本发明涉及使用微生物的发酵产物的制造方法。
背景技术：
：近年，通过使用微生物的发酵法生产工业上有用的化合物的技术已投入实际使用。微生物培养后的发酵培养液中除了发酵产物以外，还有未利用的培养原料、微生物菌体混在一起，因此在从培养液中取得发酵产物的操作中，通常首先分离菌体，然后将发酵产物与含有未利用的培养原料的溶液分离，进行回收的操作。在分离操作中，利用离心分离、膜分离、吸附分离等(例如，专利文献1～3)。此外，报道了在用多孔质陶瓷膜过滤培养液，分离菌体的同时，将培养液中含有的酶特异性地吸附在膜上，除去膜过滤液后进行洗脱回收的方法(专利文献4)。但是，在这些现有的方法中，菌体是可以再利用的，但未利用的培养原料在发酵产物的回收操作中被废弃的情况较多，在发酵产物的生产中被再利用的情况较少。发酵生产用培养基中多使用富营养的液体培养基，因此从经济的观点出发，希望有效利用培养原料。现有技术文献：专利文献1：日本特开2016-96742号公报专利文献2：日本特开2017-112847号公报专利文献3：日本特开2011-36146号公报专利文献4：日本特开平3-240487号公报技术实现要素：本发明提供一种发酵产物的制造方法，其中，所述发酵产物的制造方法是培养微生物制造发酵产物的方法，包括以下工序(a)～(d)：(a)在第1培养基中培养微生物的工序；(b)使含有培养后的菌体、培养原料及发酵产物的培养液在填充有吸附所述发酵产物的吸附剂且菌体的大小(短径)d、吸附剂的细孔径d1及吸附剂之间的最小空隙直径d2满足d1<d<d2的关系的吸附塔内通液，从而使培养液中的发酵产物吸附于所述吸附剂，并回收从吸附塔流出的含有菌体及培养原料的流出液的工序；(c)使洗脱液与所述吸附剂接触，从而使发酵产物洗脱的工序；(d)在第2培养基中培养微生物的工序，其中，所述第2培养基使用含有所述回收的菌体和培养原料的流出液。具体实施方式本发明涉及回收发酵培养液中混在一起的菌体及未利用的培养原料，可以有效利用这些菌体及培养原料生产发酵产物的方法。本发明的发明人经过反复认真的研究，结果发现不像现有那样仅从微生物培养后的发酵培养液中首先分离菌体，将菌体、未利用的培养原料及发酵产物混在一起的发酵培养液在填充有吸附剂的规定的树脂塔内通液，使发酵产物吸附于该吸附剂上，另一方面如果使含有菌体和未利用的培养原料的溶液通过，就能够一起回收菌体和未利用的培养原料，并且这些能够与发酵产物分离，可以将菌体及未利用的培养原料再利用于以后的发酵产物的生产中。根据本发明，可以实现菌体以及培养原料在发酵产物生产中的有效利用，可以通过发酵法在经济上高效地生产发酵产物。本发明是培养微生物制造发酵产物的方法，其包含工序(a)在第1培养基中培养微生物的工序；工序(b)使含有培养后的菌体、培养原料及发酵产物的培养液在填充有吸附所述发酵产物的吸附剂且菌体的大小(短径)d、吸附剂的细孔径d1及吸附剂之间的最小空隙直径d2满足d1<d<d2的关系的吸附塔内通液，从而使培养液中的发酵产物吸附于所述吸附剂，并回收从吸附塔流出的含有菌体及培养原料的流出液的工序；工序(c)使洗脱液与所述吸附剂接触，从而使发酵产物洗脱的工序；以及工序(d)在第2培养基中培养微生物的工序，其中所述第2培养基使用含有所述回收的菌体和培养原料的流出液。在本发明中，发酵产物可以是通过微生物的培养在菌体外生产的物质。优选地，可以举出蛋白质或多肽，例如可以举出食品、医药品、化妆品、洗涤剂、纤维、医疗检查等领域中使用的产业上有用的酶或生理活性肽等。作为酶，包括氧化还原酶(oxidoreductase)、转移酶(transferase)、水解酶(hydrolase)、裂解酶(lyase)、异构酶(isomerase)、合成酶(ligase/synthase)等。其中，优选为水解酶，更优选为纤维素酶、α-淀粉酶、蛋白酶，更优选为纤维素酶、蛋白酶。纤维素酶、蛋白酶优选为碱性纤维素酶、碱性蛋白酶。碱性纤维素酶、碱性蛋白酶是在碱性区域具有最适ph值的纤维素酶、蛋白酶。纤维素酶，优选为多糖水解酶的分类(biochem.j.,280,309(1991))中属于家族5的纤维素酶，更优选为微生物来源的纤维素酶，进一步优选为芽孢杆菌(bacillus)属细菌来源的纤维素酶。α-淀粉酶，优选为微生物来源的α-淀粉酶，更优选为芽孢杆菌属细菌来源的液化型淀粉酶。蛋白酶，优选为微生物来源的蛋白酶，更优选为芽孢杆菌属细菌来源的蛋白酶，进一步优选为其活性中心是丝氨酸残基的丝氨酸蛋白酶或金属蛋白酶。[工序(a)]工序(a)是在第1培养基中培养微生物的工序。微生物是具有生产发酵产物能力的微生物。作为具有生产上述蛋白质或多肽能力的微生物，可以举出属于葡萄球菌(staphylococcus)属、肠球菌(enterococcus)属、李斯特菌(listeria)属、芽孢杆菌(bacillus)属、棒状杆菌属(corynebacterium)的微生物等。其中，优选为芽孢杆菌(bacillus)属细菌、更优选为枯草杆菌(bacillussubtilis)。作为α-淀粉酶生产性微生物的芽孢杆菌属细菌，可以举出芽孢杆菌sp.(bacillussp.)ksm-k-38菌株(fermbp-6946)等。作为碱性纤维素酶生产性微生物的芽孢杆菌属细菌，可以举出芽孢杆菌sp.(bacillussp.)ksm-s237菌株(fermbp-7875)、芽孢杆菌sp.(bacillussp.)ksm-64菌株(fermbp-2886)等。作为碱性蛋白酶生产性微生物的芽孢杆菌属细菌，可以举出芽孢杆菌sp.(bacillussp.)ksm-64菌株(fermp-10482)、克劳氏芽孢杆菌(bacillusclausii)ksmk-16菌株(fermbp-3376)、芽孢杆菌sp.(bacillussp.)ksm-kp43菌株(fermbp-6532)、芽孢杆菌sp.(bacillussp.)ksm-kp9860菌株(fermbp-6534)、芽孢杆菌no.d-6(fermp-1592)(蛋白酶e-1)、芽孢杆菌sp.y(fermbp-1029)、芽孢杆菌sd521(fermp-11162)、芽孢杆菌sp.(bacillussp.)ksm-9865菌株(fermp-18566)、ncib12289菌株、ncib12513菌株等。微生物可以是野生菌株，也可以是通过各种基因操作，发生碱基序列的插入、置换、缺失等的突变的突变株，此外，也可以通过添加已知的人工修饰来赋予所希望的发酵产物生产能力。用于微生物培养的第1培养基中，作为培养原料可以适当使用含有该微生物能够吸收的碳源、氮源、无机盐类、其它必要的有机微量营养源等的合成培养基、天然培养基或在合成培养基中添加天然成分的半合成培养基。作为碳源，例如可以举出糖类。作为糖类，可以举出葡萄糖、果糖、木糖等的单糖类；蔗糖、乳糖、麦芽糖等的二糖类。糖类可以是无水物或水合物。此外，也可以使用含有糖类的糖液，例如，从淀粉中得到的糖液或糖蜜(废糖蜜)、从纤维素系生物质得到的糖液等。其中，从微生物的增殖的方面出发，优选为葡萄糖、麦芽糖。培养基中碳源的浓度，优选为5～25％(w/v)。作为氮源，可以举出酵母提取物、肉提取物、鱼肉提取物等的提取物类；氨、尿素、无机和有机铵盐、硝酸钾、硝酸钠等的含氮化合物；玉米蛋白粉、大豆粉、多聚蛋白胨、胰蛋白胨、蛋白胨、各种氨基酸、豆粕等。这些氮源可以使用市售产品，也可以使用适当制造得到的氮源。此外，培养基中的提取物类的浓度，从菌体增殖及生产效率的方面出发，优选干燥固体成分为0.1～2％(w/v)、更优选为1～2％(w/v)。作为无机盐类，例如可以举出硫酸盐、镁盐、锌盐、磷酸盐、钠盐等。作为硫酸盐的例子，可以举出硫酸镁、硫酸锌、硫酸钾、硫酸钠、硫酸锰等。作为镁盐的例子，可以举出硫酸镁、硝酸镁、氯化镁等。作为锌盐的例子，可以举出硫酸锌、硝酸锌、氯化锌等。作为磷酸盐的例子，可以举出磷酸氢钠、磷酸二氢钠、磷酸三钠、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾等。作为钠盐的例子，可以举出硫酸钠、硝酸钠、氯化钠等。培养基中无机盐类的浓度优选为0.5～1％(w/v)。此外，可以根据需要将抗生素或微量成分适当添加到培养基中。微生物的培养只要是能够使该微生物增殖、产生作为目的的发酵产物的条件，就可以采用一般的方法。例如，在芽孢杆菌属细菌的情况下，在对微生物的增值没有不利影响的范围内，对培养温度没有特别限制，但优选为20～48℃、更优选为25～45℃。芽孢杆菌属细菌相对于培养基的接种量优选为0.1％～5％(v/v)。培养芽孢杆菌属细菌时的第1培养基的ph值(25℃)优选为4～10、更优选为5～9。第1培养基的ph值可以适当地使用缓冲剂调节。根据微生物的增殖，芽孢杆菌属细菌的培养期间为10小时～7天、更优选为12小时～5天、进一步优选为24小时～4天。从后述的提高碳源转换率的方面出发，芽孢杆菌属细菌的培养期间优选为66小时～7天、更优选为66小时～5天。在培养中使用的培养槽可以适当地采用现有已知的培养槽。例如，通气搅拌型培养槽、鼓泡塔型培养槽、流化床培养槽，可以用间歇式、半间歇式以及连续式中的任意一种。在进行通气搅拌培养的情况下，溶解氧浓度优选为控制在超过0ppm、更优选为0.5ppm以上、进一步优选为1ppm以上的培养基中进行。搅拌旋转数优选为使供给培养基的气体分散的条件，可以根据规模适当调节。通过这样的培养，发酵产物在培养液中蓄积。在该培养液中，除了发酵产物以外，还有微生物菌体、未利用的培养原料混在一起。因此，需要从该培养液中取得发酵产物的操作，在本发明中将培养液供给下一个工序(b)。在供给工序(b)的培养液中，菌体的浓度(od600值)优选为20～100、更优选为25～100、进一步优选为30～100。该od600值可以根据下述实施例中所述的方法测定。此外，在供给工序(b)的培养液中，发酵产物的浓度优选为0.01～10g/l、更优选为0.1～5g/l。此外，在供给工序(b)的培养液中，未利用的培养原料，例如残糖量优选为0.1～100g/l、更优选为1～50g/l、进一步优选为5～50g/l。[工序(b)]本发明的工序(b)是使含有培养后的菌体、培养原料及发酵产物的培养液在填充有吸附所述发酵产物的吸附剂且菌体的大小(短径)d、吸附剂的细孔径d1及吸附剂之间的最小空隙直径d2满足d1<d<d2的关系的吸附塔内通液，从而使培养液中的发酵产物吸附于所述吸附剂，并回收从吸附塔流出的含有菌体及培养原料的流出液的工序。本发明中使用的吸附剂可以通过其细孔表面和发酵产物之间的物理的相互作用来吸附和脱附培养液中的发酵产物。作为吸附剂，例如可以利用交联聚合物合成树脂。作为吸附上述蛋白质或多肽的吸附剂，可以利用树脂基体为苯乙烯类树脂、丙烯酸类树脂、或甲基丙烯酸类树脂的合成树脂。其中，从发酵产物的吸附性的方面出发，优选树脂基体为苯乙烯-二乙烯基苯共聚物、聚甲基丙烯酸甲酯的合成树脂。此外，优选树脂基体在侧链上不具有溴基、丁基、苯基等的疏水性官能团。作为这些的例子，例如可以举出amberlitexad4、amberlitexad16hp、amberlitexad1180、amberlitexad2000(以上、organo公司)、diaionhp20、diaionhp20ss、diaionhp21、sepabeadssp850、sepabeadssp825、sepabeadssp700、sepabeadssp70(以上、三菱化学公司)、vpoc1062(bayer公司)等的苯乙烯类合成吸附剂；diaionhp1mg、diaionhp2mg、sepabeadssp2mgs(以上、三菱化学公司)等的甲基丙烯酸类合成吸附剂；amberlitexad7hp(organo公司)等的丙烯酸类合成吸附剂。吸附剂的形态可以是球形、不均匀形状等的任意形状，但是从分离效率的方面出发，优选为球形。在填充有吸附剂的吸附塔中，菌体的大小(短径)d、吸附剂的细孔径d1以及吸附剂之间的最小空隙直径d2满足d1<d<d2的关系。菌体的大小(短径)d大于吸附剂的细孔径d，且小于吸附剂之间的最小空隙直径d2，在吸附塔内通液的培养液中的菌体与培养原料一起从吸附塔流出，因此可以从微生物培养后的培养液中同时回收菌体以及未利用的培养原料，且可以将它们与发酵产物分离。菌体的大小d(短径)如果为同一种类就具有均匀的大小。虽然培养液中菌体的大小d(短径)根据具有生产发酵产物能力的微生物的种类而不同，但优选为0.1～300μm、更优选为0.1～10μm、进一步优选为0.3～3μm。从发酵产物的吸附性的方面出发，吸附剂的细孔径d1优选为1～100nm、更优选为5～80nm、进一步优选为20～60nm。在本说明书中，吸附剂的细孔径d1是平均值。此外，从发酵产物的吸附性的方面出发，吸附剂的平均粒径优选为30～2000μm、更优选为50～1000μm、进一步优选为70～250μm。平均粒径可以通过将吸附剂分散到蒸馏水中，使用粒径分布测定装置(例如，la-920、堀场制作所公司)测定。进一步地，从菌体的透过性的方面出发，优选吸附剂的粒径的分布狭窄。具体而言，作为相对于平均粒径d的粒径的标准偏差σ而计算出的由以下式(1)表示的变异系数cv值，优选为35％以下、更优选为25％以下、进一步优选为10％以下，下限优选为0％以上。此外，从可获得性的方面出发，下限优选为1％以上、更优选为2％以上、进一步优选为5％以上。变异系数cv值(％)＝[粒径的标准偏差σ]/[平均粒径d]×100(式1)吸附剂之间的最小空隙直径d2是吸附剂之间的空隙的最小直径。从菌体的透过性的方面出发，吸附剂之间的最小空隙直径d2优选为1～500μm、更优选为5～300μm、进一步优选为7.5～200μm、进一步优选为10～100μm、进一步优选为12～50μm。吸附剂之间的空隙直径可以根据吸附剂的平均粒径来计算，最小空隙直径也是平均值。培养液中的菌体的大小d(短径)(μm)相对于吸附剂的细孔径d1(μm)的比率[d/d1]，从发酵产物的吸附性的方面、菌体及未利用的培养原料与发酵产物之间的分离效率的方面出发，优选为1.25～2000、更优选为5～150、进一步优选为10～50。吸附剂之间的最小空隙直径d2(μm)相对于培养液中菌体的大小d(短径)(μm)的比率[d2/d]，从菌体的透过性的方面出发，优选为2～2000、更优选为5～300、进一步优选为10～100。对吸附塔的吸附剂的填充，只要是以菌体的大小(短径)d、吸附剂的细孔径d1以及吸附剂之间的最小空隙直径d2满足上述规定的关系的方式进行填充即可，作为该填充法，可以用淤浆填充等现有已知的方法进行。在向填充有吸附剂的吸附塔中通液培养液之前，优选预先清洗吸附剂，除去吸附剂中的杂质。例如，可以举出在通液速度(空间速度，sv)为0.5～5/hr、相对于吸附剂的总容量的通液倍数(bv)为4～10的通液条件下，将水通液到吸附塔中进行清洗的方法。此外，也可以将有机溶剂水溶液通液后，再将水通液。用于清洗的有机溶剂水溶液优选为10～90％(v/v)乙醇水溶液。培养液的通液条件，只要是培养液中的发酵产物充分吸附于吸附剂的条件即可，例如，sv为0.25～10/hr、bv为1～20。从发酵产物的回收效率的方面出发，更优选sv为1～5/hr、bv为2～10。因此，培养液中的发酵产物吸附于吸附剂，菌体及培养原料从吸附塔流出，因此回收含有菌体及培养原料的流出液。将培养液通液之后，优选在工序(c)之前，进行用洗涤液清洗吸附剂的工序。清洗吸附剂的洗涤液可以使用水、有机溶剂水溶液。当洗脱上述蛋白质或多肽的情况下，优选将后述的含有水溶性钙盐的有机溶剂水溶液作为洗涤液使用。[工序(c)]工序(c)是使洗脱液与上述吸附剂接触，从而使发酵产物洗脱的工序。洗脱工序可以进行一次或多次。洗脱液能够解吸、洗脱吸附在吸附剂上的发酵产物。对洗脱液的种类或浓度没有特别的限制，例如可以举出碱性水溶液、盐水溶液、有机溶剂水溶液等。当洗脱上述蛋白质或多肽的情况下，从回收效率和稳定性的方面出发，优选使用含有水溶性钙盐的有机溶剂水溶液作为洗脱液。水溶性钙盐是溶解于水溶液中的钙盐，例如可以举出乳酸钙、葡萄糖酸钙、乙酸钙等的有机盐；硝酸钙、氯化钙等的无机盐。从回收效率的方面出发，有机溶剂水溶液中的水溶性钙盐的浓度优选为0.02～30mm、更优选为0.3～15mm、进一步优选为1～10mm。作为有机溶剂水溶液中的有机溶剂，可以举出多元醇、碳原子数在4以下的一元醇等。其中，从回收效率和稳定性的方面出发，优选为多元醇。多元醇是烃的2个以上的氢被羟基取代的醇类的总称，例如可以举出乙二醇、丙二醇、1,3-丙二醇、1,3-丁二醇等的亚烷基二醇类；二乙二醇、二丙二醇、聚乙二醇、聚丙二醇等的聚亚烷基二醇类；甘油、二甘油、甘油三酸酯等的甘油类。聚乙二醇的重量平均分子量优选为200～20,000。其中，多元醇优选为sp值在7～20[(cal/cm3)1/2]的范围内，优选为在9～18[(cal/cm3)1/2]的范围内的多元醇。作为这样的多元醇(括号内表示sp值)，优选为丙二醇(12.6)、聚乙二醇400(9.4)、甘油(16.5)，进一步优选为丙二醇(12.6)、聚乙二醇400(9.4)。从回收效率和稳定性的方面出发，有机溶剂水溶液中有机溶剂的浓度优选为20～80％(v/v)、更优选为40～80％(v/v)。在多次进行洗脱工序的情况下，优选各洗脱工序中使用的有机溶剂水溶液中的有机溶剂浓度依次提高，例如，优选为第1阶段的洗脱工序用20～60％(v/v)的有机溶剂水溶液进行，第2阶段的洗脱工序用40～80％(v/v)的有机溶剂水溶液进行的方法。从回收效率和液量的方面出发，洗脱液的通液条件优选sv为0.25～10/hr，bv为1～10、更优选sv为1～5/hr，bv为2～8。[工序d]工序(d)是在第2培养基中培养微生物的工序，其中，所述第2培养基使用含有上述回收的菌体和培养原料的流出液。在该工序中，可以使用包含回收的菌体和培养原料的流出液的部分，或者也可以使用全部。此外，在使用流出液的全部的情况下，从将第2培养基投入第2培养槽的观点来看，优选浓缩流出液，浓缩倍率优选为2～6倍、更优选为3～5倍。从提高基质向发酵产物的转化率的方面出发，在第2培养基中，含有回收的菌体和培养原料的流出液以优选成为6质量％以上、更优选为10质量％以上、进一步优选为30质量％以上、更进一步优选为50质量％以上的方式使用。从提高基质向发酵产物的转化率的方面、以及发酵产物的生产效率的方面出发，从第1培养基向第2培养基的继代培养的菌体的量，基于液量的百分比优选为6％(v/v)以上、更优选为10％(v/v)以上、进一步优选为30％(v/v)以上、更进一步优选为50％(v/v)以上。从提高基质向发酵产物的转化率的方面、以及发酵产物的生产效率的方面出发，从第1培养基到第2培养基的继代培养的培养原料的量，基于液量的百分比优选为6％(v/v)以上、更优选为10％(v/v)以上、进一步优选为30％(v/v)以上、更进一步优选为50％(v/v)以上。此外，可以基于培养基中的糖量通过以下的计算公式来计算培养原料的继代培养量的比率。从第1培养基到第2培养基的培养原料继代培养比率(％)＝[第2培养开始时来自第1培养基的糖量]/[第1培养结束时第1培养液中的糖量]×100与第1培养基相同，第2培养基除了碳源以外，还可以包含氮源、无机盐和其它必要的营养源。具体而言，如上所述。工序(d)中的微生物培养可以是与工序(a)中的微生物培养相同的培养条件，也可以是不同的培养条件。培养后的细胞和未利用的培养原料可以再次再利用于发酵产物的生产。即，在工序(d)之后，将包含菌体、培养原料和发酵产物的培养液再次供给工序(b)，使用含有回收的菌体和培养原料的流出液，重复进行微生物的培养1次以上、进一步2次以上、更进一步3次以上的工序。当使用含有回收的菌体和培养原料的流出液在培养基中培养微生物的工序重复2次以上时，优选地，在使用该流出液的培养基中进行微生物培养之前，和/或在微生物培养中，进行培养基的ph值的调节。当一边再利用菌体和培养原料一边重复培养时，由于培养基成分的积累，培养基的ph值有上升或下降的倾向，通过进行使用流出液的培养基的ph值调节，可以提高具有生产发酵产物能力的微生物的发酵产物生产效率。优选将培养微生物时使用含有回收的菌体和培养原料的流出液的培养基的ph值调节成为在比第1次培养，即工序(a)中的培养时的平均ph值低1.2的值至比平均ph值高1.2的值的范围内，即，优选调节成为在“平均ph值-1.2～+1.2”的范围内，更优选为“平均ph值-0.6～+0.6”的范围内。另外，培养基的ph值可以适当使用缓冲剂进行调节。根据本发明，通过将菌体和未利用的培养原料再利用于随后的发酵产物的生产，培养原料可以利用于生产发酵产物而没有浪费。在本发明中，从投入的碳源到发酵产物的碳源转化率(％)优选为0.5％以上，更优选为0.6％以上。碳源转换率是发酵产物的总碳源重量除以投入的碳源重量的值。在实施例中记载了计算碳源转化率的计算方法的详细内容。根据本发明得到的发酵产物可以直接使用，但也可以根据需要，通过已知的方法纯化、结晶化或造粒化后使用。关于上述实施方式，本发明进一步公开了以下制造方法。<1>一种发酵产物的制造方法，其中，所述发酵产物的制造方法是培养微生物制造发酵产物的方法，包括以下工序(a)～(d)：(a)在第1培养基中培养微生物10小时～7天的工序；(b)使含有培养后的菌体、培养原料及发酵产物的培养液在填充有吸附所述发酵产物的吸附剂且菌体的大小(短径)d、吸附剂的细孔径d1及吸附剂之间的最小空隙直径d2满足d1<d<d2的关系的吸附塔内通液，从而使培养液中的发酵产物吸附于所述吸附剂，并回收从吸附塔流出的含有菌体及培养原料的流出液的工序；(c)使洗脱液与所述吸附剂接触，从而使发酵产物洗脱的工序；(d)在第2培养基中培养微生物的工序，其中，所述第2培养基使用含有所述回收的菌体和培养原料的流出液，并且，从第1培养基到第2培养基继代培养的培养原料的量为30％(v/v)以上。<2>一种发酵产物的制造方法，其中，所述发酵产物的制造方法是培养微生物制造发酵产物的方法，包括以下工序(a)～(d)：(a)在第1培养基中培养微生物的工序；(b)使含有培养后的菌体、培养原料及发酵产物的培养液在填充有吸附所述发酵产物的吸附剂且菌体的大小(短径)d、吸附剂的细孔径d1及吸附剂之间的最小空隙直径d2满足d1<d<d2的关系的吸附塔内通液，从而使培养液中的发酵产物吸附于所述吸附剂，并回收从吸附塔流出的含有菌体及培养原料的流出液的工序；(c)使洗脱液与所述吸附剂接触，从而使发酵产物洗脱的工序；(d)在第2培养基中培养微生物的工序，其中，所述第2培养基使用含有所述回收的菌体和培养原料的流出液，并且，工序(b)中的吸附剂的平均粒径d为30～2000μm，且由下式(1)表示的粒径的变异系数cv为1～35％，变异系数cv值(％)＝[粒径的标准偏差σ]/[平均粒径d]×100(式1)。<3>一种发酵产物的制造方法，其中，所述发酵产物的制造方法是培养微生物制造发酵产物的方法，包括以下工序(a)～(d)：(a)在第1培养基中培养微生物的工序；(b)使含有培养后的菌体、培养原料及发酵产物的培养液在填充有吸附所述发酵产物的吸附剂且菌体的大小(短径)d、吸附剂的细孔径d1及吸附剂之间的最小空隙直径d2满足d1<d<d2的关系的吸附塔内通液，从而使培养液中的发酵产物吸附于所述吸附剂，并回收从吸附塔流出的含有菌体及培养原料的流出液的工序；(c)使洗脱液与所述吸附剂接触，从而使发酵产物洗脱的工序；(d)在第2培养基中培养微生物的工序，其中，所述第2培养基使用含有所述回收的菌体和培养原料的流出液，并且，工序(b)中的最小空隙直径d2为1～500μm，且由下式(1)表示的粒径的变异系数cv为1～35％，变异系数cv值(％)＝[粒径的标准偏差σ]/[平均粒径d]×100(式1)。实施例[菌体浓度的测定方法]分取培养液的一部分用5％(w/v)氯化钠水溶液稀释混合100倍后，使用u-2000型日立分光光度计(日立制作所)测定波长600nm下的浊度，通过稀释率计算出od600值。[碱性蛋白酶生成量的测定方法]对于从培养液中除去菌体的培养上清液，使用proteinassayrapidkitwako(和光纯药工业公司制造)测定蛋白质的量，以求得在菌体外分泌生产的碱性蛋白酶的量。使用uv-2450分光光度计(岛津制作所制造)测定吸光度。[麦芽糖一水合物的量的测定方法]对于从培养液中除去菌体的培养上清液，使用f-kit麦芽糖/蔗糖/d-葡萄糖(rochediagnostics公司制造)，测定了麦芽糖一水合物的量。使用吸光分光光度计(benchmarkplus酶标仪、bio-rad公司制造)测定吸光度。将培养结束时的麦芽糖一水合物的量作为残糖量(g/l)。[碳源转化率的计算]碳源转化率通过下式计算。碳源转化率(％)＝[碱性蛋白酶的总碳源重量(g)]/[投入的麦芽糖一水合物的重量(g)]×100[碱性蛋白酶的回收率的计算]基于培养液和纯化的酶溶液的蛋白质的量，通过下式计算碱性蛋白酶的回收率。碱性蛋白酶的回收率(％)＝{(纯化的酶溶液的蛋白质浓度)×(纯化的酶溶液的回收量)}/{(培养液的蛋白质浓度)×(培养液的通液量)×100[ph值的测定方法]使用ph计f-635(broadleyjames公司制造)连续测定ph值。实施例1(1)导入蛋白酶基因表达突变的枯草杆菌突变株(168_protease菌株)的构建进行蛋白酶基因表达突变的导入。以枯草杆菌突变株rik1140(trpb'a'::prrnocatpt1ermhisc101)(日本特许第5847458号)的基因组dna为模板，用表1记载的引物trpb-f及prrno-catsd-r，通过pcr扩增了在来自trpb基因的氯霉素抗性基因上游区域中含有shine-dalgarno(sd)序列(shine,j.,dalgarno,l.,proc.natl.acad.sci.usa.,1974,71:1342-1346)的片段(a)。此外，使用表1记载的引物prrno-cat-erm-f和hisc-r2，通过pcr扩增含有红霉素抗性基因和hisc基因的片段(b)。接着，参考日本特开2002-218989号公报、日本特开2002-306176号公报、日本特开2004-122号公报、日本特开2004-305176号公报以及日本特开2006-129865号公报的记载，通过对蛋白酶kp43(具有序列编号no：1的氨基酸序列的碱性蛋白酶，参照日本特开2002-218989号公报)依次进行以下(1)～(11)的突变，制备kp43蛋白酶突变体。(1)第195位的酪氨酸由精氨酸取代(参照日本特开2002-218989号公报)(2)第369位的天冬氨酸由天冬酰胺取代(参照日本特开2002-306176号公报)(3)第65位的苏氨酸由脯氨酸取代(参照日本特开2004-122号公报)(4)第273位的缬氨酸由异亮氨酸取代(参照日本特开2004-122号公报)(5)第359位的苏氨酸由丝氨酸取代(参照日本特开2004-122号公报)(6)第387位的丝氨酸由丙氨酸取代(参照日本特开2004-122号公报)(7)第166位的天冬酰胺由甘氨酸取代(参照日本特开2004-305176号公报)(8)第167位的甘氨酸由缬氨酸取代(参照日本特开2004-305176号公报)(9)第133位的丙氨酸由丝氨酸取代(参照日本特开2006-129865号公报)(10)第134位的缬氨酸由苏氨酸取代(参照日本特开2006-129865号公报)(11)第133位和第134位之间插入丝氨酸(参照日本特开2006-129865号公报)将包含编码上述kp43蛋白酶突变体的基因的碱基序列的dna作为模板，用表1所述的引物prrno-p-f和prrno-p-r，将包含蛋白酶基因的片段(c)通过pcr扩增。接着，将得到的片段(a)、(b)及片段(c)用表1记载的引物trpb-f和hisc-r2通过soe-pcr法进行结合，得到最终pcr产物(a+b+c)。使用得到的最终pcr产物，通过感受态法(competentmethod)(j.bacteriol.，1960，81：741-746)对枯草杆菌野生株168菌株进行转化，得到作为红霉素耐药性且组氨酸营养缺陷型的枯草杆菌突变株168_protease菌株。hisc101表示hisc基因内的q318amber突变，该突变表示组氨酸营养缺陷型。此外，hisc101与trpc2突变(色氨酸营养缺陷型)相关。因此，枯草杆菌突变株168_protease菌株是表示色氨酸营养缺陷型和组氨酸营养缺陷型的菌株。通过使用得到的枯草杆菌突变株168_protease菌株的基因组的pcr以及随后通过sanger法进行的测序，确认在基因组上的规定的位置上导入了目标突变。[表1]引物序列(5’→3’)序列编号trpb-fgaatgaaataggcagatacggtgattttggcggaaagtttgttcc2prrno-catsd-rttgatatgcctcctaaatttttatctaaagtgtctcaaagcgact3prrno-cat-erm-ftatgaggatgaagaagcggtggatgcgtgttcgtgctgacttgca4hisc-r2ataaaatgcattttcaaacaggaactccttcgcagcggccactcc5prrno-p-faaaaatttaggaggcatatcaaatgagaagaaagaaaaaggtctt6prrn0-p-rccaccgcttcttcatcctcatattaattcacaattgccaacgaga7(2)第1培养工序将上述得到的转化体接种到30mllb培养基(10g/l胰蛋白、5g/l酵母提取物、5g/lnacl)中，在500ml容量坂口烧瓶中以30℃、125r/min的振荡速度培养20小时，作为种菌(种子培养)。接着，将上述种菌以2％(v/v)接种到100ml第1培养基(20g/l胰蛋白、10g/l酵母提取物、10g/lnacl、75g/l麦芽糖一水合物、7.5ppm硫酸锰4-5水合物)中，用第1培养槽在30℃、0.5vvm、1200r/min下进行通气搅拌培养66小时(第1培养)。培养中的平均ph值为7.6。培养66小时后菌体浓度(od600值)为37，通过光学显微镜观察培养液中的菌体大小，结果其短径约为0.8μm。此外，培养液中的残糖量为27(g/l)，碱性蛋白酶的生成量为0.24(g/l)。(3)分离工序(吸附)吸附塔中使用柱(内径23mm、高度3.6cm、体积15ml)，通过淤浆填充法将15ml作为吸附剂的sepabeadssp2mgs(三菱化学(株)制造)填充在该柱中。吸附剂的细孔径为46nm，粒径的分布范围为120～150μm，其平均粒径为137.0μm。吸附剂之间的最小空隙直径为18.6μm。柱中蒸馏水以0.5ml/分钟的流量、sv＝2/hr、bv＝5进行通液，并平衡化。接着，通过一边在第1培养槽中进行通气搅拌，一边从第1培养槽将100ml培养液以0.5ml/分钟的流量、sv＝2/hr、bv＝6.7对平衡化后的柱进行通液，由此碱性蛋白酶被吸附在吸附剂上的同时，使含有菌体和培养原料的溶液流出并回收。(水洗)接着，用15ml的2mm氯化钙水溶液作为洗涤液，以0.5ml/分的流量、sv＝2/hr、bv＝1进行通液并水洗。(脱离)对水洗后的柱，将45ml含2mm氯化钙的40％(v/v)丙二醇(pg)水溶液、45ml含2mm氯化钙的80％(v/v)丙二醇水溶液作为洗脱液，分别以0.5ml/分的流量、sv＝2/hr、bv＝3依次通液，进行碱性蛋白酶的脱离，回收纯化的酶溶液。纯化的碱性蛋白酶的回收率为90.7％。(4)第2培养工序除了将第1培养基浓缩至2.86倍以外，将35ml相同组成的第2培养基投入至第2培养槽，在与上述相同的条件下，对第2培养槽进行通气搅拌，并在其中添加65ml从柱中流出的含有菌体和培养原料的流出液。从第1培养基到第2培养基的继代培养量为菌体65％(v/v)、培养原料(基质)为65％(v/v)、产物(碱性蛋白酶)为0％(v/v)。用6n硫酸将第2培养基的ph值调节到7.0之后，在30℃、0.5vvm、1200r/min下进行通气搅拌培养76小时(第2培养)。培养中的ph值在7.0～7.9的范围内，平均ph值为7.7。培养76小时后的菌体浓度(od600值)为70。此外，碱性蛋白酶的生成量为0.51(g/l)。相对于第1培养、第2培养中全部的糖投入量，碱性蛋白酶的碳源转化率是0.67％。实施例2在实施例1的第1培养中，除了进行了97小时的培养以外，进行了相同的操作。在第1培养中，培养97小时后的菌体浓度(od600值)为30，此外，培养液中的残糖量为13(g/l)，碱性蛋白酶的生成量为0.27(g/l)。在第2培养中，培养76小时后的菌体浓度(od600值)为73，碱性蛋白酶的生成量为0.53(g/l)。此外，相对于第1培养、第2培养中全部的糖投入量，碱性蛋白酶的碳源转化率是0.71％。实施例3在实施例1的第1培养中，除了进行了122小时的培养以外，进行了相同的操作。在第1培养中，培养122小时后的菌体浓度(od600值)为29，此外，培养液中的残糖量为10(g/l)，碱性蛋白酶的生成量为0.27(g/l)。在第2培养中，培养76小时后的菌体浓度(od600值)为68，碱性蛋白酶的生成量为0.59(g/l)。此外，相对于第1培养、第2培养中全部的糖投入量，碱性蛋白酶的碳源转化率是0.77％。实施例4在实施例1的第1培养中，除了进行了144小时的培养以外，进行了相同的操作。在第1培养中，培养144小时后的菌体浓度(od600值)为26，此外，培养液中的残糖量为0(g/l)，碱性蛋白酶的生成量为0.28(g/l)。在第2培养中，培养76小时后的菌体浓度(od600值)为60，碱性蛋白酶的生成量为0.40(g/l)。此外，相对于第1培养、第2培养中全部的糖投入量，碱性蛋白酶的碳源转化率是0.61％。实施例5在实施例1的第1培养中，除了进行了7天、168小时的培养以外，进行了相同的操作。在第1培养中，培养168小时后的菌体浓度(od600值)为22，此外，培养液中的残糖量为0(g/l)，碱性蛋白酶的生成量为0.27(g/l)。在第2培养中，培养76小时后的菌体浓度(od600值)为58，碱性蛋白酶的生成量为0.36(g/l)。此外，相对于第1培养、第2培养中全部的糖投入量，碱性蛋白酶的碳源转化率是0.56％。比较例1关于实施例1的第1培养，进行培养直至培养液中的残糖量变为0(g/l)，不实施分离工序以后的工序。培养65小时后的菌体浓度(od600值)为37。相对于第1培养中的糖投入量，碱性蛋白酶的碳源转化率是0.48％。比较例2在实施例1的第1培养后，不使用柱，将培养液进行无菌离心分离(5℃，9000r/min，10分钟)以回收菌体，将其继代培养到第2培养基中。除此以外，进行了与实施例1相同的操作。培养中的ph值在6.5～8.1的范围内，平均ph值为7.6。从第1培养基到第2培养基的继代培养量为菌体100％(v/v)、培养原料(基质)为0％(v/v)、产物(碱性蛋白酶)为0％(v/v)。培养76小时后的菌体浓度(od600值)为44。此外，碱性蛋白酶的生成量为0.29(g/l)。相对于第1培养、第2培养中全部的糖投入量，碱性蛋白酶的碳源转化率是0.47％。表2示出了实施例1～5以及比较例1～2中的条件和碳源转化率。实施例6与实施例1相同地，进行第1培养工序、分离工序和第2培养工序。从第1培养基到第2培养基的继代培养量为菌体为65％(v/v)、培养原料(基质)为65％(v/v)、产物(碱性蛋白酶)为0％(v/v)。此外，第2培养工序结束后的菌体浓度(od600值)为70，培养液中的残糖量为27(g/l)，碱性蛋白酶的生成量为0.51(g/l)。第2培养中的ph值在7.0～7.9的范围内，平均ph值为7.7。相对于第1培养、第2培养中全部的糖投入量，碱性蛋白酶的碳源转化率是0.67％。第2培养工序结束后，进行与实施例1的分离工序相同的操作，回收含有菌体和培养原料的流出液后，将65ml流出液添加到投入了35ml与第2培养基相同组成的第3培养基的第3培养槽中。从第2培养基到第3培养基的继代培养量为菌体为65％(v/v)、培养原料(基质)为65％(v/v)、产物(碱性蛋白酶)为0％(v/v)。用6n硫酸将第3培养基的ph值调节到7.0之后，在30℃、0.5vvm、1200r/min下进行通气搅拌培养52小时(第3培养)。培养中的ph值在7.0～7.9的范围内，平均ph值为7.7。培养52小时后的菌体浓度(od600值)为85。此外，碱性蛋白酶的生成量为0.44(g/l)。相对于第1培养、第2培养、第3培养中全部的糖投入量，碱性蛋白酶的碳源转化率是0.71％。实施例7在实施例6中，除了培养开始时不调节第2培养基和第3培养基的ph值以外，进行了相同的操作。第2培养中的ph值在7.3～8.4的范围内，平均ph值为7.9。此外，第3培养中的ph值在7.7～8.9的范围内，平均ph值为8.3。从第1培养基到第2培养基的继代培养量为菌体为65％(v/v)、培养原料(基质)为65％(v/v)、产物(碱性蛋白酶)为0％(v/v)。此外，第2培养工序结束后的菌体浓度(od600值)为72，培养液中的残糖量为27(g/l)，碱性蛋白酶的生成量为0.47(g/l)。相对于第1培养、第2培养中全部的糖投入量，碱性蛋白酶的碳源转化率是0.63％。从第2培养基到第3培养基的继代培养量为菌体为65％(v/v)、培养原料(基质)为65％(v/v)、产物(碱性蛋白酶)为0％(v/v)。第3培养52小时后的菌体浓度(od600值)为83。此外，碱性蛋白酶的生成量为0.31(g/l)。相对于第1培养、第2培养、第3培养中全部的糖投入量，碱性蛋白酶的碳源转化率是0.61％。表3示出了实施例6和7中的条件和碳源转化率。[表3]根据表2可以确认：通过本发明的方法，可以不浪费地利用菌体和培养原料，从培养基中的碳源即麦芽糖一水合物向碱性蛋白酶的转化率高。此外，根据表3可以确认：在使用回收的流出液的培养基中，重复进行2次以上培养微生物的工序时，优选进行该培养基的ph值调节，由此提高发酵产物的生产效率。序列表<110>花王株式会社<120>发酵产物的制造方法<130>ks1614<150>jp2018-022774<151>2018-02-13<160>7<170>patentinversion3.1<210>1<211>434<212>prt<213>芽孢杆菌sp.（bacillussp.）<400>1asnaspvalalaargglyilevallysalaaspvalalaglnserser151015tyrglyleutyrglyglnglyglnilevalalavalalaaspthrgly202530leuaspthrglyargasnaspsersermethisglualaphearggly354045lysilethralaleutyralaleuglyargthrasnasnalaasnasp505560thrasnglyhisglythrhisvalalaglyservalleuglyasngly65707580serthrasnlysglymetalaproglnalaasnleuvalpheglnser859095ilemetaspserglyglyglyleuglyglyleuproserasnleugln100105110thrleupheserglnalatyrseralaglyalaargilehisthrasn115120125sertrpglyalaalavalasnglyalatyrthrthraspserargasn130135140valaspasptyrvalarglysasnaspmetthrileleuphealaala145150155160glyasngluglyproasnglyglythrileseralaproglythrala165170175lysasnalailethrvalglyalathrgluasnleuargproserphe180185190glysertyralaaspasnileasnhisvalalaglnpheserserarg195200205glyprothrlysaspglyargilelysproaspvalmetalaprogly210215220thrpheileleuseralaargserserleualaproaspserserphe225230235240trpalaasnhisaspserlystyralatyrmetglyglythrsermet245250255alathrproilevalalaglyasnvalalaglnleuarggluhisphe260265270vallysasnargglyilethrprolysproserleuleulysalaala275280285leuilealaglyalaalaaspileglyleuglytyrproasnglyasn290295300glnglytrpglyargvalthrleuasplysserleuasnvalalatyr305310315320valasngluserserserleuserthrserglnlysalathrtyrser325330335phethralathralaglylysproleulysileserleuvaltrpser340345350aspalaproalaserthrthralaservalthrleuvalasnaspleu355360365aspleuvalilethralaproasnglythrglntyrvalglyasnasp370375380phethrserprotyrasnaspasntrpaspglyargasnasnvalglu385390395400asnvalpheileasnalaproglnserglythrtyrthrilegluval405410415glnalatyrasnvalprovalglyproglnthrpheserleualaile420425430valasn<210>2<211>45<212>dna<213>人工序列<220><223>trpb-f<400>2gaatgaaataggcagatacggtgattttggcggaaagtttgttcc45<210>3<211>45<212>dna<213>人工序列<220><223>prrno-catsd-r<400>3ttgatatgcctcctaaatttttatctaaagtgtctcaaagcgact45<210>4<211>45<212>dna<213>人工序列<220><223>prrno-cat-erm-f<400>4tatgaggatgaagaagcggtggatgcgtgttcgtgctgacttgca45<210>5<211>45<212>dna<213>人工序列<220><223>hisc-r2<400>5ataaaatgcattttcaaacaggaactccttcgcagcggccactcc45<210>6<211>45<212>dna<213>人工序列<220><223>prrno-p-f<400>6aaaaatttaggaggcatatcaaatgagaagaaagaaaaaggtctt45<210>7<211>45<212>dna<213>人工序列<220><223>prrno-p-r<400>7ccaccgcttcttcatcctcatattaattcacaattgccaacgaga45当前第1页12