采用猝灭剂的定量扩增归一化的制作方法
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本申请要求2018年3月15日提交的第62/643,506号美国临时申请的优先权，其全部内容通过引用纳入本文。
背景技术：
优化条件下的定量聚合酶链反应(qpcr)基于pcr反应过程中的荧光生成产生定量结果。荧光生成的主要方法是酶促裂解探针或将染料嵌入双链dna。定量的准确性会受多种因素影响，包括反应效率或抑制剂的存在。实验样品中相对于对照的反应效率失准会造成定量过高或定量偏低。
发明概述
一方面，提供用于qpcr扩增归一化的组合物、试剂盒和方法。一些实施方式中，用于qpcr扩增归一化的组合物包含：
特异性结合对照核酸的荧光猝灭引物组，所述引物组包含正向猝灭引物和反向猝灭引物，其中，正向猝灭引物和反向猝灭引物各自包含两个或更多个猝灭剂，并且所述两个或更多个猝灭剂位于引物内以至猝灭剂由此猝灭对照核酸扩增产物发出的所有或基本上所有荧光；和
特异性关联对照核酸的可检测探针。
一些实施方式中，正向猝灭引物和/或反向猝灭引物包含两个猝灭剂。一些实施方式中，正向猝灭引物和/或反向猝灭引物包含超过两个猝灭剂(例如3、4、5或更多个猝灭剂)。一些实施方式中，猝灭剂之间的距离不超过由猝灭剂来猝灭的荧光团的
一些实施方式中，所述组合物包含：
特异性结合对照核酸的荧光猝灭引物组，所述引物组包含正向猝灭引物和反向猝灭引物，其中，正向猝灭引物和反向猝灭引物各自包含位于或靠近引物5'末端的第一猝灭剂和靠近引物3'末端的第二猝灭剂；和
特异性关联对照核酸的可检测探针。
一些实施方式中，所述组合物包含：
特异性结合对照核酸的荧光猝灭引物组，所述引物组包含正向猝灭引物和反向猝灭引物，其中，正向猝灭引物和反向猝灭引物各自包含位于或靠近引物5'末端的第一猝灭剂和靠近引物3'末端的第二猝灭剂；
特异性关联对照核酸的可检测探针；和
对照核酸，其中，所述对照核酸包含与所述正向猝灭引物结合的正向引物结合位点，与所述探针结合的探针结合位点以及与所述反向猝灭引物结合的反向引物结合位点。
一些实施方式中，就正向猝灭引物而言，第一猝灭剂位于5'末端或距5'末端5个碱基以内，第二猝灭剂距3'末端5-10个碱基以内。一些实施方式中，就正向猝灭引物而言，第一猝灭剂和第二猝灭剂相隔至多约25个碱基。一些实施方式中，就反向猝灭引物而言，第一猝灭剂位于5'末端或距5'末端5个碱基以内，第二猝灭剂距3'末端5-10个碱基以内。一些实施方式中，就反向猝灭引物而言，第一猝灭剂和第二猝灭剂相隔至多约25个碱基。一些实施方式中，第一猝灭剂和第二猝灭剂是bhq-1猝灭剂。
一些实施方式中，所述组合物还包含荧光dna嵌入剂。一些实施方式中，荧光dna嵌入剂是sybrgreeni、evagreen、picogreen、溴乙锭、sybrgold、yo-yo、yo-pro、toto、boxto或bebo。一些实施方式中，荧光dna嵌入剂是sybrgreeni。
一些实施方式中，可检测探针特异性结合(例如直接结合)对照核酸。
一些实施方式中，可检测探针与寡核苷酸接合。一些实施方式中，可检测探针与特异性结合对照核酸的荧光猝灭引物之一或两者接合。一些实施方式中，可检测探针与正向猝灭引物接合。一些实施方式中，可检测探针与反向猝灭引物接合。一些实施方式中，可检测探针与正向猝灭引物或者反向猝灭引物接合，所述组合物还包含与引物上一部分杂交的寡核苷酸，所述寡核苷酸包含猝灭可检测探针发出的信号的猝灭剂。一些实施方式中，可检测探针与杂交正向猝灭引物或反向猝灭引物一部分的寡核苷酸接合。一些实施方式中，可检测探针与杂交正向猝灭引物或者反向猝灭引物上一部分的寡核苷酸接合，所述寡核苷酸所杂交的引物还包含猝灭可检测探针发出的信号的猝灭剂。一些实施方式中，可检测探针与杂交正向猝灭引物或者反向猝灭引物上一部分的寡核苷酸接合，所述寡核苷酸还包含猝灭可检测探针发出的信号的猝灭剂。
一些实施方式中，可检测探针包含发射光谱可区分于荧光dna嵌入剂发射光谱的荧光染料。一些实施方式中，可检测探针包含选自以下物质的荧光染料：cy3、cy5、fam、hex、joe、quasar、罗丹明、rox、tamra、tet、德克萨斯红、tye和vic。一些实施方式中，可检测探针包含quasar荧光染料。一些实施方式中，可检测探针包含水解探针。
一些实施方式中，组合物还包含一种或多种缓冲剂、盐、核苷酸、引物、聚合酶和/或水。
一些实施方式中，组合物是溶液。一些实施方式中，组合物是冻干组合物。
另一方面，提供用于qpcr扩增归一化的固相支持物。一些实施方式中，固相支持物包含一个或多个分区，所述一个或多个分区各自包含本文所述的组合物(例如冻干组合物)。
另一方面，提供用于qpcr扩增归一化的试剂盒。一些实施方式中，试剂盒包含本文所述的组合物或固相支持物。
另一方面，提供对qpcr扩增相对于对照进行归一化的方法。一些实施方式中，所述方法包括：
将靶核酸和对照核酸与以下物质合并形成反应混合物：(i)荧光dna嵌入剂、(ii)包含靶核酸特异性正向引物和靶核酸特异性反向引物的靶核酸特异性引物组、(iii)特异性关联对照核酸的可检测探针和(iv)包含正向猝灭引物和反向猝灭引物的特异性结合对照核酸的荧光猝灭引物组，其中，正向猝灭引物和反向猝灭引物各自包含两个或更多个猝灭剂，所述两个或更多个猝灭剂位于引物内以至猝灭剂由此猝灭对照核酸扩增产物(对照核酸扩增子)发出的所有或基本上所有荧光；
在适合产生靶核酸扩增子和对照核酸扩增子的条件下孵育反应混合物，荧光dna嵌入剂既结合靶核酸扩增子也结合对照核酸扩增子，并且，产生的对照核酸扩增子包含多个掺入扩增子内的猝灭剂；
激发荧光dna嵌入剂(例如采用激发光源)，掺入所述对照核酸扩增子内的猝灭剂猝灭与对照核酸扩增子结合的荧光dna嵌入剂所发出荧光的至少部分；以及
检测所述靶核酸扩增子和所述对照核酸扩增子，其中，通过检测荧光dna嵌入剂发出的荧光信号来检测靶核酸扩增子，并且通过检测可检测探针来检测对照核酸扩增子。
一些实施方式中，所述方法包括：
将靶核酸和对照核酸与以下物质合并形成反应混合物：(i)荧光dna嵌入剂、(ii)包含靶核酸特异性正向引物和靶核酸特异性反向引物的靶核酸特异性引物组、(iii)特异性关联对照核酸的可检测探针和(iv)包含正向猝灭引物和反向猝灭引物的特异性结合对照核酸的荧光猝灭引物组，其中，正向猝灭引物和反向猝灭引物各自包含位于或靠近引物5'末端的第一猝灭剂和靠近引物3'末端的第二猝灭剂；
在适合产生靶核酸扩增子和对照核酸扩增子的条件下孵育反应混合物，荧光dna嵌入剂既结合靶核酸扩增子也结合对照核酸扩增子，并且，产生的对照核酸扩增子包含多个掺入扩增子内的猝灭剂；
激发荧光dna嵌入剂(例如采用激发光源)，掺入所述对照核酸扩增子内的猝灭剂猝灭与对照核酸扩增子结合的荧光dna嵌入剂所发出荧光的至少部分；以及
检测所述靶核酸扩增子和所述对照核酸扩增子，其中，通过检测荧光dna嵌入剂发出的荧光信号来检测靶核酸扩增子，并且通过检测可检测探针来检测对照核酸扩增子。
一些实施方式中，就正向猝灭引物和/或反向猝灭引物而言，第一猝灭剂位于5'末端或距5'末端5个碱基以内，第二猝灭剂距3'末端5-10个碱基以内。一些实施方式中，就正向猝灭引物和/或反向猝灭引物而言，第一猝灭剂和第二猝灭剂相隔至多约25个碱基。
一些实施方式中，可检测探针包含发射光谱可区分于荧光dna嵌入剂发射光谱的荧光染料。一些实施方式中，可检测探针发出的荧光信号与荧光dna嵌入剂发出的信号是可区分的，所述方法还包括激发可检测探针并检测由可检测探针发出的荧光信号。一些实施方式中，荧光dna嵌入剂是sybrgreeni、evagreen、picogreen、溴乙锭、sybrgold、yo-yo、yo-pro、toto、boxto或bebo。一些实施方式中，可检测探针包含选自以下物质的荧光染料：cy3、cy5、fam、hex、joe、quasar、罗丹明、rox、tamra、tet、德克萨斯红、tye和vic。
一些实施方式中，可检测探针特直接结合对照核酸。一些实施方式中，可检测探针与寡核苷酸接合。一些实施方式中，可检测探针与特异性结合对照核酸的荧光猝灭引物之一或两者接合。一些实施方式中，可检测探针与正向猝灭引物接合。一些实施方式中，可检测探针与反向猝灭引物接合。一些实施方式中，可检测探针与正向猝灭引物或者反向猝灭引物接合，合并步骤还包括将样品与如下所述的寡核苷酸合并，所述寡核苷酸与引物上一部分杂交并包含猝灭可检测探针发出的信号的猝灭剂。一些实施方式中，可检测探针与杂交正向猝灭引物或反向猝灭引物一部分的寡核苷酸接合。一些实施方式中，可检测探针与杂交正向猝灭引物或者反向猝灭引物上一部分的寡核苷酸接合，所述寡核苷酸所杂交的引物还包含猝灭可检测探针发出的信号的猝灭剂。一些实施方式中，可检测探针与杂交正向猝灭引物或者反向猝灭引物上一部分的寡核苷酸接合，所述寡核苷酸还包含猝灭可检测探针发出的信号的猝灭剂。
一些实施方式中，所述检测步骤包括测定靶核酸扩增子和对照核酸扩增子的定量循环数(cq)。一些实施方式中，所述检测步骤包括对荧光dna嵌入剂发出的荧光信号的量和可检测探针发出的信号的量进行定量。
另一方面，还提供用于在同一孔中对两个或更多个靶核酸进行多重qpcr扩增的组合物、试剂盒和方法。一些实施方式中，用于两个靶核酸多重qpcr扩增的组合物包含：
包含第一靶核酸特异性正向引物和第一靶核酸特异性反向引物的第一靶核酸特异性引物组；
包含特异性结合第二靶核酸的正向猝灭引物和反向猝灭引物的第二靶核酸特异性引物组，其中，正向猝灭引物和反向猝灭引物各自包含两个或更多个猝灭剂，所述两个或更多个猝灭剂位于引物内以至猝灭剂由此猝灭第二靶核酸扩增产物发出的所有或基本上所有荧光；和
特异性关联第二靶核酸的可检测探针。
一些实施方式中，所述组合物包含：
包含第一靶核酸特异性正向引物和第一靶核酸特异性反向引物的第一靶核酸特异性引物组；
包含特异性结合第二靶核酸的正向猝灭引物和反向猝灭引物的第二靶核酸特异性引物组，其中，正向猝灭引物和反向猝灭引物各自包含位于或靠近引物5'末端的第一猝灭剂和靠近引物3'末端的第二猝灭剂；和
特异性关联第二靶核酸的可检测探针。
一些实施方式中，所述组合物还包含荧光dna嵌入剂。一些实施方式中，荧光dna嵌入剂是sybrgreeni、evagreen、picogreen、溴乙锭、sybrgold、yo-yo、yo-pro、toto、boxto或bebo。一些实施方式中，荧光dna嵌入剂是sybrgreeni。
一些实施方式中，可检测探针特直接结合第二靶核酸。
一些实施方式中，可检测探针与寡核苷酸接合。一些实施方式中，可检测探针与特异性结合第二靶核酸的荧光猝灭引物之一或两者接合。一些实施方式中，可检测探针与正向猝灭引物接合。一些实施方式中，可检测探针与反向猝灭引物接合。一些实施方式中，可检测探针与正向猝灭引物或者反向猝灭引物接合，所述组合物还包含与引物上一部分杂交的寡核苷酸，所述寡核苷酸包含猝灭可检测探针发出的信号的猝灭剂。一些实施方式中，可检测探针与杂交正向猝灭引物或反向猝灭引物一部分的寡核苷酸接合。一些实施方式中，可检测探针与杂交正向猝灭引物或者反向猝灭引物上一部分的寡核苷酸接合，所述寡核苷酸所杂交的引物还包含猝灭可检测探针发出的信号的猝灭剂。一些实施方式中，可检测探针与杂交正向猝灭引物或者反向猝灭引物上一部分的寡核苷酸接合，所述寡核苷酸还包含猝灭可检测探针发出的信号的猝灭剂。
一些实施方式中，可检测探针包含发射光谱可区分于荧光dna嵌入剂发射光谱的荧光染料。一些实施方式中，可检测探针包含选自以下物质的荧光染料：cy3、cy5、fam、hex、joe、quasar、罗丹明、rox、tamra、tet、德克萨斯红、tye和vic。一些实施方式中，可检测探针包含quasar荧光染料。一些实施方式中，可检测探针包含水解探针。
一些实施方式中，用于多重qpcr扩增的试剂盒包含本文所述的组合物。
一些实施方式中，用于多重qpcr扩增的方法包括：
将包含第一靶核酸和第二靶核酸的样品与以下物质合并形成反应混合物：(i)荧光dna嵌入剂，(ii)包含第一靶核酸特异性正向引物和第一靶核酸特异性反向引物的第一靶核酸特异性引物组、(iii)特异性关联第二靶核酸的可检测探针和(iv)包含特异性结合第二靶核酸的正向猝灭引物和反向猝灭引物的第二靶核酸特异性引物组，其中，正向猝灭引物和反向猝灭引物各自包含两个或更多个猝灭剂，所述两个或更多个猝灭剂位于引物内以至猝灭剂由此猝灭第二靶核酸扩增产物发出的所有或基本上所有荧光；
在适合产生第一靶核酸扩增子和第二靶核酸扩增子的条件下孵育反应混合物，荧光dna嵌入剂既结合第一靶核酸扩增子也结合第二靶核酸扩增子，并且，产生的第二靶核酸扩增子包含多个掺入扩增子内的猝灭剂；
激发荧光dna嵌入剂，掺入第二靶核酸扩增子内的猝灭剂猝灭与第二靶核酸扩增子结合的荧光dna嵌入剂所发出荧光的至少部分；和
检测第一靶核酸扩增子和第二靶核酸扩增子，其中，通过检测荧光dna嵌入剂发出的荧光信号来检测第一靶核酸扩增子，并且通过检测可检测探针来检测第二靶核酸扩增子。
一些实施方式中，用于多重qpcr扩增的方法包括：
将包含第一靶核酸和第二靶核酸的样品与以下物质合并形成反应混合物：(i)荧光dna嵌入剂，(ii)包含第一靶核酸特异性正向引物和第一靶核酸特异性反向引物的第一靶核酸特异性引物组、(iii)特异性关联第二靶核酸的可检测探针和(iv)包含特异性结合第二靶核酸的正向猝灭引物和反向猝灭引物的第二靶核酸特异性引物组，其中，正向猝灭引物和反向猝灭引物各自包含位于或靠近引物5'末端的第一猝灭剂和靠近引物3'末端的第二猝灭剂；
在适合产生第一靶核酸扩增子和第二靶核酸扩增子的条件下孵育所述反应混合物，荧光dna嵌入剂既结合第一靶核酸扩增子也结合第二靶核酸扩增子，并且，产生的第二靶核酸扩增子包含多个掺入扩增子内的猝灭剂；
激发荧光dna嵌入剂，掺入第二靶核酸扩增子内的猝灭剂猝灭与第二靶核酸扩增子结合的荧光dna嵌入剂所发出荧光的至少部分；和
检测第一靶核酸扩增子和第二靶核酸扩增子，其中，通过检测荧光dna嵌入剂发出的荧光信号来检测第一靶核酸扩增子，并且通过检测可检测探针来检测第二靶核酸扩增子。
一些实施方式中，正向猝灭引物和反向猝灭引物中各自包含位于或靠近所述引物5'末端的第一猝灭剂和靠近引物3'末端的第二猝灭剂。一些实施方式中，就正向猝灭引物和/或反向猝灭引物而言，第一猝灭剂位于5'末端或距5'末端5个碱基以内，第二猝灭剂距3'末端5-10个碱基以内。一些实施方式中，就正向猝灭引物和/或反向猝灭引物而言，第一猝灭剂和第二猝灭剂相隔至多约25个碱基。
一些实施方式中，可检测探针发出的荧光信号与荧光dna嵌入剂发出的信号是可区分的，所述方法还包括激发可检测探针并检测由可检测探针发出的荧光信号。一些实施方式中，可检测探针包含水解探针。一些实施方式中，可检测探针包含选自以下物质的荧光染料：cy3、cy5、fam、hex、joe、quasar、罗丹明、rox、tamra、tet、德克萨斯红、tye和vic。一些实施方式中，荧光dna嵌入剂是sybrgreeni、evagreen、picogreen、溴乙锭、sybrgold、yo-yo、yo-pro、toto、boxto或bebo。
一些实施方式中，可检测探针特直接结合第二靶核酸。一些实施方式中，可检测探针与寡核苷酸接合。一些实施方式中，可检测探针与特异性结合第二靶核酸的荧光猝灭引物之一或两者接合。一些实施方式中，可检测探针与正向猝灭引物接合。一些实施方式中，可检测探针与反向猝灭引物接合。一些实施方式中，可检测探针与正向猝灭引物或者反向猝灭引物接合，合并步骤还包括将样品与如下所述的寡核苷酸合并，所述寡核苷酸与引物上一部分杂交并包含猝灭可检测探针发出的信号的猝灭剂。一些实施方式中，可检测探针与杂交正向猝灭引物或反向猝灭引物一部分的寡核苷酸接合。一些实施方式中，可检测探针与杂交正向猝灭引物或者反向猝灭引物上一部分的寡核苷酸接合，所述寡核苷酸所杂交的引物还包含猝灭可检测探针发出的信号的猝灭剂。一些实施方式中，可检测探针与杂交正向猝灭引物或者反向猝灭引物上一部分的寡核苷酸接合，所述寡核苷酸还包含猝灭可检测探针发出的信号的猝灭剂。
一些实施方式中，检测步骤包括测定所述第一靶核酸扩增子和所述第二靶核酸扩增子的定量循环数(cq)。一些实施方式中，检测步骤包括对荧光dna嵌入剂发出的荧光信号的量和可检测探针发出的信号的量进行定量。
附图简要说明
图1：形成可与目标基因检测并行的对照检测的一般方法。
图2a-2b:(a)荧光猝灭引物的设计。这一设计例中，引物含2个猝灭剂：1个猝灭剂位于引物的5'末端，另一个猝灭剂靠近引物3'末端(距3'末端7个碱基以内)。(b)对照核酸的pcr反应产物，其中荧光猝灭引物的猝灭剂掺入pcr反应产物中，dna嵌入剂与pcr反应产物结合。
图3a-3c：(a)无对照检测的ccnd1检测。(b)有猝灭对照检测存在的ccnd1检测。(c)有非猝灭对照检测存在的ccnd1检测。
图4：qpcr中产物特异性猝灭的例子。虽然终点强度不同，探针荧光(红色)产生单个定量循环数(cq)，如水平线所示。非猝灭和猝灭对照检测的sybrgreen荧光(绿色)相差约6-7cq。6cq大致相当于猝灭检测的sybrgreen荧光强度降低40-80倍(40-80x)。
图5a-5b：猝灭荧光qpcr检测的均一性评估。(a)该图显示无cdna时的探针信号(红色)和sybrgreen荧光(绿色)。(b)图表显示对应于不同标准差截值的探针荧光和cq值。
图6a-6b：肝素对目标基因p53检测中sybrgreen荧光的影响。(a)无对照检测的p53检测。(b)有猝灭对照检测存在的p53检测。
图7：产物介导猝灭检测的示意图，检测采用与引物接合的可检测探针。该方法中，结合目标核酸序列的正向引物包含猝灭嵌入染料的猝灭剂(bhq1)，还包含可检测探针即荧光团(q705)。与正向引物上一部分杂交的寡核苷酸包含与可检测探针q705相容的猝灭剂(bhq3)。引物结合和延伸使得正向引物与结合引物的寡核苷酸解离。这种解离，加上引物掺入最终的pcr产物中，结果，bhq1猝灭剂猝灭嵌入染料，可检测的探针荧光团q705则发出荧光。
发明具体实施方式
i.引言
本文涉及用于减少pcr反应中特定产物荧光发射的组合物和方法。当pcr反应产生产物时，通常将结合双链dna的荧光染料用于qpcr来产生信号。此类分子的例子之一是sybrgreen。sybrgreen结合pcr反应过程中产生的双链dna。以适当波长的光激发时，与pcr产物结合的sybrgreen发出荧光，由此实现扩增目标靶标的实时扩增。尽管sybrgreen检测具有无需检测昂贵的水解探针的优点，但由于难以在同一反应中评估超过一种产物，因此无法在同一反应孔中同时进行标准化检测或对照检测。
一方面，本文提供的组合物、试剂盒和方法允许在采用嵌入染料来产生信号的靶标检测同一孔中同时扩增对照检测。如本文所述，本文的组合物和方法特异性猝灭至少部分由结合对照pcr产物的双链dna结合染料(即荧光dna嵌入剂)发射的信号，但不猝灭靶标pcr产物发出的双链dna结合染料信号。一些实施方式中，对照检测包括可检测探针，可检测探针发出的信号与嵌入染料信号可区分，可以通过检测该可检测探针来监测反应并确定扩增反应是否良好。
另一方面，本文提供的组合物、试剂盒和方法允许在同一孔中同时扩增两个不同的靶核酸，其中，一个靶核酸用嵌入染料来检测，另一个靶核酸用可检测探针来检测，可检测探针发送的信号可区分于嵌入染料信号。
ii.定义
除非另外定义，本文中使用的科技术语其含意与本领域普通技术人员通常所理解的相同。参见例如lackie，dictionaryofcellandmolecularbiology(《细胞和分子生物学词典》)，埃尔斯威尔出版社(elsevier)(第4版2007)；sambrook等，molecularcloning,alaboratorymanual(《分子克隆，实验室手册》)，冷泉港实验室出版社(冷泉港，纽约1989)。术语“一个”或“一种”等意在表示“一个(种)或多个(种)”等。当术语“包含”及其各种变体例如“包括”和“含有”位于记述的步骤或要素之前时意在标识不排除增加其他步骤或元素，而这种增加是可选的。本发明的实施可采用任何与本文所述相似或等同的方法、装置和材料。以下定义用来帮助理解本文中的一些常用术语但不对本文公开的范围构成限制。
在本文中，“靶核酸”指待检测的多核苷酸序列。一些实施方式中，靶标是基因或基因的部分。一些实施方式中，靶标是具有癌症等疾病相关突变的多核苷酸序列(例如，基因或基因的部分)。一些实施方式中，靶标是具有癌症等疾病相关稀有突变的多核苷酸序列。
本文中，“核酸”表示dna、rna、单链、双链或聚集度更高的杂交基序及其任意化学修饰形式。修饰包括但不限于给核酸配体碱基或核酸配体整体提供化学基团的那些修饰，所述化学基团引入附加电荷、极化性、氢键、静电相互作用、连接点和官能团。这类修饰包括但不限于：肽核酸(pna)、磷酸二酯基团修饰(例如，硫代磷酸酯、甲基膦酸酯)、2'-位糖修饰、5-位嘧啶修饰、8-位嘌呤修饰、环外胺修饰、4-硫尿核苷取代、5-溴或5-碘-尿嘧啶取代、骨架修饰、甲基化、稀有碱基配对组合如异碱基(isobase)、异胞苷和异胍(isoguanidine)等。核酸还可以包含非天然碱基，如硝基吲哚。
本文中，“荧光dna嵌入剂”指可逆地结合或插入双链核酸(例如双链dna)碱基之间的小分子。荧光dna嵌入剂结合到双链核酸时发射荧光信号，未结合到双链核酸时不发射或发射较少信号。荧光dna嵌入剂的例子包括但不限于：sybrgreeni、sybrgreenii、sybrgold、yo-yo、yo-pro、toto、picogreen和evagreen。
本文中，“猝灭剂”指猝灭荧光化合物(例如荧光dna嵌入剂或荧光可检测探针)发出的信号的化合物(例如小分子染料)。一些实施方式中，猝灭剂吸收来自荧光化合物(例如荧光dna嵌入剂或荧光可检测探针)的激发能并以热量形式耗散从荧光化合物吸收的能量。
本文中，“引物”指与靶核酸或对照核酸上的序列杂交并且作为核酸合成起点的多核苷酸序列。引物可以有多种长度。一些实施方式中，引物长度小于100个核苷酸，例如长度为约10至约50、约15至约40、约15至约30、约20至约80、约20至约60个核苷酸。用于扩增反应(例如pcr)的引物长度和序列可根据本领域技术人员所知的原理来设计，参见例如innis等编，(1990)《pcr方案：方法和应用指南》(pcrprotocols:aguidetomethodsandapplications)。一些实施方式中，引物包含一个或多个修饰核苷碱基或非天然核苷碱基。
本文中，“猝灭引物”指含有一个或多个与之接合的猝灭剂的引物。一些实施方式中，猝灭引物含有两个或更多个与之接合的猝灭剂，例如接合在引物5'末端或5'末端附近的第一猝灭剂和接合在引物的3'末端或3'末端附近的第二猝灭剂。
核酸或其部分在一定条件下与另一个核酸“杂交”从而使得生理缓冲剂中一定温度下非特异性杂交最小化。一些情形中，核酸或其部分与靶核酸组的共有保守序列杂交。一些情形中，如果有至少约6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个连续互补核苷酸，包括与一个以上核苷酸伴侣互补的“通用”核苷酸，则引物或其部分会与引物结合位点杂交。或者，如果至少约12、13、14、15、16、17、18、19、20、25或30个连续互补核苷酸中有不到1或2个互补错配，则引物或其部分会与引物结合位点杂交。一些实施方式中，发生特异性杂交的温度是室温。一些实施方式中，发生特异性杂交的温度高于室温。一些实施方式中，发生特异性杂交的温度为至少约37、40、42、45、50、55、60、65、70、75或80℃，例如约45℃-60℃，例如约55℃-59℃。一些实施方式中，发生特异性杂交的温度比引物的算得解链温度低约5℃。
术语“扩增反应”在本文中指用于令靶核酸序列拷贝以线性或指数方式倍增的各种体外手段。这类方法包括但不限于聚合酶链式反应(pcr)、实时pcr、dna连接酶链反应(参见美国专利号4,683,195和4,683,202；《pcr方案：方法和应用指南》(pcrprotocols:aguidetomethodsandapplications)(innis等编，1990))(lcr)；基于qbetarna复制酶和基于rna转录的扩增反应(例如包括t7、t3或sp6引发的rna聚合的扩增)，例如转录扩增系统(tas)，基于核酸序列的扩增(nasba)和自主序列复制(3sr)；等温扩增反应(例如单引物等温扩增(spia))；或环介导等温扩增(lamp)；以及本领域技术人员所知的其它方法。
“扩增”在此是指令溶液(例如在反应孔中)处于足以允许多核苷酸扩增从而产生扩增产物或“扩增子”的条件的步骤。扩增反应的组分包括例如引物、多核苷酸模板、聚合酶、核苷酸等。扩增一词通常指靶核酸(或对照核酸)的指数型增加。然而，本文中，扩增也可指核酸的特定靶序列(或对照序列)数量的线性增加，例如循环测序的结果。示例性实施方式之一中，扩增指采用第一和第二扩增引物的pcr扩增。
术语“聚合酶链式反应”或“pcr”指一种令靶双链dna的特定区段或子序列得以几何级数扩增的方法。pcr是本领域技术人员所熟知的；参见例如，美国专利号4,683,195和4,683,202；和《pcr方案：方法和应用指南》，innis等编，1990。示例性pcr反应条件一般包括两步循环或三步循环。两步循环具有变性步骤和之后的杂交/延伸步骤。三步循环包括变性步骤，之后是杂交步骤，之后是独立的延伸步骤。
iii.用于定量pcr归一化和多重定量pcr的组合物
一方面，提供用于扩增反应例如qpcr的组合物(例如反应混合物)。一些实施方式中，所述组合物可用于将扩增(例如qpcr扩增)相对于对照进行归一化。一些实施方式中，所述组合物可用于在同一分区(例如同一反应孔中)进行多重扩增反应(例如多重qpcr)。
一些实施方式中，用于扩增归一化的组合物包含特异性结合对照核酸的荧光猝灭引物组，所述引物组包含正向猝灭引物和反向猝灭引物，其中，正向猝灭引物和反向猝灭引物各自包含两个或更多个猝灭剂，所述两个或更多个猝灭剂位于引物内以至猝灭剂由此猝灭对照核酸扩增产物发出的所有或基本上所有荧光；以及特异性关联对照核酸的可检测探针。一些实施方式中，可检测探针直接结合对照核酸。一些实施方式中，可检测探针与寡核苷酸接合，例如与特异性结合对照核酸的猝灭引物之一或两者接合或与杂交正向猝灭引物或反向猝灭引物上一部分的寡核苷酸接合。
一些实施方式中，用于扩增归一化的组合物包含特异性结合对照核酸的荧光猝灭引物组，所述引物组包含正向猝灭引物和反向猝灭引物，其中，正向猝灭引物和反向猝灭引物各自包含位于或靠近引物5'末端的第一猝灭剂和靠近引物3'末端的第二猝灭剂；以及特异性关联对照核酸的可检测探针。
一些实施方式中，用于扩增归一化的组合物包含：
特异性结合对照核酸的荧光猝灭引物组，所述引物组包含正向猝灭引物和反向猝灭引物，其中，正向猝灭引物和反向猝灭引物各自包含位于或靠近引物5'末端的第一猝灭剂和靠近引物3'末端的第二猝灭剂；
特异性关联对照核酸的可检测探针；和
对照核酸，其中所述对照核酸包含与所述正向猝灭引物结合的正向引物结合位点，与所述探针结合的探针结合位点以及与所述反向猝灭引物结合的反向引物结合位点。
一些实施方式中，用于进行第一靶核酸和第二靶核酸多重扩增反应的组合物包含第二靶核酸特异性引物组，该引物组包括特异性结合第二靶核酸的正向猝灭引物和反向猝灭引物，其中，正向猝灭引物和反向猝灭引物各自包含两个或更多个猝灭剂，所述两个或更多个猝灭剂位于引物内以至猝灭剂由此猝灭第二靶核酸扩增产物发出的所有或基本上所有的荧光；以及特异性关联第二靶核酸的可检测探针。
一些实施方式中，用于进行第一靶核酸和第二靶核酸多重扩增反应的组合物包含第二靶核酸特异性引物组，该引物组包括特异性结合第二靶核酸的正向猝灭引物和反向猝灭引物，其中，正向猝灭引物和反向猝灭引物各自包含位于或靠近引物5'末端的第一猝灭剂和靠近引物3'末端的第二猝灭剂；以及特异性关联第二靶核酸的可检测探针。
一些实施方式中，用于进行多重扩增反应的组合物包含：
包含第一靶核酸特异性正向引物和第一靶核酸特异性反向引物的第一靶核酸特异性引物组；
包含特异性结合第二靶核酸的正向猝灭引物和反向猝灭引物的第二靶核酸特异性引物组，其中，正向猝灭引物和反向猝灭引物各自包含位于或靠近引物5'末端的第一猝灭剂和靠近引物3'末端的第二猝灭剂；和
特异性关联第二靶核酸的可检测探针。
一些实施方式中，所述组合物还包含荧光dna嵌入剂。一些实施方式中，所述组合物如本文所述还包含一种或多种其他试剂(例如用于靶核酸的引物和/或扩增试剂)。
对照核酸
一些实施方式中，本文所述组合物(例如反应混合物)包含对照核酸。一些实施方式中，对照核酸包含人工序列，所述人工序列与任何已知核酸序列(例如任何公开核酸数据库中的任意核酸序列)都没有显著的序列相似性。产生人工核酸序列的方法在本领域多有记载。参见例如caballero等，nucl.acidsres.，2014，42(12):e99。一些实施方式中，对照核酸包含后文实施例部分记载的序列或与后文实施例部分记载的序列基本相同。
对照核酸可以是单链或双链的，或者可以既含有双链部分又含有单链序列部分。例如，核酸序列可以是基因组dna、cdna、mrna，或是dna与rna的组合或杂合体。
荧光猝灭引物
一些实施方式中，组合物包含一组荧光猝灭引物，其中包含正向猝灭引物和反向猝灭引物。一些实施方式中，荧光猝灭引物特异性结合对照核酸，例如前文所述。一些实施方式中，荧光猝灭引物特异性结合第二靶核酸，例如前文所述。设计特异性结合目标序列(例如对照核酸)的扩增引物的方法是本领域所知的。例如参见thornton等，biochem.mol.biol.educ.，2011,39:145-154。
一些实施方式中，猝灭引物(例如正向猝灭引物和/或反向猝灭引物)长度至少为15个核苷酸，例如至少20、至少25、至少30、至少35、至少40、至少45或至少50个核苷酸。一些实施方式中，猝灭引物(例如正向猝灭引物和/或反向猝灭引物)长度约为15-100个核苷酸，例如约20-80、约15-50、约20-30或约15-30个核苷酸。
一些实施方式中，猝灭引物(例如正向猝灭引物和/或反向猝灭引物)含有至少两个猝灭剂。一些实施方式中，猝灭引物含有超过两个猝灭剂，例如有3、4、5、6、7、8、9或10个猝灭剂。猝灭引物中所用猝灭剂的数量可根据引物长度而不同。一些实施方式中，猝灭剂位于引物内部以至猝灭剂猝灭扩增产物(例如对照核酸的扩增产物或第二靶核酸的扩增产物)发出的所有或基本上所有的荧光。一些实施方式中，引物上猝灭剂之间的距离不超过由猝灭剂来猝灭的荧光团的
一些实施方式中，猝灭剂是吸收来自荧光团的激发能的小分子染料(在本领域中亦称“暗猝灭剂”)。猝灭剂在本领域多有记载。猝灭剂的例子包括但不限于：blackhole
一些实施方式中，第一猝灭剂接合在引物的5'末端或5'末端附近。本文中，如果猝灭剂距离引物末端10个碱基之内则该猝灭剂“靠近”引物末端。一些实施方式中，第一猝灭剂接合处距离引物5'末端1-10个碱基之内，例如距离引物5'末端1-8个碱基之内、1-5个碱基之内、5-10个碱基之内、或2-8个碱基之内。一些实施方式中，第一猝灭剂距离引物5'末端约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个碱基。一些实施方式中，第一猝灭剂位于引物的5'末端。
一些实施方式中，第二猝灭剂接合在引物的3'末端附近。一些实施方式中，第二猝灭剂接合处距离引物3'末端至少1个碱基，例如距离引物3'末端至少2个碱基、至少3个碱基、至少4个碱基、或至少5个碱基。一些实施方式中，第二猝灭剂接合处距离3'末端5-10个碱基之内，例如距离引物3'末端5-8个碱基之内。一些实施方式中，第一猝灭剂距离引物5'末端约2、3、4、5、6、7、8、9或10个碱基。
将猝灭剂与多核苷酸序列接合的方法在本领域多有记载。参见例如wo2001/086001和us2005/0164225。一些实施方式中，猝灭剂与引物共价接合。
dna嵌入剂
一些实施方式中，组合物还包括荧光dna嵌入剂。荧光dna嵌入剂是嵌入或结合双链核酸时发出荧光的小分子。通常，荧光dna嵌入剂嵌入或结合双链核酸时发出荧光的水平显著高于未结合时的基线荧光水平。一些实施方式中，未结合双链核酸时荧光dna嵌入剂发出的荧光水平非常低。
荧光dna嵌入剂的例子包括但不限于：9-氨基吖啶，溴乙锭，菲啶染料，evagreen，picogreen(p-7581，分子探针公司(molecularprobes))，碘化丙啶(p-4170，西格玛公司(sigma))，吖啶橙(a-6014，西格玛公司)，噻唑橙，噁唑黄，7-氨基放线菌素d(a-1310，分子探针公司(molecularprobes))，菁染料(例如toto、yoyo、bobo和popo)，syto，sybrgreeni(美国专利第5,436,134号:n',n'-二甲基-n-[4-[(e)-(3-甲基-1,3-苯并噻唑-2-亚基)甲基]-1-苯基喹喏啉-1-鎓-2-基]-n-丙基丙-1,3-二胺)，sybrgreenii(美国专利第5,658,751号)，sybrdx，oligreen，cyquantgr，sytoxgreen，syto9，syto10，syto17，sybr14，fun-1，deadred，碘乙啶(hexidiumiodide)，二氢乙锭，乙锭均二聚物，9-氨基-6-氯-2-甲氧基吖啶，dapi，dipi，吲哚染料，咪唑染料，羟芪巴脒(fluorogold)，lds751(美国专利第6,210,885号)和以下文献中记载的染料：georghiou，photochemistryandphotobiology，26:59-68，佩加蒙出版社(pergamonpress)(1977)；kubota等，biophys.chem.，6:279-284(1977)；genest等，nucleicacidsres.，13:2603-2615(1985)；asseline，emboj.，3:795-800(1984)；richardson等的美国专利第4,257,774号和letsinger等的美国专利第4,547,569号。一些实施方式中，荧光dna嵌入剂是sybrgreeni、evagreen、picogreen、溴乙锭、sybrgold、yo-yo、yo-pro、toto、boxto或bebo。一些实施方式中，荧光dna嵌入剂是sybrgreeni。
可检测探针
一些实施方式中，可检测探针特异性关联待扩增的核酸序列(例如对照核酸或第二靶核酸)。一些实施方式中，可检测探针特异性结合(例如直接结合)核酸序列。一些实施方式中，可检测探针与寡核苷酸序列(例如引物)接合，所述寡核苷酸序列结合或不结合待扩增核酸序列，例如见后文详述。
一些实施方式中，可检测探针包含与待扩增核酸序列某一区域(例如对照核酸的某一区域或第二靶核酸的某一区域)杂交的寡核苷酸序列。一些实施方式中，可检测探针特包含长度约15-100个核苷酸、例如约15-75、15-50、18-50、20-50、15-30或18-30个核苷酸的寡核苷酸序列。
一些实施方式中，可检测探针与特异性结合某核酸的荧光猝灭引物之一或两者(例如本文所述的正向猝灭引物或反向猝灭引物)接合。一些实施方式中，可检测探针与正向猝灭引物接合。一些实施方式中，可检测探针与反向猝灭引物接合。一些实施方式中，可检测探针与正向猝灭引物和反向猝灭引物两者接合。一些实施方式中，可检测探针与正向猝灭引物或者反向猝灭引物接合，另有与正向猝灭引物或者反向猝灭引物一部分杂交的寡核苷酸，所述寡核苷酸包含猝灭可检测探针发出的信号的猝灭剂。
一些实施方式中，可检测探针与杂交正向猝灭引物或反向猝灭引物一部分的寡核苷酸接合。一些实施方式中，可检测探针与杂交正向猝灭引物或者反向猝灭引物上一部分的寡核苷酸接合，所述寡核苷酸所杂交的引物还包含猝灭可检测探针发出的信号的猝灭剂。一些实施方式中，可检测探针与杂交正向猝灭引物或者反向猝灭引物上一部分的寡核苷酸接合，所述寡核苷酸还包含猝灭可检测探针发出的信号的猝灭剂。一些实施方式中，猝灭剂与寡核苷酸上的可检测探针足够近从而猝灭所有或基本上所有可检测探针发出的信号。一些实施方式中，所述寡核苷酸长约15-100个核苷酸，例如约15-75、15-50、18-50、20-50、15-30或18-30个核苷酸。
一些实施方式中，与扩增产物(例如对照核酸扩增子)关联的可检测探针在扩增反应中产生可检测的信号。一些实施方式中，可检测探针包含可检测物质，例如荧光剂、磷光剂、化学发光剂等。一些实施方式中，可检测探针包含荧光剂。荧光剂可包括各种有机和/或无机小分子或各种荧光蛋白及其衍生物。一些实施方式中，所述物质是是荧光团。大量荧光团为文献所报道并为本领域技术人员所知，许多可以从生物技术领域的供应商方便地购得。荧光团的文献来源包括cardullo等，proc.natl.acad.sci.usa85:8790-8794(1988)；dexter,d.l.,j.ofchemicalphysics21:836-850(1953)；hochstrasser等，biophysicalchemistry45:133-141(1992)；selvin,p.,methodsinenzymology246:300-334(1995)；steinberg,i.ann.rev.biochem.,40:83-114(1971)；stryer,l.ann.rev.biochem.,47:819-846(1978)；wang等，tetrahedronletters31:6493-6496(1990)；以及wang等，anal.chem.67:1197-1203(1995)。荧光团的非限定性例子包括：菁类(例如cy3、cy5)，吲哚碳菁(例如
一些实施方式中，可检测探针包含发射光谱可区分于荧光dna嵌入剂发射光谱的荧光染料。本领域普通技术人员能够容易地确定荧光dna嵌入剂和可检测探针的荧光染料的激发光谱和发射光谱，并且能够确定产生可区分信号的荧光dna嵌入剂和荧光染料，例如在采用合适的荧光滤光片时。一些实施方式中，荧光dna嵌入剂的激发光谱和发射光谱与可检测探针的荧光染料的激发光谱和发射光谱基本上不重叠。
一些实施方式中，可检测探针是水解探针(亦称taqmantm探针)。通常，水解探针是在寡核苷酸5'末端共价连有荧光团而3'末端连有猝灭剂的寡核苷酸探针。taqmantm探针在与互补靶序列的杂交中依赖于dna聚合酶的5'-3'外切酶活性特异性切割探针。探针的切割令报告染料的荧光强度增加。
一些实施方式中，可检测探针是分子信标探针。通常，分子信标探针是可形成发夹结构的寡核苷酸杂交探针。在杂交探针的一端(5'或3'末端)有供体荧光团而另一端有受体部分。一些实施方式中，受体部分是吸收供体的能量但自身不发荧光的猝灭剂。见tyagi和kramer，naturebiotechnol.14:303-306(1996)。因此，当信标处于开放构象时，供体荧光团的荧光是可检测的，而当信标处于发夹(闭合)构象时，供体荧光团的荧光被猝灭。用于pcr时，与pcr产物的一条链杂交的分子信标探针处于开发构象，因此可检测到荧光，而未杂交的那些不产生荧光。
其他扩增反应组分
一些实施方式中，组合物还包含一种或多种其他试剂，例如扩增试剂。一些实施方式中，组合物还包含一种或多种以下物质：缓冲剂、盐、核苷酸、稳定剂、引物、聚合酶、或无核酸酶的水。
一些实施方式中，组合物包含dna聚合酶。用于本文所述组合物和方法的dna聚合酶可以是能够复制dna分子的任何聚合酶。一些实施方式中，所述dna聚合酶是热稳定聚合酶。热稳定聚合酶分离自多重嗜热细菌，如水生栖热菌(thermusaquaticus)(taq)，激烈热球菌(pyrococcusfuriosus)(pfu)，沃氏火球菌(pyrococcuswoesei)(pwo)，嗜热芽孢杆菌(bacillussterothermophilus)(bst)，嗜酸热硫化叶菌(sulfolobusacidocaldarius)(sac)，硫磺矿硫化叶菌(sulfolobussolfataricus)(sso)，隐蔽热网菌(pyrodictiumoccultum)(poc)，阿比热网菌(pyrodictiumabyssi)(pab)，和嗜热自养甲烷杆菌(methanobacteriumthermoautotrophicum)(mth)，以及其他物种。dna聚合酶是本领域所知的，并且市售可得。一些实施方式中，dna聚合酶是taq、tbr、tfl、tru、tth、tli、tac、tne、tma、tih、tfi、pfu、pwo、kod、bst、sac、sso、poc、pab、mth、pho、es4、venttm、deepventtm，或其活性突变体、变体或衍生物。一些实施方式中，dna聚合酶是taqdna聚合酶。一些实施方式中，dna聚合酶是高保真dna聚合酶(例如，iprooftm高保真dna聚合酶，
一些实施方式中，组合物包含核苷酸。用于本文所述组合物和方法中的核苷酸可以是可用于核酸聚合的任何核苷酸。核苷酸可以是天然的、稀有的、修饰的、衍生的、或者人工的。核苷酸可以未加标的，或者可以通过本领域技术人员已知的方法可检测地标记(例如采用放射性同位素、维生素、荧光部分或化学发光部分，地高辛(dioxigenin))。一些实施方式中，核苷酸是脱氧核苷三磷酸(“dntp”，例如datp、dctp、dgtp、dttp、ditp、dutp、α-硫代-dnit、生物素-dutp、荧光素-dutp、地高辛-dutp或7-脱氮-dgtp)。dntp也是本领域熟知的，并且市售可得。核苷酸可以任意合适的浓度存在。一些实施方式中，核苷酸的量为约1μm至约1000μm，例如约10μm至约750μm或约100μm至约500μm。
一些实施方式中，组合物包含一种或多种缓冲剂或盐。本领域熟知大量的缓冲剂和盐溶液以及改进型缓冲剂。例如，一些实施方式中，缓冲剂是tris、tricine、bis-tricine、hepes、mops、tes、taps、pipes或caps。一些实施方式中，盐是乙酸钾、硫酸钾、氯化钾、硫酸铵、氯化铵、乙酸铵、氯化镁、乙酸镁、硫酸镁、氯化锰、乙酸锰、硫酸锰、氯化钠、乙酸钠、氯化锂或乙酸锂。
缓冲剂和/或盐可以任意合适的浓度存在。一些实施方式中，缓冲剂的量为约0.1mm至约1000mm，例如约1mm至约500mm或约5mm至约250mm。一些实施方式中，盐的量为约0.01mm至约1000mm，例如约0.1mm至约500mm或约1mm至约100mm。一些实施方式中，组合物包含浓度约10mm至约100mm的盐(例如氯化钾或氯化镁)。
一些实施方式中，组合物包含一种或多种稳定剂。用于本文所述组合物和方法的稳定剂包括但不限于：多元醇(甘油，苏糖醇等)，包括环状聚醚的聚醚，聚乙二醇，有机盐或无机盐，如硫酸铵，硫酸钠，钼酸钠，钨酸钠，有机磺酸盐等，糖，多元醇，氨基酸，肽或羧酸，甘露醇，甘油，还原型谷胱甘肽，超氧化物歧化酶，牛血清白蛋白(bsa)或明胶，亚精胺，二硫苏糖醇(或巯基乙醇)和/或洗涤剂如
一些实施方式中，本文所述的组合物呈液体形式，例如溶液。一些实施方式中，本文所述的组合物呈冻干形式。一些实施方式中，由组合物的终端用户对冻干形式的组合物进行重建。
iv.定量pcr归一化的方法
另一方面，提供对qpcr扩增相对于对照进行归一化的方法。一些实施方式中，所述方法包括：
将靶核酸和对照核酸与以下物质合并形成反应混合物：(i)荧光dna嵌入剂、(ii)包含靶核酸特异性正向引物和靶核酸特异性反向引物的靶核酸特异性引物组、(iii)特异性关联对照核酸的可检测探针和(iv)包含正向猝灭引物和反向猝灭引物的特异性结合对照核酸的荧光猝灭引物组，所述正向猝灭引物和反向猝灭引物各自包含两个或更多个猝灭剂，所述两个或更多个猝灭剂位于引物内以至猝灭剂由此猝灭对照核酸扩增产物发出的所有或基本上所有荧光；
在适合产生靶核酸扩增子和对照核酸扩增子的条件下孵育反应混合物，荧光dna嵌入剂既结合靶核酸扩增子也结合对照核酸扩增子，并且，产生的对照核酸扩增子包含多个掺入扩增子内的猝灭剂；
激发所述荧光dna嵌入剂，掺入所述对照核酸扩增子内的猝灭剂猝灭与对照核酸扩增子结合的荧光dna嵌入剂所发出荧光的至少部分；和
检测所述靶核酸扩增子和所述对照核酸扩增子，其中，通过检测荧光dna嵌入剂发出的荧光信号来检测靶核酸扩增子，并且通过检测可检测探针来检测对照核酸扩增子。
一些实施方式中，所述方法包括：
将靶核酸和对照核酸与以下物质合并形成反应混合物：(i)荧光dna嵌入剂、(ii)包含靶核酸特异性正向引物和靶核酸特异性反向引物的靶核酸特异性引物组、(iii)特异性关联对照核酸的可检测探针和(iv)包含正向猝灭引物和反向猝灭引物的特异性结合对照核酸的荧光猝灭引物组，其中，正向猝灭引物和反向猝灭引物各自包含位于或靠近引物5'末端的第一猝灭剂和靠近引物3'末端的第二猝灭剂；
在适合产生靶核酸扩增子和对照核酸扩增子的条件下孵育反应混合物，荧光dna嵌入剂既结合靶核酸扩增子也结合对照核酸扩增子，并且，产生的对照核酸扩增子包含多个掺入扩增子内的猝灭剂；
激发所述荧光dna嵌入剂，掺入所述对照核酸扩增子内的猝灭剂猝灭与对照核酸扩增子结合的荧光dna嵌入剂所发出荧光的至少部分；和
检测所述靶核酸扩增子和所述对照核酸扩增子，其中，通过检测荧光dna嵌入剂发出的荧光信号来检测靶核酸扩增子，并且通过检测可检测探针来检测对照核酸扩增子。
靶核酸
靶核酸序列可以是任何基因、非编码基因组区域或感兴趣的序列。一些实施方式中，靶核酸序列是疾病(例如癌症、神经肌肉疾病、心血管疾病、发育性疾病或代谢性疾病)相关基因或序列。一些实施方式中，靶核酸序列是癌症相关基因或序列，包括但不限于：膀胱癌、脑癌、乳腺癌、子宫颈癌、结直肠癌、子宫内膜癌、食道癌、胃癌、头颈癌、肾癌、白血病、肝癌、肺癌、淋巴瘤、黑色素瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌或甲状腺癌。一些实施方式中，靶核酸序列是疾病相关基因或序列，包括但不限于：自闭症谱系障碍、心肌病、纤毛疾病、先天性糖基化障碍、先天性肌无力综合症、癫痫和癫痫发作症、眼疾、糖原贮积症、遗传性癌症综合征、遗传性周期性发热综合征、炎性肠病、溶酶体贮积症、多发性骨端异样增殖症、神经肌肉疾病、noonan综合征及相关疾病、过氧化物酶体生物发生性疾病或骨骼发育不良。
靶核酸可以是单链或双链，或者可以既含有双链部分又含有单链序列部分。例如，核酸序列可以是基因组dna、cdna、mrna，或是dna与rna的组合或杂合体。
一些实施方式中，靶核酸获自样品，例如生物样品。生物样品可获自任何生物体，例如动物、植物、真菌、病原体(例如细菌或病毒)或任何其他生物体。一些实施方式中，生物样品来自动物，例如哺乳动物(例如人或非人灵长类动物、牛、马、猪、羊、猫、狗、小鼠或大鼠)、鸟类(例如鸡)或鱼类。生物样品可以是获自生物体的任何组织或体液，例如血液，血液成分或血液产品(如血清、血浆、血小板、血红细胞等)，痰液或唾液，组织(如肾、肺、肝、心、脑、神经组织、甲状腺、眼、骨骼肌、软骨或骨组织)；培养的细胞，例如原代培养物，外植体和转化细胞，干细胞，粪便，尿液等。
一些实施方式中，在合并步骤之前，对包含靶核酸的样品进行一个或多个处理步骤。例如，可对样品进行纯化、分离、富集或过滤。一些实施方式中，样品中的核酸经片段化处理而产生一种或多种特定大小的片段，例如采用机械手段(如超声切割、声剪切、针剪切或超声处理)，化学方法或酶促处理(例如采用核酸内切酶)。一些实施方式中，对经片段化的核酸(例如靶核酸)进行尺寸选择步骤以获得具有特定尺寸或尺寸范围的核酸片段。尺寸选择的方法是本领域所知的。例如，经片段化的核酸可以采用凝胶电泳、旋转柱或顺磁珠来分离。
反应混合物
靶核酸在反应混合物中与对照核酸、特异性关联对照核酸的可检测探针和与对照核酸特异性结合的荧光猝灭引物组(例如前文第iii部分中所述组合物中那样)以及荧光dna嵌入剂和包含靶核酸特异性正向引物和靶核酸特异性反向引物的靶核酸特异性引物组合并。一些实施方式中，可检测探针与荧光猝灭引物接合，反应混合物还包含与引物上一部分杂交的寡核苷酸，所述寡核苷酸包含猝灭可检测探针发出的信号的猝灭剂。
一些实施方式中，靶核酸特异性引物(例如正向靶核酸特异性引物和/或反向靶核酸特异性引物)的长度为至少15个核苷酸，例如至少20、至少25、至少30、至少35、至少40、至少45或至少50个核苷酸。一些实施方式中，靶核酸特异性引物(例如正向靶核酸特异性引物和/或反向靶核酸特异性引物)的长度为约15-100个核苷酸，例如约20-80、约15-50、约20-30或约15-30个核苷酸。
一些实施方式中，反应混合物还包含一种或多种其他扩增试剂(例如前文第iii部分中所述)，例如但不限于一种或多种以下物质：缓冲剂、盐、核苷酸、稳定剂、引物、聚合酶或无核酸酶的水。
扩增
一些实施方式中，将反应混合物在适合于产生靶核酸扩增子和对照核酸扩增子的条件下孵育。一些实施方式中，靶核酸扩增子和对照核酸通过pcr扩增来扩增。其他扩增方法也是本领域知道的。
一般说来，在pcr扩增中，对反应混合物进行如下循环来扩增核酸：(i)核酸变性，(ii)寡核苷酸引物退火，和(iii)核酸聚合(延伸)。扩增的优选反应条件包括热循环，即改变反应混合物的温度来促进pcr循环的每一步。pcr通常经历多轮变性、退火和复制，并通过开始时延长变性步骤和最终延长延伸(聚合)步骤来增强(此为任选和优选)。一些实施方式中，pcr反应可以是“两步pcr”，其中，退火与延伸步骤组合成单个步骤。
合适的pcr扩增条件是本领域普通技术人员容易确定的，并且可以根据诸如待扩增靶标的量和组成、所用引物的组成以及其他扩增试剂的组成(例如dna聚合酶)等因素而改变。通常，热循环的温度范围在约23℃至约100℃之间，例如约37℃至约95℃之间。通常在约90℃至约100℃，例如约94℃发生核酸变性。通常在约37℃至约75℃，例如约58℃至约60℃发生退火。通常在约55℃至约80℃、例如约72℃发生聚合。pcr循环数可以是约5至约99轮，例如至少约10、约15、约20或约25轮。
一些实施方式中，扩增步骤产生的靶核酸扩增子包括与靶核酸扩增子结合的荧光dna嵌入剂。一些实施方式中，扩增步骤产生的对照核酸扩增子包括与对照核酸扩增子结合的荧光dna嵌入剂，还包含掺入扩增子内的多个猝灭剂。因此，虽然靶核酸扩增子和对照核酸扩增子都结合有荧光dna嵌入剂，对照核酸扩增子还含有猝灭剂，所述猝灭剂因为与对照核酸扩增子上的荧光dna嵌入剂靠地近所以特异性猝灭与对照核酸扩增子结合的荧光dna嵌入剂。
激发与检测
扩增期间，荧光dna嵌入剂插入扩增中的核酸(例如靶核酸扩增子和对照核酸扩增子)。通常，荧光dna嵌入剂与dna结合时相比未结合时表现出更强的荧光。因此，可通过检测dna嵌入剂发出的荧光来检测扩增核酸的存在性。
如图1和图2所示，dna嵌入剂发出的荧光可用来特异性地检测扩增的靶核酸的存在性，因为特异性结合对照核酸的猝灭引物猝灭了至少部分由结合对照核酸的dna嵌入剂发出的荧光信号。相比之下，不存在对照核酸的猝灭引物时，对照核酸扩增子结合dna嵌入剂发出的荧光妨碍对靶核酸结合dna嵌入剂发出荧光的特异性检测，见图3。
为了检测dna嵌入剂发出的荧光，对反应混合物施以合适的激发波长(例如用发光二极管、卤素灯或激光等光源)。一些实施方式中，用发射滤光片使得仅特定波长或波长范围施加到反应混合物。荧光dna嵌入剂的激发波长根据荧光dna嵌入剂的组成而不同。本领域普通技术人员能够容易地确定荧光dna嵌入剂合适的激发波长和由此所得的发射波长。作为非限制性示例之一，sybrgreeni具有约494nm的激发波长和约521nm的发射波长；一些实施方式中，可用蓝光来激发荧光的发射。
一些实施方式中，检测步骤还包括检测与对照核酸扩增子结合的可检测探针。可检测探针可包含任意可检测物质，例如荧光剂、磷光剂或化学发光剂，例如前文第iii部分中所述。一些实施方式中，可检测探针包含荧光剂。此类实施方式中，可检测探针可以是可区分于荧光dna嵌入剂的任何荧光剂。一些实施方式中，如果光学滤光片(例如发射滤光片)能够特异性地透射一种物质的发射光(例如特异性地透过荧光dna嵌入剂的发射光)同时阻止其他物质的发射光(例如阻止可检测探针荧光剂发射光的透射)，则包含荧光剂的可检测探针可区分于荧光dna嵌入剂。一些实施方式中，荧光dna嵌入剂的激发光谱和发射光谱与可检测探针的荧光染料的激发光谱和发射光谱不重叠。一些实施方式中，荧光dna嵌入剂的激发光谱和发射光谱与可检测探针的荧光染料的激发光谱和发射光谱基本上不重叠。
一些实施方式中，可用配备了荧光团可吸收激发光生成模块和荧光团发射光检测模块的检测装置来检测荧光。光源、滤光片和用于激发荧光团和检测荧光信号的装置是本领域公知的。一些实施方式中，将荧光检测模块或装置整合到用于进行扩增反应的设备或装置中，例如cfx实时pcr检测系统(生物辐射实验室股份有限公司(bio-radlaboratories，inc.)，加利福尼亚州赫拉克勒斯)。荧光检测装置和系统另可见后文第vi部分。
一些实施方式中，检测步骤包括对荧光dna嵌入剂发射的荧光信号的量(即靶核酸信号)和/或可检测探针发出的信号的量(即对照核酸信号)进行定量。一些实施方式中，所述检测步骤包括测定靶核酸扩增子和对照核酸扩增子的定量循环数(cq)。测定扩增反应cq的方法在本领域多有记载。参见例如us2016/0210406。
一些实施方式中，所述方法包括相对于对照核酸信号对靶核酸信号进行归一化。一些实施方式中，某分区或某反应孔的靶核酸信号相对于同一分区或同一反应孔的对照核酸信号进行归一化。一些实施方式中，对特定分区或反应孔的靶核酸信号进行归一化的步骤包括检测该分区或反应孔的对照核酸信号的cq，确定对照核酸信号的cq是否落入该检测预定的cq界限，如果对照核酸信号的cq不在预定的cq界限内，则排除该分区或反应孔的靶核酸信号。
iv.多重定量pcr的方法
另一方面，本文提供在同一分区(例如反应孔)对两个靶核酸进行多重扩增(例如qpcr扩增)的方法。一些实施方式中，所述方法包括：
将包含第一靶核酸和第二靶核酸的样品与以下物质合并形成反应混合物：(i)荧光dna嵌入剂，(ii)包含第一靶核酸特异性正向引物和第一靶核酸特异性反向引物的第一靶核酸特异性引物组、(iii)特异性关联第二靶核酸的可检测探针和(iv)包含特异性结合第二靶核酸的正向猝灭引物和反向猝灭引物的第二靶核酸特异性引物组，其中所述正向猝灭引物和反向猝灭引物各自包含两个或更多个猝灭剂，所述两个或更多个猝灭剂位于引物内以至猝灭剂由此猝灭第二靶核酸扩增产物发出的所有或基本上所有荧光；
在适合产生第一靶核酸扩增子和第二靶核酸扩增子的条件下孵育所述反应混合物，荧光dna嵌入剂既结合第一靶核酸扩增子也结合第二靶核酸扩增子，并且，产生的第二靶核酸扩增子包含多个掺入扩增子内的猝灭剂；
激发荧光dna嵌入剂(例如采用光源激发)，掺入第二靶核酸扩增子内的猝灭剂猝灭与第二靶核酸扩增子结合的荧光dna嵌入剂所发出荧光的至少部分；和
检测第一靶核酸扩增子和第二靶核酸扩增子，其中，通过检测荧光dna嵌入剂发出的荧光信号来检测第一靶核酸扩增子，并且通过检测可检测探针来检测第二靶核酸扩增子。
一些实施方式中，所述方法包括：
将包含第一靶核酸和第二靶核酸的样品与以下物质合并形成反应混合物：(i)荧光dna嵌入剂，(ii)包含第一靶核酸特异性正向引物和第一靶核酸特异性反向引物的第一靶核酸特异性引物组、(iii)特异性关联第二靶核酸的可检测探针和(iv)包含特异性结合第二靶核酸的正向猝灭引物和反向猝灭引物的第二靶核酸特异性引物组，其中，正向猝灭引物和反向猝灭引物各自包含位于或靠近引物5'末端的第一猝灭剂和靠近引物3'末端的第二猝灭剂；
在适合产生第一靶核酸扩增子和第二靶核酸扩增子的条件下孵育所述反应混合物，荧光dna嵌入剂既结合第一靶核酸扩增子也结合第二靶核酸扩增子，并且，产生的第二靶核酸扩增子包含多个掺入扩增子内的猝灭剂；
激发荧光dna嵌入剂(例如采用光源激发)，掺入第二靶核酸扩增子内的猝灭剂猝灭与第二靶核酸扩增子结合的荧光dna嵌入剂所发出荧光的至少部分；和
检测第一靶核酸扩增子和第二靶核酸扩增子，其中，通过检测荧光dna嵌入剂发出的荧光信号来检测第一靶核酸扩增子，并且通过检测可检测探针来检测第二靶核酸扩增子。
一些实施方式中，可检测探针发出的荧光信号与荧光dna嵌入剂发出的信号是可区分的，所述方法还包括激发可检测探针并检测由可检测探针发出的荧光信号，例如前文第iv部分中所述。
第一靶核酸序列和第二靶核酸序列都可以是任何基因、非编码基因组区域或感兴趣的序列。一些实施方式中，第一靶核酸序列和第二靶核酸序列都是疾病(例如癌症、神经肌肉疾病、心血管疾病、发育性疾病或代谢性疾病)相关基因或序列，例如前文第iv部分中记载的疾病或癌症。一些实施方式中，第一靶核酸序列和第二靶核酸序列是与同种疾病相关的基因或序列。
第一靶核酸和第二靶核酸都可以是单链或双链，或可既包含双链部分也包含单链序列部分。一些实施方式中，第一靶核酸和/或第二靶核酸是基因组dna、cdna、mrna或dna与rna的组合或杂合体。
第一靶核酸和第二靶核酸可取自任何合适的样品，例如前文第iv部分中所述的样品。一些实施方式中，第一靶核酸和第二靶核酸来自同一样品。一些实施方式中，第一靶核酸和第二靶核酸来自不同的样品，例如不同对象的样品、同一对象不同细胞或不同组织的样品、或是同一对象不同时间点相同类型组织或细胞的样品。一些实施方式中，对包含靶核酸的样品进行一个或多个处理步骤，例如前文第iv部分中所述。
一些实施方式中，形成包含以下物质的反应混合物：第一靶核酸、第二靶核酸、第一靶核酸特异性的第一引物组、包含特异性结合第二靶核酸的正向猝灭引物和反向猝灭引物的第二靶核酸特异性第二引物组、荧光dna嵌入剂和特异性结合第二靶核酸的可检测探针。一些实施方式中，引物组、荧光dna嵌入剂和可检测探针如前文第iii部分或第iv部分中所述。一些实施方式中，反应混合物还包含一种或多种其他扩增试剂(例如前文第iii部分中所述)，例如但不限于一种或多种以下物质：缓冲剂、盐、核苷酸、稳定剂、引物、聚合酶或无核酸酶的水。
一些实施方式中，在适合于产生第一核酸扩增子和第二核酸扩增子的条件下孵育反应混合物。一些实施方式中，孵育包括通过pcr扩增来扩增第一靶核酸扩增子和第二靶核酸，例如前文第iv部分中所述。一些实施方式中，扩增步骤产生的第一核酸扩增子包括与靶核酸扩增子结合的荧光dna嵌入剂。一些实施方式中，扩增步骤产生的第二核酸扩增子包括与扩增子结合的荧光dna嵌入剂，还包含掺入扩增子内的多个猝灭剂。
一些实施方式中，第一靶核酸扩增子和第二靶核酸扩增子按照前文第iv部分中所述来检测。本文所述的多重检测中，dna嵌入剂发出的荧光可用来特异性地检测第一靶核酸的存在性，因为特异性结合第二靶核酸的猝灭引物的存在猝灭了至少部分由结合第二靶核酸的dna嵌入剂发出的荧光信号。一些实施方式中，检测步骤包括对荧光dna嵌入剂发出的荧光信号的量和/或可检测探针发出的信号的量进行定量。一些实施方式中，检测步骤包括测定所述第一靶核酸扩增子和第二靶核酸扩增子的定量循环数(cq)。
vi.检测系统
本文还提供用于检测和/或对荧光dna嵌入剂发射的荧光信号量和可检测探针发出的信号量进行定量的检测装置和系统。一些实施方式中，可用配备了荧光团可吸收激发光生成模块和荧光团发射光检测模块的检测装置来检测荧光。用于监测核酸扩增反应并检测扩增反应期间发出的荧光信号的装置和系统是本领域公知的。例如参见us6,814,934。
获取荧光检测数据后，可使用通用目的计算机系统(本文中称作“主机”)来储存和处理数据。可使用计算机可执行逻辑进行诸如扣减背景信号、对靶标和/或参考序列赋值和量化数据的功能。主机可用于显示、储存、检索或计算来自核酸检测的诊断结果；储存、检索或计算来自核酸检测的原始数据；或者显示、储存、检索或计算可用于本发明方法的任何样品或患者信息。
一些实施方式中，可用主机或任何其他计算机来定量靶核酸扩增子的绝对量或相对量或计算靶核酸扩增子和/或对照核酸扩增子的定量循环数(cq)。一些实施方式中，可用主机或任何其他计算机来评价检测一致性或确定反应样本是否落入可接受的检测变差界线之内。
主机可配置众多不同的硬件组件并可制成多种尺寸和样式(例如台式pc、笔记本、平板pc、手持式计算机、服务器、工作站、大型机)。可包含标准组件，如监视器、键盘、磁盘驱动器、cd和/或dvd驱动器等。当主机与网络相连时，可通过任何合适的传输介质(例如有线、光和/或无线介质)和任何合适的通信协议(例如tcp/ip)来提供连接；主机可包括合适的网络硬件(例如调制解调器、以太网卡、wifi卡)。主机可使用多种操作系统中的任一种，包括unix、linux、microsoftwindows、macos或任何其他操作系统。
可用多种语言编写用于实施本发明的各项内容的计算机代码，包括perl、c、c++、java、javascript、vbscript、awk或任何其他的可在主机上执行或可经编译在主机上执行的脚本或编程语言。代码也可用低级语言编写或分配，例如汇编语言或机器语言。
可在用于储存和/或传输的多种计算机可读取介质上编码整合了本发明多项特征的脚本或程序。合适的介质的例子包括：磁盘或磁带、光学储存介质(如光盘(cd)或dvd(数字多功能光盘))、闪速存储器以及经由遵循各种协议的有线、光纤和/或无线网络(包括因特网)的适用于传输的载波信号。
vii.固相支持物和试剂盒
一些实施方式中，本文所述组合物附着于或包含在具有一个或多个分区的固相支持物内。一些实施方式中，固相支持物是检测板，例如多孔板，例如6孔、12孔、24孔、48孔或96孔板。
一些实施方式中，组合物包含引物(例如荧光猝灭引物)、可检测探针和/或对照核酸，如前文第iii部分中所述。一些实施方式中，组合物呈液体形式，例如溶液，并且，组合物位于固相支持物(例如检测板)的分区(例如孔)内。一些实施方式中，组合物呈冻干形式，并且，组合物位于固相支持物(例如检测板)的分区(例如孔)内。
另一方面，本文提供用于qpcr扩增归一化或在同一反应孔中进行多重反应的试剂盒。一些实施方式中，试剂盒包含：
特异性结合核酸(例如对照核酸或靶核酸)的荧光猝灭引物组，所述引物组包含正向猝灭引物和反向猝灭引物，其中，正向猝灭引物和反向猝灭引物各自包含两个或更多个猝灭剂，所述两个或更多个猝灭剂位于引物内以至猝灭剂由此猝灭核酸扩增产物发出的所有或基本上所有荧光；和
与核酸特异性关联的可检测探针。
一些实施方式中，试剂盒是用于qpcr扩增归一化的试剂盒。一些实施方式中，用于qpcr扩增归一化的试剂盒包含前文第iii部分中所述的组合物。一些实施方式中，试剂盒包含：
特异性结合对照核酸的荧光猝灭引物组，所述引物组包含正向猝灭引物和反向猝灭引物，其中，正向猝灭引物和反向猝灭引物各自包含位于或靠近引物5'末端的第一猝灭剂和靠近引物3'末端的第二猝灭剂；
特异性关联对照核酸的可检测探针；和
对照核酸，其中所述对照核酸包含与所述正向猝灭引物结合的正向引物结合位点，与所述探针结合的探针结合位点以及与所述反向猝灭引物结合的反向引物结合位点。
一些实施方式中，试剂盒是在同一反应孔中进行多重反应的试剂盒。一些实施方式中，用于多重反应的试剂盒包含前文第iii部分中所述的组合物。一些实施方式中，试剂盒包含：
包含第一靶核酸特异性正向引物和第一靶核酸特异性反向引物的第一靶核酸特异性引物组；
包含特异性结合第二靶核酸的正向猝灭引物和反向猝灭引物的第二靶核酸特异性引物组，其中，正向猝灭引物和反向猝灭引物各自包含位于或靠近引物5'末端的第一猝灭剂和靠近引物3'末端的第二猝灭剂；和
特异性关联第二靶核酸的可检测探针。
一些实施方式中，本文所述试剂盒包含引物(例如荧光猝灭引物或靶标特异性引物)、可检测探针和/或对照核酸，如前文第iii和第iv部分中所述。
一些实施方式中，试剂盒还包含荧光dna嵌入剂，如前文第iii部分中所述。一些实施方式中，荧光dna嵌入剂是sybrgreeni、evagreen、picogreen、溴乙锭、sybrgold、yo-yo、yo-pro、toto、boxto或bebo。一些实施方式中，荧光dna嵌入剂是sybrgreeni或evagreen。
一些实施方式中，试剂盒还包含一种或多种其他试剂，例如扩增试剂。一些实施方式中，试剂盒还包含一种或多种选自以下物质的试剂：盐、核苷酸、缓冲剂、稳定剂、dna聚合酶、可检测物质和无核酸酶的水。扩增试剂见前文第iii部分。
一些实施方式中，试剂盒包含具有一个或多个分区的固相支持物，分区中包含本文所述的组合物。一些实施方式中，固相支持物包含溶液形式的组合物。一些实施方式中，固相支持物包含冻干形式的组合物。一些实施方式中，固相支持物是多孔检测板，例如6孔、12孔、24孔、48孔或96孔板。
对于包含冻干形式组合物的试剂盒或包含冻干形式组合物的固相支持物，一些实施方式中，由终端用户对所述组合物进行重建。因此，一些实施方式中，试剂盒还包含对冻干组合物进行重建的说明。
一些实施方式中，试剂盒还包含说明材料，所述说明材料包含实施本公所述方法的说明(即方案)，例如使用试剂盒对qpcr测定进行归一化的说明。说明材料通常包括书面或印刷材料，但不限于此。本发明包括所有能够存储此类使用说明并将其传达给使用者的介质。此类介质包括但不限于电子存储介质(例如磁盘、磁带、墨盒、芯片等)，光学介质(例如cd-rom)等。此类介质还可以包括提供此类说明材料的互联网站点的地址。
viii.实施例
提供以下实施例用以说明而非限制要求保护的发明。
实施例1：形成用于qpcr归一化的对照检测
荧光dna嵌入剂(例如sybrgreen)常用于pcr的实时定量分析。然而，由于荧光dna嵌入剂与样品中的任何双链核酸序列都结合，因此很难在同一反应孔中评估超过一种产物。所以，开发了qpcr试剂从而能够使用荧光dna嵌入剂并将实验样品相对于同一反应孔中的对照进行归一化，由此能够通过qpcr进行更好的定量。
图1显示形成可与目标基因检测并行的对照检测的一般方法。这一检测中，样品中含有靶核酸(“目标基因”)和对照核酸(“对照”)。将样品与目标基因特异性引物、对照特异性引物和荧光dna嵌入剂一起孵育。进行pcr扩增，得到目标基因和对照的结合有荧光dna嵌入剂(sybrgreen)的pcr产物。用蓝光激发得到目标基因的sybrgreen发出的荧光，但对照没有。
形成对照检测，其中，将与任何可公开获得的核酸序列无明显序列相似性的人工dna序列用作对照dna序列：
tggacattgtcgatccgcgtgaaagttaggtggaatcgcatcatagccccgttctaggctctccgacggcactatctaaggctctgtcaacaaaacgtatccagtggtatgccgtgtattgtaatg
该序列中，引物结合位点以下划线标示，可检测探针的结合位点以斜体显示。将含有quasar705荧光染料和bhq3猝灭剂的水解探针用作可检测探针。
为了猝灭对照pcr产物中荧光而形成荧光猝灭对照检测引物。通过将猝灭剂掺入对照核酸特异性引物中使得猝灭剂在pcr扩增反应期间掺入对照核酸扩增子中，结果，对照核酸扩增子吸附dna嵌入剂产生的荧光由于被对照核酸扩增子中的猝灭剂猝灭而降低。图2a显示了一例荧光猝灭对照引物的设计，其中具有两个猝灭剂(“q”)，一个位于引物的5'末端，另一个靠近引物的3'末端。正向引物和反向引物都可采用这一示例设计。图2b显示所得pcr扩增产物，具有掺入产物的多个猝灭剂(“q”)和与产物结合的dna嵌入剂(绿色圆点)。一经蓝光激发，靠近结合dna嵌入剂的猝灭剂吸收荧光并将能量以热量的形式散发。对照产物中dna嵌入剂发出的荧光被至少部分猝灭降低了猝灭检测的荧光强度。
猝灭对照pcr产物中荧光的另一种方法如图7中所示。该方法中，结合核酸序列(例如对照核酸)的正向引物包含猝灭嵌入染料的猝灭剂(bhq1)且还包含可检测探针即荧光团(q70)。与正向引物上一部分杂交的寡核苷酸包含与可检测探针q705相容的猝灭剂(bhq3)。引物结合和延伸使得正向引物与结合引物的寡核苷酸解离。这种解离，加上最终pcr产物中的引物掺入，结果，bhq1猝灭剂猝灭嵌入染料，可检测的探针荧光团q705则发出荧光。
在以下三种条件下进行猝灭对照检测。条件1(图3a)如下进行：混合以下组分得20ul反应体积：ccnd1引物(获自生物辐射实验室(bio-radlaboratories)的primepcr产品(cat:10025636))各100nm，2ul的hela细胞cdna制备物1比10稀释液，itaq通用sybrgreen超混物(bio-rad,cat:1725121)。条件2(图3b)如下进行：反应包括条件1的全部组分外加含猝灭剂的对照引物各300nm(生物研究技术公司(biosearchtechnologies))，500nm5’端含quasar705、3’端含bhq3的报道水解探针(生物研究技术公司(biosearchtechnologies))和对照模板gblock(整合dna技术公司(integrateddnatechnologies))。条件3(图3c)如下进行：反应包括条件1的全部组分外加不含猝灭剂的对照引物各300nm(生物研究技术公司(biosearchtechnologies))，500nm5’端含quasar705、3’端含bhq3的报道水解探针(生物研究技术公司(biosearchtechnologies))和对照模板gblock(整合dna技术公司(integrateddnatechnologies))。条件1和2的对照模板浓度为约5ag/rxn。全部反应在cfx实时qpcr仪(biorad)上在白色96孔pcr板(biorad,cat:9651)中进行。温度方案为95℃与58℃间的热循环并包括每次58℃步骤后的多色孔读板。用cfxmaestro软件1.1版(bio-rad)和微软excel进行分析。
如图3a-3b所示，采用猝灭对照检测能够对靶基因(ccnd1)的qpcr反应进行准确的定量。进行无对照检测的ccnd1检测时(图3a)，测得qpcr反应的cq为22.5。如前所述在猝灭对照检测存在下采用荧光猝灭引物进行ccnd1检测时，ccnd1检测的cq仍为22.5(图3b)。相比之下，如同预期，图3c显示非猝灭对照检测(使用相同的可检测探针和相同的对照引物序列，但与图3b所用探针和引物相比引物上没有猝灭剂)确实影响了ccnd1的cq测量值(cq＝21.5)。由于cq测量值以log2值表示，因此1cq的差异构成显著差异，会妨碍对靶标的准确定量。
图4显示猝灭与非猝灭对照检测相比的另一分析。该实验中测试了两种条件。条件1：制备20ul反应系，其中包含含猝灭剂的对照引物各300nm(生物研究技术公司(biosearchtechnologies))，500nm5’端含quasar705、3’端含bhq3的报道水解探针(生物研究技术公司(biosearchtechnologies))和对照模板gblock(整合dna技术公司(integrateddnatechnologies))。条件2：制备20ul反应系，其中包含无猝灭剂的对照引物各300nm(生物研究技术公司(biosearchtechnologies))，500nm5’端含quasar705、3’端含bhq3的报道水解探针(生物研究技术公司(biosearchtechnologies))和对照模板gblock(整合dna技术公司(integrateddnatechnologies))。条件1和2的对照模板浓度为约5ag/rxn。全部反应在cfx实时qpcr仪(biorad)上在白色96孔pcr板(biorad,cat:9651)中进行。温度方案为95℃与58℃间的热循环并包括每次58℃步骤后的多色孔读板。用cfxmaestro软件1.1版(bio-rad)和微软excel进行分析。如图4所示，可检测探针发出的信号显示为红色，dna嵌入剂发出的信号显示为绿色。虽然终点强度不同，探针荧光(红色)仍产生单个cq，表明反应运行正常。非猝灭和猝灭对照检测的dna嵌入剂荧光(绿色)相差约6-7cq。6cq大致相当于猝灭检测的sybrgreen荧光强度降低40-80倍(40-80x)。
如图5所示评价对照检测的一致性。该实验中，制备20ul反应系，其中包含含猝灭剂的对照引物各300nm(生物研究技术公司(biosearchtechnologies))，500nm5’端含quasar705、3’端含bhq3的报道水解探针(生物研究技术公司(biosearchtechnologies))和对照模板gblock(整合dna技术公司(integrateddnatechnologies))。对照模板的浓度为约5ag/rxn。总共16个孔均如此制备。16孔含4种cdna输入水平，由前文就图3所述的helacdna样品制备。cdna稀释度的输入值为1比10、1比100、1比1000和无cdna。每种情况在平板上代表数均等(每种情况4孔)。全部反应在cfx实时qpcr仪(biorad)上在白色96孔pcr板(biorad,cat:9651)中进行。温度方案为95℃与58℃间的热循环并包括每次58℃步骤后的多色孔读板。用cfxmaestro软件1.1版(bio-rad)和微软excel进行分析。如图5a所示，对照检测表现出良好的一致性。图5b显示对应于不同标准差截值的cq值和不同的标准差截值时“好”孔(例如未收抑制的孔)被随机排除的几率。
实施例2：肝素滴定抑制研究
反应抑制会阻碍qpcr检测的准确定量。已知pcr反应抑制剂之一是肝素。进行了肝素滴定研究来确定本文所述猝灭对照检测是否可用于检测肝素抑制。
图6显示了抑制剂(肝素)对荧光信号的作用，并显示猝灭对照检测能够用于检测反应抑制。该实验中，检测了两种反应条件下pcr抑制剂肝素的作用。条件1(图6a)：混合以下组分形成20ul反应体积：ccnd1引物(获自生物辐射实验室(bio-radlaboratories)的primepcr产品(cat:10025636))各100nm，2ul的hela细胞cdna制备物1比10稀释液，itaq通用sybrgreen超混物(bio-rad,cat:1725121)。条件2(图6b)：反应混合物包含条件1的全部组分外加含猝灭剂的对照引物各300nm(生物研究技术公司(biosearchtechnologies))，500nm5’端含quasar705、3’端含bhq3的报道水解探针(生物研究技术公司(biosearchtechnologies))和对照模板gblock(整合dna技术公司(integrateddnatechnologies))。条件2的对照模板浓度为约5ag/rxn。对于各条件，样品用0.5ug/ml肝素(sigmaaldrich)处理或等量空白处理。全部反应在cfx实时qpcr仪(biorad)上在白色96孔pcr板(biorad,cat:9651)中进行。温度方案为95℃与58℃间的热循环并包括每次58℃步骤后的多色孔读板。用cfxmaestro软件1.1版(bio-rad)和微软excel进行分析。
图6a-6b显示，对于p53目标基因检测和猝灭对照检测，肝素存在下有3-5cq的改变。在图6b中，可检测探针(quasar)信号和sybrgreen信号均表现出近似相等的cq改变，表明该反应总体被抑制。因此，猝灭对照检测能够通过可检测探针检测有效地检测反应抑制从而排除相应孔。
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