链蛋白酶结合袋内的氨基酸残基改变；其中该第二bont/al链蛋白酶结合袋定义为野生型bont/al链(seqidno:1)的氨基酸残基q29；和
c)定位在用于结合hsnap-23的k185结合位点的第四bont/al链蛋白酶结合袋内的氨基酸残基改变；其中该第四bont/al链蛋白酶结合袋定义为野生型bont/al链(seqidno:1)的氨基酸残基g305；和
d)其中所述氨基酸残基改变包含：
i.经修饰的l链蛋白酶氨基酸序列上对应于野生型bont/al链(seqidno:1)的氨基酸残基e148的位置处选自酪氨酸的氨基酸残基；和
ii.经修饰的l链蛋白酶氨基酸序列上对应于野生型bont/al链(seqidno:1)的氨基酸残基q29的位置处选自丙氨酸的氨基酸残基；和
iii.经修饰的l链蛋白酶氨基酸序列上对应于野生型bont/al链(seqidno:1)的氨基酸残基g305的位置处选自天冬氨酸的氨基酸残基。
作为另一技术特征或作为备选的技术特征，本发明包括在本文中定义的bont/al链结合袋内含有一个或多个突变的bont/al链突变体。作为实例，切割人snap-23(hsnap-23)的本发明的经修饰的bont/al链相对于野生型bont/al链(seqidno:1)具有经修饰的氨基酸序列，其包含：
a)定位在用于结合hsnap-23的k206结合位点的第六bont/al链蛋白酶结合袋内的至少一个氨基酸残基改变；
b)其中所述第六bont/al链蛋白酶结合袋定义为野生型bont/al链(seqidno:1)的氨基酸残基y251、l256、v258、l367和f369；和
c)其中所述至少一个氨基酸残基改变包含：
i.经修饰的l链蛋白酶氨基酸序列上对应于野生型bont/al链(seqidno:1)的氨基酸残基y251的位置处选自谷氨酸和天冬氨酸的氨基酸残基；和/或
ii.经修饰的l链蛋白酶氨基酸序列上对应于野生型bont/al链(seqidno:1)的氨基酸残基l256的位置处选自谷氨酸、天冬氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、丙氨酸和精氨酸的氨基酸残基；和/或
iii.经修饰的l链蛋白酶氨基酸序列上对应于野生型bont/al链(seqidno:1)的氨基酸残基v258的位置处选自丝氨酸、丙氨酸、脯氨酸、亮氨酸和谷氨酸的氨基酸残基；和/或
iv.经修饰的l链蛋白酶氨基酸序列上对应于野生型bont/al链(seqidno:1)的氨基酸残基l367的位置处选自丙氨酸和甘氨酸的氨基酸残基；和/或
v.经修饰的l链蛋白酶氨基酸序列上对应于野生型bont/al链(seqidno:1)的氨基酸残基f369的位置处选自甘氨酸、丝氨酸和亮氨酸的氨基酸残基。
作为另一技术特征或作为备选的技术特征，本发明包括在本文中定义的bont/al链结合袋内含有一个或多个突变的bont/al链突变体。作为实例，切割人snap-23(hsnap-23)的本发明的经修饰的bont/al链相对于野生型bont/al链(seqidno:1)具有经修饰的氨基酸序列，其包含：
a)定位在用于结合hsnap-23的k206结合位点的第六bont/al链蛋白酶结合袋内的至少一个氨基酸残基改变；
b)其中所述第六bont/al链蛋白酶结合袋定义为野生型bont/al链(seqidno:1)的氨基酸残基y251、l256、v258、l367和f369；
c)其中所述至少一个氨基酸残基改变包含：
i.经修饰的l链蛋白酶氨基酸序列上对应于野生型bont/al链(seqidno:1)的氨基酸残基y251的位置处选自谷氨酸和天冬氨酸的氨基酸残基；和/或
ii.经修饰的l链蛋白酶氨基酸序列上对应于野生型bont/al链(seqidno:1)的氨基酸残基l256的位置处选自谷氨酰胺和精氨酸的氨基酸残基；和/或
iii.经修饰的l链蛋白酶氨基酸序列上对应于野生型bont/al链(seqidno:1)的氨基酸残基v258的位置处选自丝氨酸、亮氨酸和谷氨酸的氨基酸残基；和/或
iv.经修饰的l链蛋白酶氨基酸序列上对应于野生型bont/al链(seqidno:1)的氨基酸残基l367的位置处选自丙氨酸和甘氨酸的氨基酸残基；和/或
v.经修饰的l链蛋白酶氨基酸序列上对应于野生型bont/al链(seqidno:1)的氨基酸残基f369的位置处选自甘氨酸、丝氨酸和亮氨酸的氨基酸残基。
不希望受限于任何理论，申请人认为，上文定义的bont/al链结合袋与hsnap-23识别序列的(s3’)位置实现了重要的酶-底物结合。
作为另一技术特征或作为备选的技术特征，本发明包括在本文中定义的bont/al链结合袋内含有一个或多个突变的bont/al链突变体。作为实例，切割人snap-23(hsnap-23)的本发明的经修饰的bont/al链相对于野生型bont/al链(seqidno:1)具有经修饰的氨基酸序列，其包含：
a)定位在用于结合hsnap-23的k206结合位点的第六bont/al链蛋白酶结合袋内的至少一个氨基酸残基改变；
b)其中所述第六bont/al链蛋白酶结合袋定义为野生型bont/al链(seqidno:1)的氨基酸残基y251、l256、v258、l367和f369；和
c)其中所述至少一个氨基酸残基改变包含：
i.经修饰的l链蛋白酶氨基酸序列上对应于野生型bont/al链(seqidno:1)的氨基酸残基y251的位置处选自谷氨酸和天冬氨酸的氨基酸残基；和/或
ii.经修饰的l链蛋白酶氨基酸序列上对应于野生型bont/al链(seqidno:1)的氨基酸残基l256的位置处选自谷氨酰胺和精氨酸的氨基酸残基；和/或
iii.经修饰的l链蛋白酶氨基酸序列上对应于野生型bont/al链(seqidno:1)的氨基酸残基v258的位置处选自丝氨酸、亮氨酸和谷氨酸的氨基酸残基；和/或
iv.经修饰的l链蛋白酶氨基酸序列上对应于野生型bont/al链(seqidno:1)的氨基酸残基l367的位置处选自丙氨酸和甘氨酸的氨基酸残基；和/或
v.经修饰的l链蛋白酶氨基酸序列上对应于野生型bont/al链(seqidno:1)的氨基酸残基f369的位置处选自甘氨酸、丝氨酸和亮氨酸的氨基酸残基。
具有用于hsnap-23上的k206结合位点的结合袋突变的本发明的经修饰的bont/al链相对于野生型bont/al链包含一个或多个前文中定义的氨基酸残基改变。作为举例说明，本发明的经修饰的bont/al链可以具有单个氨基酸残基突变(在用于hsnap-23上的k206结合位点的结合袋内)，例如对应于野生型bont/al链(seqidno:1)的氨基酸残基y251的突变体。类似地，本发明的经修饰的bont/al链可以包含一个以上突变(在用于hsnap-23上的k206结合位点的结合袋内)，例如对应于野生型bont/al链(seqidno:1)的氨基酸残基y251&l256的突变体。
包含用于hsnap-23上的k206结合位点的结合袋突变的本发明的经修饰的bont/al链一般显示大于1.5％的hsnap-23切割(1微摩尔经修饰的bont/al链、20微摩尔hsnap-23、优选在约37℃孵育约1小时的％)—参见图1a中的第2数据列。作为参照，野生型bont/al链(例如seqidno:1)显示小于0.5％的hsnap-23切割(1微摩尔经修饰的bont/al链、20微摩尔hsnap-23、优选在约37℃孵育约1小时的％)—参见图1a中的第2数据列。这类经修饰的bont/al链(按相对于相应的野生型bont/al链seqidno:1的氨基酸取代提及)的实例包括：
含有取代y251d的经修饰的bont/al链；
含有取代y251e的经修饰的bont/al链；
含有取代l256d的经修饰的bont/al链。
在一个实施方案中，本发明的经修饰的bont/al链显示至少3％的hsnap-23切割(1微摩尔经修饰的bont/al链、20微摩尔hsnap-23、优选在约37℃孵育约1小时的％)—参见图1a中提供的第2数据列。这类经修饰的bont/al链(按相对于相应的野生型bont/al链seqidno:1的氨基酸取代提及)的实例包括：
含有取代y251e的经修饰的bont/al链。
具有用于hsnap-23上的k206的结合袋突变的经修饰的bont/al链(按相对于相应的野生型bont/al链seqidno:1的氨基酸取代提及)的其他实例包括：
含有取代v245d的经修饰的bont/al链；
含有取代l256e的经修饰的bont/al链；
含有取代l256g的经修饰的bont/al链；
含有取代l256q的经修饰的bont/al链；
含有取代l256a的经修饰的bont/al链；
含有取代v258a的经修饰的bont/al链；
含有取代v258p的经修饰的bont/al链；
含有取代v258l的经修饰的bont/al链；
含有取代l256e和v258p的经修饰的bont/al链；
含有取代l256q和v258p的经修饰的bont/al链；
含有取代l256a和v258l的经修饰的bont/al链；
含有取代l256g和v258l的经修饰的bont/al链。
在优选的实施方案中，具有用于hsnap-23上的k206结合位点的结合袋突变的本发明的经修饰的bont/al链可以在本文中所述的一个或多个不同的bont/al链结合袋内(例如在上文定义的用于hsnap-23上的p182/d178结合位点的结合袋内)进一步包含一个或多个突变。这类突变体一般显示降低至少0.5倍的hsnap-23切割(相对于e148y修饰的bont/al链而言)，或换言之至少增加4.0倍的hsnap-23切割(相对于野生型bont/al链而言)－参见图1b中针对多结合袋突变体提供的第1数据列；或至少5％的hsnap-23切割(1微摩尔经修饰的bont/al链、20微摩尔hsnap-23、优选在约37℃孵育约1小时的％)－参见图1b中的第2数据列。这类经修饰的bont/al链(按相对于相应的野生型bont/al链seqidno:1的氨基酸取代提及)的优选实例包括：
含有取代e148y和y251d的经修饰的bont/al链；
含有取代e148y和l256d的经修饰的bont/al链；
含有取代e148y和y251e的经修饰的bont/al链。
因此，在另一实施方案中，提供经修饰的bont/al链蛋白酶，其切割人snap-23(hsnap-23)，且相对于野生型bont/al链(seqidno:1)具有经修饰的氨基酸序列，其包含：
a)定位在用于结合hsnap-23的p182/d178结合位点的第一bont/al链蛋白酶结合袋内的氨基酸残基改变；其中该第一bont/al链蛋白酶结合袋定义为野生型bont/al链(seqidno:1)的氨基酸残基e148；和
b)定位在用于结合hsnap-23的k206结合位点的第五bont/al链蛋白酶结合袋内的氨基酸残基改变；其中该第五bont/al链蛋白酶结合袋定义为野生型bont/al链(seqidno:1)的氨基酸残基y251；和
c)其中所述氨基酸残基改变包含：
i.经修饰的l链蛋白酶氨基酸序列上对应于野生型bont/al链(seqidno:1)的氨基酸残基e148的位置处选自酪氨酸的氨基酸残基；和
ii.经修饰的l链蛋白酶氨基酸序列上对应于野生型bont/al链(seqidno:1)的氨基酸残基y251的位置处选自天冬氨酸的氨基酸残基。
在另一实施方案中，具有用于hsnap-23上的k206结合位点的结合袋突变的本发明的经修饰的bont/al链可以在本文中所述的至少三个不同的bont/al链结合袋内(例如在用于hsnap-23上的p182/d178结合位点的结合袋内，在用于hsnap-23上的r186结合位点的结合袋内，及在用于d189/d192结合位点的结合袋内，如上文所定义)进一步包含一个或多个突变。这类突变体一般显示增加至少1.3倍的hsnap-23切割(相对于e148y修饰的bont/al链而言)－参见图1b中针对多结合袋突变体提供的第1数据列。这类经修饰的bont/al链(按相对于相应的野生型bont/al链seqidno:1的氨基酸取代提及)的实例包括：
含有取代e148y、s143d、q29a和y251e的经修饰的bont/al链。
因此，在另一实施方案中，提供经修饰的bont/al链蛋白酶，其切割人snap-23(hsnap-23)，且相对于野生型bont/al链(seqidno:1)具有经修饰的氨基酸序列，其包含：
a)定位在用于结合hsnap-23的p182/d178结合位点的第一bont/al链蛋白酶结合袋内的氨基酸残基改变；其中该第一bont/al链蛋白酶结合袋定义为野生型bont/al链(seqidno:1)的氨基酸残基e148；和
b)定位在用于结合hsnap-23的r186结合位点的第五bont/al链蛋白酶结合袋内的氨基酸残基改变；其中该第五bont/al链蛋白酶结合袋定义为野生型bont/al链(seqidno:1)的氨基酸残基s143；和
c)定位在用于结合hsnap-23的d189/d192结合位点的第二bont/al链蛋白酶结合袋内的氨基酸残基改变；其中该第二bont/al链蛋白酶结合袋定义为野生型bont/al链(seqidno:1)的氨基酸残基q29a；和
d)定位在用于结合hsnap-23的k206结合位点的第六bont/al链蛋白酶结合袋内的氨基酸残基改变；其中该第六bont/al链蛋白酶结合袋定义为野生型bont/al链(seqidno:1)的氨基酸残基y251；和
e)其中所述氨基酸残基改变包含：
i.经修饰的l链蛋白酶氨基酸序列上对应于野生型bont/al链(seqidno:1)的氨基酸残基e148的位置处选自酪氨酸的氨基酸残基；和
ii.经修饰的l链蛋白酶氨基酸序列上对应于野生型bont/al链(seqidno:1)的氨基酸残基s143的位置处选自天冬氨酸的氨基酸残基；和
iii.经修饰的l链蛋白酶氨基酸序列上对应于野生型bont/al链(seqidno:1)的氨基酸残基q29的位置处选自丙氨酸的氨基酸残基；和
iv.经修饰的l链蛋白酶氨基酸序列上对应于野生型bont/al链(seqidno:1)的氨基酸残基y251的位置处选自谷氨酸的氨基酸残基。
作为另一技术特征或作为备选的技术特征，本发明包括在本文中定义的bont/al链结合袋内含有一个或多个突变的bont/al链突变体。作为实例，切割人snap-23(hsnap-23)的本发明的经修饰的bont/al链相对于野生型bont/al链(seqidno:1)具有经修饰的氨基酸序列，其包含：
a)定位在用于结合hsnap-23的i198结合位点的第三bont/al链蛋白酶结合袋内的氨基酸残基改变；
b)其中所述第三bont/al链蛋白酶结合袋定义为野生型bont/al链(seqidno:1)的氨基酸残基k166；和
c)其中所述氨基酸残基改变包含：
i.经修饰的l链蛋白酶氨基酸序列上对应于野生型bont/al链(seqidno:1)的氨基酸残基k166的位置处选自缬氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸和异亮氨酸的氨基酸残基。
不希望受限于任何理论，申请人认为，上文定义的bont/al链结合袋可以在hsnap-23上的i198和bont/a的氨基酸166之间提供稳定化疏水相互作用。
包含用于hsnap-23上的i198结合位点的结合袋突变的本发明的经修饰的bont/al链一般显示大于9％的hsnap-23切割(1微摩尔经修饰的bont/al链、20微摩尔hsnap-23、优选在约37℃孵育约1小时的％)—参见图1a中提供的第2数据列。作为参照，野生型bont/al链(例如seqidno:1)显示小于0.5％的hsnap-23切割(1微摩尔经修饰的bont/al链、20微摩尔hsnap-23、优选在约37℃孵育约1小时的％)—参见图1a中提供的第2数据列。这类经修饰的bont/al链(按相对于相应的野生型bont/al链seqidno:1的氨基酸取代提及)的实例包括：
含有取代k166v的经修饰的bont/al链；
含有取代k166f的经修饰的bont/al链；
含有取代k166l的经修饰的bont/al链；
含有取代k166i的经修饰的bont/al链。
在一个实施方案中，包含用于hsnap-23上的i198结合位点的结合袋突变的本发明的经修饰的bont/al链一般显示大于40％的hsnap-23切割(1微摩尔经修饰的bont/al链、20微摩尔hsnap-23、优选在约37℃孵育约1小时的％)—参见图1a中提供的第2数据列。这类经修饰的bont/al链(按相对于相应的野生型bont/al链seqidno:1的氨基酸取代提及)的实例包括：
含有取代k166f的经修饰的bont/al链；
含有取代k166l的经修饰的bont/al链。
在另一实施方案中，包含用于hsnap-23上的i198结合位点的结合袋突变的本发明的经修饰的bont/al链一般显示大于60％的hsnap-23切割(1微摩尔经修饰的bont/al链、20微摩尔hsnap-23、优选在约37℃孵育约1小时的％)—参见图1a中提供的第2数据列。这类经修饰的bont/al链(按相对于相应的野生型bont/al链seqidno:1的氨基酸取代提及)的实例包括：
含有取代k166f的经修饰的bont/al链。
在优选的实施方案中，具有用于hsnap-23上的i198结合位点的结合袋突变的本发明的经修饰的bont/al链可以在本文中所述的一个或多个不同的bont/al链结合袋内(例如在至少两个不同的bont/al链结合袋内，如用于hsnap-23上的p182/d178结合位点的结合袋和用于hsnap-23上的k185或r186结合位点的结合袋)进一步包含一个或多个突变。这类突变体一般显示至少40％的hsnap-23切割(1微摩尔经修饰的bont/al链、20微摩尔hsnap-23、优选在约37℃孵育约1小时的％)—参见图1b中提供的第2数据列。这类经修饰的bont/al链(按相对于相应的野生型bont/al链seqidno:1的氨基酸取代提及)的实例包括：
含有取代e148y、k166f和g305d的经修饰的bont/al链；
含有取代e148y、k166v和g305d的经修饰的bont/al链；
含有取代e148y、s143d和k166f的经修饰的bont/al链。
因此，在另一实施方案中，提供经修饰的bont/al链蛋白酶，其切割人snap-23(hsnap-23)，且相对于野生型bont/al链(seqidno:1)具有经修饰的氨基酸序列，其包含：
a)定位在用于结合hsnap-23的p182/d178结合位点的第一bont/al链蛋白酶结合袋内的氨基酸残基改变；其中该第一bont/al链蛋白酶结合袋定义为野生型bont/al链(seqidno:1)的氨基酸残基e148；和
b)定位在用于结合hsnap-23的i198结合位点的第三bont/al链蛋白酶结合袋内的氨基酸残基改变；其中该第三bont/al链蛋白酶结合袋定义为野生型bont/al链(seqidno:1)的氨基酸残基k166；和
c)定位在用于结合hsnap-23的k185结合位点的第四bont/al链蛋白酶结合袋内的氨基酸残基改变；其中该第四bont/al链蛋白酶结合袋定义为野生型bont/al链(seqidno:1)的氨基酸残基g305；
d)其中所述氨基酸残基改变包含：
i.经修饰的l链蛋白酶氨基酸序列上对应于野生型bont/al链(seqidno:1)的氨基酸残基e148的位置处选自酪氨酸的氨基酸残基；和
ii.经修饰的l链蛋白酶氨基酸序列上对应于野生型bont/al链(seqidno:1)的氨基酸残基k166的位置处选自缬氨酸的氨基酸残基；和
iii.经修饰的l链蛋白酶氨基酸序列上对应于野生型bont/al链(seqidno:1)的氨基酸残基g305的位置处选自天冬氨酸的氨基酸残基。
在另一实施方案中，具有用于hsnap-23上的i198结合位点的结合袋突变的本发明的经修饰的bont/al链可以在至少两个不同的bont/al链结合袋内(例如在用于hsnap-23上的p182/d178结合位点的结合袋内，及在用于hsnap-23上的k185或r186结合位点的结合袋内)进一步包含一个或多个突变。这类突变体一般显示至少15％的hsnap-23切割(10纳摩尔经修饰的bont/al链、20微摩尔hsnap-23、优选在约37℃孵育约1小时的％)—参见图1b中提供的第2数据列**。这类经修饰的bont/al链(按相对于相应的野生型bont/al链seqidno:1的氨基酸取代提及)的实例包括：
含有取代e148y、k166f和g305d的经修饰的bont/al链；
含有取代e148y、s143d和k166f的经修饰的bont/al链。
在一个实施方案中，具有用于hsnap-23上的i198结合位点的结合袋突变的本发明的经修饰的bont/al链可以在至少三个不同的bont/al链结合袋内(例如在用于hsnap-23上的p182/d178结合位点的结合袋内，在用于hsnap-23上的d189/d192结合位点的结合袋内，及在用于hsnap-23上的k185结合位点的结合袋内，如上文所定义)进一步包含一个或多个突变。这类突变体一般显示至少60％的hsnap-23切割(1微摩尔经修饰的bont/al链、20微摩尔hsnap-23、优选在约37℃孵育约1小时的％)—参见图1b中提供的第2数据列。这类经修饰的bont/al链(按相对于相应的野生型bont/al链seqidno:1的氨基酸取代提及)的实例包括：
含有取代e148y、q29a、k166v和g305d的经修饰的bont/al链；
含有取代e148y、q29a、k166f和g305d的经修饰的bont/al链。
因此，在另一实施方案中，提供经修饰的bont/al链蛋白酶，其切割人snap-23(hsnap-23)，且相对于野生型bont/al链(seqidno:1)具有经修饰的氨基酸序列，其包含：
a)定位在用于结合hsnap-23的p182/d178结合位点的第一bont/al链蛋白酶结合袋内的氨基酸残基改变；其中该第一bont/al链蛋白酶结合袋定义为野生型bont/al链(seqidno:1)的氨基酸残基e148；和
b)定位在用于结合hsnap-23的i198结合位点的第三bont/al链蛋白酶结合袋内的氨基酸残基改变；其中该第三bont/al链蛋白酶结合袋定义为野生型bont/al链(seqidno:1)的氨基酸残基k166；和
c)定位在用于结合hsnap-23的d189/d192结合位点的第二bont/al链蛋白酶结合袋内的氨基酸残基改变；其中该第二bont/al链蛋白酶结合袋定义为野生型bont/al链(seqidno:1)的氨基酸残基q29a；和
d)定位在用于结合hsnap-23的k185结合位点的第四bont/al链蛋白酶结合袋内的氨基酸残基改变；其中该第四bont/al链蛋白酶结合袋定义为野生型bont/al链(seqidno:1)的氨基酸残基g305；
e)其中所述氨基酸残基改变包含：
i.经修饰的l链蛋白酶氨基酸序列上对应于野生型bont/al链(seqidno:1)的氨基酸残基e148的位置处选自酪氨酸的氨基酸残基；和
ii.经修饰的l链蛋白酶氨基酸序列上对应于野生型bont/al链(seqidno:1)的氨基酸残基k166的位置处选自缬氨酸的氨基酸残基；和
iii.经修饰的l链蛋白酶氨基酸序列上对应于野生型bont/al链(seqidno:1)的氨基酸残基q29的位置处选自丙氨酸的氨基酸残基；和
iv.经修饰的l链蛋白酶氨基酸序列上对应于野生型bont/al链(seqidno:1)的氨基酸残基g305的位置处选自天冬氨酸的氨基酸残基。
在另一实施方案中，具有用于hsnap-23上的i198结合位点的结合袋突变的本发明的经修饰的bont/al链可以在至少三个不同的bont/al链结合袋内(例如在用于hsnap-23上的p182/d178结合位点的结合袋内，在用于hsnap-23上的d189/d192结合位点的结合袋内，及在用于hsnap-23上的k185结合位点的结合袋内)进一步包含一个或多个突变。这类突变体一般显示至少10％的hsnap-23切割(10纳摩尔经修饰的bont/al链、20微摩尔hsnap-23、优选在约37℃孵育约1小时的％)—参见图1b中提供的第2数据列**。这类经修饰的bont/al链(按相对于相应的野生型bont/al链seqidno:1的氨基酸取代提及)的实例包括：
含有取代e148y、q29a、k166f和g305d的经修饰的bont/al链。
具有用于hsnap-23上的i198的结合袋突变的经修饰的bont/al链突变体(按相对于相应的野生型bont/al链seqidno:1的氨基酸取代提及)的其他实例包括：
含有取代e148y、q29a、k166f、y251e和g305d的经修饰的bont/al链。
在一个实施方案中，具有用于hsnap-23上的i198结合位点的结合袋突变的本发明的经修饰的bont/al链可以在一个或多个不同的bont/al链结合袋内(例如在用于hsnap-23上的p182/d178结合位点的结合袋内，或在用于hsnap-23上的k185结合位点的结合袋内，如上文所定义)进一步包含一个或多个突变。这类突变体一般显示至少3％的hsnap-23切割(10纳摩尔经修饰的bont/al链、20微摩尔hsnap-23、优选在约37℃孵育约1小时的％)—参见图1b中提供的第2数据列**。这类经修饰的bont/al链(按相对于相应的野生型bont/al链seqidno:1的氨基酸取代提及)的实例包括：
含有取代e148y和k166f的经修饰的bont/al链；
含有取代g305d和k166f的经修饰的bont/al链。
在另一实施方案中，具有用于hsnap-23上的i198结合位点的结合袋突变的本发明的经修饰的bont/al链可以在一个或多个不同的bont/al链结合袋内(例如在用于hsnap-23上的p182/d178结合位点的结合袋内，或在用于hsnap-23上的k185结合位点的结合袋内)进一步包含一个或多个突变。这类突变体一般显示至少5％的hsnap-23切割(10纳摩尔经修饰的bont/al链、20微摩尔hsnap-23、优选在约37℃孵育约1小时的％)—参见图1b中提供的第2数据列**。这类经修饰的bont/al链(按相对于相应的野生型bont/al链seqidno:1的氨基酸取代提及)的实例包括：
含有取代e148y和k166f的经修饰的bont/al链。
作为另一技术特征或作为备选的技术特征，本发明包括在本文中定义的bont/al链结合袋内含有一个或多个突变的bont/al链突变体。作为实例，切割人snap-23(hsnap-23)的本发明的经修饰的bont/al链相对于野生型bont/al链(seqidno:1)具有经修饰的氨基酸序列，其包含：
a)定位在用于结合hsnap-23的d210结合位点的第七bont/al链蛋白酶结合袋内的氨基酸残基改变；
b)其中所述第七bont/al链蛋白酶结合袋定义为野生型bont/al链(seqidno:1)的氨基酸残基s254；
c)其中所述氨基酸残基改变包含：
i.经修饰的l链蛋白酶氨基酸序列上对应于野生型bont/al链(seqidno:1)的氨基酸残基s254的位置上的(例如)氨基酸残基丙氨酸。
不希望受限于任何理论，申请人认为，上文定义的bont/al链结合袋可以与hsnap-23的d210结合位点显示氢键合。此外，申请人认为该结合袋(如本文中所定义)的修饰消除了hsnap-23上的d210和bont/a的氨基酸254之间本可形成的氢键。转而认为这以更好的“离去基团”的形式产生c端hsnap-23切割产物，由此增强hsnap-23切割速率。
这类经修饰的bont/al链(按相对于相应的野生型bont/al链seqidno:1的氨基酸取代提及)的实例包括：
含有取代s254a的经修饰的bont/al链。
在一个实施方案中，具有用于hsnap-23上的d210结合位点的结合袋突变的本发明的经修饰的bont/al链可以在本文中所述的一个或多个不同的bont/al链结合袋内(例如在至少两个或三个不同的bont/al链结合袋内，如用于hsnap-23上的p182/d178结合位点的结合袋，用于hsnap-23上的i198结合位点的结合袋，及任选的用于hsnap-23上的k185结合位点的结合袋)进一步包含一个或多个突变。这类突变体一般显示至少10％的hsnap-23切割(10纳摩尔经修饰的bont/al链、20微摩尔hsnap-23、优选在约37℃孵育约1小时的％)—参见图1b中提供的第2数据列**。这类经修饰的bont/al链的实例包括：
含有取代e148y、k166f和s254a的经修饰的bont/al链；
含有取代e148y、k166f、s254a和g305d的经修饰的bont/al链。
在优选的实施方案中，具有用于hsnap-23上的d210结合位点的结合袋突变的本发明的经修饰的bont/al链可以在本文中所述的一个或多个不同的bont/al链结合袋内(例如在至少三个不同的bont/al链结合袋内，如用于hsnap-23上的p182/d178结合位点的结合袋，用于hsnap-23上的i198结合位点的结合袋，及用于hsnap-23上的k185结合位点的结合袋)进一步包含一个或多个突变。这类突变体一般显示至少25％的hsnap-23切割(10纳摩尔经修饰的bont/al链、20微摩尔hsnap-23、优选在约37℃孵育约1小时的％)—参见图1b中提供的第2数据列**。这类经修饰的bont/al链(按相对于相应的野生型bont/al链seqidno:1的氨基酸取代提及)的实例包括：
含有取代e148y、k166f、s254a和g305d的经修饰的bont/al链。
作为另一技术特征或作为备选的技术特征，本发明包括在本文中定义的bont/al链结合袋内含有一个或多个突变的bont/al链突变体。作为实例，切割人snap-23(hsnap-23)的本发明的经修饰的bont/al链相对于野生型bont/al链(seqidno:1)具有经修饰的氨基酸序列，其包含：
a)定位在用于结合hsnap-23的d168结合位点的第八bont/al链蛋白酶结合袋内的氨基酸残基改变；
b)其中所述第八bont/al链蛋白酶结合袋定义为野生型bont/al链(seqidno:1)的氨基酸残基k340；
c)其中所述氨基酸残基改变包含：
i.经修饰的l链蛋白酶氨基酸序列上对应于野生型bont/al链(seqidno:1)的氨基酸残基k340的位置上的(例如)氨基酸残基组氨酸。
不希望受限于任何理论，申请人认为，上文定义的bont/al链结合袋在hsnap-23上的d168和bont/a的氨基酸340之间提供了盐桥。
这类经修饰的bont/al链(按相对于相应的野生型bont/al链seqidno:1的氨基酸取代提及)的实例包括：
含有取代k340h的经修饰的bont/al链。
在一个实施方案中，具有用于hsnap-23上的p182/d178结合位点的结合袋突变的本发明的经修饰的bont/al链可以在用于hsnap-23上的d168结合位点的bont/al链结合袋内进一步包含一个或多个突变。这类突变体一般显示至少3％的hsnap-23切割(1微摩尔经修饰的bont/al链、20微摩尔hsnap-23、优选在约37℃孵育约1小时的％)—参见图1b中提供的第2数据列。这类经修饰的bont/al链(按相对于相应的野生型bont/al链seqidno:1的氨基酸取代提及)的实例包括：
含有取代e148y和k340h的经修饰的bont/al链。
上述经修饰的bont/al链蛋白酶可以包含与野生型bont/al链(seqidno:1)具有至少70％、例如至少80％或至少85％或至少90％或至少95％或至少97％或至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。如前所述，本说明书通篇提到的经修饰的bont/al链蛋白酶涵盖其功能性片段，即该蛋白酶的切割hsnap-23的片段。例如，本发明的经修饰的bont/al链蛋白酶包含至少300个(例如至少350个或至少400个或至少410个)氨基酸。作为实例，肉毒杆菌神经毒素l链蛋白酶的n端8个氨基酸和/或羧基端(例如最后32个氨基酸)并非蛋白水解活性所需。
可以peg化本发明的经修饰的bont/al链以提高稳定性，例如蛋白酶成分的作用持续时间。peg化优选包括将peg加至l链的n端。作为实例，l链的n端可以用一个或多个氨基酸(例如半胱氨酸)残基延伸。该氨基酸残基中的一个或多个可以具有与之连接(例如共价连接)的其自身的peg分子。此技术的实例描述于wo2007/104567中，在此以其整体引入作为参考。
本发明的经修饰的bont/al链可以包括加入(或去除)“第二修饰位点”－参见wo2002/040506、us7223577和wo2005/068494，每个专利在此以其整体引入作为参考。这类位点的额外存在或缺乏(相对于野生型bontl链)改变本发明的经修饰的l链的生物持久性(例如生物半衰期)。
本发明的第二方面提供核酸构建体，其包含或含有编码本文中所述经修饰的bont/al链的核酸序列。该核酸序列可以优选编码下文进一步描述的tsi递送载体。本发明的核酸构建体可以包含常规调节元件，如启动子和/或终止子。
在一个实施方案中，该核酸构建体以细菌质粒或病毒载体的形式提供。该核酸构建体可以任选地进行密码子偏好处理，以优化在目的宿主细胞(例如大肠杆菌(e.coli))中的表达(例如重组表达)。
在一个实施方案中，如为了治疗或美容目的，编码本文中所述经修饰的bont/al链的核酸构建体可用于对目的靶细胞施用。为此，通常以常规方法优化该核酸构建体，用于递送入靶细胞优选人细胞(然后在靶细胞内表达)。该靶细胞优选非神经元细胞。
本发明的第三方面提供用于经修饰的bont/al链的递送载体，由此便于该经修饰的bont/al链进入目的靶细胞。根据此方面，本发明更尤其涉及递送载体，其包含：
a)本发明的经修饰的bont/al链蛋白酶或核酸构建体，所述核酸构建体包含或由编码本发明的经修饰的bont/al链的核酸序列组成；和
b)将该经修饰的bont/al链蛋白酶或该核酸构建体递送至靶细胞的元件。
用于这种递送的优选元件包括本领域已知的任何常规递送载体技术，如脂质体、生物射弹粒子、细胞穿透肽、基因转移载体等。
一种尤其优选的高度适合用于本发明的递送技术是申请人专有的靶向分泌抑制物(tsi)技术。用于产生tsi的基本方法有大量资料记载且现在认为是常规方法(参见例如wo98/07864、wo2006/059113、wo2009/150469、wo2010/020811、wo2009/150470、wo2010/094905、wo2012/156743，每篇专利在此以其整体引入作为参考)。tsi技术依赖于这样的递送机制，该机制模拟梭菌神经毒素使宿主细胞中毒时所利用的相同的基本步骤(即结合靶细胞、内体形成、l链易位进入胞质溶胶、通过l链蛋白水解切割snare蛋白)。tsi递送载体基于具有三种基本成分的简单的梭菌神经毒素骨架：
1)梭菌神经毒素l链；
2)指导递送载体至所选择的靶细胞的靶向部分(tm)。通常，可用配体替换天然梭菌神经毒素结合结构域(hcc)，以提供递送载体与该hcc的天然靶细胞之外的目的靶细胞选择性结合。在优选的实施方案中，可以使用多于一个tm(任选地包括梭菌神经毒素结合结构域)；
3)确保梭菌神经毒素l链递送进入随后它可在其中发挥其蛋白水解作用(即切割snare蛋白)的靶细胞的易位肽(例如梭菌神经毒素hn易位结构域)。
因此，在优选的实施方案中，本发明的递送载体的元件b)可以包含：
-i)使递送载体与靶细胞结合的靶向部分(tm)。该靶向部分可以是天然梭菌神经毒素结合结构域(hcc)，或更优选地，是提供与该hcc的天然靶细胞之外的靶细胞结合的配体；和
-ii)使本发明的经修饰的bont/al链蛋白酶易位进入靶细胞优选地进入该细胞的胞质溶胶的易位肽。
本发明的递送载体通常包括一个或多个靶向部分(tm)。提到的tm涵盖了与位点(例如受体或接受体)功能性相互作用导致本发明的经修饰的bont/al链蛋白酶和哺乳动物靶细胞(例如人细胞)表面之间的物理结合的任何结构(通常为肽)。位点优选是能够内化(例如内体形成)(也称为受体介导的胞吞作用)的位点。tm可具有内体膜易位功能，在这种情况下，无需利用分开的tm和易位结构域组分。
本发明的tm结合(例如特异性结合)所选择的靶细胞。术语“特异性结合”优选指给定的tm以106m-1或更高、例如107m-1或更高、108m-1或更高、或109m-1或更高的结合亲和力(ka)结合靶细胞。
确认tm结合所选择的靶细胞是常规的。例如，可以利用简单的放射性替换实验，其中使代表目的靶细胞的组织或细胞在过量未标记的tm存在下暴露于标记(例如氚化)的tm。在这种实验中，可以评估非特异性和特异性结合的相对比例，由此允许确认tm与靶细胞结合。任选地，该测定法可以包括一种或多种结合拮抗剂，该测定法可进一步包括观察tm结合的丢失。这类实验的实例可见于hulme,e.c.(1990),receptor-bindingstudies,abriefoutline,303-311页,inreceptorbiochemistry,apracticalapproach,ed.e.c.hulme,oxforduniversitypress中。
本发明的tm优选结合非神经元靶细胞(例如肥大细胞和/或上皮细胞－参见例如wo00/10598和wo01/21213，每篇专利在此以其整体引入作为参考)。为此，该tm能够指导递送载体至所选择的表现所不希望hsnap-23表型(任选地所不希望的snap-25表型)的非神经元靶细胞。同时，本发明的tm可以分别地(例如通过相同的tm或通过第二tm)结合所选择的第二靶细胞，例如结合第二非神经元靶细胞或结合表现所不希望的hsnap-23和/或snap-25表型的神经元靶细胞。
适宜的tm包括：哺乳动物细胞结合位点受体的配体如细胞因子、生长因子、神经肽、凝集素和抗体—此术语包括单克隆抗体、单链抗体和抗体片段，如fab、f(ab)’2、fv、scfv等。
通过进一步举例，tm包括瘦蛋白肽、生长激素释放肽受体、生长抑素肽、胰岛素生长因子肽、erbb肽(例如egf)、vip胰高血糖素grf分泌肽(例如pacap肽)、白细胞介素肽(例如il-1、il-2、il-6或il-10肽)、ngf肽、vegf肽、蛙皮素肽、硬骨鱼紧张肽、黑色素浓缩激素肽、催乳素释放激素肽、kiss-1肽、crf肽、ghrh肽、p物质肽、β-2肾上腺素受体肽、胃泌素释放肽、降钙素基因相关肽、血小板衍生生长因子肽、角质形成细胞生长因子肽、肝细胞生长因子肽、tgf-α肽、tgf-β肽、心房钠尿肽和整联蛋白肽。
本发明的递送载体通常缺乏(功能性)梭菌神经毒素结合结构域(作为tm)。
备选地，本发明的递送载体可以包括(功能性)梭菌神经毒素结合结构域(作为tm)。提到梭菌神经毒素结合结构域涵盖梭菌神经毒素的hc(更确切地说，hcc)部分，以及其保留hc结构域的结合能力(例如在如shone等(1985)eur.j.biochem.151,75-82中所述的常规结合测定法中结合大鼠突触小体膜)的突变体。
天然梭菌神经毒素的hc结合结构域/肽包含约400-440个氨基酸残基，并由两个功能不同的各约25kda的结构域组成，即n端区域(通常称为hcn肽或结构域)和c端区域(通常称为hcc肽或结构域)。正是构成c端160-200个氨基酸残基的c端区域(hcc)负责梭菌神经毒素(与神经肌肉连接处的神经末梢)的结合。示例性hcc肽包括：
肉毒a型神经毒素-氨基酸残基(y1111-l1296)
肉毒b型神经毒素-氨基酸残基(y1098-e1291)
肉毒c型神经毒素-氨基酸残基(y1112-e1291)
肉毒d型神经毒素-氨基酸残基(y1099-e1276)
肉毒e型神经毒素-氨基酸残基(y1086-k1252)
肉毒f型神经毒素-氨基酸残基(y1106-e1274)
肉毒g型神经毒素-氨基酸残基(y1106-e1297)
破伤风神经毒素-氨基酸残基(y1128-d1315)。
上文鉴定出的参考序列应视为指导，因为根据亚血清型可存在轻微变异。
本发明的递送载体通常包括易位肽，其使得经修饰的l链能够易位进入靶标的胞质溶胶。可通过许多常规测定法中的任一种来确认肽是否具有本发明所必需的易位功能。例如，shonec.(1987)描述了利用脂质体的体外测定法，其中用测试分子攻击该脂质体。通过可容易地监测的k+和/或标记nad从脂质体的释放来确认所必需的易位功能的存在[参见shonec.(1987)eur.j.biochem；167(1)卷:175-180页]。blausteinr.(1987)提供了另一实例，其描述了利用平面磷脂双层膜的简单的体外测定法。用测试分子攻击膜，通过跨该膜的电导的增加来确认所必需的易位功能[参见blaustein(1987)febsletts；226卷,1期:115-120页]。methodsinenzymology220和221卷,membranefusiontechniques,partsa和b,academicpress1993提供了使得能够评估膜融合从而鉴定适合用于本发明的易位结构域的其他方法。
易位结构域可以属于梭菌来源，如神经毒素的hn结构域/部分。谈及“hn结构域”指梭菌神经毒素的h链的约等于h链的氨基端一半的片段。梭菌神经毒素的hn结构域缺乏h链的hc成分的天然结合功能。因此，hn结构域不能结合天然梭菌神经毒素(即全毒素)所结合的靶细胞上的结合位点。
适宜的(参考)易位结构域的实例包括：
肉毒a型神经毒素-氨基酸残基(449-871)
肉毒b型神经毒素-氨基酸残基(441-858)
肉毒c型神经毒素-氨基酸残基(442-866)
肉毒d型神经毒素-氨基酸残基(446-862)
肉毒e型神经毒素-氨基酸残基(423-845)
肉毒f型神经毒素-氨基酸残基(440-864)
肉毒g型神经毒素-氨基酸残基(442-863)
破伤风神经毒素-氨基酸残基(458-879)
研究显示，来自梭菌神经毒素重链的全长hn部分并非易位活性所必需。因此，此实施方案的方面可以包括梭菌毒素hn区域，其包含具有例如至少350个氨基酸、至少375个氨基酸、至少400个氨基酸和至少425个氨基酸的长度的易位结构域。关于肉毒梭菌和破伤风梭菌(c.tetani)中毒素产生的遗传基础的其他详情，我们参考henderson等(1997)，theclostridia:molecularbiologyandpathogenesis,academicpress。
术语hn涵盖天然存在的神经毒素hn部分，以及具有自然界中不存在的氨基酸序列的变体hn部分，只要该变体hn部分仍显示上述易位功能。例如，梭菌神经毒素hn部分涵盖与野生型梭菌神经毒素hn部分具有至少70％(例如至少80％或至少85％或至少90％或至少95％或至少97％或至少98％或至少99％)序列同一性的变体氨基酸序列，前提条件是保留易位功能。
备选地，易位肽可以属于非梭菌来源，例如白喉毒素的易位结构域[o.keefe等,proc.natl.acad.sci.usa(1992)89,6202-6206；silverman等,j.biol.chem.(1993)269,22524-22532；及london,e.(1992)biochem.biophys.acta.,1112,25-51页]、假单胞菌外毒素a型的易位结构域[prior等biochemistry(1992)31,3555-3559]、炭疽毒素的易位结构域[blanke等proc.natl.acad.sci.usa(1996)93,8437-8442]、多种具有易位功能的融合或疏水肽[plank等，j.biol.chem.(1994)269,12918-12924；及wagner等(1992)pnas,89,7934-7938页]和两亲性肽[murata等(1992)biochem.,31,1986-1992页]。
提到非梭菌神经毒素易位肽涵盖与相应的非梭菌野生型易位肽序列具有至少70％(例如至少80％或至少85％或至少90％或至少95％或至少97％或至少98％或至少99％)序列同一性的片段和变体氨基酸序列，前提条件是该变体具有所必需的易位功能。
本发明的多肽可以进一步包含易位促进结构域。该结构域便于递送非细胞毒性蛋白酶进入靶细胞的胞质溶胶，描述于例如wo08/008803和wo08/008805中，每篇专利在此引入作为参考。
作为实例，适宜的易位促进结构域包括包膜病毒融合肽结构域，例如，适宜的融合肽结构域包括流感病毒融合肽结构域(例如23个氨基酸的甲型流感病毒融合肽结构域)、甲病毒融合肽结构域(例如26个氨基酸的semliki森林病毒融合肽结构域)、水泡病毒融合肽结构域(例如21个氨基酸的水泡性口炎病毒融合肽结构域)、呼吸道病毒融合肽结构域(例如25个氨基酸的仙台病毒融合肽结构域)、麻疹病毒(morbiliivirus)融合肽结构域(例如25个氨基酸的犬瘟热病毒融合肽结构域)、禽腮腺炎病毒(avulavirus)融合肽结构域(例如25个氨基酸的新城疫病毒融合肽结构域)、亨尼病毒融合肽结构域(例如25个氨基酸的亨德拉病毒融合肽结构域)、偏肺病毒融合肽结构域(例如25个氨基酸的人类偏肺病毒融合肽结构域)或泡沫病毒融合肽结构域如猿猴泡沫病毒融合肽结构域；或其片段或变体。
作为进一步的实例，易位促进结构域可以包含梭菌神经毒素hcn结构域或片段或变体(与相应的野生型序列具有至少70％序列同一性)，前提条件是保留增强的易位功能。更详细而言，梭菌毒素hcn易位促进结构域可以具有至少200个氨基酸、至少225个氨基酸、至少250个氨基酸、至少275个氨基酸的长度。在这方面，梭菌毒素hcn易位促进结构域优选具有至多200个氨基酸、至多225个氨基酸、至多250个氨基酸、或至多275个氨基酸的长度。具体(参考)实例包括：
肉毒a型神经毒素-氨基酸残基(872-1110)
肉毒b型神经毒素-氨基酸残基(859-1097)
肉毒c型神经毒素-氨基酸残基(867-1111)
肉毒d型神经毒素-氨基酸残基(863-1098)
肉毒e型神经毒素-氨基酸残基(846-1085)
肉毒f型神经毒素-氨基酸残基(865-1105)
肉毒g型神经毒素-氨基酸残基(864-1105)
破伤风神经毒素-氨基酸残基(880-1127)。
本发明的第四方面提供切割hsnap-23的方法，该方法包括使hsnap-23与本文中所述的经修饰的bont/al链蛋白酶、或核酸构建体、或递送载体接触，由此允许经修饰的bont/al链结合该hsnap-23，然后通过经修饰的bont/al链蛋白酶蛋白水解切割hsnap-23。在一个实施方案中，该方法在体外进行。
在一个实施方案中，该切割hsnap-23的方法包括以下初步步骤：
1)递送载体通过其靶向部分(tm)结合靶细胞；和
2)经修饰的bont/al链通过递送载体的易位肽易位进入靶细胞，优选地进入该靶细胞的胞质溶胶。
优选地，tm结合靶细胞上的位点(例如蛋白质、糖和/或脂质分子)，该位点能够进行受体介导的胞吞，然后递送载体通过内体形成内化在靶细胞内。然后，递送载体的易位肽可以使经修饰的bont/al链易位跨过内体膜，进入靶细胞的胞质溶胶。
在另一方面，本发明涉及本文中所述的经修饰的(bont/a)l链蛋白酶、核酸构建体、或递送载体，用于上文所述切割hsnap23的方法中。
在另一方面，本发明涵盖本文中所述的经修饰的(bont/a)l链蛋白酶用于治疗方法，优选治疗分泌性疾病的方法。
因此，一方面提供本文中所述的bont/al链蛋白酶、或本文中所述的核酸构建体、或本文中所述的递送载体用做药物。
在这类方面，该经修饰的(bont/a)l链蛋白酶优选包含在还含有重链的bont即全长bont内。这类全长bont通常具有150kda的多肽链，包含通过二硫键连接的100kda重链和50kda轻链，组织为三个功能结构域：n端蛋白水解轻链(l链)和c端重链(h链)，后者由易位结构域(hn)和c端神经元结合结构域(hc)组成。
优选的分泌性疾病包括肌肉痉挛/肌肉过度活动(包括中风后痉挛、脊髓损伤后痉挛、头颈部痉挛、眼睑痉挛、阴道痉挛、四肢痉挛、下颌痉挛和声带痉挛)、斜视、多汗症和严重原发性腋窝多汗。
根据以下详述的实施例，将更好地理解本发明。然而，本领域技术人员将理解，此详细描述不是限制性的，可以在不背离本发明的范围的情况下进行多种修改、替换、省略和改变。
附图描述
图1-本发明的经修饰的bont/al链蛋白酶的hsnap-23和hsnap25切割数据。(a)在单个结合袋中具有突变的bont/al链蛋白酶的数据，(b)在多个结合袋中具有突变的bont/al链蛋白酶的数据。
图2-bont/al链蛋白酶(轮廓)与snap-25/23结合袋相互作用的3d渲染图像(线条渲染)。
氨基酸序列
seqidno:1-野生型bont/a轻链(uniprota5hzz9的氨基酸残基1-438)
mpfvnkqfnykdpvngvdiayikipnagqmqpvkafkihnkiwviperdtftnpeegdlnpppeakqvpvsyydstylstdnekdnylkgvtklferiystdlgrmlltsivrgipfwggstidtelkvidtncinviqpdgsyrseelnlviigpsadiiqfecksfghevlnltrngygstqyirfspdftfgfeeslevdtnpllgagkfatdpavtlahelihaghrlygiainpnrvfkvntnayyemsglevsfeelrtfgghdakfidslqenefrlyyynkfkdiastlnkaksivgttaslqymknvfkekyllsedtsgkfsvdklkfdklykmlteiytednfvkffkvlnrktylnfdkavfkinivpkvnytiydgfnlrntnlaanfngqnteinnmnftklknftglfefykllcvrgiitsk
seqidno:2-人snap23
mdnlsseeiqqrahqitdeslestrrilglaiesqdagiktitmldeqkeqlnrieegldqinkdmretektltelnkccglcvcpcnrtknfesgkaykttwgdggenspcnvvskqpgpvtngqlqqpttgaasggyikritndaredemeenltqvgsilgnlkdmalnigneidaqnpqikritdkadtnrdridianarakklids
seqidno:3-人和啮齿类动物snap25
maedadmrneleemqrradqladeslestrrmlqlveeskdagirtlvmldeqgeqlerieegmdqinkdmkeaeknltdlgkfcglcvcpcnklkssdaykkawgnnqdgvvasqparvvdereqmaisggfirrvtndarenemdenleqvsgiignlrhmaldmgneidtqnrqidrimekadsnktrideanqratkmlgsg
seqidno:4-iga-蛋白酶位点his6标签(人工的)
pptpghhhhhh
seqidno:5-双strep标签(人工的)
maswshpqfekgggsgggsgggswshpqfekgags
seqidno:6-his6标签(人工的)
ghhhhhh
seqidno:7-v-iga-蛋白酶位点his6标签(人工的)
vpptpghhhhhh
seqidno:8-野生型bont/a1
mpfvnkqfnykdpvngvdiayikipnagqmqpvkafkihnkiwviperdtftnpeegdlnpppeakqvpvsyydstylstdnekdnylkgvtklferiystdlgrmlltsivrgipfwggstidtelkvidtncinviqpdgsyrseelnlviigpsadiiqfecksfghevlnltrngygstqyirfspdftfgfeeslevdtnpllgagkfatdpavtlahelihaghrlygiainpnrvfkvntnayyemsglevsfeelrtfgghdakfidslqenefrlyyynkfkdiastlnkaksivgttaslqymknvfkekyllsedtsgkfsvdklkfdklykmlteiytednfvkffkvlnrktylnfdkavfkinivpkvnytiydgfnlrntnlaanfngqnteinnmnftklknftglfefykllcvrgiitsktksldkgynkalndlcikvnnwdlffspsednftndlnkgeeitsdtnieaaeenisldliqqyyltfnfdnepenisienlssdiigqlelmpnierfpngkkyeldkytmfhylraqefehgksrialtnsvneallnpsrvytffssdyvkkvnkateaamflgwveqlvydftdetsevsttdkiaditiiipyigpalnignmlykddfvgalifsgavillefipeiaipvlgtfalvsyiankvltvqtidnalskrnekwdevykyivtnwlakvntqidlirkkmkealenqaeatkaiinyqynqyteeeknninfniddlssklnesinkamininkflnqcsvsylmnsmipygvkrledfdaslkdallkyiydnrgtligqvdrlkdkvnntlstdipfqlskyvdnqrllstfteyikniintsilnlryesnhlidlsryaskinigskvnfdpidknqiqlfnlesskievilknaivynsmyenfstsfwiripkyfnsislnneytiincmennsgwkvslnygeiiwtlqdtqeikqrvvfkysqminisdyinrwifvtitnnrlnnskiyingrlidqkpisnlgnihasnnimfkldgcrdthryiwikyfnlfdkelnekeikdlydnqsnsgilkdfwgdylqydkpyymlnlydpnkyvdvnnvgirgymylkgprgsvmttniylnsslyrgtkfiikkyasgnkdnivrnndrvyinvvvknkeyrlatnasqagvekilsaleipdvgnlsqvvvmkskndqgitnkckmnlqdnngndigfigfhqfnniaklvasnwynrqierssrtlgcswefipvddgwgerpl
seqidno:9-lhn接头(人工的)
vrgiitsktksldkgynkalndl
seqidno:10-肠激酶活化位点
ddddk
seqidno:11-bont/a1活化环
vdgiitsktksddddknkalnlq
实施例
实施例1-本发明的经修饰的bont/al链(bont/alc)的制备
用62a菌株的细菌dna作为模板，通过pcr和适宜的寡核苷酸引物产生野生型bont/al链(氨基酸1-448，seqidno:1)编码质粒pbn3。在氨基酸ala-449的密码子之后插入编码氨基酸序列pptpghhhhhh(seqidno:4)的dna。用含有wtbont/alc或其突变体(即本申请中所述seqidno:1的蛋白酶突变体)的pbn3转染大肠杆菌菌株m15prep4(qiagen,hilden,德国)。对于每个转染的大肠杆菌菌株，用在5ml2yt培养基中过夜培养的单个细菌菌落接种500ml2yt培养基。
培养物od600达到0.7后，在21℃用0.2mmiptg在15小时诱导期间产生bont/al链。通过离心收集细菌，并在-20℃过夜冷冻。将细菌重悬在补充了终浓度分别为5mm、1μg/ml和0.5mm的苯甲脒、胃蛋白酶抑制剂a和pmsf的裂解缓冲液(300mmnacl,50mm磷酸盐,ph8.0)中，通过超声处理裂解，通过29000g离心30分钟澄清裂解物，使bont/al链结合于ni2+-次氮基三乙酸琼脂糖珠。用20倍柱床体积的含10mm咪唑的裂解缓冲液洗涤珠，通过含100mm咪唑的裂解缓冲液洗脱bont/al链。将含有目的蛋白质的级分对毒素测定缓冲液(150mm谷氨酸钾,10mmhepes–koh,ph7.2)透析，纯化的l链最终在液氮中冷冻，并保存在-70℃。
实施例2-hsnap-23无细胞切割测定
产生了用于大肠杆菌表达和体外转录/翻译的hsnap-23(seqidno:2)质粒ps3-hsnap-23his6。它编码n端融合的双strep标签(maswshpqfekgggsgggsgggswshpqfekgags,seqidno:5)和在羧基端丝氨酸211的密码子下游c端融合的his6标签(ghhhhhh,seqidno:6)。
对于蛋白质产生和纯化，将ps3-hsnap-23his6转染入大肠杆菌菌株bl21-de3(stratageneeurope,ebsdorfergrund,德国)，应用与实施例1中针对bont/al链蛋白酶详述相同的流程。但是，通过用20倍柱床体积的0.1mtrisph8.0洗涤并用含10mm脱硫生物素的0.1mtrisph8.0洗脱，在strep-tactin琼脂糖珠(ibalifesciences,
然后按照厂家说明书使用ps3-hsnap-23his6、t7偶联的tnt网织红细胞裂解物系统(promega)和[35s]甲硫氨酸(370kbq/μl,>37tbq/mmol；hartmannanalytic,braunschweig,德国)，通过体外转录/翻译产生放射性标记的hsnap-23。
hsnap-23无细胞切割测定法包含终浓度20微摩尔的重组hsnap-23加1μl[35s]甲硫氨酸标记的hsnap-23的转录/翻译混合物，及终浓度为1微摩尔或10纳摩尔的每种经修饰的或野生型的bont/al链，在总体积10μl毒素测定缓冲液中37℃孵育60分钟。通过加入等体积的双倍浓缩样品缓冲液[120mmtris–hcl(ph6.75),10％(v/v)β-巯基乙醇,4％(w/v)sds,20％(w/v)甘油,0.014％(w/v)溴酚蓝]终止反应。37℃孵育30分钟后，用15％tris-甘氨酸凝胶(丙烯酰胺/双丙烯酰胺比：73.5:1)通过sds-page分析每个样品。
对凝胶进行干燥，并利用fla-9000磷光成像仪(fujiphotofilm,co.,ltd.,东京,日本)显示放射性标记的蛋白质。用multigauge3.2软件(fujiphotofilm)进行放射性标记的蛋白质及其切割产物的定量。为了测定野生型bont/al链及其突变体的酶促动力学参数，利用在大肠杆菌中产生的hsnap-23，底物浓度在5和100μm之间。通过加入1μl通过体外转录/翻译产生的放射性标记的hsnap-23来赋予每种不同的底物浓度。在终体积25μl毒素测定缓冲液中进行孵育。在37℃孵育2和4分钟后，取10μl的小份，通过与10μl预冷的双倍浓缩sds-page样品缓冲液混合终止酶促反应。从上文详细描述的放射性标记底物的周转率确定切割百分比，并用于计算底物水解的初始速度。使用graphpadprism4.03程序(graphpadsoftwareinc.，sandiego，usa)通过非线性回归计算km、kcat和vmax值。
图1中显示所得到的数据。
实施例3-hsnap-25无细胞切割测定法
用于大肠杆菌表达的hsnap-25(seqidno:3)质粒(pbn10)已在binz等(jbiolchem.,1994；269:1617-20)中述及。羧基端甘氨酸206的密码子之后是编码氨基酸序列vpptpghhhhhh(seqidno:7)的dna。随后通过将pbn10中的ecori-sali片段亚克隆在相应切割的psp73(promega,mannheim,德国)中产生了用于体外转录/翻译的质粒psnap-25his6。
对于snap-25的蛋白质生产和纯化，将pbn10转染入大肠杆菌菌株m15prep4(qiagen,hilden,德国)中，并应用与实施例1中针对bont/al链蛋白酶详述相同的流程。
然后按照厂家说明书使用psnap-25his6、sp6偶联的tnt网织红细胞裂解物系统(promega)和[35s]甲硫氨酸(370kbq/μl,>37tbq/mmol；hartmannanalytic,braunschweig,德国)，通过体外转录/翻译产生放射性标记的snap-25。
hsnap25切割测定法完全按照实施例2中针对hsnap-23所述进行。
图1中显示所得到的数据。
实施例4-包含本发明的经修饰的轻链a(bont/alc)的lhn结构域的制备
本实施例描述本发明的含有显示hsnap23切割活性的经修饰的轻链a(bont/alc)的易位lhn结构域的构建。通过添加适当的靶向部分，这类lhn结构域可用于创建tsi递送载体家族。
简言之，首先通过化学合成dna(geneart,thermofisher)为本发明的每个bont/alc突变体构建bont/alc克隆载体，该dna编码该突变体bont/alc，并优化用于在大肠杆菌中表达，亚克隆到pcr4载体(invitrogen)中。同时，通过化学合成编码hn/a结构域(对应于seqidno:8的氨基酸残基449-872，uniprotkb检索号a5hzz9)的密码子优化dna，亚克隆到标准载体，如pcr4载体(invitrogen)中，类似地构建了bont/ahn结构域克隆载体。通过化学合成密码子优化的编码所述接头的dna，亚克隆到标准载体pcr4载体(invitrogen)中，进一步构建lhn接头克隆载体。具体而言，用适合于bont/a血清型的lhn接头vrgiitsktksldkgynkalndl(seqidno:9)(它是存在于bont/a的lc和hn结构域之间的二硫键桥的半胱氨酸之间的结构域间多肽区)构建了lhn接头载体。可以产生备选的lhn接头构建体：事实上，如熟练的从业者公知，为了产生特异性蛋白酶切割位点，可以使用对lysc蛋白酶的蛋白水解的天然易感性，或者可将肠激酶活化位点(例如ddddk，seqidno:10)插入活化环中以产生诸如vdgiitsktksddddknkalnlq(seqidno:11)的序列，或者可将本领域公知的任何其他蛋白酶如prescision、xa因子、凝血酶、tev蛋白酶等的蛋白酶位点插入活化环。
随后通过在2个主要步骤中将下述dna克隆入经修饰的pet表达载体(novagen)来组装lhn结构域，所述dna是编码本发明的每个经修饰的bont/alc的dna在编码lhn接头的dna上游，该接头进一步在编码hn/a结构域的dna上游。
实施例5-本发明的结合非神经元细胞的tsi递送载体的制备
本实施例描述了通过向包含上文实施例2中所述本发明的经修饰的轻链a的lhn结构域的每个c末端添加适宜的靶向部分(本文中为人ghrp)来构建tsi递送载体。为此，在靶向部分和lhn结构域之间引入柔性接头。
简言之，通过化学合成编码与hghrp靶向部分符合读框地融合的柔性接头的密码子优化dna，亚克隆到pcr4载体(invitrogen)中，构建了接头-hghrp克隆载体。
随后通过将编码接头-hghrp的dna克隆到包含实施例2中所述lhn结构域的每个pet表达载体中来组装tsi结构体，以这种方式使得接头-hghrp符合读框地融合到每个lhn结构域的c末端。
对于每种tsi载体的蛋白质表达，将在250ml摇瓶中的含有0.2％葡糖胺和30μg/ml卡那霉素的100ml改良terrific肉汤(tb)培养基与转染了tsi的单个细菌菌落(大肠杆菌bl21(de3))孵育。每种培养物在37℃、225rpm下培养16小时；然后用10ml过夜培养物接种在2l摇瓶中的1l含0.2％葡糖胺和30μg/ml卡那霉素的改良tb中。然后在37℃培养所得到的培养物，直到od600nm达到约0.5，此时将温度降低到16℃。1小时后，用1mmiptg诱导每个培养物，并在16℃进一步培养16小时。通过离心收集细菌，并在-20℃过夜冷冻。
所表达的每种tsi随后的纯化按以下进行。
将细菌解冻，并对细胞沉淀进行超声处理以裂解细胞。离心后，将上清上样到50mmhepesph7.2200mmnacl平衡的0.1mniso4荷电螯合柱上。用含有40-100mm咪唑的缓冲液(分步梯度)进行柱的洗涤，以洗脱非结合蛋白，用含有200mm咪唑的缓冲液洗脱tsi蛋白。随后将含有目的蛋白质(tsi)的级分对含有50mmhepesph7.2200mmnacl的缓冲液透析。然后将蛋白酶(本文中为lysc)以适当量添加到1mg纯化的tsi中以活化它(即，使得tsi形成双链，能够结合ghrp，使轻链易位进入细胞质，并催化切割hsnap23)。然后通过将所得到的混合物上样到50mmhepesph7.2200mmnacl平衡的0.1mniso4荷电螯合柱上来进一步纯化它。首次用50mmhepesph7.2200mmnacl洗涤柱，然后用含有40-100mm咪唑的缓冲液洗涤以洗脱非特异性结合的蛋白质，再用含有200mm咪唑的缓冲液洗涤以洗脱活化的tsi。随后将含有目的活化蛋白(tsi)的级分对含有50mmhepesph7.2150mmnacl的缓冲液透析。然后将透析后的蛋白质浓缩至约2mg/ml，分装并最终在-80℃冷冻。
项目
1.经修饰的肉毒杆菌神经毒素a(bont/a)l链蛋白酶，其切割人snap-23(hsnap-23)，且相对于野生型bont/al链(seqidno:1)具有经修饰的氨基酸序列，其包含：
a)定位于用于结合hsnap-23的p182/d178结合位点的第一bont/al链蛋白酶结合袋内的至少一个氨基酸残基改变；
b)其中所述第一bont/al链蛋白酶结合袋定义为野生型bont/al链(seqidno:1)的氨基酸残基e148、t307、a308和y312；和
c)其中所述至少一个氨基酸残基改变包含：
i.经修饰的l链蛋白酶氨基酸序列上对应于野生型bont/al链(seqidno:1)的氨基酸残基e148的位置处选自天冬酰胺和酪氨酸的氨基酸残基；和/或
ii.经修饰的l链蛋白酶氨基酸序列上对应于野生型bont/al链(seqidno:1)的氨基酸残基t307的位置处选自苯丙氨酸、异亮氨酸和亮氨酸的氨基酸残基；和/或
iii.经修饰的l链蛋白酶氨基酸序列上对应于野生型bont/al链(seqidno:1)的氨基酸残基a308的位置处选自脯氨酸、天冬酰胺、苏氨酸和异亮氨酸的氨基酸残基；和/或
iv.经修饰的l链蛋白酶氨基酸序列上对应于野生型bont/al链(seqidno:1)的氨基酸残基y312的位置处选自赖氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸和亮氨酸的氨基酸残基。
2.根据项1所述的经修饰的bont/al链蛋白酶，其进一步包含：
a)定位在用于结合hsnap-23的r186结合位点的第二bont/al链蛋白酶结合袋内的氨基酸残基改变；
b)其中所述第二bont/al链蛋白酶结合袋定义为野生型bont/al链(seqidno:1)的氨基酸残基s143；和
c)其中所述氨基酸残基改变包含：
i.经修饰的l链蛋白酶氨基酸序列上对应于野生型bont/al链(seqidno:1)的氨基酸残基s143的位置处选自谷氨酰胺、谷氨酸和天冬氨酸的氨基酸残基。
3.根据项1或2所述的经修饰的bont/al链蛋白酶，其进一步包含：
a)定位在用于结合hsnap-23的k185结合位点的第三bont/al链蛋白酶结合袋内的至少一个氨基酸残基改变；
b)其中所述第三bont/al链蛋白酶结合袋定义为野生型bont/al链(seqidno:1)的氨基酸残基v304和g305；和
c)其中所述至少一个氨基酸残基改变包含：
i.经修饰的l链蛋白酶氨基酸序列上对应于野生型bont/al链(seqidno:1)的氨基酸残基v304的位置处选自谷氨酸和天冬氨酸的氨基酸残基；和/或
ii.经修饰的l链蛋白酶氨基酸序列上对应于野生型bont/al链(seqidno:1)的氨基酸残基g305的位置处选自谷氨酸和天冬氨酸的氨基酸残基。
4.根据前述项中任一项所述的经修饰的bont/al链蛋白酶，其进一步包含：
a)定位在用于结合hsnap-23的d189/d192结合位点的第四bont/al链蛋白酶结合袋内的氨基酸残基改变；
b)其中所述第四bont/al链蛋白酶结合袋定义为野生型bont/al链(seqidno:1)的氨基酸残基q29；
c)其中所述氨基酸残基改变包含：
i.经修饰的l链蛋白酶氨基酸序列上对应于野生型bont/al链(seqidno:1)的氨基酸残基q29的位置处选自丙氨酸的氨基酸残基。
5.根据前述项中任一项所述的经修饰的bont/al链蛋白酶，其进一步包含：
a)定位在用于结合hsnap-23的k206结合位点的第五bont/al链蛋白酶结合袋内的至少一个氨基酸残基改变；
b)其中所述第五bont/al链蛋白酶结合袋定义为野生型bont/al链(seqidno:1)的氨基酸残基y251、l256、v258、l367和f369；
c)其中所述至少一个氨基酸残基改变包含：
i.经修饰的l链蛋白酶氨基酸序列上对应于野生型bont/al链(seqidno:1)的氨基酸残基y251的位置处选自谷氨酸和天冬氨酸的氨基酸残基；和/或
ii.经修饰的l链蛋白酶氨基酸序列上对应于野生型bont/al链(seqidno:1)的氨基酸残基l256的位置处选自谷氨酸、天冬氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、丙氨酸和精氨酸的氨基酸残基；和/或
iii.经修饰的l链蛋白酶氨基酸序列上对应于野生型bont/al链(seqidno:1)的氨基酸残基v258的位置处选自丝氨酸、丙氨酸、脯氨酸、亮氨酸和谷氨酸的氨基酸残基；和/或
iv.经修饰的l链蛋白酶氨基酸序列上对应于野生型bont/al链(seqidno:1)的氨基酸残基l367的位置处选自丙氨酸和甘氨酸的氨基酸残基；和/或
v.经修饰的l链蛋白酶氨基酸序列上对应于野生型bont/al链(seqidno:1)的氨基酸残基f369的位置处选自甘氨酸、丝氨酸和亮氨酸的氨基酸残基。
6.根据前述项中任一项所述的经修饰的bont/al链蛋白酶，其进一步包含：
a)定位在用于结合hsnap-23的i198结合位点的第六bont/al链蛋白酶结合袋内的氨基酸残基改变；
b)其中所述第六bont/al链蛋白酶结合袋定义为野生型bont/al链(seqidno:1)的氨基酸残基k166；和
c)其中所述氨基酸残基改变包含：
i.经修饰的l链蛋白酶氨基酸序列上对应于野生型bont/al链(seqidno:1)的氨基酸残基k166的位置处选自缬氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸和异亮氨酸的氨基酸残基。
7.根据前述项中任一项所述的经修饰的bont/al链蛋白酶，其进一步包含：
a)定位在用于结合hsnap-23的d210结合位点的第七bont/al链蛋白酶结合袋内的氨基酸残基改变；
b)其中所述第七bont/al链蛋白酶结合袋定义为野生型bont/al链(seqidno:1)的氨基酸残基s254；和
c)其中所述氨基酸残基改变包含：
i.经修饰的l链蛋白酶氨基酸序列上对应于野生型bont/al链(seqidno:1)的氨基酸残基s254的位置处选自丙氨酸的氨基酸残基。
8.根据前述项中任一项所述的经修饰的bont/al链蛋白酶，其进一步包含：
a)定位在用于结合hsnap-23的d168结合位点的第八bont/al链蛋白酶结合袋内的氨基酸残基改变；
b)其中所述第八bont/al链蛋白酶结合袋定义为野生型bont/al链(seqidno:1)的氨基酸残基k340；和
c)其中所述氨基酸残基改变包含：
i.经修饰的l链蛋白酶氨基酸序列上对应于野生型bont/al链(seqidno:1)的氨基酸残基k340的位置处选自组氨酸的氨基酸残基。
9.经修饰的肉毒杆菌神经毒素a(bont/a)l链蛋白酶，其切割人snap-23(hsnap-23)，且相对于野生型bont/al链(seqidno:1)具有经修饰的氨基酸序列，其包含：
a)定位在用于结合hsnap-23的d189/d192结合位点的第四bont/al链蛋白酶结合袋内的氨基酸残基改变；
b)其中所述第四bont/al链蛋白酶结合袋定义为野生型bont/al链(seqidno:1)的氨基酸残基q29；和
c)其中所述氨基酸残基改变包含：
i.经修饰的l链蛋白酶氨基酸序列上对应于野生型bont/al链(seqidno:1)的氨基酸残基q29的位置处选自丙氨酸的氨基酸残基。
10.经修饰的肉毒杆菌神经毒素a(bont/a)l链蛋白酶，其切割人snap-23(hsnap-23)，且相对于野生型bont/al链(seqidno:1)具有经修饰的氨基酸序列，其包含：
a)定位在用于结合hsnap-23的i198结合位点的第六bont/al链蛋白酶结合袋内的氨基酸残基改变；
b)其中所述第六bont/al链蛋白酶结合袋定义为野生型bont/al链(seqidno:1)的氨基酸残基k166；和
c)其中所述氨基酸残基改变包含：
i.经修饰的l链蛋白酶氨基酸序列上对应于野生型bont/al链(seqidno:1)的氨基酸残基k166的位置处选自缬氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸和异亮氨酸的氨基酸残基。
11.经修饰的肉毒杆菌神经毒素a(bont/a)l链蛋白酶，其切割人snap-23(hsnap-23)，且相对于野生型bont/al链(seqidno:1)具有经修饰的氨基酸序列，其包含：
a)定位在用于结合hsnap-23的k206结合位点的第五bont/al链蛋白酶结合袋内的至少一个氨基酸残基改变；
b)其中所述第五bont/al链蛋白酶结合袋定义为野生型bont/al链(seqidno:1)的氨基酸残基y251、l256、v258、l367和f369；和
c)其中所述至少一个氨基酸残基改变包含：
i.经修饰的l链蛋白酶氨基酸序列上对应于野生型bont/al链(seqidno:1)的氨基酸残基y251的位置处选自谷氨酸和天冬氨酸的氨基酸残基；和/或
ii.经修饰的l链蛋白酶氨基酸序列上对应于野生型bont/al链(seqidno:1)的氨基酸残基l256的位置处选自天冬氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、丙氨酸和精氨酸的氨基酸残基；和/或
iii.经修饰的l链蛋白酶氨基酸序列上对应于野生型bont/al链(seqidno:1)的氨基酸残基v258的位置处选自丝氨酸、丙氨酸、脯氨酸、亮氨酸和谷氨酸的氨基酸残基；和/或
iv.经修饰的l链蛋白酶氨基酸序列上对应于野生型bont/al链(seqidno:1)的氨基酸残基l367的位置处选自丙氨酸和甘氨酸的氨基酸残基；和/或
v.经修饰的l链蛋白酶氨基酸序列上对应于野生型bont/al链(seqidno:1)的氨基酸残基f369的位置处选自甘氨酸、丝氨酸和亮氨酸的氨基酸残基。
12.经修饰的肉毒杆菌神经毒素a(bont/a)l链蛋白酶，其切割人snap-23(hsnap-23)，且相对于野生型bont/al链(seqidno:1)具有经修饰的氨基酸序列，其包含：
a)定位在用于结合hsnap-23的d210结合位点的第七bont/al链蛋白酶结合袋内的氨基酸残基改变；
b)其中所述第七bont/al链蛋白酶结合袋定义为野生型bont/al链(seqidno:1)的氨基酸残基s254；和
c)其中所述氨基酸残基改变包含：
i.经修饰的l链蛋白酶氨基酸序列上对应于野生型bont/al链(seqidno:1)的氨基酸残基s254的位置处选自丙氨酸的氨基酸残基。
13.经修饰的肉毒杆菌神经毒素a(bont/a)l链蛋白酶，其切割人snap-23(hsnap-23)，且相对于野生型bont/al链(seqidno:1)具有经修饰的氨基酸序列，其包含：
a)定位在用于结合hsnap-23的d168结合位点的第八bont/al链蛋白酶结合袋内的氨基酸残基改变；
b)其中所述第八bont/al链蛋白酶结合袋定义为野生型bont/al链(seqidno:1)的氨基酸残基k340；和
c)其中所述氨基酸残基改变包含：
i.经修饰的l链蛋白酶氨基酸序列上对应于野生型bont/al链(seqidno:1)的氨基酸残基k340的位置处选自组氨酸的氨基酸残基。
14.根据项9至13中任一项所述的经修饰的肉毒杆菌神经毒素a(bont/a)l链蛋白酶，其进一步包含定位在不同的bont/al链蛋白酶结合袋内的至少一个氨基酸残基改变，其中所述氨基酸残基改变和所述另一bont/al链蛋白酶结合袋定义为项1至13中任一项所述的技术特征。
15.核酸构建体，其包含编码任一前述项中所述的经修饰的bont/al链蛋白酶的核酸序列或由编码任一前述项中所述的经修饰的bont/al链蛋白酶的核酸序列组成。
16.递送载体，其包含：
a)项1至14中任一项所述的经修饰的bont/al链蛋白酶，或项15的核酸构建体；和
b)用于递送所述经修饰的bont/al链蛋白酶或所述核酸构建体进入靶细胞，优选地进入非神经元靶细胞的元件。
17.根据项16所述的递送载体，其中用于递送所述经修饰的bont/al链蛋白酶至靶细胞的元件b)包含：
i)使递送载体结合至靶细胞的靶向部分；和
ii)使经修饰的bont/al链蛋白酶或核酸构建体易位进入靶细胞，优选地进入非神经元靶细胞的易位肽。
18.切割hsnap-23的方法，其包括使hsnap-23与项1至14中任一项所述的(bont/a)l链蛋白酶或与项15的核酸构建体或与项16或17的递送载体接触。
19.根据项1至14中任一项所述的(bont/a)l链蛋白酶或项15的核酸构建体或项16或17的递送载体，其用于项18的方法中。
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