非-HLA限制性T细胞受体及其用途的制作方法
相关申请的交叉引用
本申请要求于2018年2月11日提交的美国临时专利申请序列号62/629,072的优先权，其全部内容并入以供参考，并要求其优先权。
本公开的主题提供用于增强针对癌症和病原体的免疫应答的方法和组合物。它涉及t细胞受体(tcr)的新型设计和包含该t细胞受体的工程化免疫应答细胞。包含新型tcr的工程化免疫应答细胞是抗原导向的。
背景技术：
使用抗原识别受体(例如，嵌合抗原受体(car))的过继性免疫疗法在白血病的治疗中显示出显著的临床结果，并且是治疗癌症的最有希望的新策略之一。为了产生car疗法，当前的临床方案采用自体t细胞和随机整合的载体，包括γ-逆转录病毒、慢病毒和转座子，由于转基因变异，它们均导致car的半随机整合和可变表达。总之，自体细胞来源和随机载体整合的结合易于产生具有可变效力的细胞产物。因此，需要具有一致效力和增加的检测低水平靶抗原能力的抗原识别受体的新颖设计。
技术实现要素：
本公开的主题通常提供以hla-非依赖性的方式与目的抗原结合的hla-非依赖性(或非-hla限制性)t细胞受体(称为“hi-tcr”)和包含其的免疫应答细胞。本公开的主题还提供使用这样的细胞用于诱导和/或增强对靶抗原的免疫应答，和/或治疗和/或预防肿瘤(neoplasia)或其它需要提高抗原特异性免疫应答的疾病/病症的方法。
本公开的主题提供重组t细胞受体(tcr)，其包含抗原结合链，该抗原结合链包含细胞外抗原结合结构域和恒定结构域，其中重组tcr以hla-非依赖性方式结合抗原。
在某些实施方式中，恒定结构域包含天然或修饰的trac肽和/或天然或修饰的trbc肽。在某些实施方式中，恒定结构域能够与另一恒定结构域形成同二聚体或异二聚体。
在某些实施方式中，重组tcr由置于免疫应答细胞的内源性trac基因座和/或trbc基因座中的表达盒表达。在某些实施方式中，重组tcr表达盒的放置破坏或废除免疫应答细胞中包含天然tcrα链和/或天然tcrβ链的tcr的内源性表达。在某些实施方式中，重组tcr表达盒的放置防止或消除免疫应答细胞中重组tcr与天然tcrα链和/或天然tcrβ链之间的错配。在某些实施方式中，抗原结合链能够与cd3ζ多肽缔合。抗原结合链在与抗原结合后能够激活与抗原结合链缔合的cd3ζ多肽。cd3ζ多肽的激活能够激活免疫应答细胞。cd3ζ多肽可以是内源性的或外源性的。在某些实施方式中，cd3ζ多肽是内源性的并且整合在天然cd3复合物中。在某些实施方式中，cd3ζ多肽是外源性的并且任选地与选自cd28多肽、4-1bb多肽、ox40多肽、icos多肽、dap-10多肽、及其任意组合的共刺激分子整合。在某些实施方式中，抗原结合链还包含共刺激区，其中重组tcr在与抗原结合后能够刺激免疫应答细胞。共刺激区可包含选自cd28多肽、4-1bb多肽、ox40多肽、icos多肽、dap-10多肽、及其任意组合的共刺激分子。在某些实施方式中，共刺激区包含cd28多肽。
在某些实施方式中，重组tcr能够与cd3复合物缔合。在某些实施方式中，重组tcr能够与cd3复合物整合并提供hla-非依赖性抗原识别。在某些实施方式中，cd3复合物是内源性的。在某些实施方式中，重组tcr替代cd3/tcr复合物中的内源性tcr。
在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域能够与另一细胞外抗原结合结构域二聚化。细胞外抗原结合结构域可包含细胞表面受体的配体，细胞表面配体的受体，抗体或其片段的抗原结合部分或tcr的抗原结合部分。在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域包含抗体的重链可变区(vh)，或来自骆驼科动物仅-vh抗体的vhh和/或抗体的轻链可变区(vl)。在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域能够与另一细胞外抗原结合结构域二聚化。在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域包含抗体的vh，其中人、鼠(murine)或骆驼科动物vh能够与包含该抗体的vl的另一细胞外抗原结合结构域二聚化并形成可变片段(fv)。在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域包含抗体的vl，其中该vl能够与包含该抗体的vh的另一细胞外抗原结合结构域二聚化并形成可变片段(fv)。
在某些实施方式中，重组tcr与肿瘤抗原结合。在某些实施方式中，肿瘤抗原可选自cd19、muc16、muc1、ca1x、cea、cd8、cd7、cd10、cd20、cd22、cd30、cll1、cd33、cd34、cd38、cd41、cd44、cd49f、cd56、cd74、cd133、cd138、egp-2、egp-40、epcam、erb-b2,3,4、fbp、胎儿乙酰胆碱受体、叶酸受体-a、gd2、gd3、her-2、htert、il-l3r-a2、k-轻链、kdr、ley、l1细胞粘附分子、mage-a1、间皮素、erbb2、magea3、p53、mart1、gp100、蛋白酶3(pr1)、酪氨酸酶、存活蛋白、htert、epha2、nkg2d配体、ny-es0-1、癌胚抗原(h5t4)、psca、psma、ror1、tag-72、vegf-r2、wt-1、bcma、cd123、cd44v6、nkcs1、egf1r、egfr-viii和cd99、cd70、adgre2、ccr1、lilrb2、lilrb4、prame和erbb。在某些实施方式中，肿瘤抗原是cd19。
在某些实施方式中，重组tcr比靶向相同抗原的car表现出更高的抗原敏感性。在某些实施方式中，重组tcr在与肿瘤细胞表面上具有低密度的抗原结合时能够诱导免疫应答。在某些实施方式中，在细胞表面上具有低密度的抗原具有每个细胞小于约2,000个分子。
本公开的主题还提供包含本文所述的重组tcr的免疫应答细胞。在某些实施方式中，重组tcr的至少一条抗原结合链的表达盒置于免疫应答细胞的内源性基因座处。在某些实施方式中，重组tcr的两条抗原结合链的表达盒置于免疫应答细胞的内源性基因座处，其中两条抗原结合链能够二聚化。重组tcr的表达盒的放置可破坏或废除免疫应答细胞中包含天然tcrα链和/或天然tcrβ链的tcr的内源性表达，从而防止或消除免疫应答细胞中重组tcr与天然tcrα链和/或天然tcrβ链之间的错配。内源性基因座可以是cd3δ基因座、cd3ε基因座、cd247基因座、b2m基因座、trac基因座、trbc基因座或trgc基因座或trdc基因座。在某些实施方式中，内源性基因座是trac基因座和/或trbc基因座。内源性基因座可包含修饰的转录终止子区。在某些实施方式中，修饰的转录终止子区包含选自tk转录终止子、gcsf转录终止子、tcra转录终止子、hbb转录终止子、牛生长激素转录终止子、sv40转录终止子和p2a元件的基因组元件；p2a元件允许使用靶基因的内源性转录终止子。在某些实施方式中，当细胞中的一个内源性t细胞受体基因座被修饰以表达重组tcr的至少一条抗原结合链时，该细胞中的一个或多个其它内源性t细胞受体基因座被修饰以消除内源性tcr链的表达。在某些实施方式中，该一个或多个其它内源性t细胞受体基因座被进一步修饰以表达目的基因。目的基因可以是抗肿瘤细胞因子、共刺激分子配体、追踪基因或自杀基因。在某些实施方式中，一个或多个内源性tcr基因座被进一步修饰以并入编码共刺激信号传导结构域的序列，以产生在羧基末端包含这种信号传导结构域的tcr链。
在某些实施方式中，免疫应答细胞选自t细胞、细胞毒性t淋巴细胞(ctl)、调节性t细胞、天然杀伤性t(nkt)细胞、人胚胎干细胞、和可从中分化出淋巴样细胞的多能干细胞。在某些实施方式中，免疫应答细胞是自体的。
在某些实施方式中，免疫应答细胞还包含至少一种外源性共刺激配体。在某些实施方式中，共刺激配体选自cd80、cd86、41bbl、cd275、cd40l、ox40l、及其任意组合。在某些实施方式中，该细胞还包含一种外源性共刺激配体或由其组成。在某些实施方式中，该一种外源性共刺激配体是cd80或4-1bbl。在某些实施方式中，该细胞还包含两种外源性共刺激配体或由其组成。在某些实施方式中，该两种外源性共刺激配体是cd80和4-1bbl。
在某些实施方式中，免疫应答细胞还包含至少一种嵌合共刺激受体(ccr)。在某些实施方式中，ccr包含选自cd28多肽、4-1bb多肽、ox40多肽、icos多肽、dap-10多肽、及其任意组合的共刺激分子。
本公开的主题还提供包含本文公开的免疫应答细胞和药学上可接受的赋形剂的药物组合物。该药物组合物可用于治疗肿瘤。
还提供减轻受试者的肿瘤负荷的方法。另外，本公开的主题提供延长患有肿瘤(例如，癌症)的受试者的存活的方法。在某些实施方式中，该方法包括向受试者施用有效量的本文所述的免疫应答细胞或本文所述的药物组合物。
本公开的主题还提供治疗或预防肿瘤的方法。在某些实施方式中，该方法包括向受试者施用有效量的本文所述的免疫应答细胞或本文所述的药物组合物。肿瘤可选自血液癌症、b细胞白血病、多发性骨髓瘤、急性淋巴母细胞性白血病(all)、慢性淋巴细胞性白血病、非霍奇金氏淋巴瘤和腺癌。在某些实施方式中，肿瘤是b细胞白血病、多发性骨髓瘤、急性淋巴母细胞性白血病(all)、慢性淋巴细胞性白血病、或非霍奇金氏淋巴瘤，并且重组tcr与cd19结合。在某些实施方式中，肿瘤是b细胞白血病、多发性骨髓瘤、急性淋巴母细胞性白血病(all)、慢性淋巴细胞性白血病、腺癌、或非霍奇金氏淋巴瘤，并且重组tcr与cd19、muc16、muc1、ca1x、cea、cd8、cd7、cd10、cd20、cd22、cd30、cll1、cd33、cd34、cd38、cd41、cd44、cd49f、cd56、cd74、cd133、cd138、egp-2、egp-40、epcam、erb-b2,3,4、fbp、胎儿乙酰胆碱受体、叶酸受体-a、gd2、gd3、her-2、htert、il-l3r-a2、k-轻链、kdr、ley、l1细胞粘附分子、mage-a1、间皮素(msln)、erbb2、magea3、p53、mart1、gp100、蛋白酶3(pr1)、酪氨酸酶、存活蛋白、htert、epha2、nkg2d配体、ny-es0-1、癌胚抗原(h5t4)、psca、psma、ror1、tag-72、vegf-r2、wt-1、bcma、cd123、cd44v6、nkcs1、egf1r、egfr-viii、cd99、cd70、adgre2、ccr1、lilrb2、lilrb4、prame和erbb结合。在某些实施方式中，肿瘤是cd19+all。
本公开的主题还提供用于产生抗原特异性免疫应答细胞的方法。在某些实施方式中，该方法包括将编码本文所述的重组tcr的核酸序列引入免疫应答细胞中。核酸序列可以包含在载体中。在某些实施方式中，重组tcr的至少一条抗原结合链的表达盒置于免疫应答细胞的内源性基因座处。在某些实施方式中，重组tcr的两条抗原结合链的表达盒置于免疫应答细胞的内源性基因座处，其中两条抗原结合链能够二聚化。内源性基因座可以是cd3δ基因座、cd3ε基因座、cd247基因座、b2m基因座、trac基因座、trbc基因座、trdc基因座和/或trgc基因座。在某些实施方式中，内源性基因座是trac基因座和/或trbc基因座。在某些实施方式中，重组tcr的表达盒的放置破坏或废除免疫应答细胞中包含天然tcrα链和/或天然tcrβ链的tcr的内源性表达，从而防止或消除免疫应答细胞中重组tcr与天然tcrα链和/或天然tcrβ链之间的错配。在某些实施方式中，内源性基因座包含修饰的转录终止子区。在某些实施方式中，修饰的转录终止子区包含选自tk转录终止子、gcsf转录终止子、tcra转录终止子、hbb转录终止子、牛生长激素转录终止子、sv40转录终止子和p2a元件的基因组元件。在某些实施方式中，当细胞中的一个内源性t细胞受体基因座被修饰以表达重组tcr的至少一条抗原结合链时，该细胞中的一个或多个其它内源性t细胞受体基因座被修饰以消除内源性tcr链的表达。在某些实施方式中，该一个或多个其它内源性t细胞受体基因座被进一步修饰以表达目的基因。在某些实施方式中，目的基因可以是抗肿瘤细胞因子、共刺激分子配体、追踪基因或自杀基因。
本公开的主题还提供编码本文所述的重组tcr的核苷酸，以及包含本文所述的重组tcr的核酸组合物。在某些实施方式中，核酸序列包含在载体中。本公开的主题还提供包含本文所述的核酸组合物的载体。还提供试剂盒，其包含本文所述的重组tcr、本文所述的免疫应答细胞、本文所述的药物组合物、本文所述的核酸组合物或本文所述的载体。在某些实施方式中，试剂盒还包含用于治疗和/或预防肿瘤、病原体感染、自身免疫性疾病或同种异体移植的书面说明书。
可以用于本公开的主题的示例性肿瘤包括但不限于白血病(例如急性白血病、急性淋巴细胞性白血病、急性髓细胞性白血病、急性成淋巴细胞性白血病、急性早幼粒细胞性白血病、急性骨髓单核细胞性白血病、急性单核细胞性白血病、急性红白血病、慢性白血病、慢性髓细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病)、真性红细胞增多症、淋巴瘤(霍奇金氏病、非霍奇金氏病)、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症(waldenstrom’smacroglobulinemia)、重链病和实体瘤比如肉瘤和癌(carcinoma)(例如纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、骨源性肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管内皮肉瘤(lymphangioendotheliosarcoma)、滑膜瘤、间皮瘤、尤文氏瘤(ewing’stumor)、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、囊腺癌、髓样癌、支气管癌、肾细胞癌、肝细胞瘤、胆管癌、绒毛膜癌、精原细胞瘤、胚胎性癌、肾母细胞瘤(wilm’stumor)、子宫颈癌、子宫癌、睾丸癌、肺癌、小细胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神经胶质瘤、星形细胞瘤、成神经管细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、成血管细胞瘤、听神经瘤、少突神经胶质瘤、许旺氏细胞瘤、脑膜瘤、黑素瘤、成神经细胞瘤和视网膜母细胞瘤)。
本公开的主题还提供本文公开的任何重组tcr、任何药物组合物或任何免疫应答细胞在治疗中的用途。
附图说明
可以结合附图来理解以实施例的方式给出的以下详细描述，但并不旨在将本公开的主题限于所描述的特定实施方式。
图1a-1e描述在人t细胞中trac基因座处的hla-非依赖性的基于tcr的嵌合抗原受体hit(hit-car，即hi-tcr或hit)和基因靶向策略。(a)t细胞受体(tcr)，b细胞受体(bcr)，嵌合抗原受体(car)，和hla-非依赖性的基于tcr的嵌合抗原受体(hit-car，即hi-tcr或hit)的示意图。(b)3种受体到trac基因座中的crispr/cas9-靶向整合。上部：trac基因座；中间：含有两侧具有同源臂的不同受体盒的raav6。(c)靶向trac后4天的代表性tcr/小鼠f(ab’)2流式细胞仪图。tcr抗体表位识别tcrα和β的恒定链。(d)使用表达萤火虫荧光素酶(ffl)的nalm-6作为靶细胞(n＝3)，使用18小时生物发光测定法的细胞毒性活性。(e)在对cd19阳性靶细胞进行1、2或4次(箭头)刺激后，cart细胞的相对carmfi(1＝0小时处的mfi)。
图2a-2b描述hi-tcr的表达和治疗功效。(a)靶向trac后4天的代表性tcr/小鼠f(ab’)2流式细胞仪图。(b)对小鼠存活的kaplan-meier分析，其中用5×105cart细胞治疗荷nalm-6小鼠。
图3a-3e描述基因靶向策略和nyesotcr的表达。(a)整合到tcrα或β链中的nyesotcr基因的示意图。(b)靶向trac或trbc后4天的代表性tcr-v-β-1流式细胞仪图。(c)使用表达萤火虫荧光素酶(ffl)的pc3作为靶细胞(n＝3)，使用18小时生物发光测定法的细胞毒性活性。(d)共同靶向到tcrα和tcrβ两者中的示意图。(e)共同靶向trac和trbc后4天的代表性tcr-v-β-1/4-1bbl流式细胞仪图。
图4a-4c描述将car整合到trac基因座并通过各种转录终止信号/3’非翻译区(3’utr)调节表达的策略。(a)整合到trac基因座中的1928zcar基因的示意图。多聚a(黑框)对应于car盒的片段，该片段经过修饰以测试不同的病毒和哺乳动物3’utr。(b)trac后3天的代表性car流量图(左图)以及表达car群体的几何平均荧光强度(gmfi)、mfi和中位数(右图)。框内是牛生长激素多聚a的原始3’utr序列。(c)对cd19阳性靶细胞进行1、2次刺激后，cart细胞的绝对(上部)和相对(底部)carmfi(1＝0小时处的mfi)(如图1所示)。
图5a和5b描述具有不同3’utr序列的基因整合car的功效。(a)用1×105cart细胞治疗荷ffl-nalm-6小鼠，其中肿瘤负荷显示为t细胞注射后14天量化的每只动物的生物发光信号。每组n＝6只小鼠。(b)在t细胞注射后7、14和21天量化的用1×105cart细胞(n＝6；每行＝一只小鼠)治疗的荷nalm-6小鼠的肿瘤负荷(平均辐射)。
图6a-6c描述靶向人t细胞中的trac基因座的hit基因。(a)crispr/cas9-靶向的car或hit基因整合到trac基因座。上部，trac基因座；中间，包含两侧为同源臂的car盒的raav6；底部，包含两侧为同源臂的hit盒的raav6。(b)用cas9mrna和tracgrna转染t细胞并添加aav6后4天的代表性car/hit流量图。使用山羊抗-小鼠igg检测car和hit表面蛋白。(c)转导后4天通过facs分析的平均car/hit平均荧光强度(mfi)(n＝6个独立实验)。
图7a-7b描述hitt细胞在杀伤表达低抗原水平的靶细胞时优于cart细胞。使用crispr/cas9在cd19基因座处对nalm6细胞系(表达萤火虫荧光素酶)进行基因编辑，并生成表达不同cd19水平的克隆。(a)针对每个cd19表达水平组(neg＝阴性)的代表性nalm6克隆的facs分析。(b)使用4小时生物发光测定法的细胞毒性活性，使用nalm6作为靶细胞表达不同的cd19水平，和car(红色方块)或hit(蓝色圆)t细胞为1：1效应子(e)：靶标(t)比。
图8a-8c描述hitt细胞在杀伤表达低抗原水平的靶细胞时优于cart细胞。使用18小时生物发光测定法的细胞毒性活性，使用nalm6作为靶细胞表达不同的cd19水平(如右图所示)，将其与未转导的t细胞(a)、cart细胞(b)和hitt细胞(c)以不同的效应子(e)：靶标(t)比孵育。
图9a-9d描述在控制已建立的具有非常低的cd19水平的b-all肿瘤中，表达共刺激配体的hitt细胞优于cart细胞。用4×105未转导的(nt)、car或hitt细胞治疗荷nalm-6小鼠。使用bli在54天的时间内每周对肿瘤负荷
图10a-10c描述基线trac-car表达可以通过不同的3’utr序列来控制，而不会影响遇到抗原后的细胞表面补充动力学。(a)crispr/cas9靶向的car基因整合到trac基因座中。靶向构建体(aav)包含1928zcar编码序列，后接3’utr序列，其两侧为与trac基因座同源的序列(
具体实施方式
本公开的主题提供以hla-非依赖性方式结合目的抗原的hla-非依赖性(或非-hla限制性)t细胞受体(称为“hi-tcr”)。在某些实施方式中，hi-tcr是tcr分子，其中tcr可变结构域由来自抗体的可变结构域(fv)替代，从而产生fvtcr。在某些非限制性实施方式中，hi-tcr可以与肿瘤抗原或病原体抗原结合。本公开的主题还提供包含本公开的hi-tcr的细胞，包括遗传修饰的免疫应答细胞(例如，t细胞、nkt细胞或ctl细胞)。在某些非限制性实施方式中，hi-tcr与抗原的结合能够激活免疫应答细胞。本公开的主题还提供使用这样的细胞来诱导和/或增强对靶抗原的免疫应答，和/或治疗和/或预防肿瘤或其它需要提高抗原特异性免疫应答的疾病/病症的方法。
1.定义
除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语具有本领域技术人员通常理解的含义。以下参考文献为技术人员提供对本公开的主题中使用的许多术语的一般定义：singleton等人，《微生物学和分子生物学词典》(1994年第2版)；剑桥科学技术词典(walker编辑，1988)；遗传学词汇，第5版，r.rieger等(编辑)，springerverlag(1991)；和hale&marham，《哈珀·柯林斯生物学词典》(1991年)。如本文所用，除非另有说明，否则以下术语具有以下赋予它们的含义。
如本文所用，术语“约”或“近似”是指在特定值的可接受误差范围内，如本领域普通技术人员所确定的，其将部分取决于如何测量或确定该值，即，测量系统的局限性。例如，根据本领域的实践，“约”可以表示在3个或超过3个标准偏差之内。可替代地，“约”可以表示给定值的至多约20％，例如，至多约10％，至多约5％或至多约1％的范围。可替代地，特别是关于生物系统或方法，该术语可以意指在数值的一个数量级内，例如在一个值的约5倍之内或在约2倍之内。
“激活免疫应答细胞”是指信号转导的诱导或细胞中蛋白质表达的变化，导致免疫应答的启动。例如，当cd3链响应于配体结合和基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(itam)聚集时，就会产生信号转导级联反应。在某些实施方式中，当内源性tcr或外源性car与抗原结合时，发生免疫突触的形成，其包括在结合受体(例如，cd4或cd8，cd3γ/δ/ε/ζ等)附近的许多分子的聚集。膜结合信号分子的这种聚集使cd3链中包含的itam基序磷酸化。该磷酸化反过来启动了t细胞激活通路，最终激活转录因子，例如nf-κb和ap-1。这些转录因子诱导t细胞的整体基因表达，从而增加il-2的产生，促进主调节t细胞蛋白的增殖和表达，进而启动t细胞介导的免疫应答。
“刺激免疫应答细胞”是指导致强烈和持续的免疫应答的信号。在各种实施方式中，这发生在免疫细胞(例如，t细胞)激活之后或通过包括但不限于cd28、cd137(4-1bb)、ox40、cd40和icos的受体同时介导。接收多种刺激信号对于建立强烈且长期的t细胞介导的免疫应答可能很重要。t细胞可以迅速被抑制并且对抗原无应答。尽管这些共刺激信号的作用可能有所不同，但它们通常会导致基因表达增加，从而产生长寿命、增殖性和抗凋亡性t细胞，其对抗原应答强烈，可彻底和持续根除。
如本文所用，术语“抗原识别受体”是指能够响应于其与抗原的结合而激活免疫或免疫应答细胞(例如，t细胞)的受体。抗原识别受体的非限制性实例包括天然或内源性t细胞受体(“tcr”)和嵌合抗原受体(“car”)。
如本文所用，术语“抗体”不仅是指完整的抗体分子，而且是指保留免疫原结合能力的抗体分子的片段。这样的片段在本领域中也是众所周知的，并且在体外和体内均经常使用。因此，如本文所用，术语“抗体”不仅是指完整的免疫球蛋白分子，而且是众所周知的活性片段f(ab')2和fab。缺少完整抗体fc片段的f(ab')2和fab片段，从循环中清除得更快，并且可能具有更少的完整抗体的非特异性组织结合(wahl等人，j.nucl.med.24:316-325(1983))。如本文所用，抗体包括完整的天然抗体、双特异性抗体；嵌合抗体；fab、fab'、单链v区片段(scfv)、融合多肽和非常规抗体。在某些实施方式中，抗体是糖蛋白，其包含通过二硫键相互连接的至少两个重(h)链和两个轻(l)链。每条重链由重链可变区(在本文中简称为vh)和重链恒定(ch)区组成。重链恒定区由三个结构域ch1、ch2和ch3组成。每条轻链由轻链可变区(在本文中简称为vl)和轻链恒定cl区组成。轻链恒定区由一个结构域cl组成。vh区和vl区可进一步细分为高变区，称为互补决定区(cdr)，其间散布有更保守的区，称为框架区(fr)。每个vh和vl由三个cdr和四个fr组成，它们从氨基端到羧基端按以下顺序排列：fr1，cdr1，fr2，cdr2，fr3，cdr3，fr4。重链和轻链的可变区包含与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区可以介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，所述宿主组织或因子包括免疫系统的各种细胞(例如，效应细胞)和经典补体系统的第一组分(c1q)。
如本文所用，“cdr”定义为抗体的互补决定区氨基酸序列，其是免疫球蛋白重链和轻链的高变区。参见，例如，kabat等，sequencesofproteinsofimmunologicalinterest，第4版，美国国立卫生研究院卫生与公共服务部(1987)。通常，抗体在可变区中包含三个重链和三个轻链cdr或cdr区。cdr提供大多数接触残基，以使抗体与抗原或表位结合。在某些实施方式中，使用kabat系统勾勒出cdr区域(kabat，e.a，等(1991)sequencesofproteinsofimmunologicalinterest，第五版，美国卫生和公共服务部，nih出版号91-3242)。
如本文所用，术语“单链可变片段”或“scfv”是共价连接以形成vh::vl异二聚体的免疫球蛋白的重链(vh)和轻链(vl)的可变区的融合蛋白。vh和vl直接连接或通过肽编码接头(例如10、15、20、25个氨基酸)连接，该接头将vh的n端与vl的c端或vh的c端与vl的n端相连。接头通常富含甘氨酸以提高柔韧性，并富含丝氨酸或苏氨酸以提高溶解度。尽管去除了恒定区并引入了接头，scfv蛋白仍保留了原始免疫球蛋白的特异性。单链fv多肽抗体可以由如huston等(proc.nat.acad.sci.usa,85:5879-5883,1988)所述的包括vh和vl编码序列的核酸表达。还参见美国专利第5,091,513号，第5,132,405号和第4,956,778号。以及美国专利公开号20050196754和20050196754。已经描述具有抑制活性的拮抗scfv(参见，例如，zhao等，hyrbidoma(larchmt)200827(6)：455-5l；peter等，jcachexiasarcopeniamuscle2012年8月12日；shieh等，jimunol2009183(4)：2277-85；giomarelli等，thrombhaemost200797(6)：955-63；fife等，jclininvst2006116(8)：2252-61；brocks等，immunotechnology19973(3)：173-84；moosmayer等，therimmunol19952(10：31-40)。已经描述具有刺激活性的激动性scfv(参见，例如，peter等，jbioichern200325278(38)：36740-7；xie等，natbiotech199715(8)：768-71；ledbetter等，critrevimmunol199717(5-6)：427-55；ho等，biochimbiophysacta20031638(3)：257-66)。
如本文所用，术语“亲和力”是指结合强度的量度。亲和力可取决于抗体结合位点和抗原决定簇之间立体化学拟合的紧密度，它们之间接触面积的大小和/或带电和疏水基团的分布。如本文所用，术语“亲和力”还包括“亲合力”，其是指在形成可逆复合物之后抗原-抗体键的强度。计算抗体对抗原的亲和力的方法是本领域已知的，包括但不限于各种抗原结合实验，例如功能测定法(例如流式细胞术测定法)。
如本文所用，术语“嵌合抗原受体”或“car”是指包含与能够激活或刺激免疫应答细胞的细胞内信号传导结构域融合的细胞外抗原结合结构域和跨膜结构域的分子。在某些实施方式中，car的细胞外抗原结合结构域包含scfv。scfv可以源自融合抗体的可变重和轻区。替代地或另外，scfv可以衍生自fab’s(而不是抗体，例如获自fab文库)。在某些实施方式中，将scfv融合至跨膜结构域，然后融合至细胞内信号传导结构域。在某些实施方式中，car对抗原具有高结合亲和力或亲合力。
如本文所用，术语“核酸分子”包括编码目的多肽或其片段的任何核酸分子。这样的核酸分子不需要与内源性核酸序列100％同源性或同一性，而是可以表现出基本同一性。与内源性序列具有“基本同一性”或“基本同源性”的多核苷酸通常能够与双链核酸分子的至少一条链杂交。“杂交”是指在各种严格条件下在互补多核苷酸序列(例如，本文描述的基因)或其部分之间形成双链分子的配对。(参见，例如，wahl,g.m.和s.l.berger(1987)methodsenzymol.152:399；kimmel，a.r.(1987)methodsenzymol.152:507)。
例如，严格的盐浓度通常将小于约750mmnacl和75mm柠檬酸三钠，例如小于约500mmnacl和50mm柠檬酸三钠，或小于约250mmnacl和25mm柠檬酸三钠。在没有有机溶剂例如甲酰胺的情况下可以获得低严格度的杂交，而在至少约35％的甲酰胺，例如至少约50％的甲酰胺的存在下可以获得高严格度的杂交。严格的温度条件通常将包括至少约30℃，至少约37℃，或至少约42℃的温度。改变其它参数，例如杂交时间、去污剂(例如十二烷基硫酸钠(sds))的浓度、以及包含或排除载体dna是本领域技术人员众所周知的。通过根据需要组合这些各种条件来实现各种严格度。在某些实施方式中，杂交将在30℃下750mmnacl、75mm柠檬酸三钠和1％sds中进行。在某些实施方式中，杂交将在37℃下500mmnacl、50mm柠檬酸三钠、1％sds、35％甲酰胺和100μg/ml变性鲑鱼精dna(ssdna)中进行。在某些实施方式中，杂交将在42℃下250mmnacl、25mm柠檬酸三钠、1％sds、50％甲酰胺和200μg/mlssdna中进行。在这些条件下有用的变化对于本领域技术人员将是显而易见的。
对于大多数应用，杂交后的洗涤步骤的严格度也会有所不同。洗涤严格条件可以通过盐浓度和温度来定义。如上所述，可以通过降低盐浓度或通过提高温度来提高洗涤严格度。例如，洗涤步骤的严格盐浓度可以小于约30mmnacl和3mm柠檬酸三钠，例如，小于约15mmnacl和1.5mm柠檬酸三钠。洗涤步骤的严格温度条件通常将包括至少约25℃，至少约42℃或至少约68℃的温度。在某些实施方式中，洗涤步骤将在25℃下30mmnacl、3mm柠檬酸三钠和0.1％sds中进行。在某些实施方式中，洗涤步骤将在42℃下15mmnacl、1.5mm柠檬酸三钠和0.1％sds中进行。在某些实施方式中，洗涤步骤将在68℃下15mmnacl、1.5mm柠檬酸三钠和0.1％sds中进行。这些条件的其它变化对于本领域技术人员将是显而易见的。杂交技术是本领域技术人员众所周知的，并且描述于例如benton和davis(science196:180，1977)；grunstein和rogness(proc.natl.acad.sci.，usa72:3961，1975)；ausubel等(《分子生物学最新研究方法》，威利科学出版社，纽约，2001年)；berger和kimmel(分子克隆技术指南，1987年，纽约学术出版社)；和sambrook等，《分子克隆：实验室手册》，纽约冷泉港实验室出版社。
“基本同一性”或“基本同源性”是指与参考氨基酸序列(例如，本文所述的任一氨基酸序列)或核酸序列(例如，本文描述的任一核酸序列)表现出至少约50％同源性或同一性的多肽或核酸分子。在某些实施方式中，这样的序列与用于比较的氨基酸或核酸序的列为至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约99％或至少约100％同源性或同一性。
序列同一性可以通过使用序列分析软件(例如，威斯康星大学生物技术中心遗传学计算机组的序列分析软件包，威斯康星州麦迪逊市53705大学大道1710号，blast、bestfit、gap或pileup/prettybox程序)进行测量。这样的软件通过将同源性程度分配给各种取代、缺失和/或其它修饰来匹配相同或相似的序列。保守取代通常包括以下组内的取代：甘氨酸、丙氨酸；缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸；天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺；丝氨酸、苏氨酸赖氨酸、精氨酸；和苯丙氨酸、酪氨酸。在确定同一性程度的示例性方法中，可以使用blast程序，其中e-3和e-100之间的概率得分指示密切相关的序列。
“类似物”是指具有参考多肽或核酸分子功能的结构相关的多肽或核酸分子。
如本文所用，术语“配体”是指与受体结合的分子。在某些实施方式中，配体与另一细胞上的受体结合，从而允许细胞间识别和/或相互作用。
如本文所用，术语“组成型表达”或“组成型表达的”是指在所有生理条件下表达或表达的。
“疾病”是指损害或干扰细胞、组织或器官的正常功能的任何状况、疾病或病症，例如肿瘤和细胞的病原体感染。
“有效量”是指足以具有治疗作用的量。在某些实施方式中，“有效量”是足以阻止、改善或抑制肿瘤的持续增殖、生长或转移(例如，侵袭或迁移)的量。
“增强耐受性”是指阻止靶向移植的器官或组织的自反应性细胞或免疫应答性细胞的活性。
“内源性”是指核酸分子或多肽通常在细胞或组织中表达。
“外源性”是指核酸分子或多肽不是内源性存在细胞中的，或不以在过表达时足以实现获得的功能效果的水平存在。因此，术语“外源性”将涵盖在细胞中表达的任何重组核酸分子或多肽，例如外源、异源和过表达的核酸分子和多肽。“外源性”核酸是指天然野生型细胞中不存在的核酸。例如，外源性核酸可通过序列、位置/定位或两者而不同于内源性对应物。为了清楚起见，外源性核酸相对于其天然内源性对应物可以具有相同或不同的序列。可以通过遗传工程将其引入细胞本身或其祖细胞，并且可以任选地将其连接至替代控制序列，例如非天然启动子或分泌序列。
“异源核酸分子或多肽”是指通常不存在于细胞或得自细胞的样品中的核酸分子(例如cdna、dna或rna分子)或多肽。该核酸可以来自另一个生物，或者可以是例如通常不在细胞或样品中表达的mrna分子。
“免疫应答细胞”是指在免疫应答或祖细胞或其后代中起作用的细胞。
“调节”是指正或负改变。示例性调节包括约1％、约2％、约5％、约10％、约25％、约50％、约75％或约100％的变化。
“增加”是指正改变至少约5％。改变可以为约5％、约10％、约25％、约30％、约50％、约75％、约100％或更多。
“减少”是指负改变至少约5％。改变可以为约5％、约10％、约25％、约30％、约50％、约75％或甚至约100％。
“分离的细胞”是指与天然伴随细胞的分子和/或细胞组分分离的细胞。
术语“分离的”、“纯化的”或“生物学上纯净的”是指物质在不同程度上不含在其原始状态下通常与其伴随的组分。“分离”表示与原始来源或环境的分离度。“纯化”表示分离度高于分离。“纯化的”或“生物纯净的”蛋白质充分不含其它物质，以使任何杂质均不会实质性地影响蛋白质的生物学特性或引起其它不利后果。也就是说，如果核酸或肽通过重组dna技术生产而基本不含细胞材料、病毒材料或培养基，或者通过化学合成而基本不含化学前体或其它化学品，则其是纯化的。纯度和均质性通常使用分析化学技术确定，例如聚丙烯酰胺凝胶电泳或高效液相色谱法。术语“纯化的”可以表示核酸或蛋白质在电泳凝胶中产生基本上一个条带。对于可以进行修饰(例如磷酸化或糖基化)的蛋白质，不同的修饰可以产生不同的分离的蛋白质，可以将其分别纯化。
如本文所用，术语“抗原结合结构域”是指能够特异性结合细胞上存在的特定抗原决定簇或抗原决定簇组的结构域。
如本文所用，“接头”应指共价连接两个或更多个多肽或核酸以使它们彼此连接的官能团(例如化学或多肽)。如本文所用，“肽接头”是指用于将两种蛋白质偶联在一起(例如，偶联vh和vl结构域)的一个或更多个氨基酸。在某些实施方式中，所述接头包含ggggsggggsggggs[seqidno：31]所示的序列。
“肿瘤(neoplasm)”是指以细胞或组织的病理性增生及其随后向其它组织或器官的迁移或侵袭为特征的疾病。肿瘤的生长通常是不受控制的和进行性的，并且在不引起正常细胞增殖或者导致正常细胞增殖停止的条件下发生。肿瘤可影响多种细胞类型、组织或器官，包括但不限于选自以下的器官：膀胱、骨骼、大脑、乳房、软骨、神经胶质、食道、输卵管、胆囊、心脏、肠、肾脏、肝脏、肺、淋巴结、神经组织、卵巢、胰腺、前列腺、骨骼肌、皮肤、脊髓、脾脏、胃、睾丸、胸腺、甲状腺、气管、泌尿生殖道、输尿管、尿道，子宫和阴道、或其组织或细胞类型。肿瘤包括癌症，例如肉瘤、肿瘤或浆细胞瘤(浆细胞的恶性肿瘤)在某些实施方式中，肿瘤是实体瘤。
本公开的主题可以用于的示例性肿瘤包括但不限于白血病(例如急性白血病、急性淋巴细胞性白血病、急性髓细胞性白血病、急性成淋巴细胞性白血病、急性早幼粒细胞性白血病、急性骨髓单核细胞性白血病、急性单核细胞性白血病、急性红白血病、慢性白血病、慢性髓细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病)、真性红细胞增多症、淋巴瘤(霍奇金病、非霍奇金氏病)，瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症、重链病和实体瘤比如肉瘤和癌(例如纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、骨源性肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管内皮肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤文氏瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、囊腺癌、髓样癌、支气管癌、肾细胞癌、肝细胞瘤、胆管癌、绒毛膜癌、精原细胞瘤、胚胎性癌、肾母细胞瘤、子宫颈癌、子宫癌、睾丸癌、肺癌、小细胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神经胶质瘤、星形细胞瘤、成神经管细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、成血管细胞瘤、听神经瘤、少突神经胶质瘤、许旺氏细胞瘤、脑膜瘤、黑素瘤、成神经细胞瘤和视网膜母细胞瘤)。
“受体”是指存在于细胞膜上的选择性地结合一个或更多个配体的多肽或其一部分。
“识别”是指选择性地结合靶标。识别肿瘤的t细胞可以表达与肿瘤抗原结合的受体(例如tcr或car)。
“参考”或“对照”是指比较的标准。例如，可以将表达car和scfv的细胞的scfv-抗原结合水平与仅表达car的相应细胞的scfv-抗原结合水平进行比较。
“分泌的”是指多肽通过分泌通路通过内质网、高尔基体、以及作为在细胞质膜上瞬时融合从而将蛋白质释放到细胞外的囊泡而从细胞释放。
“信号序列”或“前导序列”是指存在于新合成的蛋白质的n-末端，指导它们进入分泌通路的肽序列(例如5、10、15、20、25或30个氨基酸)。示例性前导序列包括但不限于il-2信号序列：myrmqllscialslalvtns[seqidno：12](人)，mysmqlascvtltlvllvns[seqidno：13](小鼠)，κ前导序列：metpaqllfllllwlpdttg[seqidno：14](人)，metdtlllwvlllwvpgstg[seqidno：15](小鼠)；cd8前导序列：malpvtalllplalllhaarp[seqidno：16](人)；截短的人cd8信号肽：malpvtalllplalllha[seqidno：28](人)；白蛋白信号序列：mkwvtfisllfssays[seqidno：29](人)；催乳素信号序列：mdskgssqkgsrlllllvvsnlllcqgvvs[seqidno：30](人)。“可溶的”是指多肽在水性环境(例如，未与膜结合)中可自由扩散。
“特异性结合”是指多肽或其片段识别并结合目的生物分子(例如多肽)但基本上不识别并结合样品(例如生物样品，其自然包括本发明公开的多肽)中其它分子。
如本文所用，术语“肿瘤抗原”是指与正常或非is赘生性细胞相比在肿瘤细胞上唯一或差异表达的抗原(例如，多肽)。在某些实施方式中，肿瘤抗原包括由肿瘤表达的任何多肽，其能够通过抗原识别受体(例如，cd19，muc-16)激活或诱导免疫应答或能够通过受体-配体结合(例如cd47，pd-l1/l2，b7.1/2)抑制免疫应答。
术语“包含”，“包括”旨在具有美国专利法中赋予它们的广义含义，并且可以表示“含有”，“包含”等。
如本文所用，“治疗”是指试图改变所治疗的个体或细胞的疾病进程的临床干预，并且可以用于预防或在临床病理过程中进行。治疗的治疗作用包括但不限于预防疾病的发生或复发、减轻症状、减少疾病的任何直接或间接病理后果、预防转移、降低疾病进展的速度、改善或减轻疾病状态、和缓解或改善预后。通过预防疾病或病症的进展，治疗不仅可以预防在受影响或诊断的受试者或怀疑患有该病症的受试者中由于病症引起的恶化，而且治疗可以在有患病症或怀疑患有该病症风险的受试者中预防该病症的发作或该病症的症状。
本文中的“个体”或“受试者”是脊椎动物，例如人或非人动物，例如哺乳动物。哺乳动物包括但不限于人类、灵长类动物、农场动物、运动动物、啮齿动物和宠物。非人动物受试者的非限制性实例包括啮齿动物，如小鼠、大鼠、仓鼠和豚鼠；兔子；狗；猫；绵羊；猪；山羊；牛；马；和非人灵长类动物，例如猿和猴子。如本文所用，术语“免疫受损的”是指具有免疫缺陷的受试者。该受试者非常容易遭受机会性感染，这种感染是由通常不会在免疫系统健康的人中引起疾病的生物体引起的，但是会影响免疫系统功能差或免疫系统受抑制的人。
在以下公开中描述本公开主题的其它方面，并且在本公开主题的范围内。
2.hla-非依赖性t细胞受体(hi-tcr)
本公开提供以hla-非依赖性方式结合目的抗原的hi-tcr。在某些非限制性实施方式中，抗原的结合能够激活包含hi-tcr的免疫应答细胞。在某些非限制性实施方式中，hi-tcr包含抗原结合链。在某些实施方式中，抗原结合链包含细胞外抗原结合结构域。在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域衍生自鼠、人或骆驼科动物(例如羊驼属)来源的scfv、fab或抗体。在某些实施方式中，抗原结合链还包含恒定结构域。
2.1.抗原
在某些实施方式中，hi-tcr与肿瘤抗原结合。任何肿瘤抗原(抗原肽)可以用于本文所述的肿瘤相关的实施方式中。抗原来源包括但不限于癌蛋白。抗原可以表达为肽或完整蛋白或其部分。完整蛋白或其部分可以是天然的或诱变的。肿瘤抗原的非限制性实例包括碳酸酐酶ix(ca1x)、癌胚抗原(cea)、cd8、cd7、cd10、cd19、cd20、cd22、cd30、cd33、cll1、cd34、cd38、cd41、cd44、cd49f、cd56、cd74、cd133、cd138、cd123、cd44v6、巨细胞病毒(cmv)感染细胞的抗原(例如细胞表面抗原)、上皮糖蛋白-2(egp-2)、上皮糖蛋白-40(egp-40)、上皮细胞粘附分子(epcam)、受体酪氨酸蛋白激酶erb-b2,3,4(erb-b2,3,4)、叶酸结合蛋白(fbp)、胎儿乙酰胆碱受体(achr)、叶酸受体-α、神经节苷脂g2(gd2)、神经节苷脂g3(gd3)、人表皮生长因子受体2(her-2)、人端粒酶逆转录酶(htert)、白介素13受体亚基α-2(il-13rα2)、κ-轻链、激酶插入结构域受体(kdr)、路易斯y(ley)、l1细胞粘附分子(l1cam)、黑色素瘤抗原家族a,1(mage-a1)、粘蛋白16(muc16)、粘蛋白1(muc1)、间皮素(msln)、erbb2、magea3、p53、mart1、gp100、蛋白酶3(pr1)、酪氨酸酶、存活蛋白、htert、epha2、nkg2d配体、癌-睾丸抗原ny-eso-1、癌胚抗原(h5t4)、前列腺干细胞抗原(psca)、前列腺特异性膜抗原(psma)、ror1、肿瘤相关糖蛋白72(tag-72)、血管内皮生长因子r2(vegf-r2)和wilms肿瘤蛋白(wt-1)、bcma、nkcs1、egf1r、egfr-viii、cd99、cd70、adgre2、ccr1、lilrb2、lilrb4、prame和erbb。
在某些实施方式中，hi-tcr结合cd19。在某些实施方式中，hi-tcr结合人cd19多肽。在某些实施方式中，人cd19多肽包含seqidno：11所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，hi-tcr结合至cd19蛋白的细胞外结构域。
在某些实施方式中，hi-tcr结合病原体抗原，例如用于治疗和/或预防病原体感染或其它感染性疾病，例如在免疫受损的受试者中。病原体的非限制性实例包括能够引起疾病的病毒、细菌、真菌、寄生虫和原生动物。
病毒的非限制性实例包括逆转录病毒科(retroviridae)(例如，人免疫缺陷病毒，例如hiv-1(也称为hdtv-iii、lave或htlv-iii/lav或hiv-iii；以及其它分离株，例如hiv-lp)；小rna病毒科(picornaviridae)(例如脊髓灰质炎病毒、甲型肝炎病毒、肠病毒、人柯萨奇病毒、鼻病毒、艾柯病毒)；杯状病毒科(calciviridae)(例如引起肠胃炎的菌株)；披膜病毒科(togaviridae)(例如马脑炎病毒、风疹病毒)；黄病毒科(flaviridae)(例如登革热病毒、脑炎病毒、黄热病毒)；冠状病毒科(coronoviridae)(例如冠状病毒)；弹状病毒科(rhabdoviridae)(例如水疱性口炎病毒、狂犬病病毒)；丝状病毒科(filoviridae)(例如埃博拉病毒)；副粘病毒科(paramyxoviridae)(例如副流感病毒、腮腺炎病毒、麻疹病毒、呼吸道合胞病毒)；正粘病毒科(orthomyxoviridae)(例如流行性感冒病毒)；布尼亚病毒科(bungaviridae)(例如汉坦病毒、bunga病毒、静脉病毒和奈拉病毒)；沙粒病毒科(arenaviridae)(出血热病毒)；呼肠病毒科(reoviridae)(例如呼肠孤病毒、奥比病毒(orbiviruses)和轮状病毒)；双rna病毒科(birnaviridae)；嗜肝dna病毒科(hepadnaviridae)(乙型肝炎病毒)；细小病毒科(parvoviridae)(细小病毒)；乳多空病毒科(papovaviridae)(乳头瘤病毒、多瘤病毒)；腺病毒科(adenoviridae)(大多数腺病毒)；疱疹病毒科(herpesviridae)(单纯疱疹病毒(hsv)1和2、水痘带状疱疹病毒、巨细胞病毒(cmv)、疱疹病毒)；痘病毒科(poxviridae)(天花病毒、牛痘病毒、痘病毒)；和虹膜病毒科(iridoviridae)(例如非洲猪瘟病毒)；以及未分类的病毒(例如，丁型肝炎的病原体(被认为是乙肝病毒的缺陷卫星)，非甲、非乙型肝炎的病原体(类1＝内部传播；类2＝经肠胃外传播(即，丙型肝炎)；诺沃克和相关病毒，以及星状病毒)。
细菌的非限制性实例包括葡萄球菌(staphylococci)、链球菌(streptococcus)、大肠杆菌(escherichiacoli)、假单胞菌属(pseudomonasspecies)和沙门氏菌属(salmonellaspecies)。感染性细菌的具体实例包括但不限于幽门螺杆菌(helicobacterpyloris)、伯氏疏螺旋体(boreliaburgdorferi)、嗜肺军团菌(legionellapneumophilia)、分枝杆菌属(mycobacteriasp.)(例如结核分枝杆菌(m.tuberculosis)、鸟分枝杆菌(m.avium)、胞内分枝杆菌(m.intracellulare)、堪萨斯分枝杆菌(m.kansaii)、戈登分枝杆菌(m.gordonae))、金黄色葡萄球菌(staphylococcusaureus)、奈瑟氏菌淋球菌(neisseriagonorrhoeae)、脑膜炎奈瑟氏球菌(neisseriameningitidis)、单核细胞增生性李斯特菌(listeriamonocytogenes)、化脓性链球菌(streptococcuspyogenes)(a组链球菌)、无乳链球菌(streptococcusagalactiae)(b组链球菌)、链球菌(viridans组)、粪链球菌(streptococcusfaecalis)、牛链球菌(streptococcusbovis)、链球菌(厌氧属)、肺炎链球菌(streptococcuspneumoniae)、致病性弯曲杆菌属(pathogeniccampylobactersp.)、肠球菌属(enterococcussp.)、流感嗜血杆菌(haemophilusinfluenzae)、无水芽孢杆菌(bacillusantracis)、白喉棒状杆菌(corynebacteriumdiphtheriae)、棒状杆菌属(corynebacteriumsp.)、红斑丹毒丝菌(erysipelothrixrhusiopathiae)、产气荚膜梭菌(clostridiumperfringers)、破伤风梭菌(clostridiumtetani)、产气肠杆菌(enterobacteraerogenes)、肺炎克雷伯菌(klebsiellapneumoniae)、多杀性巴斯德氏菌(pasturellamultocida)、拟杆菌属(bacteroidessp.)、具核梭杆菌(fusobacteriumnucleatum)、念珠状链杆菌(streptobacillusmoniliformis)、密螺旋体(treponemapallidium)、雅司螺旋体(treponemapertenue)、钩端螺旋体(leptospira)、立克次氏体(rickettsia)和衣氏放线菌(actinomycesisraelii)。
在某些实施方式中，病原体抗原是存在于巨细胞病毒(cmv)中的病毒抗原，存在于爱泼斯坦巴尔病毒(epsteinbarrvirus)(ebv)中的病毒抗原，存在于人类免疫缺陷病毒(hiv)中的病毒抗原或存在于流感病毒中的病毒抗原。
2.2.细胞外抗原结合结构域
在某些实施方式中，抗原结合链包含细胞外抗原结合结构域。在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域特异性地结合抗原，例如肿瘤抗原或病原体抗原，例如第2.1节中公开的那些。在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域能够与另一细胞外抗原结合结构域二聚化(例如，形成可变片段(fv))，其中二聚化的抗原结合结构域(例如fv)特异性地结合抗原，例如肿瘤抗原或病原体抗原。
在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域包含细胞表面受体的配体。在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域包含细胞表面配体的受体。
在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域特异性地结合抗原，例如肿瘤抗原或病原体抗原。在某些实施方式中，抗原结合链能够与另一抗原结合链形成二聚体。在某些实施方式中，hi-tcr包含异二聚体，其包含两条不同的抗原结合链。在某些实施方式中，hi-tcr包含同二聚体，其包含两条相同的抗原结合链。在某些实施方式中，抗原结合链通过一个或多个二硫键二聚化。在某些实施方式中，抗原结合链能够与一条或多条相同或不同的抗原结合链形成三聚体或寡聚体。在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域能够与另一细胞外抗原结合结构域二聚化(例如，形成可变片段(fv))，其中二聚化的抗原结合结构域(例如fv)特异性地结合抗原，例如肿瘤抗原或病原体抗原。
在某些非限制性实施方式中，hi-tcr的细胞外抗原结合结构域(例如fv或其类似物)与抗原结合的解离常数(kd)为约2×10-7m或更小。在某些实施方式中，kd为约2×10-7m或更小，约1×10-7m或更小，约9×10-8m或更小，约1×10-8m或更小，约9×10-9m或更小，约5×10-9m或更小，约4×10-9m或更小，约3×10-9m或更小，约2×10-9m或更小，或约1×10-9m或更小。在某些非限制性实施方式中，kd为约3×10-9m或更小。在某些非限制性实施方式中，kd为约1×10-9m至约3×10-7m。在某些非限制性实施方式中，kd为约1.5×10-9m至约3×10-7m。在某些非限制性实施方式中，kd为约1.5×10-9m至约2.7×10-7m。
细胞外抗原结合结构域(例如，fv或其类似物)的结合可以通过例如酶联免疫吸附测定法(elisa)、放射免疫测定法(ria)、facs分析法、生物测定法(例如生长抑制)或westernblot测定法来测定。这些测定法中的每一种通常通过采用对目标复合物具有特异性的标记试剂(例如抗体或fv)来检测特定目标蛋白质-抗体复合物的存在。例如，fv可以被放射性标记并用于放射免疫测定法(ria)(参见，例如，weintraub,b.，放射免疫测定的原理，放射配体测定技术的第七培训课程，内分泌学会，1986年3月，并入本文以供参考)。放射性同位素可通过诸如使用γ计数器或闪烁计数器的方法或通过放射自显影来检测。在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域用荧光标志物标记。荧光标志物的非限制性示例包括绿色荧光蛋白(gfp)、蓝色荧光蛋白(例如ebfp、ebfp2、azurite和mkalamal)、青色荧光蛋白(例如ecfp、cerulean和cypet)和黄色荧光蛋白(例如，yfp、citrine、venus和ypet)。
在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域包含tcr的抗原结合部分。
在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域包含抗体或其片段的抗原结合部分。在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域包含抗体的重链可变区(vh)和/或轻链可变区(vl)。在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域包含单链可变片段(scfv)。在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域包含仅重链抗体(vhh)。在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域包含任选交联的fab。在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域包含f(ab)2。在某些实施方式中，任何前述分子可包含在具有异源序列的融合蛋白中以形成细胞外抗原结合结构域。
在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域包含抗体的重链可变区(vh)和/或轻链可变区(vl)，其中vh或vl能够与包含vl或vh的另一细胞外抗原结合结构域二聚化(例如，形成可变片段(fv))。在某些实施方式中，fv是人fv。在某些实施方式中，fv是人源化的fv。在某些实施方式中，fv是鼠fv。在某些实施方式中，通过用抗原-fc融合蛋白筛选fv噬菌体文库来鉴定fv。
靶向目的抗原的其它细胞外抗原结合结构域可以通过对靶向相同抗原的现有抗体的现有scfv或fab区进行测序而获得。
在某些实施方式中，本公开的hi-tcr的二聚化的细胞外抗原结合结构域是鼠fv。在某些实施方式中，二聚化的细胞外抗原结合结构域是与人cd19多肽结合的fv。在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域是fv，其包含seqidno：9的氨基酸序列，并特异性结合人cd19多肽(例如，包含seqidno：11所示的氨基酸序列的人cd19多肽)。在某些实施方式中，编码seqidno：9的氨基酸序列的核苷酸序列如seqidno：10所示。
在某些实施方式中，fv包含重链可变区(vh)，其包含如seqidno：7所示的氨基酸序列。在某些实施方式中，fv包含轻链可变区(vl)，其包含如seqidno：8所示的氨基酸序列。在某些实施方式中，fv包含vh和vl，其中vh包含如seqidno：7所示的氨基酸序列，vl包含如seqidno：8所示的氨基酸序列。在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域包含vh，其包含与seqidno：7具有至少约80％(例如，至少约85％、至少约90％或至少约95％)同源性或同一性的氨基酸序列。例如，细胞外抗原结合结构域包含vh，其包含与seqidno：7具有至少约80％、约81％、约82％、约83％、约84％、约85％、约86％、约87％、约88％、约89％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％同源性或同一性的氨基酸序列。在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域包含vh，其包含如seqidno：7所示的氨基酸序列。在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域包含vl，其包含与seqidno：8具有至少约80％(例如，至少约85％、至少约90％或至少约95％)同源性的氨基酸序列。例如，细胞外抗原结合结构域包含vl，其包含与seqidno：8具有至少约80％、约81％、约82％、约83％、约84％、约85％、约86％、约87％、约88％、约89％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％同源性或同一性的氨基酸序列。在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域包含vl，其包含如seqidno：8所示的氨基酸序列。某些实施方式，细胞外抗原结合结构域包含vh和vl，vh包含与seqidno：7具有至少约80％(例如，至少约85％、至少约90％或至少约95％)同源性的氨基酸序列，vl包含与seqidno：8具有至少约80％(例如，至少约85％、至少约90％或至少约95％)同源性或同一性的氨基酸序列。在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域包含含有如seqidno：7所示氨基酸序列的vh和含有如seqidno：8所示氨基酸序列的vl。
在某些实施方式中，fv包含重链可变区(vh)，其包含如seqidno：44所示的氨基酸序列。在某些实施方式中，fv包含轻链可变区(vl)，其包含如seqidno：45所示的氨基酸序列。在某些实施方式中，fv包含vh和vl，其中vh包含如seqidno：44所示的氨基酸序列，vl包含如seqidno：45所示的氨基酸序列。在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域包含vh，其包含与seqidno：44具有至少约80％(例如，至少约85％、至少约90％或至少约95％)同源性或同一性的氨基酸序列。例如，细胞外抗原结合结构域包含vh，其包含与seqidno：44具有至少约80％、约81％、约82％、约83％、约84％、约85％、约86％、约87％、约88％、约89％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％同源性或同一性的氨基酸序列。在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域包含vh，其包含如seqidno：44所示的氨基酸序列。在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域包含vl，其包含与seqidno：45具有至少约80％(例如，至少约85％、至少约90％或至少约95％)同源性的氨基酸序列。例如，细胞外抗原结合结构域包含vl，其包含与seqidno：45具有至少约80％、约81％、约82％、约83％、约84％、约85％、约86％、约87％、约88％、约89％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％同源性或同一性的氨基酸序列。在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域包含vl，其包含如seqidno：45所示的氨基酸序列。某些实施方式，细胞外抗原结合结构域包含vh和vl，vh包含与seqidno：44具有至少约80％(例如，至少约85％、至少约90％或至少约95％)同源性的氨基酸序列，vl包含与seqidno：45具有至少约80％(例如，至少约85％、至少约90％或至少约95％)同源性或同一性的氨基酸序列。在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域包含含有如seqidno：44所示氨基酸序列的vh和含有如seqidno：45所示氨基酸序列的vl。
在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域包含含有如seqidno：1所示氨基酸序列或其保守修饰的vhcdr1，含有如seqidno：2所示氨基酸序列或其保守修饰的vhcdr2和含有如seqidno：3所示氨基酸序列或其保守修饰的vhcdr3。在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域包含含有如seqidno：1所示氨基酸序列的vhcdr1，含有如seqidno：2所示氨基酸序列的vhcdr2和含有如seqidno：3所示氨基酸序列的vhcdr3。在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域包含含有如seqidno：4所示氨基酸序列或其保守修饰的vlcdr1，含有如seqidno：5所示氨基酸序列或其保守修饰的vlcdr2和含有如seqidno：6所示氨基酸序列或其保守修饰的vlcdr3。在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域包含含有如seqidno：4所示氨基酸序列的vlcdr1，含有如seqidno：5所示氨基酸序列的vlcdr2和含有如seqidno：6所示氨基酸序列的vlcdr3。在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域包含含有如seqidno：1所示氨基酸序列或其保守修饰的vhcdr1，含有如seqidno：2所示氨基酸序列或其保守修饰的vhcdr2，含有如seqidno：3所示氨基酸序列或其保守修饰的vhcdr3，含有如seqidno：4所示氨基酸序列或其保守修饰的vlcdr1，含有如seqidno：5所示氨基酸序列或其保守修饰的vlcdr2和含有如seqidno：6所示氨基酸序列或其保守修饰的vlcdr3。在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域包含含有如seqidno：1所示氨基酸序列的vhcdr1，含有如seqidno：2所示氨基酸序列的vhcdr2，含有如seqidno：3所示氨基酸序列的vhcdr3，含有如seqidno：4所示氨基酸序列的vlcdr1，含有如seqidno：5所示氨基酸序列的vlcdr2和含有如seqidno：6所示氨基酸序列的vlcdr3。
表1
如本文所用，术语“保守序列修饰”是指不显著影响或改变本公开的包含氨基酸序列的hi-tcr的结合特征的氨基酸修饰。保守修饰可以包括氨基酸取代、添加和缺失。可以通过本领域已知的标准技术(例如定点诱变和pcr介导的诱变)将修饰引入本公开的hi-tcr的fv中。氨基酸可根据其物理化学性质(例如电荷和极性)分为几组。保守氨基酸取代是其中氨基酸残基被相同组内的氨基酸取代的氨基酸取代。例如，氨基酸可以按电荷分类：带正电荷的氨基酸包括赖氨酸、精氨酸、组氨酸，带负电荷的氨基酸包括天冬氨酸、谷氨酸，中性电荷氨基酸包括丙氨酸、天冬酰胺、半胱氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸，异亮氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸。另外，氨基酸可以按极性分类：极性氨基酸包括精氨酸(碱性极性)、天冬酰胺、天冬氨酸(酸性极性)、谷氨酸(酸性极性)、谷氨酰胺、组氨酸(碱性极性)、赖氨酸(碱性极性)、丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸；非极性氨基酸包括丙氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、色氨酸和缬氨酸。因此，cdr区内的一个或更多个氨基酸残基可以被来自相同组的其它氨基酸残基替换，并且可以使用本文所述的功能测定法测试改变的抗体的保留功能(即，上述(c)至(l)中列出的功能)。在某些实施方式中，在指定序列或cdr区内不超过一个、不超过两个、不超过三个、不超过四个、不超过五个残基被改变。
相对于指定序列，含有与指定序列(例如，seqidno：7和8)具有至少约80％、至少约85％、至少约90％或至少约95％(例如，约81％、约82％、约83％、约84％、约85％、约86％、约87％、约88％、约89％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％)同源性的vh和/或vl氨基酸序列可以包含取代(例如，保守取代)、插入或缺失，但保留结合靶抗原(例如，cd19)的能力。在某些实施方式中，在指定序列(例如，seqidno：7和8)中，总共1至10个氨基酸被取代、插入和/或缺失。在某些实施方式中，取代、插入或缺失发生在细胞外抗原结合结构域的cdr之外的区(例如，在fr中)。在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域包含选自seqidno：7和8(包括该序列(seqidno：7和8)的翻译后修饰)中的vh和/或vl序列。
如本文所用，两个氨基酸序列之间的同源性百分比等同于两个序列之间的同一性百分比。两个序列之间的同一性百分比是该序列共享的相同位置数的函数(即，％同源性＝相同位置数#/位置总数#×100)，其中考虑了空位数和每个空位的长度，需要引入这些空位以实现两个序列的最佳比对。序列的比较和两个序列之间同一性百分比的确定可以使用数学算法来完成。
可以使用e.meyers和w.miller(comput.appl.biosci.,4:11-17(1988))的算法确定两个氨基酸序列之间的同源性百分比，该算法已合并到align程序(2.0版)中)，使用pam120重量残基表，空位长度罚分为12，空位罚分为4。此外，两个氨基酸序列之间的同源性百分比可以使用needleman和wunsch(j.mol.biol.48:444-453(1970))算法来确定，该算法已被整合到gcg软件包(可从www.gcg.com获得)中的gap程序中，使用blossum62矩阵或pam250矩阵，并且空位权重为16、14、12、10、8、6或4，长度权重为1、2、3、4、5或6。
另外或可替代地，本公开的主题的氨基酸序列可以进一步用作“查询序列”以对公共数据库进行搜索以例如识别相关序列。可以使用altschul等((1990)j.mol.biol.215:403-10)的xblast程序(2.0版)执行这种搜索。可以使用xblast程序进行blast蛋白质搜索，得分＝50，字长＝3，以获得与本文公开的指定序列(例如，scfvm903，m904，m905，m906和m900的重链和轻链可变区序列)同源的氨基酸序列。为了获得用于比较目的的空位比对，可以如altschul等，(1997)nucleicacidsres.25(17):3389-3402中所述使用gappedblast。当使用blast和gappedblast程序时，可以使用各个程序(例如xblast和nblast)的默认参数。
2.3.恒定结构域
在某些实施方式中，抗原结合链还包含恒定结构域。在某些实施方式中，恒定结构域包含铰链/间隔区和跨膜结构域。在某些实施方式中，恒定结构域能够与另一恒定结构域形成同二聚体或异二聚体。在某些实施方式中，恒定结构域通过一个或多个二硫键二聚化。在某些实施方式中，抗原结合链能够形成具有一个或多个相同或不同的恒定结构域的三聚体或寡聚体。
在某些非限制性实施方式中，恒定结构域包含t细胞受体恒定区，例如t细胞受体α恒定区(trac)、t细胞受体β恒定区(trbc，例如trbc1或trbc2)、t细胞受体γ恒定区(trgc，例如trgc1或trgc2)、t细胞受体δ恒定区(trdc)或其任何变体或功能片段。
在某些实施方式中，本公开的hi-tcr的恒定结构域包含天然或修饰的trac肽。在某些实施方式中，trac多肽包含与seqidno：38所示的氨基酸序列(下文提供)具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或至少约100％同源性或同一性的氨基酸序列或其片段，和/或可任选地包含至多一个或至多两个或至多三个保守氨基酸取代。
在某些实施方式中，trac多肽具有与由ncbigenbankid：28755，ng_001332.3，925603至930229的基因(下文提供的seqidno：29)表达的转录物编码的氨基酸序列具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或至少约100％同源性或同一性的氨基酸序列或其片段，和/或可任选地包含至多一个或至多两个或至多三个保守氨基酸取代。
根据本公开的主题，“trac核酸分子”是指编码trac多肽的多核苷酸。
在某些实施方式中，本公开的hi-tcr的恒定结构域包含天然或修饰的trbc肽。在某些实施方式中，本公开的hi-tcr的恒定结构域包含天然或修饰的trbc2肽。在某些实施方式中，trbc2多肽包含与下文提供的seqidno：39所示的氨基酸序列具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或至少约100％同源性或同一性的氨基酸序列或其片段，和/或可任选地包含至多一个或至多两个或至多三个保守氨基酸取代。
在某些实施方式中，本公开的hi-tcr的恒定结构域包含天然或修饰的trbc1肽。在某些实施方式中，trbc1多肽包含与下文提供的seqidno：40所示的氨基酸序列具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或至少约100％同源性或同一性的氨基酸序列或其片段，和/或可任选地包含至多一个或至多两个或至多三个保守氨基酸取代。
在某些实施方式中，trbc多肽具有与由ncbigenbankid：28639，ng_001333.2，645749至647196(trbc1，seqidno：30)，ncbigenbankid：28638，ng_001333.2，655095至656583(trbc2，seqidno：31)的基因表达的转录物编码的氨基酸序列具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或至少约100％同源性或同一性的氨基酸序列或其片段，和/或可任选地包含至多一个或至多两个或至多三个保守氨基酸取代。
根据本公开的主题，“trbc核酸分子”是指编码trbc多肽的多核苷酸。
在某些实施方式中，本公开的hi-tcr的恒定结构域包含天然或修饰的trgc肽。在某些实施方式中，本公开的hi-tcr的恒定结构域包含天然或修饰的trgc1肽。在某些实施方式中，trgc1多肽具有与下文提供的seqidno：42所示的氨基酸序列具有至少约85％、约90％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或100％同源性或同一性的氨基酸序列。
在某些实施方式中，本公开的hi-tcr的恒定结构域包含天然或修饰的trgc2肽。在某些实施方式中，trgc2多肽具有与下文提供的seqidno：43所示的氨基酸序列具有至少约85％、约90％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或100％同源性或同一性的氨基酸序列。
在某些实施方式中，trgc多肽具有与由ncbigenbankid：6966，ng_001336.2，108270至113860(trgc1，seqidno：32)，ncbigenbankid：6967，ng_001336.2，124376至133924(trgc2，seqidno：33)的基因表达的转录物编码的氨基酸序列具有至少约85％、约90％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或100％同源性或同一性的氨基酸序列或其片段，和/或可任选地包含至多一个或至多两个或至多三个保守氨基酸取代。
根据本公开的主题，“trgc核酸分子”是指编码trgc多肽的多核苷酸。
在某些实施方式中，本公开的hi-tcr的恒定结构域包含天然或修饰的trdc肽。在某些实施方式中，trdc多肽具有与下文提供的seqidno：41所示的氨基酸序列具有至少约85％、约90％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或100％同源性或同一性的氨基酸序列。
在某些非限制性实施方式中，t细胞受体恒定区包含将细胞外抗原结合结构域连接至恒定结构域的铰链/间隔区。铰链/间隔区可以足够柔韧性以允许抗原结合结构域在不同方向上定向以促进抗原识别。在某些非限制性实施方式中，铰链/间隔区可以是来自igg1的铰链区，或者是免疫球蛋白的ch2ch3区和cd3的部分，cd28多肽的部分，cd8多肽的部分，与前述任一项具有至少约80％、至少约85％、至少约90％或至少约95％的同源性或同一性的变体，或合成的间隔序列。在某些非限制性实施方式中，car的铰链/间隔区可包含cd3ζ多肽、cd40多肽、4-1bb多肽、ox40多肽、cd166肽、cd166肽、cd8a肽、cd8b肽、icos多肽、icam-1肽、ctla-4肽、合成肽(不基于与免疫应答相关的蛋白质)、或其组合的天然或修饰的铰链区。
2.4.细胞内信号传导结构域
在某些非限制性实施方式中，本公开的hi-tcr包含抗原结合链，其不包含细胞内结构域。在某些实施方式中，抗原结合链能够与cd3ζ多肽缔合。在某些实施方式中，抗原结合链包含恒定结构域，其能够与cd3ζ多肽缔合。在某些实施方式中，cd3ζ多肽是内源性的。在某些实施方式中，cd3ζ多肽是外源性的。在某些实施方式中，抗原结合链与抗原的结合能够激活与抗原结合链缔合的cd3ζ多肽。在某些实施方式中，外源性cd3ζ多肽与本文公开的共刺激分子融合或整合。
在某些非限制性实施方式中，本公开的hi-tcr包含抗原结合链，其包含细胞内结构域。在某些实施方式中，细胞内结构域包含cd3ζ多肽。在某些实施方式中，抗原结合链与抗原的结合能够激活抗原结合链的cd3ζ多肽。
激活的cd3ζ多肽可激活和/或刺激免疫应答细胞(例如，淋巴谱系的细胞，例如t细胞)。cd3ζ包含三个免疫受体酪氨酸激活基序(itam1、itam2和itam3)、三个富碱性拉伸区(brs)(brs1、brs2和brs3)，并在抗原与抗原结合链结合后将激活信号传递至细胞(例如，淋巴谱系的细胞，例如t细胞)。cd3ζ链的细胞内信号传导结构域是来自内源性tcr的主要信号传递者。在某些实施方式中，cd3ζ多肽包含或具有与具有ncbi参考编号：np_932170(seqidno：17)，ncbi参考编号：np_000725.1(seqidno：18)的序列具有至少约85％、约90％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或约100％同源性的氨基酸序列或其片段，和/或可任选地包含至多一个或至多两个或至多三个保守氨基酸取代。在某些非限制性实施方式中，cd3ζ多肽包含或具有的氨基酸序列是seqidno：17的连续部分，其长度为至少20个、或至少30个、或至少40个、或至少50个，且至多为164个氨基酸。替代地或另外地，在非限制性的各种实施方式中，cd3ζ多肽包含或具有seqidno：17的氨基酸1至164、1至50、50至100、100至150或150至164的氨基酸序列。在某些实施方式中，cd3ζ多肽包含或具有seqidno：17的氨基酸52至164的氨基酸序列。
seqidno：17提供如下：
在某些实施方式中，细胞内信号传导结构域包含人cd3ζ多肽。人cd3ζ多肽可包含或具有与下文提供的seqidno：18具有至少约85％、约90％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或约100％同源性或同一性的氨基酸序列或其片段，和/或可任选地包含至多一个或至多两个或至多三个保守氨基酸取代。
编码seqidno：18的氨基酸序列的示例性核酸序列如seqidno：19所示，提供如下。
2.4.1.共刺激区
在某些非限制性实施方式中，本公开的hi-tcr包含抗原结合链，其包含细胞内结构域，其中细胞内结构域包含共刺激区。在某些实施方式中，细胞内结构域包含共刺激区和cd3ζ多肽。在某些实施方式中，细胞内结构域包含共刺激区并且不包含cd3ζ多肽。
在某些实施方式中，所述共刺激区包含至少一种共刺激分子，其可以提供最佳的淋巴细胞激活。如本文所用，“共刺激分子”是指淋巴细胞对抗原的有效应答所需的除抗原受体或其配体以外的细胞表面分子。该至少一个共刺激信号传导区可包括cd28多肽、4-1bb多肽、ox40多肽、icos多肽、dap-10多肽、或其组合。共刺激分子可以与共刺激配体结合，该共刺激配体是在细胞表面表达的蛋白质，与受体结合后会产生共刺激应答，即影响当抗原与它的car分子结合时产生的刺激的细胞内应答。共刺激配体包括但不限于cd80、cd86、cd70、ox40l和4-1bbl。作为一个实例，4-1bb配体(即4-1bbl)可以结合4-1bb(也称为“cd137”)以提供细胞内信号，该细胞内信号与car信号一起诱导car+t细胞的效应细胞功能。在美国专利7,446,190(整体并入本文以供参考)中公开了包含细胞内信号传导结构域的car，该细胞内信号传导结构域包含具有4-1bb、icos或dap-10的共刺激信号传导区。
在某些实施方式中，hi-tcr的抗原结合链的共刺激区包含共刺激信号传导区，其包含cd28多肽。cd28多肽可包含或具有与具有ncbi参考编号：p10747或np_006130(seqidno：20)的序列具有至少约85％、约90％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或100％同源性或同一性的氨基酸序列或其片段，和/或可任选地包含至多一个或至多两个或至多三个保守氨基酸取代。在非限制性的某些实施方式中，cd28多肽包含或具有的氨基酸序列是seqidno：20的连续部分，其长度为至少20个、或至少30个、或至少40个、或至少50个，且至多为220个氨基酸。替代地或另外地，在非限制性的各种实施方式中，cd28多肽包含或具有seqidno：20的氨基酸1至220、1至50、50至100、100至150、114至220、150至200或200至220的氨基酸序列。在某些实施方式中，共刺激区包含共刺激信号传导区，其包含cd28多肽，该cd28多肽包含或具有seqidno：20的氨基酸180至220的氨基酸序列。
在某些实施方式中，共刺激区包含cd28的人细胞内信号传导结构域。cd28的人细胞内信号传导结构域可包含或具有与seqidno：21具有至少约85％、约90％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或约100％同源性或同一性的氨基酸序列或其片段，和/或可任选地包含至多一个或至多两个或至多三个保守氨基酸取代。seqidno：21提供如下：
编码seqidno：21的氨基酸序列的示例性核酸序列如seqidno：22所示，提供如下。
在某些实施方式中，共刺激区包含含有两个共刺激分子的共刺激信号传导区，例如，cd28和4-1bb的共刺激信号传导区或者cd28和ox40的共刺激信号传导区。
4-1bb可以充当肿瘤坏死因子(tnf)配体并具有刺激活性。4-1bb多肽可包含或具有与具有ncbi参考编号：p41273或np_001552(seqidno：23)的序列具有至少约85％、约90％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或约100％同源性或同一性的氨基酸序列或其片段，和/或可任选地包含至多一个或至多两个或至多三个保守氨基酸取代。
seqidno：23提供如下：
根据本公开的主题，“4-1bb核酸分子”是指编码4-1bb多肽的多核苷酸。
在某些实施方式中，共刺激区包含4-1bb的细胞内信号传导结构域。4-1bb的细胞内信号传导结构域可包含或具有与seqidno：24具有至少约85％、约90％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或约100％同源性或同一性的氨基酸序列或或其片段，和/或可任选地包含至多一个或至多两个或至多三个保守氨基酸取代。seqidno：24提供如下：
编码seqidno：24的氨基酸序列的示例性核酸序列如seqidno：27所示，提供如下。
ox40多肽可包含或具有与具有ncbi参考编号：p43489或np_003318(seqidno：25)的序列具有至少约85％、约90％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或约100％同源性或同一性的氨基酸序列或其片段，和/或可任选地包含至多一个或至多两个或至多三个保守氨基酸取代。
seqidno：25提供如下：
根据本公开的主题，“ox40核酸分子”是指编码ox40多肽的多核苷酸。
icos多肽可包含或具有与具有ncbi参考编号：np_036224(seqidno：26)的序列具有至少约85％、约90％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或约100％同源性或同一性的氨基酸序列或其片段，和/或可任选地包含至多一个或至多两个或至多三个保守氨基酸取代。
seqidno：26提供如下：
根据本公开的主题，“icos核酸分子”是指编码icos多肽的多核苷酸。
在某些实施方式中，来自不同蛋白质的car的结构域/基序/区域之间的突变位点和/或接合点被去免疫。可以使用netmhc4.0server预测不同car部分之间的接合点的免疫原性。对于每个含有来自下一个部分的至少1个氨基酸的肽，可以预测对所有等位基因与hlaa、b和c的结合亲和力。每个肽的免疫原性得分可以被分配给每个肽。免疫原性得分可以使用公式计算：免疫原性得分＝[(50-结合亲和力)*hla频率]n。n是每个肽的预测数。
2.5.cd3复合物
在某些实施方式中，本公开的hi-tcr能够与cd3复合物(也称为“t细胞共受体”)缔合。在某些实施方式中，hi-tcr和cd3复合物形成类似于天然tcr/cd3复合物的抗原识别受体复合物。在某些实施方式中，cd3复合物是内源性的。在某些实施方式中，cd3复合物是外源性的。在某些实施方式中，本公开的hi-tcr替代了cd3/tcr复合物中的天然和/或内源性tcr。在某些实施方式中，cd3复合物包含cd3γ链、cd3δ链和两条cd3ε链。
在某些实施方式中，cd3γ链包含或具有与ncbi参考编号：np_000064.1(seqidno：34，提供如下)具有至少约85％、约90％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或约100％同源性或同一性的氨基酸序列或其片段，和/或可任选地包含至多一个或至多两个或至多三个保守氨基酸取代。
在某些实施方式中，cd3δ链包含或具有与ncbi参考编号：np_000723.1(seqidno：35，提供如下)，np_001035741.1(seqidno：36，提供如下)具有至少约85％、约90％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或约100％同源性或同一性的氨基酸序列或其片段，和/或可任选地包含至多一个或至多两个或至多三个保守氨基酸取代。
在某些实施方式中，cd3ε链包含或具有与ncbi参考编号：np_000724.1(seqidno：37，提供如下)具有至少约85％、约90％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或约100％同源性或同一性的氨基酸序列或其片段，和/或可任选地包含至多一个或至多两个或至多三个保守氨基酸取代。
在某些实施方式中，重组tcr比靶向相同抗原的car表现出更高的抗原敏感性。在某些实施方式中，重组tcr在与肿瘤细胞表面上具有低密度的抗原结合时能够诱导免疫应答。在某些实施方式中，包含本公开的hi-tcr的免疫应答细胞可以用于治疗具有表面抗原低表达水平的肿瘤细胞的受试者，例如由于疾病的复发，其中该受试者接受过导致残留的肿瘤细胞的治疗。在某些实施方式中，肿瘤细胞在肿瘤细胞表面上具有低密度的靶分子。在某些实施方式中，在细胞表面上具有低密度的靶分子的密度为每个细胞小于约5,000个分子，每个细胞小于约4,000个分子，每个细胞小于约3,000个分子，每个细胞小于约2,000个分子，每个细胞少于约1,500个分子，每个细胞少于约1,000个分子，每个细胞少于约500个分子，每个细胞少于约200个分子，或者每个细胞少于约100个分子。在某些实施方式中，在细胞表面上具有低密度的靶分子的密度为每个细胞小于约2,000个分子。在某些实施方式中，在细胞表面上具有低密度的靶分子的密度为每个细胞小于约1,500个分子。在某些实施方式中，在细胞表面上具有低密度的靶分子的密度为每个细胞小于约1,000个分子。在某些实施方式中，在细胞表面上具有低密度的靶分子的密度为每个细胞约4,000个分子至每个细胞约2,000个分子，每个细胞约2,000个分子至每个细胞约1,000个分子，每个细胞约1,500个分子至每个细胞约1,000个分子，每个细胞约2,000个分子至每个细胞约500个分子，每个细胞约1,000个分子至每个细胞约200个分子，或每个细胞约1,000个分子至每个细胞约100个分子。
2.6.hi-tcr19
在某些实施方式中，本公开的hi-tcr包含两条能够二聚化的抗原结合链，例如vl-trac和vh-trbc，其中hi-tcr结合cd19(例如人cd19)。
vl-trac
在某些实施方式中，本公开的hi-tcr包含抗原结合链，其包含抗体的vl结构域的细胞外抗原结合结构域和trac的恒定结构域。在某些实施方式中，抗体结合cd19(例如人cd19)。在某些实施方式中，抗原结合链命名为“vl-trac”。
vh-trbc
在某些实施方式中，本公开的hi-tcr包含抗原结合链，其包含抗体的vh结构域的细胞外抗原结合结构域和trbc的恒定结构域。在某些实施方式中，抗体结合cd19(例如人cd19)。在某些实施方式中，抗原结合链命名为“vh-trbc”。
3.免疫应答细胞
本公开的主题提供包含本公开的hi-tcr的免疫应答细胞。在某些实施方式中，hi-tcr能够激活免疫应答细胞。结合抗原后，免疫应答细胞对携带抗原的细胞表现出细胞溶解作用。在某些实施方式中，与包含靶向相同抗原的嵌合抗原受体(car)的细胞相比，包含hi-tcr的免疫应答细胞表现出相当或更好的治疗效力。在某些实施方式中，与包含靶向相同抗原的嵌合抗原受体(car)的细胞相比，包含hi-tcr的免疫应答细胞表现出相当或更好的细胞溶解作用。在某些实施方式中，包含hi-tcr的免疫应答细胞分泌抗肿瘤细胞因子。免疫应答细胞分泌的细胞因子包括但不限于tnfα、ifnγ和il2。
本公开的主题的免疫应答细胞可以是淋巴谱系的细胞。包括b、t和自然杀伤(nk)细胞的淋巴谱系提供抗体的产生、细胞免疫系统的调节、血液中外源试剂的检测、宿主外源细胞的检测等。淋巴谱系的免疫应答细胞的非限制性实例包括t细胞、自然杀伤t(nkt)细胞及其前体包括胚胎干细胞和多能干细胞(例如，可以从中分化成淋巴样细胞的那些)。t细胞可以是在胸腺中成熟的淋巴细胞，主要负责细胞介导的免疫。t细胞参与适应性免疫系统。本公开主题的t细胞可以是任何类型的t细胞，包括但不限于辅助t细胞、细胞毒性t细胞、记忆t细胞(包括中央记忆t细胞、干细胞样记忆t细胞(或干样记忆t细胞)、和两种效应记忆t细胞：例如tem细胞和temra细胞)、调节性t细胞(也称为抑制性t细胞)、自然杀伤性t细胞、粘膜相关性不变t细胞和γδt细胞。细胞毒性t细胞(ctl或杀伤性t细胞)是能够诱导被感染的体细胞或肿瘤细胞死亡的t淋巴细胞的一个子集。患者自身的t细胞可以被基因改造以通过hi-tcr的引入靶向特定的抗原。在某些实施方式中，免疫应答细胞是t细胞。该t细胞可以是cd4+t细胞或cd8+t细胞。在某些实施方式中，t细胞是cd8+t细胞。
在某些实施方式中，免疫应答细胞包含外源性或重组的(例如，用以转导细胞)至少一种共刺激配体。在某些实施方式中，免疫应答细胞共表达hi-tcr和至少一种外源性共刺激配体。hi-tcr与至少一种外源性共刺激配体之间的相互作用提供非抗原特异性信号，该信号对于免疫应答细胞(例如t细胞)的完全激活是重要的。共刺激性配体包括但不限于肿瘤坏死因子(tnf)超家族成员和免疫球蛋白(ig)超家族配体。tnf是一种参与全身性炎症的细胞因子，可刺激急性期反应。它的主要作用是调节免疫细胞。tnf超家族成员共享许多共同特征。tnf超家族的大多数成员都被合成为ii型跨膜蛋白(细胞外c端)，包含较短的细胞质片段和相对较长的胞外区。tnf超家族成员包括但不限于神经生长因子(ngf)、cd40l(cd40l)/cd154、cd137l/4-1bbl、tnf-α、cd134l/ox40l/cd252、cd27l/cd70、fas配体(fasl)、cd30l/cd153、肿瘤坏死因子β(tnfβ)/淋巴毒素α(ltα)、淋巴毒素β(ltβ)、cd257/b细胞激活因子(baff)/blys/thank/tall-1、糖皮质激素诱导tnf受体配体(gitrl)和tnf相关凋亡诱导配体(trail)、light(tnfsf14)。免疫球蛋白(ig)超家族是一大组细胞表面和可溶性蛋白，它们参与细胞的识别、结合或粘附过程。这些蛋白质与免疫球蛋白共享结构特征-它们具有免疫球蛋白结构域(折叠)。免疫球蛋白超家族配体包括但不限于cd80和cd86，这两个都是cd28的配体。在某些实施方式中，至少一种共刺激性配体选自4-1bbl、cd275、cd80、cd86、cd70、ox40l、cd48、tnfrsf14、及其组合。在某些实施方式中，免疫应答细胞包含一种外源性或重组的共刺激配体或由其组成。在某些实施方式中，一种外源性或重组的共刺激配体是4-1bbl或cd80。在某些实施方式中，一种外源性或重组的共刺激配体是4-1bbl。在某些实施方式中，免疫应答细胞包含两种外源性或重组的共刺激配体或由其组成。在某些实施方式中，两种外源性或重组的共刺激配体是4-1bbl和cd80。
在某些实施方式中，免疫应答细胞可以包含至少一种嵌合共刺激受体(ccr)或用其转导。如本文所用，术语“嵌合共刺激受体”或“ccr”是指与抗原结合并且在其与抗原结合后向包含ccr的细胞(例如，t细胞)提供共刺激信号，但不会单独向细胞提供激活信号的嵌合受体。ccr描述于krause等人，j.exp.med.(1998)；188(4):619-626和us20020018783，将其整体并入以供参考。ccr模仿共刺激信号，但与car不同的是，ccr不提供t细胞激活信号，例如ccr缺少cd3ζ多肽。在抗原递呈细胞上不存在天然共刺激配体的情况下，ccr提供共刺激，例如cd28样信号。组合抗原识别，即ccr与car结合使用，可增强针对表达双抗原的t细胞的t细胞反应性，从而改善选择性肿瘤靶向。参见wo2014/055668，将其整体并入以供参考。kloss等人描述了一种策略，该策略整合了组合抗原识别，分裂信号传导以及至关重要的平衡强度的t细胞激活和共刺激，从而生成t细胞，该t细胞消除表达抗原组合的靶细胞，同时保留单独表达每种抗原的细胞(kloss等人,naturebiotechnololgy(2013)；31(1):71-75，其内容整体并入本文以供参考)。通过这种方法，t细胞激活需要car介导的一种抗原的识别，而共刺激是由对第二种抗原具有特异性的ccr独立介导的。为了达到肿瘤的选择性，组合抗原识别方法将t细胞激活的效率降低到在没有通过同时ccr识别第二种抗原提供恢复的情况下无效的水平。
在某些实施方式中，ccr包含与第二抗原结合的细胞外抗原结合结构域、跨膜结构域和包含至少一个共刺激分子的共刺激信号传导区。在某些实施方式中，ccr不单独向细胞递送激活信号。共刺激分子的非限制性实例包括cd28、4-1bb、ox40、icos、dap-10、及其任意组合。在某些实施方式中，ccr的共刺激信号传导区包含一种共刺激信号传导分子。在某些实施方式中，一种共刺激信号传导分子是cd28。在某些实施方式中，一种共刺激信号传导分子是4-1bb。在某些实施方式中，ccr的共刺激信号传导区包含两种共刺激信号传导分子。在某些实施方式中，两种共刺激信号传导分子是cd28和4-1bb。选择第二抗原，使得第一抗原和第二抗原的表达都限于靶细胞(例如，癌组织或癌细胞)。与car类似，细胞外抗原结合结构域可以是scfv、fab、f(ab)2或具有异源序列以形成细胞外抗原结合结构域的融合蛋白。
在某些实施方式中，ccr与hi-tcr共表达，hi-tcr结合的抗原不同于ccr结合的抗原，例如，hi-tcr结合第一抗原而ccr结合第二抗原。
本公开主题的人淋巴细胞的类型包括但不限于外周供体淋巴细胞，例如在sadelain,m.等,2003,natrevcancer3:35-45(公开了经遗传修饰以表达car的外周供体淋巴细胞)，在morgan,r.a.等,2006science314:126-129(公开了经遗传修饰以表达包含α和β异二聚体的全长肿瘤抗原识别性t细胞受体复合物的外周供体淋巴细胞)，在panelli,m.c.,等.2000jimmunol164:495-504；panelli,m.c.,等.2000jimmunol164:4382-4392(公开了在肿瘤活组织检查中衍生自肿瘤浸润淋巴细胞(til)的淋巴细胞培养物)和在dupont,j.,等.2005cancerres65:5417-5427；papanicolaou,g.a.,等.2003blood102:2498-2505(选择性地公开了使用人工抗原递呈细胞(aapc)或脉冲树突状细胞在体外扩增的抗原特异性外周血白细胞)中公开的那些。免疫应答细胞(例如，t细胞)可以是自体的、非自体的(例如，同种异体的)、或者是体外从工程化的祖细胞或干细胞衍生的。
本公开的免疫应答细胞能够调节肿瘤微环境。肿瘤具有对宿主免疫应答敌对的微环境，该微环境涉及恶性细胞保护自身免受免疫识别和消除的一系列机制。这种“敌对的肿瘤微环境”包含多种免疫抑制因子，其包括浸润性调节性cd4+t细胞(tregs)、髓样衍生抑制细胞(mdsc)、肿瘤相关巨噬细胞(tam)、包括tgf-b在内的免疫抑制细胞因子、以及靶向由激活的t细胞表达的免疫抑制受体(ctla-4和pd-1)的配体的表达。这些免疫抑制机制在维持耐受性和抑制不适当的免疫应答中起作用，但是在肿瘤微环境内，这些机制阻止了有效的抗肿瘤免疫应答。这些免疫抑制因子在遇到目标肿瘤细胞后，可以共同诱导过继转移的car修饰的t细胞明显的无反应性或凋亡。
未纯化的ctl来源可以是本领域已知的任何来源，例如骨髓、胎儿、新生儿或成年或其它造血细胞来源，例如胎儿肝、外周血或脐带血。可以采用各种技术来分离细胞。例如，阴性选择法可以最初去除非ctl。mab对于鉴定与特定细胞谱系和/或阳性和阴性选择的分化阶段相关的标志物特别有用。
最初可以通过相对粗略的分离除去大部分末端分化的细胞。例如，最初可以使用磁珠分离来去除大量不相关的细胞。在某些实施方式中，在分离细胞之前将去除总造血细胞的至少约80％，通常至少约70％。
分离的程序包括但不限于密度梯度离心；重置；偶联至改变细胞密度的颗粒；用抗体包被的磁珠进行磁分离；亲和色谱；与mab结合或结合使用的细胞毒性剂，包括但不限于补体和细胞毒素；并用附着在固体基质(例如板、芯片、淘析)上的抗体淘选或任何其它方便的技术。
分离和分析的技术包括但不限于流式细胞术，其可以具有不同的复杂程度，例如多个颜色通道、低角度和钝角光散射检测通道、阻抗通道。
通过使用与死细胞相关的染料，例如碘化丙啶(pi)，可以针对死细胞选择细胞。在某些实施方式中，将细胞收集在包含2％胎牛血清(fcs)或0.2％牛血清白蛋白(bsa)的培养基或任何其它合适的例如无菌等渗培养基中。
4.载体
免疫应答细胞(例如，t细胞或nkt细胞)的遗传修饰可以通过用重组dna构建体转导基本上均质的细胞组成来完成。在某些实施方式中，逆转录病毒载体(γ-逆转录病毒或慢病毒)用于将dna构建体引入细胞。例如，可以将编码hi-tcr的多核苷酸克隆到逆转录病毒载体中，并且可以从其内源启动子、逆转录病毒长末端重复序列或对目的靶细胞类型特异性的启动子驱动表达。也可以使用非病毒载体。
对于免疫应答细胞的初始遗传修饰以包括hi-tcr，逆转录病毒载体通常用于转导，然而可以使用任何其它合适的病毒载体或非病毒递送系统。可以在单个多顺反子表达盒、单个载体的多个表达盒或多个载体中用辅助分子(例如细胞因子)构建hi-tcr。产生多顺反子表达盒的元件的实例包括但不限于各种病毒和非病毒内部核糖体进入位点(ires，例如，fgf-1ires、fgf-2ires、vegfires、igf-iiires、nf-κbires、runx1ires、p53ires、甲型肝炎ires、丙型肝炎ires、瘟病毒ires、无杆状病毒ires、小核糖核酸病毒ires、脊髓灰质炎病毒ires和脑心肌炎病毒ires)和可裂解的接头(例如2a肽，例如p2a、t2a、e2a和f2a肽)。逆转录病毒载体和合适的包装系的组合也是合适的，其中衣壳蛋白将具有感染人细胞的功能。已知各种产生两性病毒的细胞系，包括但不限于pa12(miller等，(1985)mol.cell.biol.5:431-437)；pa317(miller等，(1986)mol.cell.biol.6:2895-2902)；和crip(danos等，(1988)proc.acad.sci.usa85:6460-6464)。非两性粒子也是合适的，例如，用vsvg、rd114或galv包膜和本领域已知的任何其它假型化的粒子。
可能的转导方法还包括细胞与生产细胞的直接共培养，例如通过bregni等.(1992)blood80:1418-1422的方法，或单独用病毒上清液或含有或不含有适当生长因子和聚阳离子的浓缩载体原种培养，例如通过xu,等.(1994)exp.hemat.22:223-230；和hughes,等.(1992)j.clin.invest.89:1817的方法。
其它转导病毒载体可用于修饰免疫应答细胞。在某些实施方式中，所选择的载体表现出高的感染效率和稳定的整合和表达(参见，例如，cayouette等,humangenetherapy8:423-430,1997；kido等,currenteyeresearch15:833-844,1996；bloomer等,journalofvirology71:6641-6649,1997；naldini等,science272:263-267,1996；和miyoshi等,proc.natl.acad.sci.u.s.a.94:10319,1997)。可以使用的其它病毒载体包括，例如，腺病毒、慢病毒和与腺相关的病毒载体、牛痘病毒、牛乳头瘤病毒或疱疹病毒，例如爱泼斯坦-巴尔病毒(也参见例如miller,humangenetherapy15-14,1990；friedman,science244:1275-1281,1989；eglitis等,biotechniques6:608-614,1988；tolstoshev等,currentopinioninbiotechnology1:55-61,1990；sharp,thelancet337:1277-1278,1991；cornetta等,nucleicacidresearchandmolecularbiology36:311-322,1987；anderson,science226:401-409,1984；moen,bloodcells17:407-416,1991；miller等,biotechnology7:980-990,1989；legallasalle等,science259:988-990,1993；和johnson,chestl07:77s-83s,1995的载体)。逆转录病毒载体发展地特别好，并已用于临床(rosenberg等,n.engl.j.med323:370,1990；anderson等,u.s.pat.no.5,399,346)。
非病毒方法也可以用于免疫应答细胞的遗传修饰。例如，可以通过在脂质转染(feigner等,proc.natl.acad.sci.u.s.a.84:7413,1987；ono等,neuroscienceletters17:259,1990；brigham等,am.j.med.sci.298:278,1989；staubinger等,methodsinenzymology101:512,1983)，脱唾液酸血清类粘蛋白-聚赖氨酸偶联(wu等,journalofbiologicalchemistry263:14621,1988；wu等,journalofbiologicalchemistry264:16985,1989)，或手术条件下的微注射(wolff等,science247:1465,1990)的情况下施用核酸来将核酸分子引入免疫应答细胞中。其它非病毒的基因转移方法包括使用磷酸钙、deae葡聚糖、电穿孔和原生质体融合的体外转染。脂质体也可能对将dna递送到细胞中有益。也可以通过将正常核酸转移到可离体培养的细胞类型(例如，自体或异源原代细胞或其后代)中来完成将正常基因移植到受试者的受影响组织中，之后，将细胞(或其后代)注射到目标组织中或全身注射。重组受体也可以使用转座酶或靶向核酸酶(例如锌指核酸酶、大范围核酸酶或tale核酸酶、crispr)衍生或获得。瞬时表达可通过rna电穿孔获得。在某些实施方式中，重组受体可以通过基于转座子的载体引入。在某些实施方式中，基于转座子的载体包含转座子(又称可转座元件)。在某些实施方式中，转座子可以由转座酶识别。在某些实施方式中，转座酶是睡美人(sleepingbeauty)转座酶。
成簇的规律间隔的短回文重复序列(crispr)系统是在原核细胞中发现的基因组编辑工具。当用于基因组编辑时，该系统包括cas9(一种能够使用crrna作为其向导来修饰dna的蛋白质)，crisprrna(crrna，包含cas9用来引导其到达宿主dna正确片段的rna，以及与tracrrna结合的区域(通常以发夹环形式)，与cas9形成活性复合物)，反式激活crrna(tracrrna，与crrna结合，与cas9形成活性复合物)，以及dna修复模板的可选片段(可指导细胞修复过程允许插入特定的dna序列的dna)。crispr/cas9通常采用质粒转染靶细胞。crrna需要针对每种应用进行设计，因为这是cas9用来识别并直接结合细胞中靶dna的序列。携带car表达盒的修复模板还需要针对每种应用进行设计，因为它必须与切口两侧的序列重叠，并为插入序列编码。多个crrna和tracrrna可以包装在一起以形成单向导rna(sgrna)。该sgrna可以与cas9基因连接在一起并制成质粒，以便被转染到细胞中。
锌指核酸酶(zfn)是一种人工限制性酶，通过将锌指dna结合结构域与dna裂解结构域结合而产生。锌指结构域可以被工程化以靶向特定的dna序列，其允许锌指核酸酶靶向基因组内的期望序列。各个zfn的dna结合结构域通常包含多个独立的锌指重复序列，并且每个都可以识别多个碱基对。产生新的锌指结构域的最常见方法是结合已知特异性的较小锌指“模块”。zfn中最常见的裂解结构域是来自ii型限制性核酸内切酶foki的非特异性裂解结构域。使用内源性同源重组(hr)机器和带有car表达盒的同源dna模板，zfn可以用于将car表达盒插入基因组。当靶序列被zfn酶切后，hr机器搜索受损染色体与同源dna模板之间的同源性，然后在染色体的两个断裂末端之间复制模板的序列，从而将同源dna模板整合到基因组。
转录激活因子样效应物核酸酶(talen)是限制性酶，可以工程化为切割dna的特定序列。talen系统的工作原理几乎与zfn相同。它们是通过将转录激活因子样效应物dna结合结构域与dna裂解结构域结合而产生的。
转录激活因子样效应物(tale)由具有两个可变位置的33-34个氨基酸重复基序组成，这些位置对特定核苷酸有很强的识别能力。通过组装这些tale的阵列，可以对taledna结合结构域进行改造以结合所需的dna序列，从而指导核酸酶切割基因组中的特定位置。用于多核苷酸疗法的cdna表达可以从任何合适的启动子(例如人巨细胞病毒(cmv)、猿猴病毒40(sv40)或金属硫蛋白启动子)中进行指导，并由任何适当的哺乳动物调节元件或内含子(例如延伸因子1a增强子/启动子/内含子结构)调节。例如，如果需要的话，已知优先在特定细胞类型中指导基因表达的增强子可以用于指导核酸的表达。所使用的增强剂可以包括但不限于被表征为组织或细胞特异性增强子的那些。或者，如果将基因组克隆用作治疗构建体，则可以通过同源调控序列或，如果需要，通过衍生自包括上述任何启动子或调控元件的异源的调控序列来介导调控。
所得的细胞可以在与未修饰的细胞相似的条件下生长，由此修饰的细胞可以被扩增并用于多种目的。
6.基因组编辑方法
在某些非限制性实施方式中，本文公开的hi-tcr、共刺激配体、ccr或任何其它分子/转基因由免疫应答细胞通过修饰的基因组基因座表达。在某些实施方式中，通过靶基因组编辑方法将转基因的表达盒整合到免疫应答细胞的靶基因组基因座中。在某些实施方式中，靶基因组基因座可以是cd3δ、cd3ε、cd247、b2m、trac、trbc1、trbc2、trgc1和/或trgc2基因座。
6.1.工程化t细胞受体基因座
在某些实施方式中，hi-tcr由免疫应答细胞通过修饰的内源性t细胞受体基因座表达。在某些实施方式中，hi-tcr表达盒整合在内源性t细胞受体基因座处。在某些实施方式中，hi-tcr表达盒整合在t细胞受体α基因座(tra，genbankid：6955)内。在某些实施方式中，hi-tcr表达盒整合在t细胞受体β基因座(trb，genbankid：6957)内。在某些实施方式中，hi-tcr表达盒整合在t细胞受体γ基因座(trg，genbankid：6965)内。
在某些实施方式中，hi-tcr表达盒包含整合在tcr恒定结构域基因座的第一外显子中的细胞外抗原结合结构域，使得细胞外抗原结合结构域和tcr恒定结构域包含在hi-tcr的一条抗原结合链中。在某些实施方式中，tcr恒定结构域基因座可以是trac、trbc1、trbc2、trgc1或trgc2。在某些实施方式中，hi-tcr表达盒包含整合在trac基因座的第一外显子中的细胞外抗原结合结构域，使得细胞外抗原结合结构域和trac肽包含在hi-tcr的第一抗原结合链中。在某些实施方式中，hi-tcr表达盒还包含第二抗原结合链，其任选地包含细胞外抗原结合结构域和trbc肽。在某些实施方式中，hi-tcr表达盒包含整合在trbc基因座的第一外显子中的细胞外抗原结合结构域，使得细胞外抗原结合结构域和trbc肽包含在hi-tcr的第一抗原结合链中。在某些实施方式中，hi-tcr表达盒还包含第二抗原结合链，其任选地包含细胞外抗原结合结构域和trac肽。在某些实施方式中，表达盒包含产生多顺反子表达盒的元件，例如可裂解的肽，例如2a肽。
在某些实施方式中，重组tcr由置于免疫应答细胞的内源性trac基因座和/或trbc基因座中的表达盒表达。在某些实施方式中，重组tcr表达盒的放置破坏或消废除免疫应答细胞中包含天然tcrα链和/或天然tcrβ链的tcr的内源性表达。在某些实施方式中，重组tcr表达盒的放置防止或消除免疫应答细胞中重组tcr与天然tcrα链和/或天然tcrβ链之间的错配。
可以使用任何合适的遗传编辑方法和系统来修饰内源性t细胞受体基因座。第4节中公开的基因组编辑方法可用于修饰内源性t细胞受体基因座。在某些实施方式中，crispr系统用于修饰t细胞受体基因座。在某些实施方式中，crispr系统靶向人trac基因座的外显子1。在某些实施方式中，crispr系统包含靶向人trac基因座的外显子1的指导rna(grna)。
在某些实施方式中，锌指核酸酶用于修饰内源性t细胞受体基因座。在某些实施方式中，talen系统用于修饰内源性t细胞受体基因座。
在某些实施方式中，当细胞中的一个内源性t细胞受体基因座被修饰以表达hi-tcr的一条或多条抗原结合链时，该细胞中的一个或多个其它内源性t细胞受体基因座被修饰以消除内源性tcr链的内源性表达。在某些实施方式中，一个或多个其它内源性t细胞受体基因座被进一步修饰以表达目的基因，例如抗肿瘤细胞因子(例如il-2、il-12，tnfα和infγ)、共刺激分子配体(例如4-1bbl)、追踪基因(例如egfp)或自杀基因。
6.2.通过启动子或转录终止子的基因组编辑来修饰基因表达
在某些非限制性实施方式中，整合到靶基因组基因座中的hi-tcr表达盒的表达由基因组基因座的内源性启动子/增强子驱动。在某些实施方式中，整合到靶基因组基因座中的hi-tcr表达盒的表达由引入基因组基因座的修饰的启动子/增强子驱动。可以使用任何靶基因组编辑方法来修饰靶基因组基因座的启动子/增强子区，从而增强或修饰免疫应答细胞中hi-tcr的表达。在某些实施方式中，修饰包括用组成型启动子或诱导型启动子替换内源性启动子，或将组成型启动子或诱导型启动子插入靶基因组基因座的启动子区。在某些实施方式中，组成型启动子位于靶基因组基因座上以驱动hi-tcr的基因表达。合适的组成型启动子包括但不限于cmv启动子、ef1a启动子、sv40启动子、pgk1启动子、ubc启动子、β-肌动蛋白启动子和cag启动子。可替代地或另外地，条件或诱导型启动子位于靶基因组基因座上以驱动hi-tcr的基因表达。条件启动子的非限制性实例包括四环素应答元件(tre)启动子和雌激素应答元件(ere)启动子。另外，可以将增强子元件置于启动子区以外的区域中。
在某些非限制性实施方式中，整合到靶基因组基因座中的hi-tcr表达盒的表达由基因组基因座的内源性转录终止子调节。在某些实施方式中，整合到靶基因组基因座中的hi-tcr表达盒的表达由引入基因组基因座的修饰的转录终止子调节。可以使用任何靶基因组编辑方法来修饰靶基因组基因座的转录终止子区，从而修饰免疫应答细胞中hi-tcr的表达。在某些实施方式中，修饰包括用替代转录终止子替换内源性转录终止子，或将替代转录终止子插入靶基因组基因座的转录终止子区。在某些实施方式中，替代转录终止子包含基因的3’utr区或多聚a区。在某些实施方式中，替代转录终止子是内源性的。在某些实施方式中，替代转录终止子是外源性的。在某些实施方式中，替代转录终止子包括但不限于tk转录终止子、gcsf转录终止子、tcra转录终止子、hbb转录终止子、牛生长激素转录终止子、sv40转录终止子和p2a元件。
可以使用任何靶基因组编辑方法来修饰靶基因组基因座的启动子/增强子区和/或转录终止子区。在某些实施方式中，crispr系统用于修饰靶基因组基因座的启动子/增强子区和/或转录终止子区。在某些实施方式中，锌指核酸酶用于修饰靶基因组基因座的启动子/增强子区和/或转录终止子区。在某些实施方式中，talen系统用于修饰靶基因组基因座的启动子/增强子区和/或转录终止子区。
用于递送基因组编辑剂/系统的方法可以根据需要而变化。在某些实施方式中，选择的基因组编辑方法的组分作为dna构建体在一个或多个质粒中递送。在某些实施方式中，通过病毒载体递送组分。常见的递送方法包括但不限于电穿孔、显微注射、基因枪、穿刺(impalefection)、流体静压力、连续输注、超声处理、磁转染、腺相关病毒、病毒载体的包膜蛋白假型、可复制的载体顺式和反式元件、单纯疱疹病毒和化学媒介物(例如寡核苷酸、脂复合物、聚合物小体、多复合物、树状聚合物、无机纳米颗粒和穿透细胞的肽)。
可以在靶基因组基因座内的任何位置进行修饰，或在可以影响靶基因组基因座的基因表达的任何位置进行修饰。在某些实施方式中，修饰发生在靶基因组基因座的转录起始位点的上游。在某些实施方式中，修饰发生在靶基因组基因座的转录起始位点和蛋白质编码区之间。在某些实施方式中，修饰发生在靶基因组基因座的蛋白质编码区的下游。在某些实施方式中，修饰发生在靶基因组基因座的转录起始位点的上游，其中该修饰产生新的转录起始位点。
7.多肽和类似物
当在免疫应答细胞中表达时，以增强其抗肿瘤活性的方式修饰的多肽(例如cd19、cd8、cd28、cd3ζ、cd40、4-1bb、ox40、cd84、cd166、cd8a、cd8b、icos、icam-l、trac、trbc1、trbc2、trgc1、trgc2、cd3γ、cd3δ、cd3ε和ctla-4)或其片段也包括在本公开的主题中。本公开的主题提供通过产生序列改变来优化氨基酸序列或核酸序列的方法。这样的改变可以包括某些突变、缺失、插入或翻译后修饰。本公开的主题还包括本文公开的任何天然存在的多肽(包括但不限于cd19、cd8、cd28、cd3ζ、cd40、4-1bb、ox40、cd84、cd166、cd8a、cd8b、icos、icam-l、trac、trbc1、trbc2、trgc1、trgc2、cd3γ、cd3δ、cd3ε和ctla-4)的类似物。类似物可以通过氨基酸序列差异、通过翻译后修饰或通过两者与本文公开的天然存在的多肽不同。类似物可表现出与本公开主题的全部或部分天然存在的氨基酸序列具有至少约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或更多的同源性。序列差异的长度是至少5、10、15或20个氨基酸残基，例如至少25、50或75个氨基酸残基，或超过100个氨基酸残基。同样，在确定同一性程度的示例性方法中，可以使用blast程序，其概率得分在e-3和e-100之间，指示密切相关的序列。修饰包括多肽的体内和体外化学衍生，例如乙酰化、羧化、磷酸化或糖基化；这样的修饰可以在多肽合成或加工过程中或在用分离的修饰酶处理之后发生。类似物也可以通过一级结构(primarysequence)的改变而不同于天然存在的多肽。这些包括天然和诱导的遗传变异(例如，如sambrook,fritsch和maniatis,《分子克隆：实验室手册》(第2版),csh出版社,1989，或ausubel等，同上，中所述，是由于通过辐射或暴露于乙烷甲基硫酸盐中的随机诱变或通过位点特异性诱变而产生的)。还包括环化的肽、分子和类似物，其含有除l-氨基酸以外的残基，例如d-氨基酸或非天然存在的或合成的氨基酸，例如β或γ氨基酸。
除了全长多肽，本公开主题还提供本文公开的任何多肽或肽结构域的片段。如本文所用，术语“片段”是指至少5、10、13或15个氨基酸。在某些实施方式中，片段包含至少20个连续氨基酸、至少30个连续氨基酸或至少50个连续氨基酸。在某些实施方式中，片段包含至少60至80、100、200、300或更多个连续氨基酸。片段可以通过本领域技术人员已知的方法产生，或者可以由正常的蛋白质加工产生(例如，从新生多肽中去除生物活性不需要的氨基酸，或者通过替代性的mrna剪接或替代性蛋白质加工事件去除氨基酸)。
非蛋白质类似物具有设计为模仿本文公开的蛋白质的功能活性的化学结构。这样的类似物可能超过原始多肽的生理活性。类似物设计的方法在本领域中是众所周知的，并且可以根据这样的方法通过修饰化学结构来进行类似物的合成，以使所得的类似物在免疫应答细胞中表达时增加原始多肽的抗肿瘤活性。这些化学修饰包括但不限于取代替代的r基团和改变参考多肽的特定碳原子处的饱和度。在某些实施方式中，蛋白质类似物对体内降解具有相对抗性，从而在给药后导致更长的治疗效果。用于测量功能活性的测定包括但不限于以下实施例中描述的那些。
8.给药
可以将包含本公开的免疫应答细胞的组合物系统地或直接提供给受试者，以诱导和/或增强对抗原的免疫应答和/或治疗和/或预防肿瘤、病原体感染或感染性疾病。在某些实施方式中，将本公开的免疫应答细胞或包含其的组合物直接注射到目的器官(例如，受肿瘤影响的器官)中。或者，例如通过向循环系统(例如，肿瘤脉管系统)给药，将本公开的免疫应答细胞或包含其的组合物间接地提供给目的器官。可以在施用细胞或组合物之前，之中或之后提供扩增和分化剂，以增加体外或体内t细胞、nkt细胞或ctl细胞的产生。
可以在任何生理上可接受的载体中通常在血管内施用本公开的免疫应答细胞，然而它们也可以被引入骨骼或其它方便的部位，在这些部位细胞可以找到合适的再生和分化部位(例如胸腺)。通常，将施用至少约1×105个细胞，最终达到约1×1010个或更多。本公开的免疫应答细胞可以包含纯化的细胞群。本领域技术人员可以使用各种众所周知的方法，例如荧光激活细胞分选(facs)，容易地确定群体中本公开的免疫应答细胞的百分比。在包含本公开的免疫应答细胞的群体中，纯度的合适范围是约50％至约55％、约5％至约60％、以及约65％至约70％。在某些实施方式中，纯度为约70％至约75％、约75％至约80％或约80％至约85％。在某些实施方式中，纯度为约85％至约90％，约90％至约95％以及约95％至约100％。剂量可以由本领域技术人员容易地调节(例如，纯度降低可能需要增加剂量)。可以通过注射、导管等引入细胞。
本公开的组合物可以是包含本公开的免疫应答细胞或其祖细胞和药学上可接受的载体的药物组合物。给药可以是自体的或异体的。例如，可以从一个受试者获得免疫应答细胞或祖细胞，并将其施用于相同受试者或不同的相容受试者。外周血来源的免疫应答细胞或其后代(例如，体内、离体或体外来源)可通过局部注射施用，包括导管给药、全身注射、局部注射、静脉内注射或肠胃外给药。当施用本公开的主题的治疗组合物(例如，包含本公开的免疫应答细胞的药物组合物)时，可以将其配制成单位剂量可注射形式(溶液剂、悬浮剂、乳剂)。
9.剂型
包含本公开的免疫应答细胞的组合物可以方便地以无菌液体制剂的形式提供，例如等渗水溶液剂、悬浮液、乳剂，分散剂或粘性组合物，其可以缓冲至选定的ph。液体制剂通常比凝胶、其它粘性组合物和固体组合物更容易制备。另外，液体组合物在某种程度上更方便施用，尤其是通过注射。另一方面，可以在适当的粘度范围内配制粘性组合物以提供与特定组织的更长的接触时间。液体或粘性组合物可以包含载体，所述载体可以是溶剂或分散介质，其包含例如水、盐水、磷酸盐缓冲盐水、多元醇(例如甘油、丙二醇、液体聚乙二醇等)及其合适的混合物。
可以通过将遗传修饰的免疫应答细胞掺入所需量的适当溶剂中，并根据需要掺入不同量的其它成分来制备无菌注射溶液。这样的组合物可以与合适的载体、稀释剂或赋形剂例如无菌水、生理盐水、葡萄糖、右旋糖等混合。组合物也可以冻干。所述组合物可包含辅助物质，例如润湿剂、分散剂或乳化剂(例如，甲基纤维素)、ph缓冲剂、胶凝剂或增粘剂、防腐剂、矫味剂、颜料等，这取决于给药途径和所需制剂。可以参考标准文本，例如“remington'spharmaceuticalscience”，1985年第17版，以引用方式并入本文，以制备合适的制剂，而无需进行过多的实验。
可以添加增强组合物的稳定性和无菌性的各种添加剂，包括抗微生物防腐剂、抗氧化剂、螯合剂和缓冲剂。可以通过各种抗细菌和抗真菌剂，例如对羟基苯甲酸酯、三氯叔丁醇、苯酚、山梨酸等来确保防止微生物的作用。可通过使用延迟吸收的试剂例如单硬脂酸铝和明胶来延长可注射药物形式的吸收。然而，根据本公开的主题，所使用的任何媒介物、稀释剂或添加剂将必须与遗传修饰的免疫应答细胞或其祖细胞相容。
该组合物可以是等渗的，即它们可以具有与血液和泪液相同的渗透压。组合物的所需等渗性可以使用氯化钠或其它药学上可接受的试剂例如葡萄糖、硼酸、酒石酸钠、丙二醇或其它无机或有机溶质来实现。氯化钠可以特别适用于含有钠离子的缓冲剂。
如果需要，可使用药学上可接受的增稠剂将组合物的粘度保持在选定水平。例如，甲基纤维素容易且经济地获得并且易于使用。其它合适的增稠剂包括，例如，黄原胶、羧甲基纤维素、羟丙基纤维素、卡波姆等。增稠剂的浓度可以取决于选择的试剂。重要的是要使用能够达到所选粘度的用量。显然，合适载体和其它添加剂的选择将取决于确切的给药途径和特定剂型的性质，例如液体剂型(例如，是否将组合物配制成溶液剂、悬浮液、凝胶剂或其它液体形式，例如定时释放形式或液体填充形式)。
对于所治疗的受试者，要施用的细胞数量将有所不同。在一个实施方式中，向人受试者施用的本公开的免疫应答细胞为约104至约1010之间、约105至约109之间、或约106至约108之间。可以以更少的数量施用更有效的细胞。在某些实施方式中，向人受试者施用的本公开的免疫应答细胞为至少约1×108、约2×108、约3×108、约4×108或约5×108。可以根据每个受试者的个体因素，包括其大小、年龄、性别、体重和具体受试者的状况，来确定有效剂量的精确确定。本领域技术人员从本公开和本领域知识中可以容易地确定剂量。
本领域技术人员可以容易地确定组合物中和在方法中施用的细胞和任选的添加剂、媒介物和/或载体的量。通常，任何添加剂(除一种或多种活性细胞和/或一种或多种试剂外)在磷酸盐缓冲盐水中的存在量为0.001％至50％(重量)溶液，并且活性成分按微克至毫克的顺序存在，例如约0.0001wt％至约5wt％、约0.0001wt％至约1wt％、约0.0001wt％至约0.05wt％或约0.001wt％至约20wt％、约0.01wt％至约10wt％或约0.05wt％至约5wt％。对于要施用于动物或人的任何组合物，可以确定以下结果：毒性，例如通过在合适的动物模型例如啮齿类动物如小鼠中确定致死剂量(ld)和ld50；组合物的剂量，其中的组分浓度和施用组合物的时间，引起合适的反应。根据技术人员，本公开和本文引用的文献的知识，这种确定不需要过度的实验。并且，可以确定连续给药的时间而无需过多的实验。
10.治疗方法
本公开的主题提供用于在需要其的受试者中诱导和/或增加免疫应答的方法。本公开的免疫应答细胞和包含其的组合物可以用于治疗和/或预防受试者的肿瘤。本公开的免疫应答细胞和包含其的组合物可以用于延长患有肿瘤的受试者的存活。本公开的免疫应答细胞和包含其的组合物也可以用于治疗和/或预防诸如免疫功能低下的人受试者的病原体感染或其它感染性疾病。这种方法包括施用有效量的本公开的免疫应答细胞或包含其的组合物(例如药物组合物)以达到期望的效果，无论是减轻现有病症还是预防复发。为了治疗，施用的量是有效产生所需效果的量。可以一次或多次给药来提供有效量。可以大剂量或通过连续灌注来提供有效量。
在某些实施方式中，包含本文公开的hi-tcr的免疫应答细胞可以用于治疗具有表面抗原表达水平低的肿瘤细胞的受试者，例如由于疾病的复发，其中受试者接受过导致残留肿瘤细胞的治疗。在某些实施方式中，肿瘤细胞在肿瘤细胞表面上具有低密度的靶分子。在某些实施方式中，在细胞表面上具有低密度的靶分子的密度为每个细胞小于约5,000个分子，每个细胞小于约4,000个分子，每个细胞小于约3,000个分子，每个细胞小于约2,000个分子，每个细胞小于约1,500个分子，每个细胞小于约1,000个分子，每个细胞小于约500个分子，每个细胞中小于约200个分子，或每个细胞小于约100个分子。在某些实施方式中，在细胞表面上具有低密度的靶分子的密度为每个细胞小于约2,000个分子。在某些实施方式中，在细胞表面上具有低密度的靶分子的密度为每个细胞小于约1,500个分子。在某些实施方式中，在细胞表面上具有低密度的靶分子的密度为每个细胞小于约1,000个分子。在某些实施方式中，在细胞表面上具有低密度的靶分子的密度为每个细胞约4,000个分子至每个细胞约2,000个分子，每个细胞约2,000个分子至每个细胞约1,000个分子，每个细胞约1,500个分子至每个细胞约1,000个分子，每个细胞约2,000个分子至每个细胞约500个分子，每个细胞约1,000个分子至每个细胞约200个分子，或每个细胞约1,000个分子至每个细胞约100个分子。在某些实施方式中，包含本文公开的hi-tcr的免疫应答细胞可以用于治疗患有疾病复发的受试者，其中该受试者接受过包含car的免疫应答细胞(例如，t细胞)，该car包含细胞内信号传导结构域，其包含含有4-1bb多肽的共刺激性信号传导结构域(例如4-1bbzcar)。在某些实施方式中，肿瘤细胞在肿瘤细胞表面上具有低密度的肿瘤特异性抗原。在某些实施方式中，该疾病是cd19+all。在某些实施方式中，肿瘤细胞在肿瘤细胞上具有低密度的cd19。这种方法包括施用有效量的本公开的免疫应答细胞或包含其的组合物(例如药物组合物)以达到期望的效果，缓解现有病症或预防复发。
“有效量”(或“治疗有效量”)是足以在治疗后产生有益或期望的临床结果的量。可以以一剂或多剂剂量将有效量施用于受试者。就治疗而言，有效量是足以缓解、改善、稳定、逆转或减慢疾病进展或以其它方式减少疾病病理后果的量。有效量通常由医师根据具体情况确定，并且在本领域技术人员的能力范围内。当确定合适的剂量以达到有效量时，通常要考虑几个因素。这些因素包括受试者的年龄、性别和体重、所治疗的疾病、疾病的严重程度以及所施用的免疫应答细胞的形式和有效浓度。
对于使用抗原特异性t细胞的过继免疫疗法，通常输注约106-1010(例如约109)范围内的细胞剂量。在将本公开的细胞施用于宿主并随后分化后，诱导特异性针对特定抗原的t细胞。修饰的细胞可以通过本领域已知的任何方法施用，包括但不限于静脉内、皮下、结内、肿瘤内、鞘内、胸膜内、腹膜内和直接向胸腺施用。
本公开的主题提供用于治疗和/或预防受试者中的肿瘤的方法。该方法可以包括向患有肿瘤的受试者施用有效量的本公开的免疫应答细胞或包含其的组合物。
肿瘤的非限制性实例包括血液癌症(例如白血病、淋巴瘤和骨髓瘤)、卵巢癌、乳腺癌、膀胱癌、脑癌、结肠癌、肠癌、肝癌、肺癌、胰腺癌、前列腺癌、皮肤癌、胃癌、胶质母细胞瘤、喉癌、黑素瘤、神经母细胞瘤、腺癌、神经胶质瘤、软组织肉瘤和各种癌(包括前列腺癌和小细胞肺癌)。合适的癌还包括肿瘤学领域中任何已知的癌，包括但不限于星形细胞瘤、纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、少突胶质细胞瘤、室管膜瘤、髓母细胞瘤、原始神经外胚层肿瘤(pnet)、软骨肉瘤、成骨肉瘤、胰腺导管腺癌、小细胞和大细胞肺腺癌、脊索瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、鳞状细胞癌、支气管肺泡癌、上皮腺癌及其肝转移灶、淋巴管肉瘤、淋巴管内皮肉瘤、肝癌、胆管癌、滑膜瘤、间皮瘤、尤文氏瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、基底细胞癌、汗腺癌、乳头状癌、皮脂腺癌、状腺癌、囊腺癌、髓样癌、支气管癌、肾细胞癌、胆小管癌、绒毛膜癌、精原细胞瘤、胚胎癌、wilms’肿瘤、睾丸肿瘤、髓母细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、血管母细胞瘤、听神经瘤、少突胶质细胞瘤、脑膜瘤、神经母细胞瘤、视网膜母细胞瘤、白血病、多发性骨髓瘤、waldenstrom’s巨球蛋白血症和重链疾病、诸如导管和小叶腺癌的乳腺肿瘤、子宫颈的鳞状和腺癌、子宫和卵巢上皮癌、前列腺腺癌、膀胱移行鳞状细胞癌、b和t细胞淋巴瘤(结节性和弥漫性)浆细胞瘤、急慢性白血病、恶性黑色素瘤、软组织肉瘤和平滑肌肉瘤。在某些实施方式中，肿瘤选自血液癌症(例如白血病、淋巴瘤和骨髓瘤)、卵巢癌、前列腺癌、乳腺癌、膀胱癌、脑癌、结肠癌、肠癌、肝癌、肺癌、胰腺癌、前列腺癌、皮肤癌、胃癌、胶质母细胞瘤和喉癌。在某些实施方式中，本公开的免疫应答细胞和包含其的组合物可以用于治疗和/或预防常规治疗措施不适合的血液癌症(例如白血病、淋巴瘤和骨髓瘤)或卵巢癌。在某些实施方式中，肿瘤是实体瘤。
受试者可以患有疾病的晚期形式，在这种情况下，治疗目标可以包括缓解或逆转疾病进展和/或减轻副作用。受试者可以具有已经对其进行过治疗的病史，在这种情况下，治疗目标通常包括降低或延迟复发风险。
用于治疗的合适的人受试者通常包括可以通过临床标准区分的两个治疗组。患有“晚期疾病”或“高肿瘤负荷”的受试者是携带临床上可测量的肿瘤的受试者。临床上可测量的肿瘤是一种可以根据肿瘤肿块检测到的肿瘤(例如，通过触诊、cat扫描、超声检查、乳房x线照片或x射线；单独的阳性生化或组织病理学标志物不足以识别该人群)。向这些受试者施用药物组合物以引发抗肿瘤反应，以减轻其状况。理想地，结果是减小了肿瘤块，但是任何临床改善都可带来益处。临床改善包括降低风险或进展速度或减少肿瘤病理后果。
第二组合适的受试者在本领域中称为“佐剂组”。这些是有肿瘤史但对另一种治疗方式有反应的个体。先前的疗法可以包括但不限于手术切除、放射疗法和传统化学疗法。结果，这些个体没有临床上可测量的肿瘤。然而，他们被怀疑有在原发肿瘤部位附近或转移的疾病进展风险。该组可以进一步分为高风险和低风险的个体。根据在初始治疗之前或之后观察到的特征进行细分。这些特征在临床领域中是已知的，并且针对每种不同的肿瘤适当地定义。高危亚组的典型特征是肿瘤侵犯了邻近组织或淋巴结受累。
另一组具有肿瘤的遗传易感性，但尚未证实肿瘤的临床体征。例如，对于与乳腺癌相关的基因突变测试呈阳性但仍处于育龄的妇女，可能希望接受本文所述的一种或多种免疫应答细胞进行预防性治疗，以防止肿瘤的发生，直到适合进行预防性手术。
另外，本公开的主题提供用于在例如免疫受损的受试者中治疗和/或预防病原体感染(例如病毒感染、细菌感染、真菌感染、寄生虫感染或原生动物感染)的方法。该方法可以包括向患有病原体感染的受试者施用有效量的本公开的免疫应答细胞或包含其的组合物。易于治疗的示例性病毒感染包括但不限于巨细胞病毒(cmv)、爱泼斯坦巴尔病毒(ebv)、人免疫缺陷病毒(hiv)和流感病毒感染。
可以对本公开的免疫应答细胞(例如，t细胞)进行进一步修饰，以避免或最小化免疫并发症(称为“恶性t细胞转化”)，例如移植物抗宿主病(gvhd)，或当健康组织表达与肿瘤细胞相同的靶抗原时，会导致类似于gvhd的结果的风险。该问题的潜在解决方案是将自杀基因改造到本公开的免疫应答细胞中。合适的自杀基因包括但不限于单纯疱疹病毒胸苷激酶(hsv-tk)、诱导型caspase9自杀基因(icasp-9)和截短的人表皮生长因子受体(egfrt)多肽。在某些实施方式中，自杀基因是egfrt多肽。egfrt多肽可通过施用抗egfr单克隆抗体(例如西妥昔单抗)来使t细胞消除。egfrt可以共价连接至本公开的car的抗原识别受体的上游。自杀基因可以包含在包含编码本公开的car的核酸的载体内。以此方式，在恶性t细胞转化(例如，gvhd)过程中施用旨在激活自杀基因的前药(例如，前药(例如，可以激活icasp-9的ap1903))，可以触发由自杀基因激活的表达car的t细胞的凋亡。将自杀基因掺入本公开的car中可提高安全性，并能够在很短的时间内消除大部分cart细胞。可以在cart细胞输注后的给定时间点抢先消除掺入了自杀基因的本公开的免疫应答细胞(例如，t细胞)，或在毒性的最早迹象时将其消除。
11.试剂盒
本公开的主题提供用于在受试者中诱导和/或增强免疫应答和/或治疗和/或预防肿瘤或病原体感染的试剂盒。在某些实施方式中，试剂盒包含有效量的本公开的免疫应答细胞或包含其的药物组合物。在某些实施方式中，试剂盒包括无菌容器；这样的容器可以是盒子、安瓿、瓶、小瓶、管、袋、小袋、泡罩包装或本领域已知的其它合适的容器形式。这样的容器可以由塑料、玻璃、层压纸、金属箔或其它适合于容纳药物的材料制成。在某些非限制性实施方式中，试剂盒包括编码本文公开的hi-tcr的分离的核酸分子，其以可表达的形式指向目的抗原，可以任选地包含在一种或多种载体中。
如果需要的话，将免疫应答细胞和/或核酸分子与将细胞或核酸分子施用于患有肿瘤或病原体或免疫疾病或有发展成肿瘤或病原体或免疫疾病的受试者的说明书一起提供。说明书通常包括有关组合物用于治疗和/或预防肿瘤或病原体感染的信息。在某些实施方式中，说明书包括以下至少一项：治疗剂的描述；用于治疗或预防肿瘤、病原体感染或免疫疾病或其症状的剂量表和给药；注意事项；警告；适应症；不适应症；用药信息；不良反应；动物药理学；临床研究；和/或参考。这些说明书可以直接打印在容器上(如果有的话)，或者作为粘贴在容器上的标签，或者作为单独的纸页、小册子、卡片或文件夹提供在容器内或与容器一起。
实施例
除非另有说明，否则本公开的实践采用分子生物学、微生物学、细胞生物学、生物化学和免疫学的常规技术(包括重组技术)，其在技术人员的能力范围内。在诸如“分子克隆：实验室手册”，第二版(sambrook，1989)；“寡核苷酸合成”(gait，1984)；“动物细胞培养”(freshney，1987)；“酶学方法”“实验免疫学手册”(weir，1996)；“哺乳动物细胞的基因转移载体”(miller和calos，1987年)；“分子生物学的当前方法”(ausubel，1987年)；“pcr：聚合酶链式反应”，(mullis，1994年)；“免疫学的当前方法”(coligan，1991年)中充分地解释了这些技术。这些技术适用于本文公开的多核苷酸和多肽的产生，并且因此可以在制备和实施本公开的主题中考虑。在以下部分中将讨论用于具体实施方式的特别有用的技术。
提出以下实施例以向本领域普通技术人员提供有关如何制备和使用本公开的细胞和组合物的完整公开和描述，而不旨在限制发明人认作其发明的范围。
实施例1-用内源性非-hla限制性t细胞受体/cd3复合物靶向t细胞
简介
在tcr基因座上进行特异性修饰，旨在改变人t细胞的抗原特异性，而又不破坏或绕过其cd3复合物，该cd3复合物在生理上控制和调节t细胞激活。在这种方法中，t细胞失去其内源性t细胞受体，并利用其cd3复合物获得了识别独立于hla的抗原的能力，与之不同地，cd3复合物在使用car时被绕过。这是通过靶向破坏内源性tcr并与将抗原结合结构域引入trac基因座相结合来实现的，以这种方式从而将天然cd3复合物的所有成分保留在其天然结构中。重组tcr-样分子(即hi-tcr、fvtcr或hit-car)可带有衍生自免疫球蛋白基因的可变结构域、或替代配体，以指导抗原识别。经由cd3复合物的重组受体信号可以是完整的(即，在其生理组成上)，或者也可以通过非共价掺入共刺激结构域而增强。
结果
通过整合tcr或tcr-样基因与预定抗原的独特可变结构域，开发了一种一步生成tcr和tcr-样t细胞的新策略。这导致新的tcr/tcr-样基因在内源性tcr启动子(α、β或两者)的控制下表达，并伴随破坏内源性tcr的表面表达。
通过靶向无启动子的car基因盒在tcrα恒定链(trac)第一外显子中的整合，开发了一种一步生成通用cart细胞的策略。这导致car表达在内源性tcrα启动子的控制下，并伴随破坏tcrα基因表达，导致在细胞表面缺乏tcr表达。通过使用位点特异性核酸酶(例如crispr/cas9)和aav供体模板，通过同源重组(hr)实现靶向trac基因座处的car基因。使用基于hr的基因靶向，本策略允许生成具有独特特异性的t细胞，其由含有特定抗原结合结构域的嵌合tcr受体编码。抗原结合结构域衍生自免疫球蛋白(即fv片段)，细胞表面受体的配体或tcr(αβ或γδ)。杂合免疫球蛋白-tcr嵌合抗原受体(即hit-car、fvtcr或hi-tcr)或γδtcr允许t细胞以hla-非依赖性方式识别靶细胞。插入新的αβtcr的方法可以相同，但会导致hla-限制性抗原识别。
例如，图1a显示t细胞受体(tcr)、b细胞受体(bcr)、嵌合抗原受体(car)和基于hla-非依赖性tcr的嵌合抗原受体(即hit-car、fvtcr或hi-tcr)的示意图。crispr/cas9靶向的三种受体整合到trac基因座中，如图1b所示。工程化的hit-car靶向cd19。来自trac基因座的hit-car(即hi-tcr)的细胞表面表达如图1c所示。hit-car(即hi-tcr或fvtcr)t细胞的细胞溶解作用和增殖分别显示在图1d和1e中。
如图2a所示，建立在单一步骤中将靶基因破坏和hit-car(即hi-tcr或fvtcr)靶向插入相结合的条件，以产生至多65％的hit-car(即hi-tcr或fvtcr)t细胞。这些t细胞表现出体外和体内肿瘤裂解活性，类似于先前表征的表达1928zcar的trac-cart细胞，如图2b所示。另外，抗原相互作用诱导了hit-car(即，hi-tcr或fvtcr)t细胞的下调，这取决于抗原依赖性刺激的次数。由于在细胞表面消除了内源性tcr表达，因此这些hit-car(即hi-tcr或fvtcr)t细胞可用于开发现成的免疫疗法。
cd19以外的靶标可用于免疫治疗。nyesotcr基因整合到tcrα或β链中的示意图如图3a所示。trac-nyeso-tcr和trbc-nyeso-tcr(即hi-tcr或fvtcr)的细胞表面表达如图3b所示。trac或trbc靶向后4天的代表性tcr-v-β-1流式细胞仪图如图3b所示。工程化的t细胞的细胞毒性活性如图3c所示。共靶向tcrα和tcrβ的替代设计的示意图如图3d所示，其中nyeso-hi-tcr置于trac基因座中，而4-1bbl表达盒位于trbc基因座中。trac-nyeso-tcr和trbc-4-1bbl的细胞表面表达如图3e所示。
还提供一种变体方法，其中将共刺激结构域非共价地插入cd3复合物中，这提供了超生理学上的抗原感测和激活。这是通过将共刺激结构域融合到一条或两条tcr链来实现的。此外，通过将共刺激结构域融合到一条或两条修饰的tcr链(即抗原结合链)上，可能有两种共刺激剂量。
此外，hi-tcr与car相比具有更高的灵敏度。经过编辑以hi-tcr替换内源性tcr的人t细胞获得了结合较低抗原密度并杀死这种细胞的能力。例如，表2显示hi-tcr细胞的体外细胞毒性活性。hi-tcr或cd19-car通过crispr/cas9介导的基因编辑和aav6供体载体而引入人外周血t细胞的内源性trac基因座。基因靶向后五天，将t细胞(6、30或15万个)与表达不同cd19水平(从非常低到高水平)的25万个nalm6白血病细胞一起孵育。将细胞在500-ul含血清(不含il2)的x-vivo培养基中孵育22小时。在计数珠的存在下通过facs分析共培养物以确定nalm6细胞的总数。细胞毒性活性显示为杀伤的nalm6的百分比。e/t：效应子(t细胞)与靶标(nalm6)之比。数据清楚地表明，hi-tcr可以检测到比car更低的cd19抗原水平。此功能对于中等表达或低表达的抗原例如cd22、bcma、ccr1、cd70等非常有用，并且在对于任何抗原的car疗法后也可用于治疗复发，因为复发的肿瘤细胞经常显示它们表面上的抗原密度减少。
表2.肿瘤细胞杀伤百分比
此外，发现一组外源性和内源性3’非翻译区(3’utr)能够调节tcr基因座上精确且可预测的基因表达。例如，图4a显示整合到trac基因座中的cd28zcar基因的示意图。多聚a(黑框)对应于car盒的片段，该片段经过修饰以测试不同的病毒和哺乳动物3’utr。使用表达cd28zcar的trac-cart细胞作为模型，与牛生长激素(bgh)多聚a序列相比，显示某些3’utr降低car表达(图4b和4c)，产生具有损害的体内细胞毒性活性的car-t细胞(图5a和5b)。显示某些其它3’utr，包括内源性trac3’utr，可增加car表面表达水平(图4b和4c)，从而产生具有改善的体内细胞毒活性的car-t细胞(图5a和5b)。这些3’utr也可以用于调节本文公开的任何hi-tcr的精确和可预测的基因表达。
trac基因座上的上述遗传修饰允许生成表达hi-tcr最佳水平的t细胞，该水平与生理tcr相似，但与car不同，采取了内源性t细胞激活机制(cd3复合物和下游信号传导元件)的优势。这种方法可以促进自体和异体t细胞疗法。
tcr基因编辑具有相关应用的另一个相关领域是t-ips衍生的t细胞。t-ips细胞是通过对外周t淋巴细胞进行重编程而获得的多能干细胞。因此，这些t-ips细胞包含重排的t细胞受体，即αβ或γδtcr，可以使用基因编辑技术对其进行修饰。通过定向分化从t-ips细胞获得的t细胞表达重排的tcr，可以对其进行检测和测序。使用这一序列，可以确定t-ips细胞基因组中重排可变结构域的精确位置。使用特异性靶向这种重排可变结构域的核酸酶和含有已知特异性tcr可变结构域的供体dna，人们可以用新的一个替换内源性可变结构域。这种方法需要两个步骤的基因编辑：一个靶向α(或γ)链，另一个靶向β(或δ)链。由于只需要修饰两个等位基因，因此该方法可以在一个步骤中进行。另外，使用与对于原代人t细胞所述的策略相似的策略，可以修饰tcr链以表达本文公开的任何hi-tcr。
实施例2
crispr/cas9靶向的三种受体整合到trac基因座中，如图1a所示。工程化hit-car靶向cd19。来自trac基因座的hit-car(即hi-tcr)的细胞表面表达如图6b和6c所示。hit-car(即hi-tcr或fvtcr)t细胞的细胞溶解作用和增殖情况如图7a、7b和8a-8c所示。特别地，这些数据显示，在杀伤表达低抗原水平的靶细胞时，hitt细胞优于car-t细胞。
此外，如图9a-9d所示，将hi-tcrt细胞改造成共表达共刺激配体。在这个特定的实验中，在将hi-tcr靶向trac基因座的第二天，将t细胞与编码cd80、41bbl或两者的逆转录病毒sfg载体一起转移。离体扩增这些细胞后5天，将4e5trac-car或trac-hi-tcr阳性t细胞注射到nsg小鼠中，该小鼠携带表达cd19水平非常低的nalm6细胞。trac-hi-tcrt细胞表达cd80、41bbl，两者配体，或者都不表达。生物发光用于每周评估肿瘤负荷并跟踪小鼠的存活。
观察到trac-cart细胞不能控制具有非常低cd19水平的肿瘤，并且所有小鼠都在第30天时垂危。在这种低剂量下，hi-tcrt细胞最初控制了肿瘤负荷，然而，在第10天小鼠复发，并在第40天时垂危。当hi-tcrt细胞共表达cd80和4-1bbl时，向hi-tcrt细胞添加共刺激配体可改善抗肿瘤活性并具有最佳应答。这种提高的活性导致长期控制表达非常低水平cd19的nalm6。
图10a-10c进一步证明基线trac-car表达可以通过不同的3’utr序列控制，而不会影响遇到抗原后的细胞表面补充动力学。trac-cart细胞的工程化方法与前面所述的相同，因此所有构建体均处于trac内源性启动子的转录控制之下。观察到，通过修饰3’utr(包括多聚a信号)，可以调节基线表达水平(图10b)。当将这些不同的trac-cart细胞培养在表达cd19的肿瘤细胞上时，通过流式细胞术观察到car细胞表面表达下降，随后补足(图10c)。不同的3’utr改变基线表达水平，但它们保持相同的补充动力学，最终表达水平与基线相似。
此外，还创建了靶向cd70的hi-tcr和靶向cd22的hi-tcr。可以通过对靶向相同抗原的现有抗体的现有scfv或fab区进行测序以获得细胞外抗原结合结构域，来创建靶向目的抗原的hi-tcr。
本公开的主题的实施方式
从前面的描述中，将显而易见的是，可以对本公开的主题进行变型和修改以将其应用于各种用途和条件。这样的实施方式也在所附权利要求的范围内。
本文所述变量定义中的元素列表包括将变量定义为列出的元素的任何单个元素或组合(或子组合)。本文所述实施方式包括将该实施方式作为任何单一实施方式或与任何其它实施方式或其部分相结合。
本说明书中提到的所有专利和出版物都以相同的程度并入本文以供参考，就如同每个独立的专利和出版物都被具体地和单独地指出以并入以供参考一样。
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