修饰的牛痘载体的制作方法

[0001]
本发明涉及免疫疗法领域，例如，用于治疗细胞增殖异常，如癌症。具体地，本发明涉及基因修饰的牛痘病毒(vaccinia viruses)以及制备和使用所述牛痘病毒的方法。
[0002]
发明背景
[0003]
可以刺激免疫系统以识别肿瘤细胞并靶向它们进行破坏。使用溶瘤牛痘病毒(oncolytic vaccinia viruses)的免疫疗法是癌症研究中的快速发展领域。需要新的方法来工程设计和/或提高溶瘤病毒的肿瘤选择性以使效率和安全最大化。当将潜在毒性的治疗剂或基因加入至病毒时，这种选择性是特别重要的。
[0004]
尽管牛痘病毒作为临床溶瘤载体的使用是有希望的癌症治疗范式，但是由于在患者中的毒性，如痘病变(pox lesions)以及免疫抑制副作用，大部分当前的临床候选仅显示出有限的临床成功。仍需要方法来工程设计显示出更稳健的病毒复制、癌细胞杀死和从感染点的扩展的牛痘病毒。本发明通过使用修饰的牛痘病毒解决了这种需要并且提供了选择性和安全性限制的解决方案。
[0005]
发明概述
[0006]
本发明公开描述了哥本哈根(copenhagen)来源的牛痘病毒载体用于癌症治疗的使用。具体地，本发明公开部分基于当基因修饰牛痘病毒以包含以下基因中的一些或全部缺失时，意外提高的溶瘤活性，感染的扩展以及安全性结果：c2l、c1l、n1l、n2l、m1l、m2l、k1l、k2l、k3l、k4l、k5l、k6l、k7r、f1l、f2l、f3l、b14r、b15r、b16r、b17l、b18r、b19r、b20r、k orf a、k orf b、b orf e、b orf f、b orf g、b21r、b22r、b23r、b24r、b25r、b26r、b27r、b28r和b29r。具体地，在这些基因的一种或多种或全部中显示出突变的来源于基因修饰的哥本哈根来源的牛痘病毒的载体可以显示出一系列有益特征，如改善的溶瘤能力、肿瘤内的复制、感染性、免疫逃避(immune evasion)、肿瘤持久性(tumor persistence)、掺入外源dna序列的能力和大规模生产的可采性。本发明公开描述了进一步基因修饰以包含b8r基因中的缺失的牛痘病毒。在以下公开的多个实施方式中，本发明还可以包括b8r基因的缺失。在多个实施方式中，修饰的牛痘病毒表达至少一种转基因。
[0007]
在第一个方面，本发明的特征在于包括重组牛痘病毒基因组(recombinant vaccinia virus genome)的核酸，其中所述重组牛痘病毒基因组具有至少六个牛痘基因的缺失，其中一个牛痘基因来自以下(a)-(f)中的每一项：(a)f1l；(b)n1l和b14r；(c)m2l、k1l和k7r；(d)c2l、n2l、m1l、k2l、k3l、f3l、b16r和b19r；(e)k4l、k5l、k6l和f2l；(f)b15r、b17l、b18r和b20r。
[0008]
在一些实施方式中，所述缺失包括至少7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21或22个基因，每个独立地选自c2l、c1l、n1l、n2l、m1l、m2l、k1l、k2l、k3l、k4l、k5l、k6l、k7r、f1l、f2l、f3l、b14r、b15r、b16r、b17l、b18r、b19r、b20r。在一些实施方式中，所述缺失包括c2l、c1l、n1l、n2l、m1l、m2l、k1l、k2l、k3l、k4l、k5l、k6l、k7r、f1l、f2l、f3l、b14r、b15r、b16r、b17l、b18r、b19r、b20r基因中的每一个。在多个实施方式中，所述重组牛痘病毒基因组还可以包括b8r缺失。
[0009]
在另一个方面，本发明的特征在于包括重组牛痘病毒基因组的核酸，其中所述重组牛痘病毒基因组具有至少1、2、3、4或5个基因的缺失，所述基因选自b14r、b16r、b17l、b18r、b19r和b20r。在一些实施方式中，所述缺失包括b14r、b16r、b17l、b18r、b19r和b20r中的每一个。在多个实施方式中，所述重组牛痘病毒基因组还可以包括b8r缺失。
[0010]
在另一个方面，本发明的特征在于包括重组牛痘病毒基因组的核酸，其中所述重组牛痘病毒基因组具有至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个基因的缺失，所述基因选自c2l、c1l、n1l、n2l、m1l、m2l、k1l、k2l、k3l、k4l、k5l、k6l、k7r、f1l、f2l、f3l。在一些实施方式中，所述缺失包括c2l、c1l、n1l、n2l、m1l、m2l、k1l、k2l、k3l、k4l、k5l、k6l、k7r、f1l、f2l、f3l中的每一个。在多个实施方式中，所述重组牛痘病毒基因组还可以包括b8r缺失。
[0011]
在另一个方面，本发明的特征在于包括重组牛痘病毒基因组的核酸，其中所述重组牛痘病毒基因组具有至少1个基因的缺失，所述基因编码半胱天冬氨酸酶-9抑制剂。在一些实施方式中，编码半胱天冬氨酸酶-9抑制剂的基因是f1l。
[0012]
在另一个方面，本发明的特征在于包括重组牛痘病毒基因组的核酸，其中所述重组牛痘病毒基因组具有至少1个基因的缺失，所述基因编码bcl-2抑制剂。在一些实施方式中，编码bcl-2抑制剂的基因是n1l。
[0013]
在另一个方面，本发明的特征在于包括重组牛痘病毒基因组的核酸，其中所述重组牛痘病毒基因组具有至少1个基因的缺失，所述基因编码dutp酶。在一些实施方式中，编码dutp酶的基因是f2l。
[0014]
在另一个方面，本发明的特征在于包括重组牛痘病毒基因组的核酸，其中所述重组牛痘病毒基因组具有至少1个基因的缺失，所述基因编码ifn-α/β-受体-样分泌糖蛋白。在一些实施方式中，编码ifn-α/β-受体-样分泌糖蛋白的基因是b19r。
[0015]
在另一个方面，本发明的特征在于包括重组牛痘病毒基因组的核酸，其中所述重组牛痘病毒基因组具有至少1个基因的缺失，所述基因编码il-1-β-抑制剂。在一些实施方式中，编码il-1-β-抑制剂的基因是b16r。
[0016]
在另一个方面，本发明的特征在于包括重组牛痘病毒基因组的核酸，其中所述重组牛痘病毒基因组具有至少1个基因的缺失，所述基因编码磷脂酶-d。在一些实施方式中，编码磷脂酶-d的基因是k4l。
[0017]
在另一个方面，本发明的特征在于包括重组牛痘病毒基因组的核酸，其中所述重组牛痘病毒基因组具有至少1个基因的缺失，所述基因编码pkr抑制剂。在一些实施方式中，编码pkr抑制剂的基因是k3l。
[0018]
在另一个方面，本发明的特征在于包括重组牛痘病毒基因组的核酸，其中所述重组牛痘病毒基因组具有至少1个基因的缺失，所述基因编码丝氨酸蛋白酶抑制剂。在一些实施方式中，编码丝氨酸蛋白酶抑制剂的基因是k2l。
[0019]
在另一个方面，本发明的特征在于包括重组牛痘病毒基因组的核酸，其中所述重组牛痘病毒基因组具有至少1个基因的缺失，所述基因编码tlr信号转导抑制剂。在一些实施方式中，编码tlr信号转导抑制剂的基因是n2l。
[0020]
在另一个方面，本发明的特征在于包括重组牛痘病毒基因组的核酸，其中所述重组牛痘病毒基因组具有至少1或2个基因的缺失，所述基因编码kelch-样蛋白。在一些实施方式中，编码kelch-样蛋白的基因独立地选自f3l和c2l。
[0021]
在另一个方面，本发明的特征在于包括重组牛痘病毒基因组的核酸，其中所述重组牛痘病毒基因组具有至少1或2个基因的缺失，所述基因编码单酸甘油酯脂肪酶(monoglyceride lipase)。在一些实施方式中，编码单酸甘油酯脂肪酶的基因独立地选自k5l和k6l。
[0022]
在另一个方面，本发明的特征在于包括重组牛痘病毒基因组的核酸，其中所述重组牛痘病毒基因组具有至少1、2或3个基因的缺失，所述基因编码nf-κb抑制剂。在一些实施方式中，编码nf-κb抑制剂的基因独立地选自k7r、k1l和m2l。
[0023]
在一些实施方式中，所述重组牛痘病毒基因组具有至少1、2或3个基因的缺失，所述基因编码锚蛋白重复序列蛋白。在一些实施方式中，编码锚蛋白重复序列蛋白的基因独立地选自b18r、b20r和m1l。
[0024]
在一些实施方式中，所述重组牛痘病毒基因组具有至少1、2或3个基因的缺失，所述基因选自b15r、b17r和b14r。在多个实施方式中，所述重组牛痘病毒基因组还可以包括b8r缺失。
[0025]
在一些实施方式中，所述重组牛痘病毒基因组具有至少1、2、3、4、5、6、7或8个基因的缺失，所述基因选自末端反向重复(itr)基因，所述基因包括b21r、b22r、b23r、b24r、b25r、b26r、b27r、b28r和b29r。在一些实施方式中，所述缺失包括b21r、b22r、b23r、b24r、b25r、b26r、b27r、b28r和b29r中的每一个。在多个实施方式中，所述重组牛痘病毒基因组还可以包括b8r缺失。在多个实施方式中，所述重组牛痘病毒基因组还可以包括b8r缺失。
[0026]
在一些实施方式中，所述缺失的一种或多种或者全部是编码相应基因的整个多核苷酸的缺失。在一些实施方式中，所述缺失的一种或多种或者全部是编码相应基因的多核苷酸的部分缺失，从而所述缺失足以使所述基因无功能，例如，当引入宿主细胞中时。
[0027]
在一些实施方式中，所述核酸还包括编码提供改善的溶瘤活性的蛋白、能够引起免疫应答以用作疫苗的蛋白、治疗性多肽或治疗性核酸的转基因。在一些实施方式中，所述转基因编码提供改善的溶瘤活性的蛋白。在一些实施方式中，所述转基因编码能够引起免疫应答以用作疫苗的蛋白。在一些实施方式中，所述转基因编码提供治疗性多肽的蛋白。在一些实施方式中，所述转基因编码治疗性多肽。
[0028]
在另一个方面，本发明的特征在于具有至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21或22个基因的缺失的重组牛痘病毒载体，每个所述基因独立地选自c2l、c1l、n1l、n2l、m1l、m2l、k1l、k2l、k3l、k4l、k5l、k6l、k7r、f1l、f2l、f3l、b14r、b15r、b16r、b17l、b18r、b19r、b20r、k orf a、k orf b、b orf e、b orf f、b orf g、b21r、b22r、b23r、b24r、b25r、b26r、b27r、b28r和b29r。在一些实施方式中，所述缺失包括c2l、c1l、n1l、n2l、m1l、m2l、k1l、k2l、k3l、k4l、k5l、k6l、k7r、f1l、f2l、f3l、b14r、b15r、b16r、b17l、b18r、b19r、b20r、k orf a、k orf b、b orf e、b orf f、b orf g、b21r、b22r、b23r、b24r、b25r、b26r、b27r、b28r和b29r中的每一个。在多个实施方式中，所述重组牛痘病毒基因组还可以包括b8r缺失。
[0029]
在另一个方面，本发明的特征在于包括重组牛痘病毒基因组的重组牛痘病毒载体，其中所述重组牛痘病毒基因组具有至少1、2、3、4或5个基因的缺失，所述基因选自b14r、b16r、b17l、b18r、b19r和b20r。在一些实施方式中，所述缺失包括b14r、b16r、b17l、b18r、b19r和b20r中的每一个。在多个实施方式中，所述重组牛痘病毒基因组还可以包括b8r缺
失。
[0030]
在另一个方面，本发明的特征在于包括重组牛痘病毒基因组的重组牛痘病毒载体，其中所述重组牛痘病毒基因组具有至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16个基因的缺失，所述基因选自c2l、c1l、n1l、n2l、m1l、m2l、k1l、k2l、k3l、k4l、k5l、k6l、k7r、f1l、f2l、f3l。在一些实施方式中，所述缺失包括c2l、c1l、n1l、n2l、m1l、m2l、k1l、k2l、k3l、k4l、k5l、k6l、k7r、f1l、f2l、f3l中的每一个。在多个实施方式中，所述重组牛痘病毒基因组还可以包括b8r缺失。
[0031]
在另一个方面，本发明的特征在于具有至少1个基因的缺失的重组牛痘病毒载体，所述基因编码半胱天冬氨酸酶-9抑制剂。在一些实施方式中，编码半胱天冬氨酸酶-9抑制剂的基因是f1l。
[0032]
在另一个方面，本发明的特征在于具有至少1个基因的缺失的重组牛痘病毒载体，所述基因编码bcl-2抑制剂。在一些实施方式中，编码bcl-2抑制剂的基因是n1l。
[0033]
在另一个方面，本发明的特征在于具有至少1个基因的缺失的重组牛痘病毒载体，所述基因编码dutp酶。在一些实施方式中，编码dutp酶的基因是f2l。
[0034]
在另一个方面，本发明的特征在于具有至少1个基因的缺失的重组牛痘病毒载体，所述基因编码ifn-α/β-受体-样分泌糖蛋白。在一些实施方式中，编码ifn-α/β-受体-样分泌糖蛋白的基因是b19r。
[0035]
在另一个方面，本发明的特征在于具有至少1个基因的缺失的重组牛痘病毒载体，所述基因编码il-1-β-抑制剂。在一些实施方式中，编码il-1-β-抑制剂的基因是b16r。
[0036]
在另一个方面，本发明的特征在于具有至少1个基因的缺失的重组牛痘病毒载体，所述基因编码磷脂酶-d。在一些实施方式中，编码磷脂酶-d的基因是k4l。
[0037]
在另一个方面，本发明的特征在于具有至少1个基因的缺失的重组牛痘病毒载体，所述基因编码pkr抑制剂。在一些实施方式中，编码pkr抑制剂的基因是k3l。
[0038]
在另一个方面，本发明的特征在于具有至少1个基因的缺失的重组牛痘病毒载体，所述基因编码丝氨酸蛋白酶抑制剂。在一些实施方式中，编码丝氨酸蛋白酶抑制剂的基因是k2l。
[0039]
在另一个方面，本发明的特征在于具有至少1个基因的缺失的重组牛痘病毒载体，所述基因编码tlr信号转导抑制剂。在一些实施方式中，编码tlr信号转导抑制剂的基因是n2l。
[0040]
在另一个方面，本发明的特征在于具有至少1个基因的缺失的重组牛痘病毒载体，所述基因编码kelch-样蛋白。
[0041]
在一些实施方式中，所述重组牛痘病毒基因组具有至少1或2个基因的缺失，所述基因编码kelch-样蛋白。在一些实施方式中，编码kelch-样蛋白的基因独立地选自f3l和c2l。
[0042]
在另一个方面，本发明的特征在于具有至少1个基因的缺失的重组牛痘病毒载体，所述基因编码单酸甘油酯脂肪酶。
[0043]
在一些实施方式中，所述重组牛痘病毒基因组具有至少1或2个基因的缺失，所述基因编码单酸甘油酯脂肪酶。在一些实施方式中，编码单酸甘油酯脂肪酶的基因独立地选自k5l和k6l。
[0044]
在另一个方面，本发明的特征在于具有至少1个基因的缺失的重组牛痘病毒载体，所述基因编码nf-κb抑制剂。
[0045]
在一些实施方式中，所述重组牛痘病毒基因组具有至少1、2或3个基因的缺失，所述基因编码nf-κb抑制剂。在一些实施方式中，编码nf-κb抑制剂的基因独立地选自k7r、k1l和m2l。
[0046]
在另一个方面，本发明的特征在于具有至少1个基因的缺失的重组牛痘病毒载体，所述基因编码锚蛋白重复序列蛋白。
[0047]
在一些实施方式中，所述重组牛痘病毒基因组具有至少1、2或3个基因的缺失，所述基因编码锚蛋白重复序列蛋白。在一些实施方式中，编码锚蛋白重复序列蛋白的基因独立地选自b18r、b20r和m1l。
[0048]
在一些实施方式中，所述重组牛痘病毒基因组具有至少1、2或3个基因的缺失，所述基因选自b15r、b17r和b14r。
[0049]
在一些实施方式中，所述重组牛痘病毒载体具有至少1、2、3、4、5、6、7或8个基因的缺失，所述基因选自包括b21r、b22r、b23r、b24r、b25r、b26r、b27r、b28r和b29r的itr基因。在多个实施方式中，所述重组牛痘病毒基因组还可以包括b8r缺失。
[0050]
在一些实施方式中，所述缺失的一种或多种或者全部是编码相应基因的整个多核苷酸的缺失。在一些实施方式中，所述缺失的一种或多种或者全部是编码相应基因的多核苷酸的部分缺失，从而所述缺失足以使所述基因无功能，例如，当引入宿主细胞中时。
[0051]
在一些实施方式中，所述载体还包括编码提供改善的溶瘤活性的蛋白、能够引起免疫应答以用作疫苗的蛋白、治疗性多肽或治疗性核酸的转基因。在一些实施方式中，所述转基因编码提供改善的溶瘤活性的蛋白。在一些实施方式中，所述转基因编码能够引起免疫应答以用作疫苗的蛋白。在一些实施方式中，所述转基因编码提供治疗性多肽的蛋白。在一些实施方式中，所述转基因编码治疗性多肽。
[0052]
在一些实施方式中，一旦将哺乳动物细胞群体(例如，人细胞，如人癌细胞)与所述核酸或所述重组牛痘病毒载体接触，则相对于与不包括所述缺失的牛痘病毒载体形式接触的相同类型的哺乳动物细胞群体，所述细胞显示出升高的合胞体形成(syncytia formation)，如(例如)使用本文所述的或本领域中已知的显微镜学技术通过目视检查所评价的。
[0053]
在一些实施方式中，一旦将哺乳动物细胞群体(例如，人细胞，如人癌细胞)与所述核酸或所述重组牛痘病毒载体接触，则相对于与不包括所述缺失的牛痘病毒载体形式接触的相同类型的哺乳动物细胞群体，所述细胞显示出升高的牛痘病毒载体的扩展，如(例如)使用本文所述的或本领域中已知的空斑形成测定(plaque-forming assays)所评价的。
[0054]
在一些实施方式中，相对于不包括所述缺失的牛痘病毒载体形式，所述核酸或所述重组牛痘病毒载体对哺乳动物细胞群体(例如，人细胞，如人癌细胞)施加了升高的细胞毒作用，如(例如)使用本文所述的或本领域中已知的细胞死亡测定所评价的。
[0055]
在一些实施方式中，所述哺乳动物细胞来自选自下列的细胞系：u2os、293、293t、vero、hela、a549、bhk、bsc40、cho、ovcar-8、786-0、nci-h23、u251、sf-295、t-47d、skmel2、bt-549、sk-mel-28、mda-mb-231、sk-ov-3、mcf7、m14、sf-268、caki-1、hpav、ovcar-4、hct15、k-562和hct-116。
[0056]
在另一个方面，本发明的特征在于含有根据本文所述的任何方面或实施方式的核酸或重组牛痘病毒载体的包装细胞系(packaging cell line)。
[0057]
在另一个方面，本发明的特征在于通过向患者施用治疗有效量的所述核酸或所述重组牛痘病毒载体，治疗哺乳动物患者中的癌症的方法。
[0058]
在一些实施方式中，所述哺乳动物患者是人患者。
[0059]
在一些实施方式中，癌症选自白血病、淋巴瘤、肝癌、骨癌、肺癌、脑癌、膀胱癌、胃肠癌、乳腺癌、贲门癌、宫颈癌、子宫癌、头颈癌、胆囊癌、喉癌、唇癌和口腔癌、眼癌、黑素瘤、胰腺癌、前列腺癌、结肠直肠癌、睾丸癌和咽喉癌。
[0060]
在一些实施方式中，癌症选自急性淋巴母细胞性白血病(all)、急性髓细胞性白血病(aml)、慢性淋巴细胞性白血病(cll)、慢性粒性白血病(cml)、肾上腺皮质癌、aids-相关淋巴瘤、原发性cns淋巴瘤、肛门癌、阑尾癌、星形细胞瘤、非典型性畸胎样/横纹肌样肿瘤、基底细胞癌、胆管癌、肝外癌、尤因肉瘤家族肿瘤、骨肉瘤和恶性纤维组织细胞瘤、中枢神经系统胚胎性瘤、中枢神经系统生殖细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、支气管瘤、伯基特淋巴瘤、类癌瘤、原发性淋巴瘤、脊索瘤、慢性骨髓增殖性肿瘤、结肠癌、肝外胆管癌、原位管癌(dcis)、子宫内膜癌、室管膜瘤、食道癌、鼻腔神经胶质瘤、颅外生殖细胞瘤、性腺外生殖细胞瘤、输卵管癌、骨纤维组织细胞瘤、胃肠道类癌瘤、胃肠道间质瘤(gist)、睾丸生殖细胞瘤、妊娠滋养细胞病、神经胶质瘤、儿童脑干神经胶质瘤、毛细胞白血病、肝细胞癌、郎格罕细胞组织细胞增生症、霍奇金淋巴瘤、舌癌、胰岛细胞瘤、胰腺神经内分泌瘤、胚胎性癌肉瘤及其它儿童肾瘤、郎格罕细胞组织细胞增生症、小细胞肺癌、皮肤t细胞淋巴瘤、眼内黑素瘤、merkel细胞癌、间皮瘤、转移性颈鳞癌、中线道癌、多发性内分泌瘤综合征、多发性骨髓瘤/浆细胞瘤、脊髓发育不良综合征、鼻腔和鼻窦癌、鼻咽癌、成神经细胞瘤、非霍奇金氏淋巴瘤(nhl)、非小细胞肺癌(nsclc)、上皮性卵巢癌、生殖细胞卵巢癌、低度恶性潜能卵巢癌、胰腺神经内分泌瘤、乳头状瘤病、副神经节瘤、鼻窦和鼻腔癌、甲状旁腺癌、阴茎癌、咽癌、嗜铬细胞瘤、垂体瘤、胸膜肺胚细胞瘤、原发性腹膜癌、直肠癌、成视网膜细胞瘤、横纹肌肉瘤、唾液腺癌、卡波西肉瘤、横纹肌肉瘤、塞扎里氏综合征、小肠癌、软组织肉瘤、咽喉癌、胸腺瘤和胸腺癌、甲状腺癌、肾盂和输尿管的移行细胞癌、尿道癌、子宫内膜癌、子宫肉瘤、阴道癌、外阴癌和华氏巨球蛋白血症。
[0061]
在另一个方面，本发明的特征在于含有根据本文所述的任何方面或实施方式的核酸或载体的试剂盒和向所述试剂盒的用户说明以在宿主细胞中表达核酸或载体的包装说明书。
[0062]
在另一个方面，本发明的特征在于含有根据本文所述的任何方面或实施方式的核酸或重组牛痘病毒载体的试剂盒和向用户说明以向患有癌症的哺乳动物患者(例如，人患者)施用治疗有效量的所述核酸或重组牛痘病毒载体，借此治疗所述癌症的包装说明书。
[0063]
定义
[0064]
如本文所使用的，术语“约”是指大于或小于所描述的值不超过10％的值。例如，术语“约5nm”表示4.5nm至5.5nm的范围。
[0065]
如本文所使用的，术语“缺失”等表示移除基因或另外使基因无功能的对所述基因或与之结合或与之操作性连接的调控元件(例如，转录因子结合位点，如启动子或增强子元件)的修饰(modifications)。如本文所述，示例性缺失包括从靶标基因的起始密码子至终
止密码子，将编码所涉及的基因的核酸的全部移除。如本文所述的缺失的其它实例包括编码靶标基因的核酸的部分移除(例如，一个或多个密码子或其部分，如单核苷酸缺失)，从而当部分缺失的靶标基因表达时，产物(例如，rna转录本、蛋白产物或调控rna，如mirna)是无功能的或比靶标基因的野生型形式的功能低。如本文所述的示例性缺失包括与所涉及的基因结合的调控元件的全部或部分移除，如调控靶标基因表达的启动子和/或增强子核酸的全部或部分的移除。
[0066]
如本文所使用的，术语“内源的”描述了天然存在于特定生物(例如，人)或生物内的特定位置(例如，器官、组织或细胞，如人细胞)中的分子(例如，多肽、核酸或辅因子)。
[0067]
如本文所使用的，术语“序列同一性百分比(％)”是指在序列比对和为了实现最大序列同一性百分比(如有必要)而引入缺口(例如，可以在候选和参考序列之一或两者中引入缺口以进行最优比对，并且出于比较的目的，可以忽略非同源序列)之后，与参考序列的氨基酸(或核酸)残基相同的候选序列的氨基酸(或核酸)残基的百分比。出于确定序列同一性百分比的目的，可以通过本领域技术范围内的多种方式实现比对，例如，使用公开可用的计算机软件，如blast、align或megalign(onastar)软件。本领域技术人员可以确定用于测量比对的适当参数，其包括对正在比较的序列全长实现最大比对所需的任何算法。例如，为了与候选序列相比较而比对的参考序列可以显示候选序列在候选序列全长或候选序列邻接氨基酸(或核酸)残基的所选部分显示出50％至100％的序列同一性。出于比较目的而比对的候选序列长度可以是(例如)参考序列长度的至少30％(例如，30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％)。当候选序列中的5位被与参考序列中相应位置相同的氨基酸残基占据时，则所述分子在该位置处是同一的。
[0068]
如本文所使用的，术语“受试者”和“患者”是指接受对如本文所述的特定疾病或病况(如癌症或传染性疾病)的治疗的生物。受试者和患者的实例包括接受对疾病或病况，例如，细胞增殖异常，如癌症的治疗的哺乳动物，如人。
[0069]
如本文所使用的，术语“治疗”是指治疗性治疗(therapeutic treatment)，其中目标是预防或减缓(减轻)不希望的生理变化或异常，如细胞增殖异常的发展，如癌症。有益或所期望的临床结果包括(但不限于)症状减轻、疾病程度降低、稳定(即，未恶化)的疾病状态、疾病发展的延迟或减缓、疾病状态的改善或减轻和(部分或全部)症状的缓解，无论其是可检测的或不可检测的。需要治疗的那些包括已患有病况或病症的那些以及易患病况或病症的那些或者其中要预防病况或病症的那些。
[0070]
如本文所使用的，术语“载体”是指核酸载体，例如，dna载体，如质粒、rna载体、病毒或其它适合的复制子(例如，病毒载体)。已开发了多种载体以用于将编码外源蛋白的多核苷酸递送至原核或真核细胞。在(例如)wo 1994/11026中公开了这些表达载体的实例；其作为参考并入本文。本发明的表达载体可以含有用于蛋白表达和/或这些多核苷酸序列向宿主细胞，如哺乳动物细胞(例如，人细胞)的基因组中整合的一个或多个其它序列元件。可以用于本文所述的抗体和抗体片段的表达的示例性载体包括含有指导基因转录的调控序列，如启动子和增强子区的质粒。载体可以含有调节靶标基因的翻译速率或改善由基因转录所产生的mrna的稳定性或核输出的核酸。这些序列元件可以包括(例如)5'和3'未翻译区、内部核糖体进入位点(ires)和多腺苷酸化信号位点以指导表达载体所携带的基因的有效转录。本文所述的载体还可以含有编码用于含有这些载体的细胞的选择的标志物的多核
苷酸。适合的标志物的实例包括编码抗生素(如氨苄西林(ampicillin)、氯霉素(chloramphenicol)、卡那霉素(kanamycin)或诺尔丝菌素(nourseothricin))的抗药性的基因。
[0071]
基因定义
[0072]
如本文所使用的，“c2l”是指牛痘病毒基因，如编码kelch-样蛋白的基因。编码c2l基因的蛋白序列的非限制性实例列于下表31-35中。术语“c2l”还可以包括下表所列的蛋白的片段或变体或者来自另一牛痘病毒株的同源基因。
[0073]
如本文所使用的，“c1l”是指牛痘病毒基因。编码c2l基因的蛋白序列的非限制性实例列于下表31-35中。术语“c1l”还可以包括下表所列的蛋白的片段或变体或者来自另一牛痘病毒株的同源基因。
[0074]
如本文所使用的，“n1l”是指牛痘病毒基因，如编码bcl-2抑制剂的基因。编码n1l基因的蛋白序列的非限制性实例列于下表31-35中。术语“n1l”还可以包括下表所列的蛋白的片段或变体或者来自另一牛痘病毒株的同源基因。
[0075]
如本文所使用的，“n2l”是指牛痘病毒基因，如编码tlr信号转导抑制剂的基因。编码n2l基因的蛋白序列的非限制性实例列于下表31-35中。术语“n2l”还可以包括下表所列的蛋白的片段或变体或者来自另一牛痘病毒株的同源基因。
[0076]
如本文所使用的，“m1l”是指牛痘病毒基因，如编码锚蛋白重复序列蛋白的基因。编码m1l基因的蛋白序列的非限制性实例列于下表31-35中。术语“m1l”还可以包括下表所列的蛋白的片段或变体或者来自另一牛痘病毒株的同源基因。
[0077]
如本文所使用的，“m2l”是指牛痘病毒基因，如编码nf-κb抑制剂的基因。编码m2l基因的蛋白序列的非限制性实例列于下表31-35中。术语“m2l”还可以包括下表所列的蛋白的片段或变体或者来自另一牛痘病毒株的同源基因。
[0078]
如本文所使用的，“k1l”是指牛痘病毒基因，如编码nf-κb抑制剂的基因。编码k1l基因的蛋白序列的非限制性实例列于下表31-35中。术语“k1l”还可以包括下表所列的蛋白的片段或变体或者来自另一牛痘病毒株的同源基因。
[0079]
如本文所使用的，“k2l”是指牛痘病毒基因，如编码锚蛋白重复序列蛋白的基因。编码k2l基因的蛋白序列的非限制性实例列于下表31-35中。术语“k2l”还可以包括下表所列的蛋白的片段或变体或者来自另一牛痘病毒株的同源基因。
[0080]
如本文所使用的，“k3l”是指牛痘病毒基因，如编码pkr抑制剂的基因。编码k3l基因的蛋白序列的非限制性实例列于下表31-35中。术语“k3l”还可以包括下表所列的蛋白的片段或变体或者来自另一牛痘病毒株的同源基因。
[0081]
如本文所使用的，“k4l”是指牛痘病毒基因，如编码磷脂酶-d的基因。编码k4l基因的蛋白序列的非限制性实例列于下表31-35中。术语“k4l”还可以包括下表所列的蛋白的片段或变体或者来自另一牛痘病毒株的同源基因。
[0082]
如本文所使用的，“k5l”是指牛痘病毒基因，如编码单酸甘油酯脂肪酶的基因。编码k5l基因的蛋白序列的非限制性实例列于下表31-35中。术语“k5l”还可以包括下表所列的蛋白的片段或变体或者来自另一牛痘病毒株的同源基因。
[0083]
如本文所使用的，“k6l”是指牛痘病毒基因，如编码单酸甘油酯脂肪酶的基因。编码k6l基因的蛋白序列的非限制性实例列于下表31-35中。术语“k6l”还可以包括下表所列
的蛋白的片段或变体或者来自另一牛痘病毒株的同源基因。
[0084]
如本文所使用的，“k7r”是指牛痘病毒基因，如编码nf-κb抑制剂的基因。编码k7r基因的蛋白序列的非限制性实例列于下表31-35中。术语“k7r”还可以包括下表所列的蛋白的片段或变体或者来自另一牛痘病毒株的同源基因。
[0085]
如本文所使用的，“f1l”是指牛痘病毒基因，如编码半胱天冬氨酸酶-9抑制剂的基因。编码f1l基因的蛋白序列的非限制性实例列于下表31-35中。术语“f1l”还可以包括下表所列的蛋白的片段或变体或者来自另一牛痘病毒株的同源基因。
[0086]
如本文所使用的，“f2l”是指牛痘病毒基因，如编码dutp酶的基因。编码f2l基因的蛋白序列的非限制性实例列于下表31-35中。术语“f2l”还可以包括下表所列的蛋白的片段或变体或者来自另一牛痘病毒株的同源基因。
[0087]
如本文所使用的，“f3l”是指牛痘病毒基因，如编码kelch-样蛋白的基因。编码f3l基因的蛋白序列的非限制性实例列于下表31-35中。术语“f1l”还可以包括下表所列的蛋白的片段或变体或者来自另一牛痘病毒株的同源基因。
[0088]
如本文所使用的，“b14r”是指牛痘病毒基因。编码b14r基因的蛋白序列的非限制性实例列于下表36-40中。术语“b14r”还可以包括下表所列的蛋白的片段或变体或者来自另一牛痘病毒株的同源基因。
[0089]
如本文所使用的，“b15r”是指牛痘病毒基因。编码b15r基因的蛋白序列的非限制性实例列于下表36-40中。术语“b15r”还可以包括下表所列的蛋白的片段或变体或者来自另一牛痘病毒株的同源基因。
[0090]
如本文所使用的，“b16r”是指牛痘病毒基因，如编码il-1-β抑制剂的基因。编码b16r基因的蛋白序列的非限制性实例列于下表31-35中。术语“b16r”还可以包括下表所列的蛋白的片段或变体或者来自另一牛痘病毒株的同源基因。
[0091]
如本文所使用的，“b17l”是指牛痘病毒基因。编码b17l基因的蛋白序列的非限制性实例列于下表36-40中。术语“b17l”还可以包括下表所列的蛋白的片段或变体或者来自另一牛痘病毒株的同源基因。
[0092]
如本文所使用的，“b18r”是指牛痘病毒基因，如编码锚蛋白重复序列蛋白的基因。编码b18r基因的蛋白序列的非限制性实例列于下表36-40中。术语“b18r”还可以包括下表所列的蛋白的片段或变体或者来自另一牛痘病毒株的同源基因。
[0093]
如本文所使用的，“b19r”是指牛痘病毒基因，如编码ifn-α-β-受体-样分泌糖蛋白的基因。编码b19r基因的蛋白序列的非限制性实例列于下表36-40中。术语“b19r”还可以包括下表所列的蛋白的片段或变体或者来自另一牛痘病毒株的同源基因。
[0094]
如本文所使用的，“b20r”是指牛痘病毒基因，如编码锚蛋白重复序列蛋白的基因。编码b20r基因的蛋白序列的非限制性实例列于下表36-40中。术语“b20r”还可以包括下表所列的蛋白的片段或变体或者来自另一牛痘病毒株的同源基因。
[0095]
如本文所使用的，“b8r”是指牛痘病毒基因，如编码与γ干扰素(ifn-γ)具有同源性的分泌蛋白的基因。在uniprotkb数据库条目p21004中提供了牛痘病毒的哥本哈根株中的示例性b8r基因所编码的蛋白序列的非限制性实例，并且复制如下：
[0096]
mryiiilavlfinsihakitsykfesvnfdskiewtgdglynislknygiktwqtmytnvpegtydisafpkndfvsfwvkfeqgdykveeyctglcvevkigpptvtlteyddhinlyiehpyatrgskkipiykrgdmcdiyll
ytanftfgdseepvtydiddydctstgcsidfattekvcvtaqgategflekitpwssevcltpkknvytcairkedvpnfkdkmarvikrkfnkqsqsyltkflgstsndvttflsmlnltkys
[0097]
术语“b8r”还可以包括以上所列的蛋白的片段或变体或者来自另一牛痘病毒株的同源基因。变体无限制地包括与本文所公开的序列具有85％或以上的同一性的那些序列。
附图说明
[0098]
图1显示了59个痘病毒株，包括牛痘病毒株的系统发育分析。
[0099]
图2显示了将5种牛痘病毒在不同肿瘤类型中传代后，不同病毒株的丰度。
[0100]
图3显示了牛痘野生株中多个不同患者肿瘤中心区中的复制能力。
[0101]
图4显示了不同牛痘野生株的空斑尺寸测量。
[0102]
图5a显示了在牛痘哥本哈根基因组中的1kb区内的ttaa位点数目。
[0103]
图5b显示了牛痘哥本哈根基因组内转座子插入频率。每个点代表了特定基因的转座子敲除。通过敲除频率确定y轴上的点的位置。
[0104]
图5c显示了痘病毒基因在59个病毒中的保守性。更高的保守性表明该基因存在于多个种中。
[0105]
图6显示了在许可癌细胞(permissive cancer cell)中传代后，多个转座子敲除的频率。
[0106]
图7显示了纯化的转座子的空斑尺寸测量。
[0107]
图8显示了5p缺失(copmd5p)和3p缺失(copmd3p)的基因组结构。将copmd5p和copmd3p两者杂交以产生copmd5p3p。
[0108]
图9显示了显示用不同剂量的哥本哈根或copmd5p3p感染后癌细胞死亡的热图。
[0109]
图10显示了在4种不同的癌细胞系中哥本哈根和copmd5p3p复制的生长曲线。
[0110]
图11显示了哥本哈根和copmd5p3p在患者离体样品中复制的能力，如通过滴度所示。
[0111]
图12显示了修饰的copmd5p3p病毒形成的空斑不同于亲代病毒。copmd5p3p空斑在中间更透明，并且我们可以观察到合胞体(细胞融合)。
[0112]
图13显示了copmd5p3p在786-o细胞中诱导合胞体(细胞融合)。
[0113]
图14显示与哥本哈根野生型类似，copmd5p3p能够控制肿瘤生长，但是不导致重量减轻。
[0114]
图15显示与具有胸苷激酶的溶瘤敲除的两种其它牛痘株(哥本哈根和惠氏)相比时，copmd5p3p不导致痘病变形成。
[0115]
图16显示了在裸cd-1小鼠中全身施用之后，牛痘的ivis生物分布。编码copmd5p3p的荧光素酶(tk ko)是肿瘤特异性的并且不会在脱靶组织中复制。
[0116]
图17显示了在全身施用之后，牛痘的生物分布。在肿瘤中，copmd5p3p与其它溶瘤牛痘类似地复制，但是在脱靶组织/器官中复制较少。
[0117]
图18显示了牛痘在人pbmc中的免疫原性。copmd5p3p诱导人先天性免疫细胞激活的能力比野生型哥本哈根更强。
[0118]
图19显示了牛痘在小鼠脾细胞中的免疫原性。copmd5p3p诱导小鼠先天性免疫细胞激活的能力比哥本哈根更强。
[0119]
图20显示了牛痘在人细胞中的免疫原性。copmd5p3p激活nf-kb免疫转录因子的能力比哥本哈根或vvdd更强，但是类似于mg-1。
[0120]
图21显示了用于在多种牛痘株中产生从头(denovo)5p(左图)和3p(右图)主要缺失的同源重组靶向策略的示意图。
[0121]
图22显示了野生型哥本哈根牛痘病毒和几种修饰的哥本哈根牛痘病毒粒子在多种细胞系中增殖的能力。
[0122]
图23显示了野生型哥本哈根牛痘病毒和几种修饰的哥本哈根牛痘病毒粒子对多种细胞系的细胞毒作用，如通过结晶紫(上部部分)和阿拉玛蓝测定(下部部分)的评价。沿下部部分中所示的图中的x轴对每个细胞系所列的株的顺序如下所示：从左至右，copmd5p、copmd5p3p、copmd3p和copwt。
[0123]
图24显示了通过对小鼠的施用，野生型哥本哈根牛痘病毒和几种修饰的哥本哈根牛痘病毒粒子的分布。
[0124]
图25显示了野生型哥本哈根牛痘病毒和几种修饰的哥本哈根牛痘病毒粒子激活自然杀伤(nk)细胞和促进抗肿瘤免疫的能力。
[0125]
图26显示了野生型哥本哈根牛痘病毒和几种修饰的哥本哈根牛痘病毒粒子提高nk细胞介导的对ht29细胞的脱粒(degranulation)(nk细胞活性和抗肿瘤免疫的量度)的能力。
[0126]
图27显示了野生型哥本哈根牛痘病毒和几种修饰的哥本哈根牛痘病毒粒子致敏(prime)t细胞以引起抗肿瘤免疫应答的能力。
[0127]
图28显示了野生型哥本哈根牛痘病毒和几种修饰的哥本哈根牛痘病毒粒子从初始感染点扩展至较远位置的能力。
[0128]
图29显示了野生型哥本哈根牛痘病毒和几种修饰的哥本哈根牛痘病毒粒子形成空斑(病毒增殖的量度)的能力。
[0129]
图30显示了野生型哥本哈根牛痘病毒和几种修饰的哥本哈根牛痘病毒粒子在786-o细胞中形成空斑的能力。
[0130]
图31显示了在多种痘病毒基因组中在copmd5p3p中缺失的基因的百分比。
[0131]
图32显示了skv-b8r+病毒的正常相对于癌细胞系的感染。
[0132]
图33显示了skv-b8r+不损害干扰素信号转导。
[0133]
图34显示了与skv-b8r+相比，skv(copmd5p3-b8r-)在肿瘤控制中具有类似的效力。
[0134]
图35显示了多种牛痘株中工程设计的主要双重缺失(major double deletions)提高了体外癌细胞杀死。
[0135]
图36显示了用多种牛痘株感染的hela细胞的表型表征。
[0136]
图37显示了与野生株相比，5p3p牛痘株不引起重量减轻。
[0137]
图38显示了与野生株相比，5p3p牛痘株不引起痘病变。
[0138]
发明详述
[0139]
本发明的特征在于基因修饰的哥本哈根-来源的牛痘病毒以及它们用于多种癌症治疗的使用。本发明部分基于以下意外发现：当将病毒工程设计以包含以下中的一种或多种或全部的缺失时，牛痘病毒，如哥本哈根显示出显著改善的溶瘤活性、肿瘤内的复制、感
染性、免疫逃避、肿瘤持久性、掺入外源dna序列的能力和大规模生产的可采性：c2l、c1l、n1l、n2l、m1l、m2l、k1l、k2l、k3l、k4l、k5l、k6l、k7r、f1l、f2l、f3l、b14r、b15r、b16r、b17l、b18r、b19r、b20r、k orf a、k orf b、b orf e、b orf f、b orf g、b21r、b22r、b23r、b24r、b25r、b26r、b27r、b28r和b29r。在本发明的多个实施方式中，修饰的牛痘病毒含有b8r基因的缺失。尽管在小鼠中无活性，但是b8r基因中和人ifn-γ的抗病毒活性。在多个实施方式中，随后通过同源重组靶向策略将至少一个转基因插入b8r基因(目前缺失)的基因座。
[0140]
可以将本文所述的牛痘病毒施用于患者，如哺乳动物患者(例如，人患者)以治疗多种细胞增殖异常，包括广泛的癌症。以下部分描述了牛痘病毒以及对其的基因修饰，以及生产和增殖基因修饰的牛痘病毒的方法和将它们施用于患者的技术。
[0141]
牛痘病毒
[0142]
牛痘病毒是正痘病毒或痘病毒科，脊椎动物痘病毒亚科和正痘病毒属成员。正痘病毒比脊椎动物痘病毒亚科的其它成员相对更均一，并且包括11个不同但密切相关的种，其包括牛痘病毒、天花病毒(天花的病原体)、牛痘病毒、水牛痘病毒、猴痘病毒、鼠痘病毒和马痘病毒种等(参见moss,1996)。如本文所述，本发明的某些实施方式可以扩展至正痘病毒属的其它成员以及副痘病毒、麻雀痘病毒、山羊痘病毒、野兔痘病毒、猪痘病毒、软疣痘病毒和塔痘病毒属。通常通过血清学方式，包括实验动物中的中和和交叉反应性来定义正痘病毒科的属。正痘病毒属的多个成员以及脊椎动物病毒(chordovirinae)亚科的其它成员使用免疫调节(immunomodulatory)分子(本文提供了所述分子的实例)来抵抗受体生物的免疫应答。
[0143]
牛痘病毒是大的、包膜复杂的病毒，其具有约190k的线性双链dna基因组，并且编码约250个基因。牛痘熟知的作用是作为根除天花的疫苗。在根除天花后，科学家们寻求使用牛痘作为将基因递送至生物组织中的工具(基因疗法和基因工程)。牛痘病毒因其仅在宿主细胞的细胞质中复制而在dna病毒中是独一无二的。因此，需要大基因组来编码病毒dna复制所需的多种酶和蛋白。在复制期间，牛痘产生了其外膜不同的几种感染形式：胞内成熟病毒粒子(imv)、胞内包膜病毒粒子(iev)、细胞结合包膜病毒粒子(cev)和胞外包膜病毒粒子(eev)。imv是最丰富的感染形式并且被认为负责宿主间的传播。另一方面，cev被认为在细胞-至-细胞的传播中起作用，而eev则被认为对于宿主生物内的大范围扩散是重要的。
[0144]
牛痘病毒(vaccinia virus)与导致牛痘(cowpox)的病毒密切相关。牛痘的确切来源是未知的，但是最常见的认识是牛痘病毒、牛痘病毒和天花病毒(天花的病原体)均来源于共同的祖先病毒。还推测牛痘病毒最初分离自马。牛痘病毒感染是轻度的并且通常在健康个体中无症状，但是它可能导致轻度的皮疹和发烧，具有极低的死亡率。对牛痘病毒感染所产生的免疫应答保护个体抵抗致死的天花感染。为此，将牛痘病毒用作抵抗天花的活病毒疫苗。牛痘病毒疫苗是安全的，因为它不含天花病毒，但是偶尔可能出现某些并发症和/或疫苗副作用，特别是如果疫苗是损害免疫能力的。
[0145]
示例性的牛痘病毒株包括哥本哈根来源的牛痘病毒。
[0146]
胸苷激酶突变体
[0147]
作为溶瘤病毒测试牛痘病毒的几项当前的临床研究在病毒胸苷激酶(tk)基因中具有缺失。这种缺失减弱了病毒，从而使得所述病毒的dna复制依赖于细胞胸苷激酶活性，并因此减弱了病毒增殖。细胞胸苷激酶在大部分正常组织中以低水平表达，而在多种癌细
胞中以高水平表达。通过代谢靶向，tk病毒可以在具有高代谢率的细胞(例如，健康细胞或肿瘤细胞)中生长，并且将不会在具有低胸苷激酶水平的细胞中良好生长。由于存在休眠肿瘤细胞(例如，癌症干细胞)，因此tk病毒杀死这种癌细胞群体的能力可能受损，正如化疗基本无效一样。本发明公开中所述的修饰的病毒载体保留了病毒合成机制(包括tk)并且可能在休眠癌细胞中增殖。本发明公开的病毒修饰可以使病毒是高选择性的，同时不会使tk或其它dna代谢酶(例如，核糖核苷酸还原酶)缺失并且可以在具有低代谢率的肿瘤内更有效。
[0148]
病毒增殖
[0149]
本发明的特征在于牛痘病毒，其包括与野生型相比，通过一种或多种基因缺失所构建的那些，从而所述病毒显示出所期望的用于抗癌细胞的使用的性质，同时其对非癌细胞是低毒或无毒的。本节通过举例总结了多种用于产生本文所述的重组牛痘病毒的规程，如通过使用dna重组技术用于产生突变病毒的方法。
[0150]
例如，为了在牛痘病毒基因组中产生突变，可以通过包含在载体中的核酸分子编码天然和修饰的多肽。载体包括质粒、粘粒、病毒(噬菌体、动物病毒和植物病毒)和人工染色体(例如，yac)。本领域技术人员将通过标准重组技术装备完善地构建载体，所述标准重组技术描述于sambrook等人,(1989)和ausubel等人,1994，以上两篇文献作为参考并入本文。除编码修饰的多肽，如修饰的白树毒素(gelonin)之外，载体可以编码未修饰的多肽序列，如标签或靶标分子。
[0151]
为了在宿主细胞中增殖载体，它可以含有一个或多个复制起点位点(通常称为“ori”)，它是在此起始复制的特异性核酸序列。作为另外一种选择，如果宿主细胞是酵母，则可以使用自主复制序列(ars)。
[0152]
在表达异源核酸序列的背景中，“宿主细胞”是指原核或真核细胞，并且它包括能够复制载体和/或表达载体编码的异源基因的任何可转化的生物。宿主细胞可以并且已用作载体或病毒的受体(如果它不表达外源多肽，则其不能作为载体)。可以“转染”或“转化”宿主细胞，转染或转化是指通过其将外源核酸，如修饰的蛋白编码序列转移或引入宿主细胞中的方法。转化的细胞包括原代受试者细胞及其子代。宿主细胞可以来源于原核生物或真核生物，其包括酵母细胞、昆虫细胞和哺乳动物细胞，这取决于所期望的结果是载体的复制还是载体编码的核酸序列的部分或全部的表达。多种细胞系和培养物作为宿主细胞可用，并且它们可以通过美国模式培养物保藏所(atcc)获得，美国模式培养物保藏所是用作活培养物和基因材料存档的组织(www.atcc.org)。基于载体主链和所期望的结果，本领域技术人员可以确定适当的宿主。质粒或粘粒(例如)可以引入原核生物宿主细胞以用于多种载体的复制。作为用于载体复制和/或表达的宿主细胞使用的细菌细胞包括dh5α、jm109和kcb以及一些可商购的细菌宿主，如感受态细胞和solopack
tm gold细胞(la jolla,calif.)。作为另外一种选择，细菌细胞，如大肠杆菌(e.coli)le392可以用作噬菌体病毒的宿主细胞。适当的酵母细胞包括酿酒酵母(saccharomyces cerevisiae)、裂殖酵母(saccharomyces pombe)和巴斯德毕赤氏酵母(pichia pastoris)。用于载体复制和/或表达的真核宿主细胞的实例包括hela、nih3t3、jurkat、293、cos、cho、saos和pc12。来自多种细胞类型和生物的多种宿主细胞是可用的并且将是本领域技术人员已知的。类似地，可以结合真核或原核宿主细胞使用病毒载体，特别是对于许可载体的复制或表达的宿主细胞。一些载体可以使用控制序列来使其在原核和真
核细胞两者中复制和/或表达。本领域技术人员还将理解培育所有上述宿主细胞以维持它们并使载体复制的条件。将允许载体的大规模生产以及载体编码的核酸以及它们的同源多肽、蛋白或肽的生产的技术和条件也将是所理解和已知的。
[0153]
对牛痘病毒基因组的基因修饰
[0154]
基因修饰方法。
[0155]
用于来自靶标基因组的核酸的插入或缺失的方法包括本文所述的和本领域中已知的那些。可以用于将编码靶标基因的多核苷酸引入靶标基因组的一种这种方法包括转座子的使用。转座子是编码转座酶并且含有通过5'和3'切除位点所侧接的所关心的多核苷酸序列或基因的多核苷酸。一旦将转座子递送至靶标核酸(例如，在宿主细胞中)，则转座酶基因的表达起始并且导致产生了从转座子切割所关心的基因的活性的酶。通过经由转座酶的转座子切除位点的位点特异性识别来介导这种活性。在某些情况下，这些切除位点可以是末端重复或末端反向重复。一旦从转座子切除，则可以通过存在于所述细胞的核基因组内的类似的切除位点的转座酶催化的切割，将所关心的基因整合到靶标基因组中。这使得所关心的基因在互补切除位点插入到所切割的核dna中，并且将所关心的基因连接至靶标基因组dna的后续磷酸二酯键的共价连接完成了引入过程。在某些情况下，所述转座子可以是反转座子，从而首先将编码靶标基因的基因转录为rna产物，然后在引入哺乳动物细胞基因组中之前，反转录为dna。转座子系统包括piggybac转座子(在例如wo 2010/085699中详细描述)和睡美人(sleeping beauty)转座子(在例如us2005/0112764中详细描述)，以上每篇专利的公开内容作为参考并入本文。
[0156]
据信用于核酸递送以实现本发明的组合物的表达的其它方法包括如本文所述的，可以通过所述方法将核酸(例如，dna，包括病毒和非病毒载体)引入细胞器、细胞、组织或生物中或者如本领域的技术人员将已知的几乎任何方法。这些方法包括(但不限于)dna的直接递送，如通过注射(美国专利no.5,994,624、5,981,274、5,945,100、5,780,448、5,736,524、5,702,932、5,656,610、5,589,466和5,580,859，以上每篇专利作为参考并入本文)，包括微注射(harland and weintraub,1985；美国专利no.5,789,215，这些文献作为参考并入本文)；通过电穿孔(美国专利no.5,384,253，该专利作为参考并入本文)；通过磷酸钙沉淀(graham and van der eb,1973；chen and okayama,1987；rippe等人,1990)；通过使用deae-右旋糖酐，然后使用聚乙二醇(gopal,1985)；通过直接声波载入(direct sonic loading)(fechheimer等人,1987)；通过脂质体介导的转染(nicolau and sene,1982；fraley等人,1979；nicolau等人,1987；wong等人,1980；kaneda等人,1989；kato等人,1991)；通过微弹轰击(pct专利申请no.wo 94/09699和95/06128；美国专利no.5,610,042；5,322,783、5,563,055、5,550,318、5,538,877和5,538,880，并且以上每篇文献作为参考并入本文)；通过使用碳化硅纤维的搅拌(kaeppler等人,1990；美国专利no.5,302,523和5,464,765，以上每篇文献作为参考并入本文)；通过农杆菌-介导的转化(美国专利no.5,591,616和5,563,055，以上每篇文献作为参考并入本文)；或者通过peg-介导的原生质体转化(omirulleh等人,1993；美国专利no.4,684,611和4,952,500，以上每篇文献作为参考并入本文)；通过干燥/抑制-介导的dna吸收(potrykus等人,1985)。通过如这些的技术的应用，可以稳定或瞬时转化细胞器、细胞、组织或生物。
[0157]
copmd5p、copmd3p和copmd5p3p缺失。
[0158]
在多个实施方式中，使多种基因缺失以提高牛痘病毒的溶瘤活性。本文所述的大部分缺失涉及对宿主对病毒感染应答的阻断或另外具有未知功能。在多个实施方式中，从重组牛痘病毒基因组中缺失了表1中所示的至少一种基因。在多个实施方式中，从重组牛痘基因组中缺失了表2中所示的基因中的至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或31个。在多个实施方式中，从重组牛痘病毒基因组中缺失了表2中所示的所有基因。本文描述了本发明的三个示例性实施方式copmd5p、copmd3p和copmd5p3p。下表1中显示了缺失的基因簇以及它们在copmd5p、copmd3p和copmd5p3p病毒中的功能。在多个实施方式中，当存在两个itr拷贝时，仅基因组的右侧itr缺失，而左侧itr保持完整。通过完整基因组测序确认了缺失。
[0159]
表1：牛痘病毒中缺失的基因
[0160]
[0161][0162]
b8r基因缺失。
[0163]
在多个实施方式中，对牛痘病毒进一步基因修饰以包含b8r基因中的缺失。牛痘病毒b8r基因编码与γ干扰素受体(ifn-γ)具有同源性的分泌蛋白。体外，b8r蛋白结合并中和几个种的γ干扰素的抗病毒活性，包括人和大鼠γ干扰素；然而，它不明显结合鼠科ifn-γ。b8r基因的缺失防止人中ifn-γ的损伤。b8r基因的缺失导致安全性升高，但不具有相伴的免疫原性降低。
[0164]
转基因插入
[0165]
在多个实施方式中，可以将其它转基因插入载体。在多个实施方式中，将1、2或3个转基因插入缺失b8r基因的基因座中。在一些株中，除存在于b8r缺失位点的转基因之外，所
述株还具有至少一个转基因，其插入非缺失的b8r基因的基因座的牛痘病毒上的其它基因座中。在多个实施方式中，将至少一个转基因插入5p缺失的边界，将至少一个转基因插入3p缺失的边界或两者。在多个实施方式中，将至少3、4、5或更多个转基因插入修饰的牛痘病毒基因组。
[0166]
治疗方法
[0167]
药物组合物、施用和剂量
[0168]
可以使用本领域中已知的方法制备本发明的含有重组牛痘病毒载体的治疗性组合物。例如，可以使用(例如)生理学可用的载体、赋形剂或稳定剂(remington's pharmaceutical sciences,第16版，osol,a.主编(1980)；该文献作为参考并入本文)并以所期望的形式，例如，以冷冻干燥制剂或水溶液的形式制备这些组合物。
[0169]
为了使用本发明所述的方法和组合物诱导溶瘤，杀死细胞，抑制生长，抑制转移，降低肿瘤尺寸以及另外逆转或降低肿瘤细胞的恶性表型，可以将肿瘤与修饰的牛痘病毒接触，例如，通过经由(例如)本文所述的一种或多种施用途径，向患有癌症的患者施用牛痘病毒。施用途径可以随癌症的位置和性质而改变并且可以包括(例如)皮内、透皮、肠胃外、静脉内、肌内、鼻内、皮下、局部(例如，在肿瘤附近，特别是具有肿瘤脉管系统或相邻脉管系统的肿瘤附近)、经皮、气管内、腹膜内、动脉内、膀胱内、肿瘤内、吸入、灌注、灌洗和口服施用和制剂。
[0170]
应理解术语“血管内”是指向患者脉管系统的递送，其表示递送至患者血管、血管内或血管中。在某些实施方式中，认为向血管的施用是静脉(静脉内)，而在其它实施方式，认为向血管的施用是动脉。静脉包括(但不限于)颈内静脉、外周静脉、冠状静脉、肝静脉、门静脉、大隐静脉、肺静脉、上腔静脉、下腔静脉、胃静脉、脾静脉、肠系膜下静脉、肠系膜上静脉、头静脉和/或股静脉。动脉包括(但不限于)冠状动脉、肺动脉、肱动脉、颈内动脉、主动脉弓、股动脉、周围动脉和/或睫状动脉。据考虑递送可以通过或至小动脉或毛细血管。
[0171]
将肿瘤内注射或直接向肿瘤脉管系统的注射具体考虑用于单独、实体、可接近的肿瘤。局部、区域或全身施用也可以是适当的。通过以(例如)约1cm间隔的间距，向肿瘤施用多次注射，可以有利地接触病毒颗粒。就手术干预来说，可以术前使用本发明，从而使不能手术的肿瘤进行切除。还可以在适当的情况下，例如，通过将导管植入肿瘤或肿瘤脉管系统中，应用连续施用。这种连续灌注(perfusion)可以在治疗开始后发生(例如)约1-2小时至约2-6小时，至约6-12小时或者约12-24小时的一段时间。通常，通过连续灌注的治疗性组合物的剂量可以相当于通过单次或多次注射所提供的剂量，并且可以在灌注发生期间进行调整。还考虑肢体灌注可以用于施用本发明的治疗性组合物，特别是在黑素瘤和肉瘤的治疗中。
[0172]
治疗方案可以是不同的，并且通常基于肿瘤类型、肿瘤位置、疾病发展和患者的健康和年龄。某些类型的肿瘤将需要更积极的治疗，而与此同时，某些患者不可以耐受压力过大的规程。临床医师将最适合于基于治疗制剂的已知效力和毒性(如果有的话)来做出这些决定。在某些实施方式中，正在治疗的肿瘤可以不是可切除的，至少在开始时不是。由于边缘收缩或者通过除去某些特定侵袭性部分，使用本发明公开的治疗剂的治疗可以提高肿瘤的可切除性。治疗后，切除术可以是可能的。切除术之后的其它治疗将用于消除肿瘤位点处的微观残余疾病。
[0173]
治疗可以包括多种“单位剂量”。单位剂量的定义为含有预定量的治疗性组合物。要施用的量和具体的途径和制剂在临床领域的那些技术人员的技术范围内。单位剂量不需要作为单次注射施用，而是可以包含在规定时间段内的连续输注。可以方便地以病毒构建体的空斑形成单位(pfu)描述本发明的单位剂量。单位剂量可以在103、104、105、106、107、108、109、10
10
、10
11
、10
12
至10
13
pfu和更高的范围内。另外或者作为另外一种选择，基于病毒种类和可达到的滴度，可以将1至100、10至50、100-1000或高达约或至少约1
×
104、1
×
105、1
×
106、1
×
107、1
×
108、1
×
109、1
×
10
10
、1
×
10
11
、1
×
10
12
、1
×
10
13
、1
×
10
14
或1
×
10
15
或以上的感染性病毒颗粒(vp)(包括它们之间的全部值和范围)递送至肿瘤或肿瘤位点。
[0174]
本文所公开的重组牛痘病毒基因组向癌症或肿瘤细胞的另一种递送方法可以通过肿瘤内注射。然而，作为另外一种选择，可以于肠胃外、静脉内、皮内、肌内、经皮或甚至腹膜内施用本文所公开的药物组合物，如美国专利no.5,543,158；美国专利no.5,641,515和美国专利no.5,399,363中所述(其分别具体地以其全部内容作为参考并入本文)。可以通过注射器或用于溶液注射的任何其它方法递送核酸构建体的注射，只要表达构建体可以通过注射所需的特定规格的针。在美国专利no.5,846,233中举例说明了可以用于本文所述的重组牛痘病毒的施用的示例性无针注射系统。这种系统的特征在于限定用于保持溶液的安瓿室(ampule chamber)的喷嘴和用于将溶液从喷嘴中推出至递送位点的能量装置。另一种示例性注射器系统是允许以任何深度多次精确注射预定量的溶液的系统(美国专利no.5,846,225)。
[0175]
可以在与一种或多种赋形剂、载体或稀释剂适当混合的水中制备本文所述的病毒颗粒或核酸的混合物。还可以在甘油、液体聚乙二醇及其混合物中和在油剂中制备分散系。在常规储存条件和使用情况下，这些制剂可以含有防腐剂以防止微生物的生长。适合于可注射使用的药物形式包括用于无菌可注射溶液或分散系的临时制备的无菌水溶液或分散系以及无菌粉末(美国专利no.5,466,468，具体地以其全部内容作为参考并入本文)。在所有情况下，所述形式可以是无菌的并且可以是达到易于可注射性程度的流体。它可以在生产和储存条件下是稳定的，并且必须以抵抗微生物，如细菌和真菌的污染作用而保存。所述载体可以是含有(例如)水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和/或液体聚乙二醇等)、其适合的混合物和/或植物油的溶剂或分散媒介。可以(例如)通过使用涂层，如卵磷脂，就分散系来说通过维持所需的粒径和通过使用表面活性剂来维持适当的流动性。可以通过多种抗细菌和抗真菌剂，例如，对羟苯甲酸、氯代丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等导致对微生物作用的防止。在多数情况下，将优选地包括等渗剂(isotonic agents)，例如，糖或氯化钠。可以通过在所述组合物中使用延缓吸收的试剂，例如，单硬脂酸铝和明胶来导致可注射组合物的延长吸收。
[0176]
对于水溶液中的肠胃外施用，例如，如有必要，可以适当缓冲溶液，并且首先使用足够的盐水或葡萄糖使液体稀释剂等渗。这些具体的水溶液特别适合于静脉内、肌内、皮下、肿瘤内和腹膜内施用。在这一点上，根据本发明公开，可以使用的无菌水媒介将是本领域技术人员已知的。例如，可以将1个剂量溶于1ml等渗nacl溶液并添加至1000ml皮下输液流体或者在所提议的输注位点注射。基于正在治疗的受试者的状况，将在剂量中做出一些必要变化。在任何情况下，负责施用的人将确定个体受试者的适当剂量。此外，对于人施用，制剂应满足fda生物标准局所要求的无菌、热原性、一般安全性和纯度标准。
[0177]
如本文所使用的，“载体”包括任何和全部溶剂、分散媒介、媒介物、涂层、稀释剂、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗和吸收延迟剂、缓冲剂、载体溶液、混悬液、胶体等。这些媒介物和药剂用于药物活性物质的使用在本领域中是熟知的。除了任何常规媒介物或试剂与活性成分不相容以外，考虑其在治疗性组合物中的使用。还可以将补充性活性成分引入所述组合物中。短语“药物可用的”或“药理学可用的”是指当施用于人时，不产生过敏或类似不良反应的分子实体和组合物。含有蛋白作为活性成分的水性组合物制剂是本领域中熟知的。通常，将这些组合物作为液体溶液或混悬液制备为可注射剂；还可以制备在注射前，适合于在液体中的溶液或者在液体中的混悬液的固体形式。
[0178]
癌症
[0179]
可以将本文所公开的重组牛痘病毒施用于患有细胞增殖异常，如癌症的哺乳动物受试者，如人，以通过溶瘤直接杀死癌细胞和/或提高对靶标癌细胞的适应性免疫应答的有效性。在一些实施方式中，所述细胞增殖异常是癌症，如白血病、淋巴瘤、肝癌、骨癌、肺癌、脑癌、膀胱癌、胃肠癌、乳腺癌、贲门癌、宫颈癌、子宫癌、头颈癌、胆囊癌、喉癌、唇癌和口腔癌、眼癌、黑素瘤、胰腺癌、前列腺癌、结肠直肠癌、睾丸癌或咽喉癌。在具体的情况下，所述细胞增殖异常可以是癌症，其选自急性淋巴母细胞性白血病(all)、急性髓细胞性白血病(aml)、慢性淋巴细胞性白血病(cll)、慢性粒性白血病(cml)、肾上腺皮质癌、aids-相关淋巴瘤、原发性cns淋巴瘤、肛门癌、阑尾癌、星形细胞瘤、非典型性畸胎样/横纹肌样肿瘤、基底细胞癌、胆管癌、肝外癌、尤因肉瘤家族肿瘤、骨肉瘤和恶性纤维组织细胞瘤、中枢神经系统胚胎性瘤、中枢神经系统生殖细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、支气管瘤、伯基特淋巴瘤、类癌瘤、原发性淋巴瘤、脊索瘤、慢性骨髓增殖性肿瘤、结肠癌、肝外胆管癌、原位管癌(dcis)、子宫内膜癌、室管膜瘤、食道癌、鼻腔神经胶质瘤、颅外生殖细胞瘤、性腺外生殖细胞瘤、输卵管癌、骨纤维组织细胞瘤、胃肠道类癌瘤、胃肠道间质瘤(gist)、睾丸生殖细胞瘤、妊娠滋养细胞病、神经胶质瘤、儿童脑干神经胶质瘤、毛细胞白血病、肝细胞癌、郎格罕细胞组织细胞增生症、霍奇金淋巴瘤、舌癌、胰岛细胞瘤、胰腺神经内分泌瘤、胚胎性癌肉瘤及其它儿童肾瘤、郎格罕细胞组织细胞增生症、小细胞肺癌、皮肤t-细胞淋巴瘤、眼内黑素瘤、merkel细胞癌、间皮瘤、转移性颈鳞癌、中线道癌、多发性内分泌瘤综合征、多发性骨髓瘤/浆细胞瘤、脊髓发育不良综合征、鼻腔和鼻窦癌、鼻咽癌、成神经细胞瘤、非霍奇金氏淋巴瘤(nhl)、非小细胞肺癌(nsclc)、上皮性卵巢癌、生殖细胞卵巢癌、低度恶性潜能卵巢癌、胰腺神经内分泌瘤、乳头状瘤病、副神经节瘤、鼻窦和鼻腔癌、甲状旁腺癌、阴茎癌、咽癌、嗜铬细胞瘤、垂体瘤、胸膜肺胚细胞瘤、原发性腹膜癌、直肠癌、成视网膜细胞瘤、横纹肌肉瘤、唾液腺癌、卡波西肉瘤、横纹肌肉瘤、塞扎里氏综合征、小肠癌、软组织肉瘤、咽喉癌、胸腺瘤和胸腺癌、甲状腺癌、肾盂和输尿管的移行细胞癌、尿道癌、子宫内膜癌、子宫肉瘤、阴道癌、外阴癌和华氏巨球蛋白血症。
[0180]
具有本领域中常规技术的医师可以容易地确定用于向对其有需要的哺乳动物受试者(例如，人)施用的重组牛痘病毒载体的有效量。例如，医师可以以小于实现所期望的治疗效果所需的水平来起始重组牛痘病毒载体的处方剂量，并逐渐提高剂量直至实现所期望的效果。作为另外一种选择，医师可以通过施用重组牛痘病毒载体剂量来开始治疗方案并随后逐渐施用较低的剂量直至实现治疗效果(例如，一种或多种肿瘤体积的减小)。通常，本发明的重组牛痘病毒载体的适合的日剂量将是作为对于产生治疗效果有效的最低剂量的
重组牛痘病毒载体的量。可以作为单次剂量或者作为在一天、一周、一个月或一年内以适当间隔，任选地以单位剂量形式单独施用的2、3、4、5、6或更多个剂量施用本发明的重组牛痘病毒载体的治疗性组合物的日剂量。尽管有可能单独施用本发明的重组牛痘病毒载体，但是它还可以作为药物制剂与赋形剂、载体和任选地，其它治疗剂组合施用。
[0181]
可以通过本领域中已知的任何多种方法来监测本发明的重组牛痘病毒载体降低细胞增殖疾病，如癌症发展的能力。例如，医师可以通过分析患者中一种或多种肿瘤的体积来监测哺乳动物受试者(例如，人)对使用本发明的重组牛痘病毒载体的治疗的反应。作为另外一种选择，医师可以通过分析特定受试者的淋巴中t-reg细胞群体来监测受试者(例如，人)对使用本发明的重组牛痘病毒载体的治疗的反应性。例如，医师可以从哺乳动物受试者(例如，人)采集样品并使用规定程序，如荧光激活细胞分选术确定癌细胞的量或密度。相对于得自施用重组牛痘病毒之前的受试者的样品中的癌细胞的量，样品中癌细胞的量降低(例如，1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或以上)的发现可以指示牛痘病毒施用有效治疗了癌症。
[0182]
用于测量病毒特征的测定
[0183]
本领域中已知的测量肿瘤扩散和病毒毒力的测定包括(但不限于)测量空斑尺寸、合胞体形成和/或彗星测定(eev)。本领域中已知的测量病毒的免疫刺激性活性的测定包括(但不限于)nk激活(以cd69表达％测量)、nk脱粒(以cd107a的增加倍数测量)和/或t细胞致敏测定。本领域中已知的测量病毒选择性的测定包括(但不限于)尾痘病变(tail pox lesion)、生物分布和/或体重测量。
[0184]
通过牛痘病毒基因编码的蛋白的实例
[0185]
如以下所使用的，术语“位置”是指基因相对于本文所述的示例性牛痘病毒载体中缺失的核酸的位置。对于多种基因，提供了氨基酸序列信息和蛋白登录id号。
[0186]
表2.通过copmd5p载体中缺失的哥本哈根牛痘基因编码的蛋白的实例
[0187]
[0188]
[0189]
[0190][0191]
表3.通过copmd3p载体中缺失的哥本哈根牛痘基因编码的蛋白的实例
[0192]
[0193]
[0194]
[0195]
实施例
[0196]
提出以下实施例以向本领域技术人员提供如何实施、制备和评价本文所主张的组合物和方法的描述，并且以下实施例旨在是对本发明的纯粹示例，并且不意欲限制本发明人所认为的她的发明的范围。
[0197]
实施例1-copmd5p3p“skv-b8r+”重组牛痘病毒的产生
[0198]
将来自59个痘病毒株的开放阅读框(orf)聚类为直系同源基因(orthologs)并在氨基酸水平比对(参见图1的系统发育分析)。实施贝叶斯分析以确定所有株的相关性。痘病毒在基因含量和宿主范围方面非常多样化。存在几种天然存在的牛痘野生株，其彼此不同。
[0199]
将5种牛痘野生株(哥本哈根、天坛(tiantan)、李斯特(lister)、惠氏(wyeth)和西储(western reserve))以相等的空斑形成单位计数混合并通过ngs测序(接种库(input pool))。将所得混合物在不同的癌细胞系(hela、786-o、ht29、mcf7)中传代三次。通过ngs illumina测序对最终的群体测序。基于序列同一性将读序(短dna片段)分配给各个株，并将其用于计算每个株在最终群体中的百分比。然后，定量不同病毒株的相对丰度。如图2所示，在4个癌细胞系中的任一个中传代三次后，哥本哈根株是最大量的牛痘株，这表明该株能够比其它株生长的更快，并因此更快复制。
[0200]
不同的牛痘野生株还用于以低pfu(1
×
104)感染多个患者的肿瘤中心区。每株平均感染4个复制(replicates)，每个含有3个2
×
2mm的肿瘤中心区。通过病毒滴度评价复制，并将其表示为空斑形成单位(pfu)，如图3所示。哥本哈根株比其它株生长至更高的滴度，并因此在患者离体样品中更快地复制。患者离体中心区是患者3d肿瘤的优良模拟。
[0201]
然后，在u2-os细胞上，以3％的cmc覆盖，对牛痘野生株进行空斑测定。感染后2天，对每个株的20-30个空斑测量了其尺寸。图4显示了哥本哈根、西储、惠氏、李斯特和天坛的空斑尺寸测量。斑块形成受病毒复制、扩散和杀死能力的影响。对于哥本哈根株所观察到的较大的空斑尺寸表明该株在这些能力方面具有优势，这对溶瘤病毒的开发是重要的。
[0202]
然后，对牛痘哥本哈根基因组中的1kb区域内的ttaa位点数进行计数(参见图5a)。将ilumina ngs测序组合并用于识别转座子插入位点(tn-seq)。将接种文库(input library)在hela或u2-os细胞中传代三次，然后确定转座子敲除频率。敲除频率直接对应于支持该事件的读序的量(参见图5b和图6)。
[0203]
最终，将来自图1的全部59个痘病毒基因组用于找出orf并聚类成直系同源组。基
于哥本哈根基因组中基因的位置(x轴)和组的规模(y轴)，将含有哥本哈根基因的组作图。当全部59个种共有相同基因时，则保守度认为是100％。转座子插入需要ttaa基序，并且该基序在基因组中普遍存在，这表明转座子可以在基因组中的任何位置插入。然而，注意到转座子优先插入到低痘病毒基因保守度的区域中。当测序转座子敲除时，鉴别了主要缺失并将其标记为copmd5p和copmd3p(参见图5c和图6)。存在于基因组中间且具有高基因保守度的基因(图5c)对于病毒复制是重要的。这是因为通过转座子插入将这些基因敲除导致了适应性的降低(传代后较低的频率)。据发现作为主要缺失copmd5p和copmd3p的一部分的基因对于病毒复制不太重要，因为它们的缺失不影响适应性。
[0204]
illumina ngs深度测序显示在空斑纯化法期间存在主要缺失。copmd5p和copmd3p代表空斑纯化且发现具有主要基因组缺失的克隆。将这2个克隆用于以高moi(moi 10)共感染hela细胞单层以诱导重组。随机空斑挑取和pcr显示存在含有两个基因组缺失的双重缺失的copmd5p3p(参见图8)。将这2个缺失组合并纯化以提供复制病毒，其在本文中称为“copmd5p3p”，其显示出在c2l、c1l、n1l、n2l、m1l、m2l、k1l、k2l、k3l、k4l、k5l、k6l、k7r、f1l、f2l、f3l、b14r、b15r、b16r、b17l、b18r、b19r和b20r基因中的缺失和在itr基因b21r、b22r、b23r、b24r、b25r、b26r、b27r、b28r和b29r中的每一个中的单一缺失。如本文所使用的，“copwt”是指野生型哥本哈根牛痘病毒，“copmd5p”是指具有代表性的5'基因(c2l、c1l、n1l、n2l、m1l、m2l、k1l、k2l、k3l、k4l、k5l、k6l、k7r、f1l、f2l、f3l)中的缺失的哥本哈根牛痘病毒，而“copmd3p”是指具有代表性的3'基因(b14r、b15r、b16r、b17l、b18r、b19r和b20r)中的缺失以及itr基因b21r、b22r、b23r、b24r、b25r、b26r、b27r、b28r和b29r中的每一个中的单一缺失的哥本哈根牛痘病毒。
[0205]
然后，对59个痘病毒基因组评价了copmd5p3p中缺失的这31个基因的存在。将同源性搜索用于从具有来自哥本哈根基因组的表2基因的氨基酸序列的其它进化枝中查找痘病毒。如图36所示，存在于各个痘病毒株中的这32个基因的百分比随着与哥本哈根株的分化度的升高而降低(图上每个点代表一个痘病毒基因组)。然而，大部分牛痘家族成员包含至少85％的在copmd5p3p重组载体中缺失的基因。
[0206]
实施例2-癌细胞死亡
[0207]
以4个重复，在24-孔板中用copmd5p3p以一系列moi(1至0.01)感染癌细胞。病毒感染后2天，用结晶紫对板进行染色。将结晶紫染色溶于sds并通过分光光度法读数。作为未感染细胞的百分比表示数据(参见图9)。该数据显示当暴露于copmd5p3p病毒时，大部分癌细胞系更快地死亡。
[0208]
图26、27和29-35中还显示了野生型哥本哈根牛痘病毒和几种修饰的哥本哈根牛痘病毒粒子诱导抗-肿瘤免疫应答和在多种癌细胞系中增殖的能力。
[0209]
实施例3-癌细胞中的生长
[0210]
在24-孔板中，以低moi(0.001)并且在不同时间点，用copmd5p3p感染4种癌细胞系，重复三次，并且收集病毒并测量滴度。时间0h代表接种。图10显示了hela、786-o、ht-29和mcf7的生长曲线。该数据显示修饰的copmd5p3p病毒的体外生长能力未受到损害。这表示该病毒是有复制能力的，即使是在存在干扰素反应的情况下。在哺乳动物细胞系中的复制能力提供了另一个重要的优势。照此，可以产生具有高速度和效率的病毒。
[0211]
实施例4-患者肿瘤样品中的生长
[0212]
手术后立即获得患者肿瘤样品并将其切成2mm
×
2mm的中心区。用少量野生型哥本哈根或copmd5p3p病毒(1
×
104pfu)感染三个中心区。72h后，通过空斑测定评价病毒产量并且最终病毒滴度表示为pfu(参见图11)。该数据显示修饰的copmd5p3p病毒可以在新鲜的患者肿瘤样品中复制。患者肿瘤样品中的复制是患者3d肿瘤中的优良复制模型。
[0213]
实施例5-u2-os细胞中的合胞体
[0214]
用哥本哈根野生型或copmd5p3p病毒感染u2-os细胞单层。2h后，如空斑测定中所做的一样，将培养基更换为覆盖层培养基。感染后48h，通过evos采集照片以评价空斑表型(参见图12)。据信细胞融合，也称为合胞体将帮助病毒扩散，因为未感染的细胞将与感染的细胞融合。另外，已显示融合的细胞是免疫原性的并且就癌细胞来说，可以帮助引起抗肿瘤免疫应答。参见，例如，http://cancerres.aacrjournals.org/content/62/22/6566.long。
[0215]
实施例6-786-o细胞中的合胞体
[0216]
用哥本哈根野生型或copmd5p3p病毒感染786-o细胞单层。24h后，以10
×
放大，用evos采集照片(参见图13)。这是合胞体发生的另外的证据。在图12中，显示了空斑的表型。在当前的实验中，在无覆盖层的情况下感染了单细胞层。copmd5p3p病毒感染的大部分细胞已融合。
[0217]
实施例7-小鼠模型中的肿瘤控制和重量减轻
[0218]
对裸cd-1(crl:cd1-foxn1nu)小鼠接种ht-29人结肠癌异种移植(5e6个细胞)。一旦皮下肿瘤达到大致5mm
×
5mm的尺寸，则以1
×
107pfu，以24h的间隔，用任一种牛痘病毒静脉内处理小鼠三次(短划线)。大致每隔一天对小鼠测量肿瘤尺寸和重量减轻(参见图14)。该实验显示copmd5p3p是更安全的病毒，因为它不会在免疫受损裸鼠中导致任何重量减轻或其它疾病病征。该实验还显示copmd5p3p能够与亲代哥本哈根野生型病毒类似地控制肿瘤生长。
[0219]
实施例8-痘病变形成
[0220]
以1
×
107pfu，用任一种牛痘病毒静脉内处理裸cd-1小鼠一次，每组六只小鼠。处理后2周，将小鼠处死并采集尾部照片。手动对每只小鼠的尾部计数尾部上的痘病变。图15显示了代表性照片。该实验显示copmd5p3p是更安全的病毒，因为它不会在免疫受损裸鼠中导致任何痘病变。这是重要的，因为先前的溶瘤牛痘临床数据已显示治疗时患者出现痘病变。胸苷激酶(tk)的敲除是提高ov(溶瘤病毒)安全性的通用方式，其目前存在于iii期溶瘤牛痘和fda批准的溶瘤t-vec(oncolytic t-vec)中。数据显示tk缺失在该测定中不起重要作用，其中当用tk缺失的病毒激发时，小鼠出现痘病变，但使用具有完整tk的copmd5p3p时，不出现痘病变。
[0221]
实施例9-全身施用后牛痘的ivis生物分布
[0222]
通过用psem1质粒转染感染的细胞，从而用fluc和yfp替换tk，将牛痘病毒野生型惠氏、野生型哥本哈根和copmd5p3p工程设计以表达荧光虫荧光素酶(fluc)和yfp。将病毒空斑纯化并扩增。所有病毒均为tk敲除的并且在它们的tk基因座中编码功能性fluc。
[0223]
然后，用ht-29人结肠癌异种移植接种裸cd-1小鼠。一旦皮下肿瘤达到大致5mm
×
5mm的尺寸，则以1e7pfu，用任一种牛痘fluc编码病毒静脉内处理小鼠一次，每组4只小鼠。处理后4天，对小鼠i.p.(腹膜内)注射萤光素并用ivis对病毒的存在成象(参见图16)。该实验显示copmd5p3p是更安全的病毒，因为它对肿瘤特异性更强。其它病毒在尾部、肌肉、爪和
one.6(9):e24643(2011)中所述的技术，该文献的公开内容作为参考并入本文。
[0236]
简要地，通过g-block技术(idt,coralville iowa)合成了copmd5p(在5'基因：c2l、c1l、n1l、n2l、m1l、m2l、k1l、k2l、k3l、k4l、k5l、k6l、k7r、f1l、f2l、f3l中具有缺失的哥本哈根牛痘病毒)和copmd3p(在3'基因：b14r、b15r、b16r、b17l、b18r、b19r和b20r中具有缺失并且在靶向重组构建体的itr基因b21r、b22r、b23r、b24r、b25r、b26r、b27r、b28r和b29r中的每一个中具有单一缺失的哥本哈根牛痘病毒)。以0.01的moi，在无血清dmem中，用野生型牛痘病毒(惠氏、西储、天坛、李斯特)感染u2os细胞1.5小时。吸出病毒上清液并通过lipofectamine 2000(invitrogen)，在optimem(gibco)中用pcr扩增的copmd5p或copmd3p靶向g-blocks转染u2os细胞。在转染后30分钟将补充有10％fbs的dmem加入至细胞中并保持过夜。随后几天，吸出转染培养基并将新鲜的dmem 10％fbs培养基加入至细胞。感染转染后48小时，收获u2os细胞并通过单一冷冻融化循环裂解。将顺序稀释的裂解液在汇合的单层u2os细胞上铺板，并分离egfp阳性(copmd5p靶向的)或mcherry阳性(copmd3p靶向)空斑并通过5轮空斑纯化进行纯化。
[0237]
对于每种病毒，在u2os细胞中，通过以moi为5的copmd5p和copmd3p缺失的牛痘病毒的共转染，产生了双重主要缺失的牛痘病毒。次日收获细胞并通过1轮冷冻融化裂解。将裂解液顺序稀释，并在汇合的单层u2os细胞上铺板，并对双重阳性空斑(egfp+mcherry)进行选择。通过5轮空斑纯化来纯化空斑。
[0238]
在图25中显示了用于产生本发明公开所述的修饰的牛痘病毒载体(例如，修饰的牛痘病毒载体，如修饰的哥本哈根牛痘病毒载体)的示例性方案。
[0239]
实施例15-与skv-(copmd5p3p-b8r+)相比，skv-gfp(copmd5p3p-b8r-)在肿瘤控制方面具有类似的效力
[0240]
牛痘病毒(vv)b8r基因编码与γ干扰素受体(ifn-γ)具有同源性的分泌蛋白。体外，b8r蛋白结合至并中和几个种的γ干扰素，包括人和大鼠γ干扰素的抗病毒活性；然而，它不明显结合鼠科ifn-γ。在本文中，我们描述了缺少b8r基因的重组vv的构建和表征。靶标构建体和b8r基因座之间的同源重组导致75％的b8r基因被通过两个loxp位点(skv-gfp)侧接的egfp转基因替换。
[0241]
b8r-病毒显示出与b8r+病毒类似的效力。图35。评价了用skv或skv-gfp处理的小鼠的存活。在第0天，皮下接种5
×
106个ct26-lacz细胞。在第14、16和18天，以107pfu的剂量，通过skv或skv-gfp的抗肿瘤注射治疗肿瘤。当所注射的病毒具有b8r基因座缺失时，未观察到效力的明显降低。
[0242]
实施例16-skv(copmd5p3p-b8r+)病毒的正常相对于癌细胞系的感染
[0243]
将原代健康细胞存活力与癌细胞的相比较。以一系列moi(pfu/细胞)感染汇合的正常或癌细胞48小时，然后定量存活力。如图33所示，skv(copmd5p3p-b8r+)病毒优先感染癌细胞。
[0244]
实施例17-skv(copmd5p3p-b8r+)不损害干扰素信号转导。
[0245]
通过确定多种正常细胞系和一种癌细胞系(786-o)中上调(诱导表达)或下调(抑制表达)的干扰素途径中的基因数目来评价干扰素的信号转导。图34，以moi为3(3e6 pfu)，用skv-b8r+(copmd5p3p)或者tk基因无功能的亲代哥本哈根病毒株感染1百万个汇合的单层细胞18h。使用rna-seq对rna测序并在读序定位和表达归一化之后确定干扰素基因的基
因表达。尽管skv-b8r+(copmd5p3p)病毒大部分诱导干扰素途径中的基因，但亲代哥本哈根抑制基因。这表明skv-b8r+(copmd5p3p)能够诱导i型干扰素信号转导，这在正常细胞的病毒清除中是至关重要的。
[0246]
实施例18-多种牛痘株中工程设计的主要双重缺失提高了体外癌细胞杀死。
[0247]
以0.1的moi，用以下工程牛痘病毒株感染hela细胞：(1)亲代野生型病毒(wt)；(2)5'主要缺失(5p)、(3)3'主要缺失(3p)和(4)重组5'和3'主要双重缺失(5p3p)。感染后72小时，通过阿拉玛蓝测定定量细胞存活力。当与它们的亲代野生型和3p主要缺失株相比时，5p和5p3p主要双重缺失的牛痘株两者在hella细胞中的细胞毒性更强。参见图36。图37显示了主要缺失的牛痘株以及5p、3p和5p3p缺失对合胞体、细胞毒性和复制的影响的总结。通过静脉内尾静脉注射，用1
×
107pfu处理cd-1裸鼠并在指定时间点测量。与野生株相比，5p3p牛痘株不引起重量减轻。图38。注射后6天，还检查了小鼠的痘病变。与野生株相比，5p3p牛痘株不引起痘病变。图39。
[0248]
一些实施方式
[0249]
在本说明书中提及的所有专利公开、专利和专利申请以每个独立的专利公开或专利申请具体且单独表明作为参考并入的相同程度作为参考并入本文。
[0250]
尽管已结合其具体实施方式描述了本发明，但是将理解它能够进一步修饰，并且本发明申请旨在涵盖一般地，根据本发明的原理并且包括本发明所属领域内的已知或惯例实践内的与本发明公开的这些偏离所做的本发明的任何变化、使用或改变，并且可以适用于以上所述的基本特征，并处于权利要求的范围内。
[0251]
一些实施方式在权利要求之内。