用于抑制与AAV转导有关的先天免疫应答的方法和组合物与流程

优先权声明根据35u.s.c.§119(e)，本申请要求利益2018年1月19日提交的美国临时申请号62/619,468的利益，其全部内容引入本文作为参考。政府支持的声明本发明按照国立卫生研究院授予的资助号ai117408、hl125749、ai072176和ar064369在政府支持下进行。政府对本发明具有一定权利。关于序列表电子提交的声明代替纸质副本，提供了ascii文本格式的序列表，其根据37c.f.r.§1.821提交，名称为5470-819wo_st25.txt，大小为7,205字节，于2019年1月18日产生并通过efs-web提交。这个序列表关于其公开内容特此引入本说明书作为参考。发明领域本发明涉及用于抑制与aav转导有关的先天免疫应答的方法和组合物。发明背景腺伴随病毒(aav)载体已成功地在临床试验中应用于具有血友病和失明障碍的患者。在一些具有血友病b的患者中，在递送编码因子ix(fix)的aav载体后，在第6至10周转基因表达随肝酶升高而降低。施用泼尼松防止fix降低并增加fix至血液中的先前水平。这种现象在临床前试验中在啮齿动物和大型动物中从未观察到。衣壳特异性细胞毒性t淋巴细胞(ctl)在这些患者中检出；因此，已提议治疗失败归因于由衣壳特异性ctl介导的aav转导肝细胞的清除。本发明不完全支持这种假设。首先，aav衣壳抗原呈递的动力学研究表明，有效的抗原呈递在aav施用后立即发生，并在aav转导后的后面时间点逐渐降低至不可检出的水平。这暗示衣壳特异性ctl应该在早期时间点杀死大部分aav转导细胞，但在后面的时间可能不影响转基因表达。第二，如果存在ctl介导的aav转导靶细胞消除，施用泼尼松不会恢复转基因表达至先前水平。第三，尽管在一些患者中观察到衣壳特异性ctl应答，但没有fix表达受到抑制。因此，在aav基因递送后，其它机制可能在fix降低中起作用。已证实在aav施用后通过tlr9和tlr2识别，先天免疫应答被立即激活；然而，没有研究在aav施用后的后面时间点的先天免疫应答诱导或其在转基因表达中的作用。aav是一种单链dna病毒。其基因组包含侧翼为两个反向末端重复(itr)的rep和cap序列。用治疗盒(包含启动子、一个或多个治疗转基因和聚(a)(“pa”)尾部)置换rep和cap基因产生aav载体构建体。已表明aavitr具有启动子功能，这暗示从5’itr转录的正链rna和从3’itr转录的负链rna可在aav转导细胞中产生。这种假设得到本文描述的调查结果的支持，其中当通过转染测定，具有3’-itr的质粒缺失时，转基因表达增加(图9)。通过3’-itr启动子转录的rna负链可能用作反义rna以敲减转基因表达。在两个末端上从aavitr启动子产生的正链rna和负链rna能够在aav转导细胞的细胞质中退火并形成dsrna。另外，已表明一些用于基因递送的启动子具有双向转录功能以产生负链rna，藉此也可能形成dsrna。从基因递送形成dsrna的第三种可能是由于转基因cdna序列的修饰导致的mrna从转基因盒的二级结构形成。这种dsrna形成可能激活先天免疫应答。mda5和rig-i是在病毒感染后能够激活i型干扰素信号转导途径的细胞质病毒rna传感器，因此它们在抗病毒先天免疫中起关键作用。mda5和rig-i共有高度序列相似性和共同的信号转导衔接子，线粒体抗病毒信号转导(mavs)，但它们在抗病毒免疫中通过识别不同的病毒或病毒rna起不重复的功能。rig-i识别5′-三磷酸化(ppp)平端双链rna(dsrna)或单链rna发夹，其通常存在于各种正链和负链病毒中。mda5识别dsrna病毒基因组或正链病毒的dsrna复制中间体中的相对长的dsrna，所述正链病毒例如脑心肌炎病毒(emcv)和脊髓灰质炎病毒。本发明通过提供组合物和其在抑制受试者的与aav转导有关的先天免疫应答中的使用方法，克服了本领域的先前缺点。发明概述本概述列出了本公开的主题的数个实施方案，并且在许多情况下列出了这些实施方案的变化和排列。本概述仅是许多和变化的实施方案的示例。给定实施方案的一个或多个代表性特征的提及同样是示例性的。这样的实施方案可通常在具有或没有所提及的特征的情况下存在；同样，那些特征可应用于无论在本概述中是否列出的本公开的主题的其它实施方案。为了避免过度重复，本概述没有列出或提出这样的特征的所有可能组合。在一个实施方案中，本发明提供了一种重组核酸分子，其包含腺伴随病毒(aav)5'反向末端重复(itr)、与启动子可操作地缔合的目的核苷酸序列(noi)和aav3’itr，其中重组核酸分子进一步包含：a)5’itr的下游和启动子的上游的以3’至5’定向的聚(a)(pa)序列和3’itr的上游和noi的下游的以3’至5’定向的pa序列；b)3’itr的上游和noi的下游的以3’至5’定向的pa序列；c)3’itr的上游和noi的下游的以3’至5’定向的第一pa序列和第一pa序列的下游和3’itr的上游的以5’至3’定向的第二pa序列；d)3’itr的上游和noi的下游的以3’至5’定向的第一pa序列和noi的下游和第一pa的上游的以5’至3’定向的第二pa序列；e)3’itr的上游和noi的下游的以3’至5’定向的第一pa序列和5’itr的下游和启动子的上游的以5’至3’定向的第二pa序列；f)5’itr的下游和启动子的上游的以3’至5’定向的第一pa序列、noi的下游和第三pa序列的上游的以5’至3’定向的第二pa序列和第二pa序列的下游和3’itr的上游的以3’至5’定向的第三pa序列；g)5’itr的下游和启动子的上游的以5’至3’定向的第一pa序列、noi的下游和第三pa序列的上游的以3’至5’定向的第二pa序列和第二pa序列的下游和3’itr的上游的以5’至3’定向的第三pa序列；h)5’itr的下游和启动子的上游的以5’至3’定向的第一pa序列、noi的下游和第三pa序列的上游的以5’至3’定向的第二pa序列和第二pa序列的下游和3’itr的上游的以3’至5’定向的第三pa序列；i)5’itr的下游和启动子的上游的以5’至3’定向的第一pa序列、noi的下游和第三pa序列的上游的以3’至5’定向的第二pa序列和第二pa序列的下游和3’itr的上游的以5’至3’定向的第三pa序列；j)5’itr的下游和第二pa序列的上游的以3’至5’定向的第一pa序列、第一pa序列的下游和启动子的上游的以5’至3’定向的第二pa序列、noi的下游和第四pa序列的上游的以5’至3’定向的第三pa序列和第三pa序列的下游和3’itr的上游的以3’至5’定向的第四pa序列；k)5’itr的下游和第二pa序列的上游的以3’至5’定向的第一pa序列、第一pa序列的下游和启动子的上游的以5’至3’定向的第二pa序列、noi的下游和第四pa序列的上游的以3’至5’定向的第三pa序列和第三pa序列的下游和3’itr的上游的以5’至3’定向的第四pa序列；l)5’itr的下游和第二pa序列的上游的以5’至3’定向的第一pa序列、第一pa序列的下游和启动子的上游的以3’至5’定向的第二pa序列、noi的下游和第四pa序列的上游的以5’至3’定向的第三pa序列和第三pa序列的下游和3’itr的上游的以3’至5’定向的第四pa序列；和/或m)5’itr的下游和第二pa序列的上游的以5’至3’定向的第一pa序列、第一pa序列的下游和启动子的上游的以3’至5’定向的第二pa序列、noi的下游和第四pa序列的上游的以3’至5’定向的第三pa序列和第三pa序列的下游和3’itr的上游的以5’至3’定向的第四pa序列。在另一个实施方案中，本发明提供了一种重组核酸分子，其包含第一aav血清型的腺伴随病毒(aav)载体盒，所述载体盒包含aav5'反向末端重复(itr)、与启动子可操作地缔合的目的核苷酸序列(noi)和aav3’itr，其中重组核酸分子包含来自不同于第一aav血清型的第二aav血清型并置换第一aav血清型的5’itr和/或3’itr的aav5’itr和/或aav3’itr，并且在特定的实施方案中，其中与第一aav血清型的itr的启动子功能相比，第二aav血清型的itr没有启动子功能或具有降低的启动子功能。在该实施方案中，第一aav血清型可以是目前已知或后面鉴定的任何aav血清型，和不同于第一aav血清型的第二aav血清型可以是目前已知或后面鉴定的任何aav血清型。在一些实施方案中，第一aav血清型是aav2和第二aav血清型的itr是aav5。例如，重组核酸分子可包含aav2的aav载体盒，所述aav2盒包含aav5的5’和/或3’itr。在进一步的实施方案中，本发明提供了一种重组核酸分子，其包含腺伴随病毒(aav)5'反向末端重复(itr)、与启动子可操作地缔合的目的核苷酸序列(noi)和aav3’itr，其中5’itr和/或3’itr经修饰(例如通过取代、插入和/或缺失)以减少或消除来自5’itr和/或3’itr的启动子活性。在另一个实施方案中，本发明提供了一种重组核酸分子，其包含aav5’itr、与启动子可操作地缔合的noi、以3’至5’定向的pa序列和aav3’itr，其中noi序列与一个或多于一个核苷酸序列融合(例如与其在框内；在其上游和/或下游)，所述核苷酸序列编码靶向一种或多于一种细胞质dsrna传感器的干扰rna序列。在一些实施方案中，本发明提供了a)重组核酸分子，其包含aav5’itr、与第一启动子可操作地缔合的noi、以3’至5’定向的第一pa序列、与第二启动子可操作地缔合的编码靶向细胞质dsrna传感器的干扰rna序列的核苷酸序列、第二pa序列和aav3’itr；b)重组核酸分子，其包含aav5’itr、与第一启动子可操作地缔合的noi、以3’至5’定向的pa序列、与第二启动子可操作地缔合的靶向细胞质dsrna传感器的短发夹rna(shrna)序列和aav3’itr；c)重组核酸分子，其包含aav5’itr、与第一启动子可操作地缔合的靶向细胞质dsrna传感器的shrna、与第二启动子可操作地缔合的noi、以3’至5’定向的pa序列和aav3’itr；d)重组核酸分子，其按以下顺序包含：aav5’itr、均与启动子可操作地缔合的noi和靶向细胞质dsrna传感器的微小rna(mirna)序列、以3’至5’定向的pa序列和aav3’itr；e)重组核酸分子，其按以下顺序包含：aav5’itr、均与启动子可操作地缔合的靶向细胞质dsrna传感器的mirna和noi、以3’至5’定向的pa序列和aav3’itr；和/或e)重组核酸分子，其按以下顺序包含：aav5’itr、noi、以3’至5’定向的pa序列和aav3’itr，所述noi包含在noi内的mirna内含子序列，所述noi与启动子可操作地缔合。本发明的另一方面涉及包含上述重组核酸分子的raav载体基因组。本发明的另一方面涉及包含raav基因组的aav颗粒，所述raav基因组包含上述核酸分子。本发明的另一方面涉及包含raav颗粒的组合物。本文进一步提供了包含第一重组核酸分子和第二重组核酸分子的组合物，所述第一重组核酸分子包含aav5’itr、与启动子可操作地缔合的noi、以3’至5’定向的pa序列和aav3’itr，所述第二重组核酸分子包含靶向细胞质dsrna传感器的干扰rna序列。本发明的细胞质dsrna的非限制性实例包括在本发明的重组核酸分子中以任何组合和顺序的mda5、mavs、rig-1、traf6、traf5、rip1、fadd、irf、traf3、nap1、tbk1、ikk、iκb、tank和参与mavs下游信号转导的任何其它分子。本发明的干扰rna(rnai)的非限制性实例包括小干扰rna(sirna)、短发夹rna(shrna)、微小rna(mirna)、长双链rna(长dsrna)、反义rna、核酶等，如本领域已知的，以及目前已知或后面鉴定的任何其它干扰rna或抑制性rna。本发明进一步提供了一种重组核酸分子，其包含aav5’itr、均与启动子可操作地缔合的noi和mavs信号转导的抑制剂、以3’至5’定向的pa序列和aav3’itr。本文还提供了一种重组核酸分子，其包含aav5’itr、与第一启动子可操作地缔合的noi、以3’至5’定向的第一pa序列、与第二启动子可操作地缔合的mavs信号转导的抑制剂、以3’至5’定向的第二pa序列和aav3’itr。在另外的实施方案中，本发明提供了包含第一重组核酸分子和第二重组核酸分子的组合物，所述第一重组核酸分子包含aav5’itr、与启动子可操作地缔合的noi、以3’至5’定向的pa序列和aav3’itr，所述第二重组核酸分子包含mavs信号转导的抑制剂和以3’至5’定向的pa序列。mavs信号转导的抑制剂的非限制性实例包括来自丙型肝炎病毒的丝氨酸蛋白酶ns3–4a、来自甲型肝炎病毒和gb病毒b的蛋白酶、和乙型肝炎病毒(hbv)x蛋白、聚(rc)-结合蛋白2、20s蛋白酶体亚基psma7和线粒体融合蛋白2，以及目前已知或后面鉴定的任何其它mavs信号转导的抑制剂。本文还提供了增强aav载体在受试者的细胞中转导的方法，包括向受试者施用aav载体和在受试者的细胞中干扰dsrna活化途径的试剂。干扰dsrna活化途径的试剂的非限制性实例包括2-氨基嘌呤、类固醇(例如氢化可的松，如图28和29所示)和目前已知或后面鉴定的任何其它在细胞中干扰dsrna活化途径的试剂。在一些实施方案中，本发明的aav载体和试剂可以任何顺序和以任何时间间隔(例如数小时、数天、数周等)，同时和/或相继向受试者施用。附图简述图1a和1b显示在hela细胞系中ifn-β抑制aav转基因表达。hela细胞用每个细胞5x103个aav2/萤光素酶颗粒转导。(1a)24h后，将重组人ifn-β以不同的剂量加入至培养基。在补充ifn-β后第1、2、4和6天，通过萤光素酶测定检测转基因表达。(1b)每天以0.5ng/ml将重组人ifn-β加入至培养基。在第1、2、4和6天，通过萤光素酶测定检测转基因表达。当与无ifn-β处理相比时，***p<0.001。图2显示在细胞系中聚(i:c)抑制aav转基因表达。hela或huh7细胞用每个细胞5x103个aav2/萤光素酶颗粒转导。将2μg/ml聚(i:c)在不同的时间点加入：aav转导前18h，第0天或第3天。在聚(i:c)转染后3天，检测萤光素酶表达。图3a-3e显示dsrna免疫应答在aav转导后的较后时间点被激活。hela细胞用每个细胞5x103个dsaav2/gfp颗粒转导。在hela细胞中mda5(3a)、rig-i(3b)和ifn-β(3c)的表达在转导后的不同时间点通过q-pcr检测。当与pbs组相比时，*p<0.05，**p<0.01。数据表示来自3次实验的平均值和标准偏差。对于每次实验，pbs或aav感染组含有2或3孔细胞。对于q-pcr数据分析，在每次实验的每个时间点，来自pbs组的一个样品被标准化为1。在dsaav2/gfp转导后8天，在每个组中在hela细胞中的mda5表达通过蛋白质印迹检测(3d)。mda5表达的相对水平基于β-肌动蛋白的强度计算(3e)。当与pbs组相比时，***p<0.001。图4a和4b显示在不同的细胞系中的dsrna应答概况。(4a)huh7、hek293和hepg2细胞用每个细胞5x103个aav2/gfp颗粒转导。在第7天，mda5、rig-i和ifn-β的表达通过q-pcr检测。当与pbs组相比时，*p<0.05，**p<0.01。(4b)以每个细胞5x103个颗粒将具有不同的转基因的aav2加入hela细胞。在aav转导后第7天，mda5、rig-i和ifn-β的表达通过q-pcr检测。对于q-pcr数据分析，在每次实验中来自pbs组的样品被标准化为1。图5a和5b显示在dsaav2/gfp转导后在人原代肝细胞中的dsrna先天免疫应答。来自12名个体的新鲜人原代肝细胞以每个细胞5x103个颗粒通过aav2/gfp转导。在aav转导后的不同时间点，mda5、rig-i和ifn-β的表达通过q-pcr检测。对于相对基因表达计算，在每个时间点的pbs组的基因表达被标准化为1，其在图中未显示。图6a和6b显示在dsaav2/hfix-opt转导后在人原代肝细胞中的dsrna先天免疫应答。来自10名个体的新鲜人原代肝细胞以每个细胞5x103个颗粒通过dsaav8/hfix-opt转导。在aav转导后的不同时间点，mda5、rig-i和ifn-β的表达通过q-pcr检测。对于相对基因表达计算，在每个时间点的pbs组的基因表达被标准化为1，其在图中未显示。图7a-7c显示在dsaav8/hfix-opt转导后，在来自异种移植小鼠的人肝细胞中的dsrna应答。(7a)2个来自异种移植小鼠的人肝细胞用3x1011个aav8/hfix-opt颗粒注射。在aav转导后8周，小鼠中人肝细胞的mda5、rig-i和ifn-β的表达通过q-pcr检测。在小鼠肝脏中的mda5蛋白在8周后通过蛋白质印迹检测，测量条带强度以显示基于β-肌动蛋白的相对mda5表达，其中数据来自3次独立的实验。当与对照组相比时，**p<0.01。(7b)2只具有来自另一供体的人肝细胞的异种移植小鼠用一定剂量的dsaav8/hfix-opt注射。小鼠中人肝细胞的mda5、rig-i和ifn-β的表达在aav转导后4和8周通过q-pcr检测。(7c)小鼠肝脏中的mda5蛋白在4或8周后通过蛋白质印迹检测，mda5的相对表达水平基于β-肌动蛋白强度计算，当与对照组相比时，*p<0.05。图8a-8e显示dsrna活化途径的敲减增加aav转基因表达。(8a)hela细胞用sicontrol、simda5或simavs转染。敲减效率通过蛋白质印迹和q-pcr检测。(8b)在第0天，hela细胞用每个细胞5x103个aav2/萤光素酶颗粒转导。在第4天将sirna转染至hela细胞，并且48h或72h后检测萤光素酶表达。作为对照，在第3天加入2μg/ml聚(i:c)和在第4天将sirna转染至hela细胞。当与pbs组相比时，*p<0.05，**p<0.01，**p<0.001。(8c)aav转导4天后，将sirna转染至hela细胞，和在sirna转染后48h通过q-pcr检测ifn-β表达。当与pbs组相比时，**p<0.01。(8d)aav转导4天后，将sirna和ifn-β启动子报告质粒共转染至hela细胞，然后在72h后测量萤光素酶活性。(8e)在sirna转染后48h通过q-pcr检测mda5表达。图9显示3’-itr对转基因表达的影响。将1x105个293细胞/孔在24孔板中铺板。24小时后，使用lipofectamine2000将0.5up的侧翼有两个aavitr(2tr)或具有3’itr缺失(up/tr)或在转基因和3’-itr之间以反方向具有聚(a)(2tr/down-polya-r)的人α-1抗胰蛋白酶(aat)表达质粒转染至293细胞中。在转染后48hr，使用elisa检测在上清液中的aat水平。当与2tr质粒相比时，*p<0.05，**p<0.01。图10a-10b显示具有(10a)单一聚(a)阻断和(10b)多重聚(a)阻断的盒的图示。图11显示来自aav2和aav5的itr的图示。图12显示来自aavitr启动子的gfp表达。在6孔板中将5ug的ptr/gfp与1ug的pcmv/lacz共转染至293细胞中。2天后，293细胞在荧光显微术下可视化，并对于lacz表达进行染色。图13显示来自aavitr启动子的aat表达。在12孔板中将2ug的ptr/aat转染至不同的细胞中。2天后，收获上清液以供使用elisa进行aat检测。图14显示来自aav/itr-aat载体的aat表达。在48孔板中将1x10e9个aav/itr/aat载体颗粒加入1x10e5个293细胞。2天后，收获上清液用于aat表达。图15显示在c57bl小鼠中通过肌肉注射施用1x10e11个aav/itr/aat载体颗粒。4周后，收获血液和通过elisa检测aat表达。图16显示shrna或mirna的位置的图示a-f。图17显示用于抑制剂表达的盒的图示a-c。图18显示在后面时间点氢化可的松对aav转导的影响。hela细胞用aav2/luc转导，和在aav转导后第5天将10ug氢化可的松加入培养物。加入氢化可的松后24hr或48hr，测量来自细胞裂解物的萤光素酶活性。图19显示在后面时间点氢化可的松对来自aav转导的先天免疫应答的影响。hela细胞用aav2/luc转导和在aav转导后第5天将10ug氢化可的松加入培养物。加入氢化可的松后24hr，收获细胞用于在转录水平上通过定量rt-pcr分析mda5(上图)和ifn-β(下图)表达。图20a-20b显示在aav-转导细胞中的链转录物产生。(20a)基因特异性反转录以检测正链或负链转录物的概述。在aav2/萤光素酶转导后第8天收获hela细胞。提取rna和用dna酶处理。正链或负链萤光素酶的特异性引物用于合成不同定向的cdna。使用引物对1(f1和r1)和引物对2(f2和r2)进行pcr以检测在不同定向的cdna中的转录物。(20b)显示pcr产物。pbs用作没有aav病毒的阴性对照。ptr/萤光素酶质粒用作pcr的阳性对照。rna用作模板以消除在提取的rna中aav基因组dna污染的可能性。为了测量转录物的产率，将不同定向的cdna稀释至20、200或2,000倍作为pcr模板。图21显示在具有mavs缺乏的人肝细胞中的高aav转导。具有mavs敲减的人肝细胞细胞系ph5ch8和ph5ch8用不同剂量/细胞的aav2/luc载体转导。上图：200vg/细胞剂量；中图：5000vg/细胞剂量；下图：5000vg/细胞剂量。在指定的时间点分析转基因表达。图22a-22b显示使用的shrna和用于mavsshrna敲减效率的蛋白质印迹。将5种不同的mavsshrna转染到hela细胞中，和48小时后，收集细胞用于制备细胞裂解物。将细胞裂解物加载到sds-page凝胶上，之后转移到硝酸纤维素膜和用mavs抗体和gapdh抗体染色。使用ecl蛋白质印迹检测试剂(ge)检测信号。(22a)mavsshrna的序列。mavsshrna#29:seqidno:36;mavsshrna#30:seqidno:37;mavsshrna#31:seqidno:38;mavsshrna#32:seqidno:39;mavsshrna#68:seqidno:40。(22b)mavs和gapdh的蛋白质印迹。图23显示用shrna敲减mavs增加aav转导。hela细胞在第-1天用mavsshrna#31转染，然后在第0天加入5000/细胞的剂量的aav2/luc载体。在aav感染后第1和4天，分析转基因表达。发明详述现在在下文参考附图和说明书更全面地描述本发明，其中显示了本发明的优选实施方案。然而本发明可以不同的形式体现和不应该解释为限于本文提供的实施方案。除非另外定义，本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。在本发明的描述中使用的术语在本文中仅出于描述具体实施方案的目的，和不意图限制本发明。本文引用的所有出版物、专利申请、专利以及其它参考资料和登记号通过引用以其整体并入本文，用于与提供参考的语句和/或段落相关的教导。如本文使用的，"a"、"an"或"the"可指一个或多于一个。例如，"a"细胞可指单个细胞或多个细胞。还如本文使用的，"和/或"是指和包括一个或多个相关的所列项目的任何和所有可能组合，以及当以选择的方式("或")解释时缺少组合。本文使用的术语"约"当涉及可测量值例如剂量的量(例如非病毒载体的量)等时，是指包括规定量的±20%、±10%、±5%、±1%、±0.5%或甚至±0.1%的变化。如本文使用的，过渡短语"基本上由……组成"是指权利要求的范围应被解释为包括权利要求中描述的指定材料或步骤，以及不实质影响要求保护的发明的基本和新颖特征的那些。参见inreherz,537f.2d549,551-52,190uspq461,463(ccpa1976)(在原文中强调)；亦参见mpep§2111.03。因此，术语"基本上由……组成"当用于本发明的权利要求中时不意图解释为等同于"包含"。本发明的各方面涉及以下发现：aav施用诱导在受试者中由长期aav转导引起的先天免疫应答。这种先天免疫应答在感染阶段中是晚期的。不受理论的约束，认为先天免疫应答至少部分地由双链rna的存在触发，所述双链rna由病毒感染和/或复制产生，触发细胞质dsrna识别途径。因此，当大量的负链rna通过aav合成时(例如在aav转导的晚期阶段)激活先天免疫应答。这可在转导的大约第6周时处于其峰值。这种先天免疫应答至少部分地包括在接受者细胞或受试者中i型ifn-β的产生增加和/或dsrna传感器(例如mda5和mavs)增加。在aav转导后的晚期阶段的先天免疫应答的抑制，例如通过抑制dsrna传感器的表达和/或活性，在细胞或受试者中增加aav转基因表达。本发明的一个方面涉及核酸分子盒，其经设计以减少在aav转导中的dsrna产生，从而减少先天免疫应答的激发，和/或抑制可产生的先天免疫应答(例如通过表达rnai，例如sirna，其特异性靶向应答介质，例如mda5和/或mavs)。这些盒的各种形式在本文中描述(例如，显示于图10a和/或图10b和/或图16和/或图17)。本发明的另一方面涉及raav载体基因组，其包含本文所述的核酸分子盒(例如，显示于图10a和/或图10b和/或图16和/或图17)。含有核酸分子盒的aav基因组可进一步包装至病毒衣壳中以形成raav颗粒。本发明的另一方面涉及包含raav载体基因组或aav颗粒的药物制剂，所述raav载体基因组或aav颗粒包含本文所述的核酸分子盒。在一个实施方案中，与其它方面相同的缺少本文所述的盒元件的raav病毒颗粒相比，用包含核酸分子盒的raav病毒颗粒的感染导致在病毒转导的后期阶段在接受者细胞或受试者中先天免疫应答的显著减少。在一个实施方案中，与其它方面相同的缺少本文所述的盒元件的对照raav病毒颗粒相比，用包含核酸分子盒的raav病毒颗粒的感染导致在病毒转导的后期阶段在接受者细胞或受试者中转基因表达的显著增加。显著增加是任何可复制的统计学显著增加，例如通过本文的实施例章节中使用的方法(例如与对照相比，5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、50%、60%、75%、90%、100%、2x、3x、4x、5x、10x或更多增加)。在一个实施方案中，本发明提供了重组核酸分子，其包含腺伴随病毒(aav)5'反向末端重复(itr)、与启动子可操作地缔合的目的核苷酸序列(noi)和aav3’itr，其中重组核酸分子进一步包含：a)5’itr的下游和启动子的上游的以3’至5’定向的聚(a)(pa)序列和3’itr的上游和noi的下游的以3’至5’定向的pa序列；b)3’itr的上游和noi的下游的以3’至5’定向的pa序列；c)3’itr的上游和noi的下游的以3’至5’定向的第一pa序列和第一pa序列的下游和3’itr的上游的以5’至3’定向的第二pa序列；d)3’itr的上游和noi的下游的以3’至5’定向的第一pa序列和noi的下游和第一pa的上游的以5’至3’定向的第二pa序列；e)3’itr的上游和noi的下游的以3’至5’定向的第一pa序列和5’itr的下游和启动子的上游的以5’至3’定向的第二pa序列；f)5’itr的下游和启动子的上游的以3’至5’定向的第一pa序列、noi的下游和第三pa序列的上游的以5’至3’定向的第二pa序列和第二pa序列的下游和3’itr的上游的以3’至5’定向的第三pa序列；g)5’itr的下游和启动子的上游的以5’至3’定向的第一pa序列、noi的下游和第三pa序列的上游的以3’至5’定向的第二pa序列和第二pa序列的下游和3’itr的上游的以5’至3’定向的第三pa序列；h)5’itr的下游和启动子的上游的以5’至3’定向的第一pa序列、noi的下游和第三pa序列的上游的以5’至3’定向的第二pa序列和第二pa序列的下游和3’itr的上游的以3’至5’定向的第三pa序列；i)5’itr的下游和启动子的上游的以5’至3’定向的第一pa序列、noi的下游和第三pa序列的上游的以3’至5’定向的第二pa序列和第二pa序列的下游和3’itr的上游的以5’至3’定向的第三pa序列；j)5’itr的下游和第二pa序列的上游的以3’至5’定向的第一pa序列、第一pa序列的下游和启动子的上游的以5’至3’定向的第二pa序列、noi的下游和第四pa序列的上游的以5’至3’定向的第三pa序列和第三pa序列的下游和3’itr的上游的以3’至5’定向的第四pa序列；k)5’itr的下游和第二pa序列的上游的以3’至5’定向的第一pa序列、第一pa序列的下游和启动子的上游的以5’至3’定向的第二pa序列、noi的下游和第四pa序列的上游的以3’至5’定向的第三pa序列和第三pa序列的下游和3’itr的上游的以5’至3’定向的第四pa序列；l)5’itr的下游和第二pa序列的上游的以5’至3’定向的第一pa序列、第一pa序列的下游和启动子的上游的以3’至5’定向的第二pa序列、noi的下游和第四pa序列的上游的以5’至3’定向的第三pa序列和第三pa序列的下游和3’itr的上游的以3’至5’定向的第四pa序列；和/或m)5’itr的下游和第二pa序列的上游的以5’至3’定向的第一pa序列、第一pa序列的下游和启动子的上游的以3’至5’定向的第二pa序列、noi的下游和第四pa序列的上游的以3’至5’定向的第三pa序列和第三pa序列的下游和3’itr的上游的以5’至3’定向的第四pa序列。在一个实施方案中，包含腺伴随病毒(aav)5'反向末端重复(itr)、与启动子可操作地缔合的目的核苷酸序列(noi)和aav3’itr的重组核酸分子进一步包含：a)5’itr的下游和启动子的上游的以3’至5’定向的聚a(pa)序列和3’itr的上游和noi的下游的以3’至5’定向的pa序列；b)3’itr的上游和noi的下游的以3’至5’定向的pa序列；c)3’itr的上游和noi的下游的以3’至5’定向的第一pa序列和第一pa序列的下游和3’itr的上游的以5’至3’定向的第二pa序列；d)3’itr的上游和noi的下游的以3’至5’定向的第一pa序列和noi的下游和第一pa的上游的以5’至3’定向的第二pa序列；e)3’itr的上游和noi的下游的以3’至5’定向的第一pa序列和5’itr的下游和启动子的上游的以5’至3’定向的第二pa序列；f)5’itr的下游和启动子的上游的以3’至5’定向的第一pa序列、noi的下游和第三pa序列的上游的以5’至3’定向的第二pa序列和第二pa序列的下游和3’itr的上游的以3’至5’定向的第三pa序列；g)5’itr的下游和启动子的上游的以5’至3’定向的第一pa序列、noi的下游和第三pa序列的上游的以3’至5’定向的第二pa序列和第二pa序列的下游和3’itr的上游的以5’至3’定向的第三pa序列；h)5’itr的下游和启动子的上游的以5’至3’定向的第一pa序列、noi的下游和第三pa序列的上游的以5’至3’定向的第二pa序列和第二pa序列的下游和3’itr的上游的以3’至5’定向的第三pa序列；i)5’itr的下游和启动子的上游的以5’至3’定向的第一pa序列、noi的下游和第三pa序列的上游的以3’至5’定向的第二pa序列和第二pa序列的下游和3’itr的上游的以5’至3’定向的第三pa序列；j)5’itr的下游和第二pa序列的上游的以3’至5’定向的第一pa序列、第一pa序列的下游和启动子的上游的以5’至3’定向的第二pa序列、noi的下游和第四pa序列的上游的以5’至3’定向的第三pa序列和第三pa序列的下游和3’itr的上游的以3’至5’定向的第四pa序列；k)5’itr的下游和第二pa序列的上游的以3’至5’定向的第一pa序列、第一pa序列的下游和启动子的上游的以5’至3’定向的第二pa序列、noi的下游和第四pa序列的上游的以3’至5’定向的第三pa序列和第三pa序列的下游和3’itr的上游的以5’至3’定向的第四pa序列；l)5’itr的下游和第二pa序列的上游的以5’至3’定向的第一pa序列、第一pa序列的下游和启动子的上游的以3’至5’定向的第二pa序列、noi的下游和第四pa序列的上游的以5’至3’定向的第三pa序列和第三pa序列的下游和3’itr的上游的以3’至5’定向的第四pa序列；或m)5’itr的下游和第二pa序列的上游的以5’至3’定向的第一pa序列、第一pa序列的下游和启动子的上游的以3’至5’定向的第二pa序列、noi的下游和第四pa序列的上游的以3’至5’定向的第三pa序列和第三pa序列的下游和3’itr的上游的以5’至3’定向的第四pa序列。在可选的实施方案中，本发明提供了一种重组核酸分子，其包含腺伴随病毒(aav)5'反向末端重复(itr)、与启动子可操作地缔合的目的核苷酸序列(noi)和aav3’itr，其中重组核酸分子进一步包含以下中的一个或多个：a)5’itr的下游和启动子的上游的以3’至5’定向的聚a(pa)序列和3’itr的上游和noi的下游的以3’至5’定向的pa序列；b)3’itr的上游和noi的下游的以3’至5’定向的pa序列；c)3’itr的上游和noi的下游的以3’至5’定向的第一pa序列和第一pa序列的下游和3’itr的上游的以5’至3’定向的第二pa序列；d)3’itr的上游和noi的下游的以3’至5’定向的第一pa序列和noi的下游和第一pa的上游的以5’至3’定向的第二pa序列；e)3’itr的上游和noi的下游的以3’至5’定向的第一pa序列和5’itr的下游和启动子的上游的以5’至3’定向的第二pa序列；f)5’itr的下游和启动子的上游的以3’至5’定向的第一pa序列、noi的下游和第三pa序列的上游的以5’至3’定向的第二pa序列和第二pa序列的下游和3’itr的上游的以3’至5’定向的第三pa序列；g)5’itr的下游和启动子的上游的以5’至3’定向的第一pa序列、noi的下游和第三pa序列的上游的以3’至5’定向的第二pa序列和第二pa序列的下游和3’itr的上游的以5’至3’定向的第三pa序列；h)5’itr的下游和启动子的上游的以5’至3’定向的第一pa序列、noi的下游和第三pa序列的上游的以5’至3’定向的第二pa序列和第二pa序列的下游和3’itr的上游的以3’至5’定向的第三pa序列；i)5’itr的下游和启动子的上游的以5’至3’定向的第一pa序列、noi的下游和第三pa序列的上游的以3’至5’定向的第二pa序列和第二pa序列的下游和3’itr的上游的以5’至3’定向的第三pa序列；j)5’itr的下游和第二pa序列的上游的以3’至5’定向的第一pa序列、第一pa序列的下游和启动子的上游的以5’至3’定向的第二pa序列、noi的下游和第四pa序列的上游的以5’至3’定向的第三pa序列和第三pa序列的下游和3’itr的上游的以3’至5’定向的第四pa序列；k)5’itr的下游和第二pa序列的上游的以3’至5’定向的第一pa序列、第一pa序列的下游和启动子的上游的以5’至3’定向的第二pa序列、noi的下游和第四pa序列的上游的以3’至5’定向的第三pa序列和第三pa序列的下游和3’itr的上游的以5’至3’定向的第四pa序列；l)5’itr的下游和第二pa序列的上游的以5’至3’定向的第一pa序列、第一pa序列的下游和启动子的上游的以3’至5’定向的第二pa序列、noi的下游和第四pa序列的上游的以5’至3’定向的第三pa序列和第三pa序列的下游和3’itr的上游的以3’至5’定向的第四pa序列；或m)5’itr的下游和第二pa序列的上游的以5’至3’定向的第一pa序列、第一pa序列的下游和启动子的上游的以3’至5’定向的第二pa序列、noi的下游和第四pa序列的上游的以3’至5’定向的第三pa序列和第三pa序列的下游和3’itr的上游的以5’至3’定向的第四pa序列。在可选的实施方案中，本发明提供了一种重组核酸分子，其包含腺伴随病毒(aav)5'反向末端重复(itr)、与启动子可操作地缔合的目的核苷酸序列(noi)和aav3’itr，其中重组核酸分子进一步包含以下中的至少一个：a)5’itr的下游和启动子的上游的以3’至5’定向的聚a(pa)序列和3’itr的上游和noi的下游的以3’至5’定向的pa序列；b)3’itr的上游和noi的下游的以3’至5’定向的pa序列；c)3’itr的上游和noi的下游的以3’至5’定向的第一pa序列和第一pa序列的下游和3’itr的上游的以5’至3’定向的第二pa序列；d)3’itr的上游和noi的下游的以3’至5’定向的第一pa序列和noi的下游和第一pa的上游的以5’至3’定向的第二pa序列；e)3’itr的上游和noi的下游的以3’至5’定向的第一pa序列和5’itr的下游和启动子的上游的以5’至3’定向的第二pa序列；f)5’itr的下游和启动子的上游的以3’至5’定向的第一pa序列、noi的下游和第三pa序列的上游的以5’至3’定向的第二pa序列和第二pa序列的下游和3’itr的上游的以3’至5’定向的第三pa序列；g)5’itr的下游和启动子的上游的以5’至3’定向的第一pa序列、noi的下游和第三pa序列的上游的以3’至5’定向的第二pa序列和第二pa序列的下游和3’itr的上游的以5’至3’定向的第三pa序列；h)5’itr的下游和启动子的上游的以5’至3’定向的第一pa序列、noi的下游和第三pa序列的上游的以5’至3’定向的第二pa序列和第二pa序列的下游和3’itr的上游的以3’至5’定向的第三pa序列；i)5’itr的下游和启动子的上游的以5’至3’定向的第一pa序列、noi的下游和第三pa序列的上游的以3’至5’定向的第二pa序列和第二pa序列的下游和3’itr的上游的以5’至3’定向的第三pa序列；j)5’itr的下游和第二pa序列的上游的以3’至5’定向的第一pa序列、第一pa序列的下游和启动子的上游的以5’至3’定向的第二pa序列、noi的下游和第四pa序列的上游的以5’至3’定向的第三pa序列和第三pa序列的下游和3’itr的上游的以3’至5’定向的第四pa序列；k)5’itr的下游和第二pa序列的上游的以3’至5’定向的第一pa序列、第一pa序列的下游和启动子的上游的以5’至3’定向的第二pa序列、noi的下游和第四pa序列的上游的以3’至5’定向的第三pa序列和第三pa序列的下游和3’itr的上游的以5’至3’定向的第四pa序列；l)5’itr的下游和第二pa序列的上游的以5’至3’定向的第一pa序列、第一pa序列的下游和启动子的上游的以3’至5’定向的第二pa序列、noi的下游和第四pa序列的上游的以5’至3’定向的第三pa序列和第三pa序列的下游和3’itr的上游的以3’至5’定向的第四pa序列；或m)5’itr的下游和第二pa序列的上游的以5’至3’定向的第一pa序列、第一pa序列的下游和启动子的上游的以3’至5’定向的第二pa序列、noi的下游和第四pa序列的上游的以3’至5’定向的第三pa序列和第三pa序列的下游和3’itr的上游的以5’至3’定向的第四pa序列。本发明的实施方案的非限制性实例包括如图10a、10b、16和17中所示的各个盒(即，重组核酸分子)，以及具有如相应的盒中所示的任何元件(例如聚(a)序列)组合和/或任何定向组合的任何盒。可用于本发明的聚(a)序列是本领域已知的，和可由技术人员确定。这些盒和重组核酸分子可单独或以任何组合和/或以任何比率存在于组合物或群体中。本发明的组合物或群体也可包含本发明的单一的盒或重组核酸分子，基本上由其组成或由其组成。在另一个实施方案中，本发明提供了一种重组核酸分子，其包含第一aav血清型的腺伴随病毒(aav)载体盒，其包含aav5'反向末端重复(itr)、与启动子可操作地缔合的目的核苷酸序列(noi)和aav3’itr，其中aav5’itr和/或aav3’itr来自不同于第一aav血清型的第二aav血清型。例如，第一aav血清型的5’itr和/或3’itr可被来自第二aav血清型的5’itr和/或3’itr置换。在本发明的重组核酸分子的进一步的实施方案中，与第一aav血清型的itr的启动子功能相比，第二aav血清型的itr没有启动子功能或具有减少的启动子功能。在这样的实施方案中，第一aav血清型可以是目前已知或后面鉴定的任何aav血清型，和不同于第一aav血清型的第二aav血清型可以是目前已知或后面鉴定的任何aav血清型。在一些实施方案中，第一aav血清型是aav2和第二aav血清型的itr是aav5。例如，重组核酸分子可包含aav2的aav载体盒，aav2的所述盒包含aav5的5’itr和/或3’itr。在进一步的实施方案中，本发明提供了一种重组核酸分子，其包含腺伴随病毒(aav)5'反向末端重复(itr)、与启动子可操作地缔合的目的核苷酸序列(noi)和aav3’itr，其中5’itr和/或3’itr被修饰(例如通过取代、插入和/或缺失)以减少或消除来自5’itr和/或3’itr的启动子活性。在另一个实施方案中，本发明提供了一种重组核酸分子，其包含aav5’itr、与启动子可操作地缔合的noi、以3’至5’定向的pa序列和aav3’itr，其中noi序列与一个或多于一个核苷酸序列融合(例如在框内与其融合；在其上游和/或下游)，所述核苷酸序列编码靶向一种或多于一种细胞质dsrna传感器的干扰rna序列。在一些实施方案中，本发明提供了a)重组核酸分子，其包含aav5’itr、与第一启动子可操作地缔合的noi、以3’至5’定向的第一pa序列、与第二启动子可操作地缔合的编码靶向细胞质dsrna传感器的干扰rna序列的核苷酸序列、第二pa序列和aav3’itr；b)重组核酸分子，其包含aav5’itr、与第一启动子可操作地缔合的noi、以3’至5’定向的pa序列、与第二启动子可操作地缔合的靶向细胞质dsrna传感器的短发夹rna(shrna)序列和aav3’itr；c)重组核酸分子，其包含aav5’itr、与第一启动子可操作地缔合的靶向细胞质dsrna传感器的shrna、与第二启动子可操作地缔合的noi、以3’至5’定向的pa序列和aav3’itr；d)重组核酸分子，其按以下顺序包含：aav5’itr、均与启动子可操作地缔合的noi和靶向细胞质dsrna传感器的微小rna(mirna)序列、以3’至5’定向的pa序列和aav3’itr；e)重组核酸分子，其按以下顺序包含：aav5’itr、均与启动子可操作地缔合的靶向细胞质dsrna传感器的mirna和noi、以3’至5’定向的pa序列和aav3’itr；和/或e)重组核酸分子，其按以下顺序包含：aav5’itr、noi、以3’至5’定向的pa序列和aav3’itr，所述noi包含在noi内的mirna内含子序列，所述noi与启动子可操作地缔合。本文进一步提供了一种组合物，其包含第一重组核酸分子和第二重组核酸分子，所述第一重组核酸分子包含aav5’itr、与启动子可操作地缔合的noi、以3’至5’定向的pa序列和aav3’itr，所述第二重组核酸分子包含靶向细胞质dsrna传感器的干扰rna序列。本发明的细胞质dsrna的非限制性实例包括在本发明的重组核酸分子中以任何组合和顺序的mda5、mavs、rig-1、traf6、traf5、rip1、fadd、irf、traf3、nap1、tbk1、ikk、iκb、tank和参与mavs下游信号转导的任何其它分子。本发明的干扰rna(rnai)的非限制性实例包括如本领域已知的小干扰rna(sirna)、短发夹rna(shrna)、微小rna(mirna)、长双链rna(长dsrna)、反义rna、核酶等，以及目前已知或后面鉴定的任何其它干扰rna或抑制性rna。本发明进一步提供了一种重组核酸分子，其包含aav5’itr、均与启动子可操作地缔合的noi和mavs信号转导的抑制剂、以3’至5’定向的pa序列和aav3’itr。本文还提供了一种重组核酸分子，其包含aav5’itr、与第一启动子可操作地缔合的noi、以3’至5’定向的第一pa序列、与第二启动子可操作地缔合的mavs信号转导的抑制剂、以3’至5’定向的第二pa序列和aav3’itr。在另外的实施方案中，本发明提供了一种组合物，其包含第一重组核酸分子和第二重组核酸分子，所述第一重组核酸分子包含aav5’itr、与启动子可操作地缔合的noi、以3’至5’定向的pa序列和aav3’itr，所述第二重组核酸分子包含mavs信号转导的抑制剂和以3’至5’定向的pa序列。mavs信号转导的抑制剂的非限制性实例包括来自丙型肝炎病毒的丝氨酸蛋白酶ns3–4a、来自甲型肝炎病毒和gb病毒b的蛋白酶、乙型肝炎病毒(hbv)x蛋白、聚(rc)-结合蛋白2、20s蛋白酶体亚基psma7和/或线粒体融合蛋白2，以及目前已知或后面鉴定的任何其它mavs信号转导的抑制剂。本文还提供了在受试者的细胞中增强aav载体的转导的方法，包括向受试者施用aav载体和在受试者的细胞中干扰dsrna活化途径的试剂。干扰dsrna活化途径的试剂的非限制性实例包括2-氨基嘌呤、类固醇(例如氢化可的松)和目前已知或后面鉴定的任何其它在细胞中干扰dsrna活化途径的试剂。在一些实施方案中，本发明的aav载体和试剂可同时和/或相继地以任何顺序和以任何时间间隔(例如数小时、数天、数周等)施用于受试者。在一个实施方案中，首先施用aav载体，接着施用所述试剂。在一个实施方案中，首先施用所述试剂，和接着施用aav载体。在一个实施方案中，所述试剂以一个或数个间隔施用。在一个实施方案中，在施用aav载体后，所述试剂以间隔(例如数天，例如每1、2、3、4、5、6天，或数周，例如每1、2、3、4、5、6周或更久)施用。定义除非上下文另外指出，否则意图明确地是可以以任何组合使用本文描述的本发明的各种特征。此外，本发明还预期在本发明的一些实施方案中，可以排除或省略本文陈述的任何特征或特征的组合。为了进一步举例说明，例如，如果说明书表明特定的氨基酸可以选自a、g、i、l和/或v，则这一措辞还表明氨基酸可以选自一种或多种这些氨基酸的任何亚群，例如a、g、i或l；a、g、i或v；a或g；只有l；等等，好像每种这样的子组合都在本文明确陈述一样。此外，这种措辞还表明可以放弃一种或多种指定的氨基酸（例如，通过否定的条件）。例如，在特定的实施方案中，氨基酸不是a、g或i；不是a；不是g或v；等等，好像每种这样的可能放弃都在本文明确陈述一样。在本发明的aav载体和重组aav核酸分子中aav衣壳蛋白中所有氨基酸位置的指定相对于vp1衣壳亚基编号(天然aav2vp1衣壳蛋白：genbank登记号aac03780或yp680426)。本领域技术人员将理解，本文所述的修饰如果插入到aavcap基因中可导致vp1、vp2和/或vp3衣壳亚基中的修饰。或者，衣壳亚基可独立地表达以在仅一个或两个衣壳亚基(vp1、vp2、vp3、vp1+vp2、vp1+vp3或vp2+vp3)中实现修饰。如本文所用的，术语“减少（reduce）”、“减少（reduces）”、“减少（reduction）”、“减少（diminish）”、“抑制”和类似术语意指至少约5%、10%、15%、20%、25%、35%、50%、75%、80%、85%、90%、95%、97%或更多的降低。如本文所用的，术语“增强（enhance）”、“增强（enhances）”、“增强（enhancement）”和类似术语表示至少约25%、50%、75%、100%、150%、200%、300%、400%、500%或更多的增加。如本文所用的术语“细小病毒”包括细小病毒科（parvoviridae），包括自主复制细小病毒和依赖病毒。自主细小病毒包括属细小病毒属（parvovirus）、红病毒属（erythrovirus）、浓核病毒属（densovirus）、重复病毒属（iteravirus）和康特拉病毒属（contravirus）的成员。示例性自主细小病毒包括，但不限于，小鼠极小病毒、牛细小病毒、犬细小病毒、鸡细小病毒、猫泛白细胞减少症病毒、猫细小病毒、鹅细小病毒、h1细小病毒、番鸭细小病毒（muscovyduckparvovirus）、b19病毒和任何其它现在已知或较后发现的自主细小病毒。其它自主细小病毒是本领域技术人员已知的。参见，例如，bernardn.fields等人,virology,第2卷,第69章（第4版,lippincott-ravenpublishers）。如本文所用的，术语“腺伴随病毒”（aav）包括但不限于，aav类型1、aav类型2、aav类型3（包括类型3a和3b）、aav类型4、aav类型5、aav类型6、aav类型7、aav类型8、aav类型9、aav类型10、aav类型11、禽aav、牛aav、犬aav、马aav、绵羊aav以及任何其它现在已知或较后发现的aav。参见，例如，bernardn.fields等人,virology,第2卷,第69章（第4版,lippincott-ravenpublishers）。已经鉴定出许多另外的aav血清型和进化枝（参见，例如，gao等人,(2004)j.virology78:6381-6388；moris等人,(2004)virology33-:375-383；和表3）。各种aav血清型和自主细小病毒的基因组序列以及天然末端重复（tr）、rep蛋白和衣壳亚基的序列是本领域已知的。这种序列可以在文献中或在诸如genbank的公共数据库中找到。参见，例如，genbank登记号nc_002077、nc_001401、nc_001729、nc_001863、nc_001829、nc_001862、nc_000883、nc_001701、nc_001510、nc_006152、nc_006261、af063497、u89790、af043303、af028705、af028704、j02275、j01901、j02275、x01457、af288061、ah009962、ay028226、ay028223、nc_001358、nc_001540、af513851、af513852、ay530579；其公开内容引入本文作为参考，用于教导细小病毒和aav核酸和氨基酸序列。还参见，例如，srivistava等人(1983)j.virology45:555；chiorini等人(1998)j.virology71:6823；chiorini等人,(1999)j.virology73:1309；bantel-schaal等人,(1999)j.virology73:939；xiao等人,(1999)j.virology73:3994；muramatsu等人,(1996)virology221:208；shade等人,(1986)j.virol.58:921；gao等人,(2002)proc.nat.acad.sci.usa99:11854；moris等人,(2004)virology33-:375-383；国际专利公开wo00/28061、wo99/61601、wo98/11244；和美国专利号6,156,303；其公开内容引入本文作为参考，用于教导细小病毒和aav核酸和氨基酸序列。也参见表3。自主细小病毒和aav的衣壳结构在bernardn.fields等人,virology,第2卷,第69&70章（第4版,lippincott-ravenpublishers）中进行更详细的描述。还参见，aav2（xie等人,(2002)proc.nat.acad.sci.99:10405-10）、aav4（padron等人,(2005)j.virol.79:5047-58）、aav5（walters等人,(2004)j.virol.78:3361-71）和cpv（xie等人,(1996)j.mol.biol.6:497-520和tsao等人,(1991)science251:1456-64）的晶体结构的描述。如本文所用的术语“嗜性”是指病毒优先进入某些细胞或组织，任选地继之以病毒基因组所携带的一种或多种序列在细胞中的表达（例如，转录和任选地翻译），例如，对于重组病毒，一种或多种目的异源核酸的表达。除非另外指出，否则可以通过参考合适的对照来确定“有效转导”或“有效嗜性”或类似术语（例如，分别为对照的转导或嗜性的至少约50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%、100%、125%、150%、175%、200%、250%、300%、350%、400%、500%或更多）。在特定的实施方案中，病毒载体对于神经元细胞和心肌细胞有效地转导或具有有效的嗜性。合适的对照将取决于多种因素，包括所期望的嗜性和/或转导分布。类似地，可以通过参考合适的对照来确定病毒对于靶组织是否“不有效地转导”或“不具有有效的嗜性”或类似术语。在特定的实施方案中，病毒载体对于肝、肾、生殖腺和/或生殖细胞不有效地转导（即，不具有有效的嗜性）。在特定的实施方案中，一种或多种组织（例如，肝）的转导（例如，不期望的转导）为一种或多种期望的靶组织（例如，骨骼肌、膈肌（diaphragmmuscle）、心肌和/或中枢神经系统的细胞）的转导水平的20％或更小、10％或更小、5％或更小、1％或更小、0.1％或更小。如本文所用的，除非另外指出，否则术语“多肽”包括肽和蛋白。“多核苷酸”是核苷酸碱基的序列，并且可以是rna、dna或dna-rna杂合序列（包括天然存在的和非天然存在的核苷酸两者），但是在代表性的实施方案中是单链或双链dna序列。如本文所用的，“分离的”多核苷酸（例如，“分离的dna”或“分离的rna”）意指与天然存在的生物或病毒的至少一些其它组分（例如，通常发现与多核苷酸缔合的细胞或病毒结构成分或其它多肽或核酸）至少部分分开的多核苷酸。在代表性的实施方案中，与原材料相比，“分离的”核苷酸富集至少约10-倍、100-倍、1000-倍、10,000-倍或更多。同样，“分离的”多肽意指与天然存在的生物或病毒的至少一些其它组分（例如，通常发现与多肽缔合的细胞或病毒结构成分或其它多肽或核酸）至少部分分开的多肽。在代表性的实施方案中，与原材料相比，“分离的”多肽富集至少约10-倍、100-倍、1000-倍、10,000-倍或更多。“分离的细胞”是指与其它组分分开的细胞，所述细胞在其天然状态通常与所述其它组分缔合。例如，分离的细胞可以是培养基中的细胞和/或本发明的药学上可接受的载剂中的细胞。因此，分离的细胞可以被递送到和/或引入受试者中。在一些实施方案中，分离的细胞可以是从受试者取出并如本文所述离体操作且然后返回所述受试者的细胞。如本文所用的，所谓“分离”或“纯化”（或语法上的等同物）病毒载体或病毒颗粒或病毒颗粒群体指的是病毒载体或病毒颗粒或病毒颗粒群体至少部分地与原材料中的至少一些其它组分分开。在代表性的实施方案中，与原材料相比，“分离的”或“纯化的”病毒载体或病毒颗粒或病毒颗粒群体富集至少约10-倍、100-倍、1000-倍、10,000-倍或更多。“治疗用多肽”是可以减轻、减少、预防、延迟和/或稳定由细胞或受试者中蛋白的不存在或缺陷引起的症状的多肽，和/或是以其它方式使受试者具有益处的多肽，例如，抗癌作用或移植体存活能力（survivability）的改善或免疫应答的诱导。所谓术语“治疗（treat）”、“治疗（treating）”或“的治疗（treatmentof）”（及其语法变化）指的是受试者状况的严重性降低、至少部分改善或稳定和/或实现了至少一种临床症状的一些减轻、缓和、减少或稳定和/或存在疾病或病症的进展的延迟。术语“预防（prevent）”、“预防（preventing）”和“预防（prevention）”（及其语法变化）是指相对于在没有本发明方法的情况下所将发生的，受试者中疾病、病症和/或一种或多种临床症状的发病的预防和/或延迟和/或所述疾病、病症和/或一种或多种临床症状的发病的严重性的降低。预防可以是完全的，例如，完全不存在疾病、病症和/或一种或多种临床症状。预防也可以是部分的，从而使得受试者中疾病、病症和/或一种或多种临床症状的发生和/或发病的严重性显著小于在没有本发明的情况下所将发生的。如本文所用的“治疗有效”量是足以向受试者提供一些改善或益处的量。换句话说，“治疗有效”量是将提供受试者中至少一种临床症状中的一些减轻、缓和、减少或稳定的量。本领域技术人员将理解，治疗效果不需要是完全的或治愈的，只要向受试者提供了一些益处。如本文所用的“预防有效”量是相对于在没有本发明方法的情况下所将发生的，足以预防和/或延迟受试者中疾病、病症和/或临床症状的发病和/或降低和/或延迟受试者中疾病、病症和/或临床症状的发病的严重性的量。本领域技术人员将理解，预防水平不需要是完全的，只要向受试者提供了一些预防益处。术语“目的核苷酸序列（noi）”、“异源核苷酸序列”和“异源核酸分子”在本文可互换使用，并且是指病毒中非天然存在的核酸序列。通常，noi、异源核酸分子或异源核苷酸序列包含可读框，其编码目的多肽和/或非翻译rna（例如，用于递送至细胞和/或受试者）。如本文所用的，术语“病毒载体”、“载体”或“基因递送载体”是指起核酸递送载体作用并包含包装在病毒体中的载体基因组（例如，病毒dna[vdna]）的病毒（例如，aav）颗粒。或者，在一些情况下，术语“载体”可仅用于指载体基因组/vdna。“重组核苷酸序列”、“重组核酸分子”、“raav载体基因组”或“raav基因组”是包含一个或多个异源核酸序列的aav基因组(即，vdna)。术语“末端重复”或“tr”或“反向末端重复（itr）”包括形成发夹结构且起反向末端重复的作用（即，介导所期望的功能，例如复制、病毒包装、整合和/或原病毒拯救（provirusrescue）等）的任何病毒末端重复或合成序列。tr可以是aavtr或非-aavtr。例如，非-aavtr序列，例如其它细小病毒（例如，犬细小病毒（cpv）、小鼠细小病毒（mvm）、人细小病毒b-19）的那些或任何其它合适的病毒序列（例如，充当sv40复制起点的sv40发夹），可以用作tr，其可以通过截短、取代、缺失、插入和/或添加进一步修饰。进一步地，tr可以是部分或完全合成的，例如授予samulski等人的美国专利号5,478,745中所述的“双-d序列（double-dsequence）”。“aav末端重复”或“aavtr”可以来自任何aav，包括但不限于血清型1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12或任何其它现在已知或较后发现的aav（参见，例如，表3）。aav末端重复不需要具有天然末端重复（例如，可以通过插入、缺失、截短和/或错义突变来改变天然aavtr序列），只要所述末端重复介导所期望的功能，例如，复制、病毒包装、整合和/或原病毒拯救等。aav蛋白vp1、vp2和vp3是衣壳蛋白，它们一起相互作用以形成二十面体对称的aav衣壳。vp1.5是美国公开号2014/0037585中描述的aav衣壳蛋白。如国际专利公开wo00/28004和chao等人,(2000)moleculartherapy2:619所述的，本发明的病毒载体可以进一步是“靶向的”病毒载体（例如，具有定向嗜性）和/或“杂种”细小病毒（即，其中病毒trs和病毒衣壳来自不同的细小病毒）。如国际专利公开wo01/92551中所述的（其公开内容整体引入本文作为参考），本发明的病毒载体可以进一步是双链体细小病毒颗粒。因此，在一些实施方案中，可以将双链（双链体）基因组包装到发明的病毒衣壳中。进一步地，病毒衣壳或基因组元件可含有其它修饰，包括插入、缺失和/或取代。如本文所用的“嵌合”衣壳蛋白意指已经通过相对于野生型在衣壳蛋白的氨基酸序列中的一个或多个（例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10等）氨基酸残基中的取代以及相对于野生型在氨基酸序列中插入和/或缺失一个或多个（例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10等）氨基酸残基而修饰的aav衣壳蛋白。在一些实施方案中，来自一种aav血清型的完整或部分结构域、功能区、表位等可以以任何组合置换不同aav血清型的相应的野生型结构域、功能区、表位等，以产生本发明的嵌合衣壳蛋白。嵌合衣壳蛋白的产生可以根据本领域众所周知的规程进行，并且大量的嵌合衣壳蛋白在文献以及本文中都有描述，其可以包括在本发明的衣壳中。如本文所用的，术语“氨基酸”或“氨基酸残基”包括任何天然存在的氨基酸，其修饰形式和合成氨基酸。表4中显示了天然存在的左旋（l-）氨基酸。或者，氨基酸可以是修饰的氨基酸残基（非限制性实例显示在表6中）和/或可以是通过翻译后修饰（例如，乙酰化作用、酰胺化、甲酰化、羟化、甲基化作用、磷酸化或硫酸化（sulfatation））修饰的氨基酸。进一步地，非天然存在的氨基酸可以是如wang等人,annurevbiophysbiomolstruct.35:225-49(2006)所述的“非天然”氨基酸。这些非天然氨基酸可有利地用于将目的分子化学连接至aav衣壳蛋白。在一些实施方案中，本发明的aav载体可以是合成的病毒载体，其被进行设计以展示适合于不同的体外和体内应用的一系列期望的表型。因此，在一个实施方案中，本发明提供了包含腺伴随病毒（aav）衣壳的aav颗粒，其中所述衣壳包含以任何组合的衣壳蛋白vp1（其中所述衣壳蛋白vp1来自一种或多于一种第一aav血清型）和衣壳蛋白vp3，其中所述衣壳蛋白vp3来自一种或多于一种第二aav血清型，并且其中所述第一aav血清型中的至少一种与所述第二aav血清型中的至少一种不同。在一些实施方案中，aav颗粒可包含衣壳，所述衣壳包含以任何组合的衣壳蛋白vp2，其中所述衣壳蛋白vp2来自一种或多于一种第三aav血清型，其中所述一种或多于一种第三aav血清型中的至少一种与所述第一aav血清型和/或所述第二aav血清型不同。在一些实施方案中，本文所述的aav衣壳可包含衣壳蛋白vp1.5。vp1.5描述于美国专利公开号20140037585中，并且于此处提供了vp1.5的氨基酸序列。在一些实施方案中，本发明的aav颗粒可包含衣壳，所述衣壳包含以任何组合的衣壳蛋白vp1.5，其中所述衣壳蛋白vp1.5来自一种或多于一种第四aav血清型，其中所述一种或多于一种第四aav血清型的至少一种与所述第一aav血清型和/或所述第二aav血清型不同。在一些实施方案中，本文所述的aav衣壳蛋白可包含衣壳蛋白vp2。本发明还提供了本发明的aav载体，其包含aav衣壳，其中所述衣壳包含以任何组合的衣壳蛋白vp1（其中所述衣壳蛋白vp1来自一种或多于一种第一aav血清型）和衣壳蛋白vp2，其中所述衣壳蛋白vp2来自一种或多于一种第二aav血清型，并且其中所述第一aav血清型中的至少一种与所述第二aav血清型中的至少一种不同。在一些实施方案中，本发明的aav载体可包含衣壳，所述衣壳包含以任何组合的衣壳蛋白vp3，其中所述衣壳蛋白vp3来自一种或多于一种第三aav血清型，其中所述一种或多于一种第三aav血清型中的至少一种与所述第一aav血清型和/或所述第二aav血清型不同。在一些实施方案中，本文所述的aav衣壳可包含衣壳蛋白vp1.5。本发明进一步提供了包含腺伴随病毒（aav）衣壳的aav载体，其中所述衣壳包含以任何组合的衣壳蛋白vp1（其中所述衣壳蛋白vp1来自一种或多于一种第一aav血清型）和衣壳蛋白vp1.5，其中所述衣壳蛋白vp1.5来自一种或多于一种第二aav血清型，并且其中所述第一aav血清型中的至少一种与所述第二aav血清型中的至少一种不同。在一些实施方案中，本发明的aav载体可包含衣壳，所述衣壳包含以任何组合的衣壳蛋白vp3，其中所述衣壳蛋白vp3来自一种或多于一种第三aav血清型，其中所述一种或多于一种第三aav血清型中的至少一种与所述第一aav血清型和/或所述第二aav血清型不同。在一些实施方案中，本文所述的aav衣壳蛋白可包含衣壳蛋白vp2。在本文所述的aav载体的衣壳的一些实施方案中，所述一种或多于一种第一aav血清型、所述一种或多于一种第二aav血清型、所述一种或多于一种第三aav血清型和所述一种或多于一种第四aav血清型以任何组合选自表3中所列举的aav血清型。在本发明的aav载体的一些实施方案中，本文所述的aav衣壳缺乏衣壳蛋白vp2。在本发明的aav载体的一些实施方案中，衣壳可以包含嵌合衣壳vp1蛋白、嵌合衣壳vp2蛋白、嵌合衣壳vp3蛋白和/或嵌合衣壳vp1.5蛋白。本发明进一步提供了组合物，其可以是包含本发明的病毒载体或aav颗粒和药学上可接受的载剂的药物制剂。在本发明的实施方案中，通过本发明的aav颗粒的细胞转导是本文所述的诱导dsrna介导的免疫应答的aav颗粒的转导水平的至少约5倍、10倍、50倍、100倍、1000倍或更高。异源分子（例如，核酸、蛋白、肽等）被定义为在aav感染中不是天然发现的那些，例如，不是由野生型aav基因组编码的那些。进一步地，可将治疗上有用的分子与转基因缔合，用于将分子转移到宿主靶细胞中。这种缔合的分子可以包括dna和/或rna。修饰的衣壳蛋白和衣壳可进一步包含目前已知或后面鉴定的任何其它修饰。本领域技术人员将理解，对于一些aav衣壳蛋白，取决于对应的氨基酸位置是否部分或完全存在于病毒中，或者完全不存在，对应的修饰将是插入和/或取代。同样，当修饰除aav2以外的aav时，一个或多个特定氨基酸位置可以与aav2中的位置不同（参见，例如，表5）。如本文其它地方所讨论的，使用众所周知的技术，一个或多个对应的氨基酸位置对于本领域技术人员将是显而易见的。在许多其它aav中对应的位置的非限制性实例显示于表5(位置2)中。在代表性的实施方案中，本发明的病毒载体是重组病毒载体，其包含编码目的多肽和/或功能性rna的异源核酸。重组病毒载体在下面更详细地描述。本领域技术人员将理解，在某些实施方案中，本发明的衣壳蛋白、病毒衣壳、病毒载体和aav颗粒排除了在它们将以其天然状态存在或发现的情况下的那些衣壳蛋白、衣壳、病毒载体和aav颗粒。生产病毒载体的方法本发明进一步提供了生产本发明的aav颗粒和载体的方法。因此，本发明提供了制备aav颗粒的方法，其包括：a）用一种或多种质粒转染宿主细胞，所述质粒共同提供装配aav颗粒所需的所有功能和基因；b）将一种或多种核酸构建体引入包装细胞系或生产细胞系，以共同提供装配aav颗粒所需的所有功能和基因；c）将一种或多种重组杆状病毒载体引入宿主细胞，所述重组杆状病毒载体共同提供装配aav颗粒所需的所有功能和基因；和/或d）将一种或多种重组疱疹病毒载体引入宿主细胞，所述重组疱疹病毒载体共同提供装配aav颗粒所需的所有功能和基因。制备本发明病毒载体的各种方法的非限制性实例描述于clement和greiger（“manufacturingofrecombinantadeno-associatedviralvectorsforclinicaltrials”mol.ther.methodsclindev.3:16002(2016)）和greiger等人（“productionofrecombinantadeno-associatedvirusvectorsusingsuspensionhek293cellsandcontinuousharvestofvectorfromtheculturemediaforgmpfixandflt1clinicalvector”molther24(2):287-297(2016)），其全部内容引入本文作为参考。在一个代表性的实施方案中，本发明提供了生产aav颗粒的方法，所述方法包括向细胞提供：（a）包含至少一种tr序列（例如，aavtr序列）的核酸模板，和（b）足以满足核酸模板复制和包衣壳到aav衣壳中的aav序列（例如，aavrep序列和编码本发明aav衣壳的aavcap序列）。任选地，核酸模板进一步包含至少一种异源核酸序列。在特定实施方案中，核酸模板包含两种aavitr序列，其位于异源核酸序列（如果存在的话）的5'和3'，尽管它们不需要正好与其邻接。在使得在细胞中产生包含包装在aav衣壳内的核酸模板的病毒载体的条件下提供核酸模板和aavrep和cap序列。所述方法可以进一步包括从细胞收集病毒载体的步骤。可以从培养基和/或通过裂解细胞收集病毒载体。所述细胞可以是容许aav病毒复制的细胞。可以采用本领域已知的任何合适的细胞。在特定的实施方案中，细胞是哺乳动物细胞。作为另一选择，所述细胞可以是反式互补包装细胞系，其提供从复制缺陷型辅助病毒中缺失的功能，例如，293细胞或其它e1a反式互补细胞。aav复制和衣壳序列可以通过本领域已知的任何方法提供。当前的规程一般在单个质粒上表达aavrep/cap基因。aav复制和包装序列不需要一起提供，尽管这样做可能是方便的。aavrep和/或cap序列可以由任何病毒或非病毒载体提供。例如，rep/cap序列可以由杂种腺病毒或疱疹病毒载体提供（例如，插入缺失的腺病毒载体的e1a或e3区域中）。eb病毒（ebv）载体也可以用于表达aavcap和rep基因。这个方法的一个优点是ebv载体是附加型的，但在整个连续的细胞分裂过程中仍将保持高拷贝数（即，作为染色体外元件稳定整合到细胞中，称为“基于ebv的核附加体”，参见margolski,(1992)curr.top.microbiol.immun.158:67）。作为进一步的备择方案，可以将rep/cap序列稳定地并入细胞中。一般，aavrep/cap序列将不由tr侧接，以防止这些序列的拯救和/或包装。可以使用本领域已知的任何方法将核酸模板提供给细胞。例如，模板可以由非病毒（例如，质粒）或病毒载体供应。在特定实施方案中，核酸模板由疱疹病毒或腺病毒载体供应（例如，插入缺失的腺病毒的e1a或e3区域中）。作为另一举例说明，palombo等人,j.virology72:5025(1998)描述了杆状病毒载体，其携带由aavtrs侧接的报道基因。ebv载体也可以用于递送模板，如以上关于rep/cap基因所述的。在另一个代表性的实施方案中，核酸模板由复制型raav病毒提供。在再其它实施方案中，包含核酸模板的aav原病毒被稳定整合到细胞的染色体中。为了提高病毒滴度，可以向细胞提供促进生产性aav感染的辅助病毒功能（例如，腺病毒或疱疹病毒）。aav复制所必需的辅助病毒序列是本领域已知的。一般，这些序列将由辅助腺病毒或疱疹病毒载体提供。或者，腺病毒或疱疹病毒序列可以由另一种非病毒或病毒载体提供，例如，作为非感染性腺病毒小质粒，其携带促进有效的aav生产的所有辅助基因，如由ferrari等人,(1997)naturemed.3:1295，和美国专利号6,040,183和6,093,570所述的。进一步地，辅助病毒功能可以由包装细胞提供，所述包装细胞具有包埋在染色体中或作为稳定的染色体外元件维持的辅助序列。通常，辅助病毒序列不能包装到aav病毒体中，例如，不由tr侧接。本领域技术人员将理解，在单个辅助构建体上提供aav复制和衣壳序列以及辅助病毒序列（例如，腺病毒序列）可能是有利的。所述辅助构建体可以是非病毒或病毒构建体。作为一个非限制性举例说明，辅助构建体可以是包含aavrep/cap基因的杂种腺病毒或杂种疱疹病毒。在一个实施方案中，aavrep/cap序列和腺病毒辅助序列由单个腺病毒辅助载体供应。所述载体可以进一步包含核酸模板。aavrep/cap序列和/或raav模板可以插入腺病毒的缺失区域（例如，e1a或e3区域）中。在进一步的实施方案中，aavrep/cap序列和腺病毒辅助序列由单个腺病毒辅助载体供应。根据所述实施方案，可以将raav模板作为质粒模板提供。在另一个举例说明性实施方案中，aavrep/cap序列和腺病毒辅助序列由单个腺病毒辅助载体提供，并且raav模板作为原病毒整合到细胞中。或者，raav模板由ebv载体提供，所述ebv载体作为染色体外元件（例如，作为基于ebv的核附加体）维持在细胞内。在进一步的示例性实施方案中，aavrep/cap序列和腺病毒辅助序列由单个腺病毒辅助病毒提供。raav模板可以作为单独的复制型病毒载体提供。例如，raav模板可以由raav颗粒或第二重组腺病毒颗粒提供。根据前述方法，杂种腺病毒载体一般包含足以满足腺病毒复制和包装的腺病毒5’和3’顺式序列（即，腺病毒末端重复和pac序列）。aavrep/cap序列和如果存在的话的raav模板包埋在腺病毒主链中，且由5'和3'顺式序列侧接，以便可以将这些序列包装到腺病毒衣壳中。如上所述的，腺病毒辅助序列和aavrep/cap序列通常不由tr侧接，以便这些序列不包装到aav病毒体中。zhang等人（(2001)genether.18:704-12）描述了包含腺病毒和aavrep和cap基因两者的嵌合辅助病毒。疱疹病毒也可以在aav包装方法中用作辅助病毒。编码一种或多种aavrep蛋白的杂种疱疹病毒可以有利地促进可改变比例的（scalable）aav载体生产方案。表达aav-2rep和cap基因的杂种单纯疱疹病毒i型（hsv-1）载体已得到了描述（conway等人(1999)genetherapy6:986和wo00/17377。作为进一步的备择方案，可以使用杆状病毒载体以递送rep/cap基因和raav模板在昆虫细胞中产生本发明的病毒载体，如例如由urabe等人,(2002)humangenetherapy13:1935-43所述的。可以通过本领域已知的任何方法获得不含污染性辅助病毒的aav载体原种。例如，可以容易地基于大小区别aav和辅助病毒。还可以基于对肝素底物的亲和力将aav与辅助病毒分开（zolotukhin等人(1999)genetherapy6:973）。可以使用缺失的复制缺陷型辅助病毒，以便任何污染性辅助病毒都不具有复制能力。作为进一步的备择方案，可以使用缺乏晚期基因表达的腺病毒辅助病毒，这是因为仅需要腺病毒早期基因表达以介导aav病毒的包装。对于晚期基因表达有缺陷的腺病毒突变体是本领域已知的（例如，ts100k和ts149腺病毒突变体）。重组病毒载体本发明提供了向细胞施用核酸分子的方法，所述方法包括使细胞与本发明的病毒载体、aav颗粒、组合物和/或药物制剂接触。本发明进一步提供了将核酸递送给受试者的方法，所述方法包括向受试者施用本发明的病毒载体、aav颗粒、组合物和/或药物制剂。本发明的受试者可以是任何动物，且在一些实施方案中，受试者是哺乳动物，且在一些实施方案中，受试者是人。在一些实施方案中，受试者患有可以通过免疫治疗和/或基因治疗规程治疗的病症或处于该病症的危险中。这种病症的非限制性实例包括肌营养不良，包括杜兴或贝克尔肌营养不良，血友病a，血友病b，多发性硬化，糖尿病，高歇病，法布里病，蓬珀病，癌症，关节炎，肌肉消瘦，心脏病，包括充血性心力衰竭或周围动脉疾病，内膜增生，神经障碍，包括癫痫，亨廷顿舞蹈病，帕金森氏病或阿尔茨海默氏病，自身免疫性疾病，囊性纤维化，地中海贫血，胡尔勒氏综合症，斯利综合征，谢伊综合征，hurler-scheie综合征，亨特氏综合征，桑菲列普综合征a，b，c，d，莫尔基奥综合征，马-兰综合征，克拉伯氏病，苯丙酮尿症，巴腾氏病，脊髓大脑性共济失调，ldl受体缺乏，高氨血，贫血，关节炎，视网膜变性疾病，包括黄斑变性，腺苷脱氨酶缺乏症，代谢紊乱，和癌症，包括形成肿瘤的癌症。在本文所述的方法中，本发明的病毒载体、aav颗粒和/或组合物或药物制剂可以通过全身途径（例如，静脉内、动脉内、腹膜内等）和/或局部直接注射（例如，肌内注射、直接脑注射、注入csf、注入眼等）施用/递送至本发明的受试者。在一些实施方案中，可以通过脑室内、脑池内、实质内、颅内和/或鞘内途径将病毒载体和/或组合物施用于受试者。本发明的病毒载体用于体外、离体和体内将核酸分子递送至细胞。特别地，病毒载体可以有利地用于将核酸分子递送或转移至动物细胞，包括哺乳动物细胞。目的任何一种或多种异源核酸序列都可以在本发明的病毒载体中递送。目的核酸分子包括编码多肽的核酸分子，包括治疗用（例如，用于医学或兽医用途）和/或免疫原性（例如，用于疫苗）多肽。治疗用多肽包括，但不限于，囊性纤维化跨膜调节蛋白（cftr），肌养蛋白（包括小（mini-）和微（micro-）肌养蛋白，参见，例如，vincent等人(1993)naturegenetics5:130；美国专利公开号2003/017131；国际公开wo/2008/088895；wang等人proc.natl.acad.sci.usa97:13714-13719(2000)；和gregorevic等人mol.ther.16:657-64(2008)），肌肉生长抑制素（myostatin）前肽，促滤泡素抑制素，ii型激活蛋白可溶性受体，igf-1，抗炎多肽，例如ikappab显性突变体，sarcospan，肌养相关蛋白（utrophin）（tinsley等人(1996)nature384:349），小肌养相关蛋白（mini-utrophin），凝血因子（例如，凝血因子viii、凝血因子ix、凝血因子x等），促红细胞生成素，制管张素，内皮抑制素，过氧化氢酶，酪氨酸羟化酶，超氧化物歧化酶，瘦蛋白，ldl受体，脂蛋白脂肪酶，鸟氨酸转氨甲酰酶，β-珠蛋白，α-珠蛋白，血影蛋白，α1-抗胰蛋白酶，腺苷脱氨酶，次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶，β-葡糖脑苷脂酶，鞘磷脂酶，溶酶体氨基己糖苷酶a，支链酮酸脱氢酶，rp65蛋白，细胞因子（例如，α-干扰素、β-干扰素、干扰素-γ、白细胞介素-2、白细胞介素-4、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子、淋巴毒素等），肽生长因子，神经营养因子和激素（例如，促生长素，胰岛素，胰岛素样生长因子1和2，血小板衍生生长因子，表皮生长因子，成纤维细胞生长因子，神经生长因子，神经营养因子-3和-4，脑衍生神经营养因子，骨形态发生蛋白[包括rankl和vegf]，神经胶质衍生生长因子，转化生长因子-α和-β等），溶酶体酸性α-葡糖苷酶，α-半乳糖苷酶a，受体（例如，肿瘤坏死生长因子α可溶性受体），s100a1，小白蛋白，腺苷酸环化酶6型，调节钙处理的分子（例如，serca2a，pp1的抑制剂1及其片段[例如，wo2006/029319和wo2007/100465]），影响g蛋白偶联受体激酶2型击倒的分子，如截短的组成型活性barkct，抗炎因子如irap，抗肌肉生长抑制素（myostatin）蛋白，天冬氨酸酰基转移酶（aspartoacylase），单克隆抗体（包括单链单克隆抗体；示例性的mab是herceptin®mab），神经肽及其片段（例如，甘丙肽，神经肽y（参见，u.s.7,071,172），血管发生抑制剂例如血管生成抑制蛋白（vasohibins）和其它vegf抑制剂（例如，血管生成抑制蛋白2[参见wojp2006/073052]）。其它举例说明性的异源核酸序列编码“自杀”基因产物（例如，胸苷激酶、胞嘧啶脱氨酶、白喉毒素和肿瘤坏死因子），赋予对用于癌症治疗的药物的抗性的蛋白，肿瘤抑制基因产物（例如，p53、rb、wt-1），trail，fas-配体和在有需要的受试者中具有治疗作用的任何其它多肽。aav载体还可用于递送单克隆抗体和抗体片段，例如，针对肌肉生长抑制素的抗体或抗体片段（参见，例如，fang等人naturebiotechnology23:584-590(2005)）。编码多肽的异源核酸序列包括编码报道多肽（例如，酶）的那些。报道多肽是本领域已知的，且包括但不限于，绿色荧光蛋白（gfp）、萤光素酶、β-半乳糖苷酶、碱性磷酸酶、萤光素酶和氯霉素乙酰转移酶基因。任选地，异源核酸分子编码分泌的多肽（例如，在其天然状态是分泌的多肽或已经例如通过与如本领域已知的分泌信号序列可操作地缔合被人工改造为分泌的多肽）。或者，在本发明的特定实施方案中，异源核酸分子可编码反义核酸分子，核酶（例如，如美国专利号5,877,022中所述的），影响剪接体介导的反式剪接的rnas（参见，puttaraju等人(1999)naturebiotech.17:246；美国专利号6,013,487；美国专利号6,083,702），干扰rnas（rnai），包括介导基因沉默的sirna，shrna或mirna（参见，sharp等人(2000)science287:2431）以及其它非翻译rnas，例如“指导”rna（gorman等人(1998)proc.nat.acad.sci.usa95:4929；授予yuan等人的美国专利号5,869,248）等。示例性的非翻译rnas包括针对多重抗药性（mdr）基因产物的rnai（例如，以治疗和/或预防肿瘤和/或向心脏施用以防止化学疗法的损伤），针对肌肉生长抑制素的rnai（例如，对于杜兴肌营养不良），针对vegf的rnai（例如，以治疗和/或预防肿瘤），针对受磷蛋白的rnai（例如，以治疗心血管疾病，参见，例如，andino等人j.genemed.10:132-142(2008)和li等人actapharmacolsin.26:51-55(2005)）；受磷蛋白抑制性或显性失活分子，例如受磷蛋白s16e（例如，以治疗心血管疾病，参见，例如，hoshijima等人nat.med.8:864-871(2002)），对腺苷激酶的rnai（例如，用于癫痫），和针对病原生物和病毒（例如，乙型和/或丙型肝炎病毒、人免疫缺陷病毒、cmv、单纯疱疹病毒、人乳头瘤病毒等）的rnai。进一步地，可以递送指导可变剪接的核酸序列。为了举例说明，可以将与肌养蛋白外显子51的5'和/或3'剪接位点互补的反义序列（或其它抑制序列）与u1或u7核内小（sn）rna启动子一起递送以诱导这个外显子的跨跃。例如，可以在本发明的修饰的衣壳中包装和递送包含位于一种或多种反义/抑制序列5'的u1或u7snrna启动子的dna序列。病毒载体还可包含与宿主细胞染色体上的基因座共有同源性并与其重组的异源核酸分子。例如，可以利用所述方法以改正宿主细胞中的遗传缺陷。本发明还提供了表达免疫原性多肽、肽和/或表位的病毒载体，例如，用于接种。核酸分子可以编码本领域已知的任何目的免疫原，包括，但不限于，来自人免疫缺陷病毒（hiv）、猿猴免疫缺陷病毒（siv）、流感病毒、hiv或sivgag蛋白、肿瘤抗原、癌症抗原、细菌抗原、病毒抗原等的免疫原。细小病毒作为疫苗载体的用途是本领域已知的（参见，例如，miyamura等人(1994)proc.nat.acad.sciusa91:8507；授予young等人的美国专利号5,916,563，授予mazzara等人的美国专利号5,905,040，美国专利号5,882,65，授予samulski等人的美国专利号5,863,541）。抗原可以存在于细小病毒衣壳中。或者，免疫原或抗原可以由引入重组载体基因组中的异源核酸分子表达。本发明的病毒载体可以提供如本文所述的和/或如本领域中所已知的任何目的免疫原或抗原。免疫原性多肽可以是适合于引出免疫应答和/或保护受试者免于感染和/或疾病的任何多肽、肽和/或表位，包括，但不限于，微生物、细菌、原生动物、寄生物、真菌和/或病毒感染和疾病。例如，免疫原性多肽可以是正黏病毒免疫原（例如，流感病毒免疫原，例如流感病毒血凝素（ha）表面蛋白或流感病毒核蛋白，或马流感病毒免疫原）或慢病毒免疫原（例如，马传染性贫血病毒免疫原，猿猴免疫缺陷病毒（siv）免疫原或人免疫缺陷病毒（hiv）免疫原，例如hiv或siv包膜gp160蛋白，hiv或siv基质/衣壳蛋白，以及hiv或sivgag、pol和env基因产物）。免疫原性多肽还可以是沙粒病毒免疫原（例如，拉沙热病毒免疫原，例如拉沙热病毒核衣壳蛋白和拉沙热包膜糖蛋白），痘病毒免疫原（例如，痘苗病毒免疫原，例如痘苗l1或l8基因产物），黄病毒免疫原（例如，黄热病毒免疫原或日本脑炎病毒免疫原），线状病毒免疫原（例如，依波拉病毒免疫原或马尔堡病毒免疫原，例如np和gp基因产物），布尼亚病毒免疫原（例如，rvfv、cchf和/或sfs病毒免疫原），或冠状病毒免疫原（例如，传染性人冠状病毒免疫原，例如人冠状病毒包膜糖蛋白，或猪传染性胃肠炎病毒免疫原，或禽传染性支气管炎病毒免疫原）。免疫原性多肽可以进一步是脊髓灰质炎免疫原，疱疹免疫原（例如，cmv、ebv、hsv免疫原），腮腺炎免疫原，麻疹免疫原，风疹免疫原，白喉毒素或其它白喉免疫原，百日咳抗原，肝炎（例如，甲型肝炎、乙型肝炎、丙型肝炎等）免疫原，和/或本领域现在已知或较后鉴定为免疫原的任何其它疫苗免疫原。或者，免疫原性多肽可以是任何肿瘤或癌细胞抗原。任选地，肿瘤或癌抗原在癌细胞表面上表达。示例性的癌和肿瘤细胞抗原描述于s.a.rosenberg（immunity10:281（1991））中。其它举例说明癌和肿瘤抗原包括，但不限于：brca1基因产物，brca2基因产物，gp100，酪氨酸酶，gage-1/2，bage，rage，lage，ny-eso-1，cdk-4，β-联蛋白，mum-1，胱天蛋白酶-8，kiaa0205，hpve，sart-1，prame，p15，黑素瘤肿瘤抗原（kawakami等人(1994)proc.natl.acad.sci.usa91:3515；kawakami等人(1994)j.exp.med.,180:347；kawakami等人(1994)cancerres.54:3124），mart-1，gp100mage-1，mage-2，mage-3，cea，trp-1，trp-2，p-15，酪氨酸酶（brichard等人(1993)j.exp.med.178:489）；her-2/neu基因产物（美国专利号4,968,603），ca125，lk26，fb5（内皮唾液酸蛋白），tag72，afp，ca19-9，nse，du-pan-2，ca50，span-1，ca72-4，hcg，stn（唾液酸tn抗原），c-erbb-2蛋白，psa，l-canag，雌激素受体，乳脂肪球蛋白，p53肿瘤阻抑蛋白（levine.(1993)ann.rev.biochem.62:623）；黏蛋白抗原（国际专利公开no.wo90/05142）；端粒末端转移酶；核基质蛋白；前列腺酸性磷酸酶；乳头瘤病毒抗原；和/或现在已知或较后发现与以下癌症有关的抗原：黑素瘤、腺癌、胸腺瘤、淋巴瘤（例如，非何杰金氏淋巴瘤、何杰金氏淋巴瘤）、肉瘤、肺癌、肝癌、结肠癌、白血病、子宫癌、乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、宫颈癌、膀胱癌、肾癌、胰癌、脑癌和现在已知或较后鉴定的任何其它癌症或恶性状况（参见，例如，rosenberg,(1996)ann.rev.med.47:481-91）。作为进一步的备择方案，异源核酸分子可以编码期望在体外、离体或体内的细胞中产生的任何多肽、肽和/或表位。例如，可以将病毒载体引入培养的细胞中，并从其中分离表达的基因产物。本领域技术人员将理解，一种或多种目的异源核酸分子可以与适当的控制序列可操作地结合。例如，异源核酸分子可以与表达控制元件，例如转录/翻译控制信号、复制起点、多腺苷酸化信号、内部核糖体进入位点（ires）、启动子和/或增强子等可操作地结合。进一步地，可以在转录后水平实现一种或多种目的异源核酸分子的可调型表达，例如，通过寡核苷酸、小分子和/或其它选择性地阻断特定位点的剪接活性的化合物的存在或不存在来调节不同内含子的选择性剪接（例如，如wo2006/119137中所述的）。本领域技术人员将理解，取决于所期望的水平和组织特异性表达，可以使用多种启动子/增强子元件。取决于所期望的表达模式，所述启动子/增强子可以是组成型或诱导型的。启动子/增强子可以是天然的或外源的，并且可以是天然的或合成的序列。所谓外源的意图是指在向其中引入转录起始区的野生型宿主中未发现转录起始区。在特定的实施方案中，启动子/增强子元件可以对于靶细胞或要治疗的受试者是天然的。在代表性的实施方案中，启动子/增强子元件可以对于异源核酸序列是天然的。通常选择启动子/增强子元件，以便其在一种或多种目的靶细胞中起作用。进一步地，在特定实施方案中，启动子/增强子元件是哺乳动物启动子/增强子元件。启动子/增强子元件可以是组成型或诱导型的。诱导型表达控制元件一般在期望提供对于一种或多种异源核酸序列表达的调节的那些应用中是有利的。用于基因递送的诱导型启动子/增强子元件可以是组织特异性或优选的启动子/增强子元件，并且包括肌肉特异性或优选的（包括心、骨骼和/或平滑肌特异性或优选的）、神经组织特异性或优选的（包括脑特异性或优选的）、眼特异性或优选的（包括视网膜特异性和角膜特异性）、肝特异性或优选的、骨髓特异性或优选的、胰特异性或优选的、脾特异性或优选的以及肺特异性或优选的启动子/增强子元件。其它诱导型启动子/增强子元件包括激素诱导型和金属诱导型元件。示例性诱导型启动子/增强子元件包括，但不限于，teton/off元件、ru486-诱导型启动子、蜕皮素诱导型启动子、雷帕霉素诱导型启动子和金属硫蛋白启动子。在其中一种或多种异源核酸序列在靶细胞中被转录且然后翻译的实施方案中，通常包括特异性起始信号用于插入的蛋白编码序列的有效翻译。这些可以包括atg起始密码子和相邻序列的外源翻译控制序列可以有天然的和合成的两者的多种起源。根据本发明的病毒载体提供了用于将异源核酸分子递送到许许多多的细胞中的手段，所述细胞包括分裂细胞和非分裂细胞。病毒载体可用于将目的核酸分子体外递送至细胞，例如，以体外产生多肽或用于离体或体内基因治疗。所述病毒载体另外用于将核酸递送至需要其的受试者的方法中，例如，以表达免疫原性或治疗用多肽或功能性rna。照这样，可以在受试者中体内产生多肽或功能性rna。所述受试者可能需要所述多肽，这是因为所述受试者缺乏所述多肽。进一步地，可以实践所述方法，这是因为在受试者中多肽或功能性rna的产生可以赋予一些有益效果。病毒载体还可用于在培养的细胞中或在受试者中产生目的多肽或功能性rna（例如，使用受试者作为生物反应器以产生多肽或观察功能性rna对受试者的作用，例如，连同筛选方法）。通常，本发明的病毒载体可用于递送编码多肽或功能性rna的异源核酸分子，以治疗和/或预防递送治疗用多肽或功能性rna对于有益的任何病症或疾病状态。举例说明性疾病状态包括，但不限于：囊性纤维化（囊性纤维化跨膜调节蛋白）和其它肺疾病，血友病a（凝血因子viii），血友病b（凝血因子ix），地中海贫血（β-珠蛋白），贫血（促红细胞生成素）和其它血液病症，阿尔茨海默氏病（gdf；中性溶酶），多发性硬化（β-干扰素），帕金森氏病（胶质细胞系衍生神经营养因子[gdnf]），亨廷顿舞蹈病（去除重复的rnai），肌萎缩性侧索硬化症，癫痫（甘丙肽，神经营养因子）和其它神经障碍，癌症（内皮抑制素，制管张素，trail，fas-配体，细胞因子包括干扰素；rnai包括针对vegf或多重抗药性基因产物的rnai，mir-26a[例如，用于肝细胞癌]），糖尿病（胰岛素），肌营养不良包括杜兴（肌养蛋白，小肌养蛋白，胰岛素样生长因子i，肌膜聚糖（sarcoglycan）[例如，α、β、γ]，针对肌肉生长抑制素的rnai，肌肉生长抑制素前肽，促滤泡素抑制素，ii型激活蛋白可溶性受体，抗炎多肽，例如ikappab显性突变体，sarcospan，肌养相关蛋白，小肌养相关蛋白，针对肌养蛋白基因中的剪接点的反义或rnai以诱导外显子跨跃[参见，例如，wo/2003/095647]，针对u7snrnas的反义以诱导外显子跨跃[参见，例如，wo/2006/021724]，以及针对肌肉生长抑制素或肌肉生长抑制素前肽的抗体或抗体片段）和贝克尔，高歇病（葡糖脑苷脂酶），胡尔勒氏病（α-l-艾杜糖苷酸酶），腺苷脱氨酶缺乏症（腺苷脱氨酶），糖原贮积病（例如，法布里病[α-半乳糖苷酶]和蓬珀病[溶酶体酸性α-葡糖苷酶]）和其它代谢紊乱，先天性气肿（α1-抗胰蛋白酶），累-奈综合征（次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶），尼-皮病（鞘磷脂酶），泰-萨病（溶酶体氨基己糖苷酶a），枫糖尿病（支链酮酸脱氢酶），视网膜变性疾病（以及其它眼和视网膜疾病；例如，用于黄斑变性的pdgf和/或血管生成抑制蛋白（vasohibin）或其它vegf的抑制剂或其它血管发生抑制剂，以治疗/预防视网膜病症，例如，在i型糖尿病中），实体器官疾病，如脑（包括帕金森氏病[gdnf]，星形细胞瘤[内皮抑制素，制管张素和/或针对vegf的rnai]，成胶质细胞瘤[内皮抑制素，制管张素和/或针对vegf的rnai]），肝，肾，心，包括充血性心力衰竭或周围动脉疾病（pad）（例如，通过递送蛋白磷酸酶抑制剂i（i-1）及其片段（例如，i1c），serca2a，调节受磷蛋白基因的锌指蛋白，barkct，β2-肾上腺素能受体，β2-肾上腺素能受体激酶（bark），磷酸肌醇-3激酶（pi3激酶），s100a1，小白蛋白，腺苷酸环化酶6型，影响g蛋白偶联受体激酶2型击倒的分子，如截短的组成型活性barkct；calsarcin，针对受磷蛋白的rnai；受磷蛋白抑制性或显性失活分子，例如受磷蛋白s16e等），关节炎（胰岛素样生长因子），关节病症（胰岛素样生长因子1和/或2），内膜增生（例如，通过递送enos，inos），改善心脏移植的存活（超氧化物歧化酶），aids（可溶性cd4），肌肉消瘦（胰岛素样生长因子i），肾虚（kidneydeficiency）（促红细胞生成素），贫血（促红细胞生成素），关节炎（抗炎因子，例如irap和tnfα可溶性受体），肝炎（α-干扰素），ldl受体缺乏（ldl受体），高氨血（鸟氨酸转氨甲酰酶），克拉伯氏病（半乳糖脑苷脂酶），巴腾氏病，包括sca1、sca2和sca3的脊髓大脑性共济失调，苯丙酮尿症（苯丙氨酸羟化酶），自身免疫性疾病等。本发明可以在器官移植后进一步用于增加移植的成功和/或减少器官移植或辅助疗法的消极副作用（例如，通过施用免疫抑制剂或抑制性核酸来阻断细胞因子产生）。作为另一个例子，例如，在癌症患者中切断或外科手术去除之后，可以将骨形态发生蛋白（包括bnp2、7等，rankl和/或vegf）与骨同种异体移植物一起施用。本发明还可用于产生诱导的多潜能干细胞（ips）。例如，本发明的病毒载体可以用于将一种或多种干细胞有关的核酸递送到非多潜能细胞中，例如成体成纤维细胞、皮肤细胞、肝细胞、肾细胞、脂肪细胞、心脏细胞（cardiaccell）、神经细胞、上皮细胞、内皮细胞等。编码与干细胞有关的因子的核酸是本领域已知的。与干细胞和多潜能性有关的这种因子的非限制性示例包括oct-3/4、sox家族（例如，sox1、sox2、sox3和/或sox15）、klf家族（例如，klf1、klf2、klf4和/或klf5）、myc家族（例如，c-myc、l-myc和/或n-myc）、nanog和/或lin28。还可以实践本发明以治疗和/或预防代谢紊乱，例如糖尿病（例如，胰岛素），血友病（例如，凝血因子ix或凝血因子viii），溶酶体贮积病症，例如粘多糖沉积症（例如，斯利综合征[β-葡糖醛酸糖苷酶]，胡尔勒综合征[α-l-艾杜糖苷酸酶]，谢伊综合征[α-l-艾杜糖苷酸酶]，hurler-scheie综合征[α-l-艾杜糖苷酸酶]，亨特氏综合征[艾杜糖醛酸硫酸酯酶]，桑菲列普综合征a[乙酰肝素磺酰胺酶]，b[n-乙酰氨基葡糖苷酶]，c[乙酰辅酶a:α-氨基葡糖苷乙酰转移酶]，d[n-乙酰葡糖胺6-硫酸酯酶]，莫尔基奥综合征a[半乳糖-6-硫酸硫酸酯酶]，b[β-半乳糖苷酶]，马-兰综合征[n-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶]等），法布里病（α-半乳糖苷酶），高歇氏病（葡糖脑苷脂酶），或糖原贮积病症（例如，蓬珀病；溶酶体酸性α-葡糖苷酶）。基因转移对于理解疾病状态和为其提供治疗具有相当大的潜在用途。存在许多其中缺陷基因已知并已被克隆的遗传病。通常，以上疾病状态分为两类：缺乏状态，通常是通常以隐性方式遗传的酶，以及不平衡状态，其可能涉及调节或结构蛋白，且其一般以显性方式遗传。对于缺乏状态的疾病，可以使用基因转移将正常基因带入受影响的组织中用于替补疗法，以及以使用反义突变产生所述疾病的动物模型。对于不平衡的疾病状态，可以使用基因转移在模型系统中产生疾病状态，然后可以将其用于抵消疾病状态的努力中。因此，根据本发明的病毒载体允许治疗和/或预防遗传病。根据本发明的病毒载体还可以用于在体外或体内向细胞提供功能性rna。例如，功能性rna在细胞中的表达可以减少细胞对特定靶蛋白的表达。因此，可以施用功能性rna以减少需要其的受试者中特定蛋白的表达。也可以在体外向细胞施用功能性rna以调节基因表达和/或细胞生理学，例如，以最优化细胞或组织培养系统或在筛选方法中。此外，根据本发明的病毒载体应用于诊断和筛选方法中，由此目的核酸在细胞培养系统或者转基因动物模型中瞬时或稳定表达。如对于本领域技术人员而言将显而易见的，本发明的病毒载体还可用于各种非治疗目的，包括但不限于用于评估基因寻靶、清除、转录、翻译等的规程中。病毒载体还可用于评价安全性（传播、毒性、免疫原性等）的目的。例如，在评价临床功效之前，美国食品药品管理局（unitedstatesfoodanddrugadministration）将这种数据作为管理批准手续的一部分进行考虑。作为进一步的方面，本发明的病毒载体可用于在受试者中产生免疫应答。根据所述实施方案，可以将包含编码免疫原性多肽的异源核酸序列的病毒载体施用给受试者，并且由受试者针对所述免疫原性多肽发动主动免疫应答。免疫原性多肽如在上文所述的。在一些实施方案中，引出保护性免疫应答。“主动免疫应答”或“自动免疫”的特征在于“在遇到免疫原后宿主组织和细胞的参与。它包括淋巴网状组织中免疫活性细胞的分化和增殖，其导致抗体的合成或细胞介导的反应性的发展，或两者。”herbertb.herscowitz,immunophysiology:cellfunctionandcellularinteractionsinantibodyformation,在immunology:basicprocesses117（josepha.bellanti编,1985）中。换句话说，宿主在通过感染或接种暴露于免疫原后发动主动免疫应答。自动免疫可以与被动免疫相对比，所述被动免疫通过“将预先形成的物质（抗体、转移因子、胸腺移植物、白细胞介素-2）从主动免疫的宿主转移到非免疫宿主”而获得。同前。如本文所用的“保护性”免疫应答或“保护性”免疫表明，免疫应答使受试者具有一些益处，这是因为其预防或降低疾病的发病率。或者，保护性免疫应答或保护性免疫可用于治疗和/或预防疾病，特别是癌症或肿瘤（例如，通过预防癌症或肿瘤形成、通过引起癌症或肿瘤消退和/或通过预防转移和/或通过预防转移性结节（metastaticnodules）的生长）。保护作用可以是完全的或部分的，只要治疗的益处多于其任何缺点。在特定的实施方案中，包含异源核酸分子的病毒载体或细胞可以以免疫原性有效量施用，如下文所述的。本发明的病毒载体也可以通过表达一种或多种癌细胞抗原（或免疫学上相似的分子）或产生针对癌细胞的免疫应答的任何其它免疫原的病毒载体的施用而施用用于癌症免疫治疗。为了举例说明，可以通过施用包含编码癌细胞抗原的异源核酸的病毒载体来在受试者中产生针对癌细胞抗原的免疫应答，例如以治疗患有癌症的患者和/或在受试者中防止癌症的发展。如本文所述的，可以将病毒载体体内或通过使用离体方法施用于受试者。或者，癌抗原可以作为病毒衣壳的一部分表达或以其它方式与病毒衣壳缔合（例如，如上文所述的）。作为另一种备择方案，可以施用本领域已知的任何其它治疗用核酸（例如，rnai）或多肽（例如，细胞因子）以治疗和/或预防癌症。如本文所用的，术语“癌症”包括形成肿瘤的癌症。同样，术语“癌性组织”包括肿瘤。“癌细胞抗原”包括肿瘤抗原。术语“癌症”具有其在本领域中理解的含义，例如，组织的不受控制的生长，其有扩散到身体的远侧部位的潜力（即，转移）。示例性癌症包括，但不限于，黑素瘤、腺癌、胸腺瘤、淋巴瘤（例如，非何杰金氏淋巴瘤、何杰金氏淋巴瘤）、肉瘤、肺癌、肝癌、结肠癌、白血病、子宫癌、乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、宫颈癌、膀胱癌、肾癌、胰癌、脑癌和现在已知或较后鉴定的任何其它癌症或恶性状况。在代表性的实施方案中，本发明提供了治疗和/或预防形成肿瘤的癌症的方法。术语“肿瘤”在本领域中也被理解为例如多细胞生物中异常的未分化的细胞团。肿瘤可以是恶性的或良性的。在代表性的实施方案中，本文公开的方法用于预防和治疗恶性肿瘤。所谓术语“治疗癌症”、“癌症的治疗”和等同术语意图是指降低或至少部分消除癌症的严重性和/或减缓和/或控制疾病的进展和/或稳定疾病。在特定的实施方案中，这些术语指示预防或减少或至少部分消除癌症的转移，和/或预防或减少或至少部分消除转移性结节的生长。所谓术语“癌症的预防”或“预防癌症”和等同术语意图是指所述方法至少部分地消除或减少和/或延迟癌症发病的发病率和/或严重性。换句话说，受试者中癌症的发病可以在似然性或可能性中降低和/或延迟。本领域已知免疫应答可以通过免疫调谐细胞因子（例如，α-干扰素、β-干扰素、γ-干扰素、ω-干扰素、τ-干扰素、白细胞介素-1α、白细胞介素-1β、白细胞介素-2、白细胞介素-3、白细胞介素-4、白细胞介素5、白细胞介素-6、白细胞介素-7、白细胞介素-8、白细胞介素-9、白细胞介素-10、白细胞介素-11、白细胞介素12、白细胞介素-13、白细胞介素-14、白细胞介素-18、b细胞生长因子、cd40配体、肿瘤坏死因子-α、肿瘤坏死因子-β、单核细胞趋化蛋白-1、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子和淋巴毒素）来增强。因此，免疫调谐细胞因子（优选地，ctl诱导性细胞因子）可以与病毒载体一起施用于受试者。可以通过本领域已知的任何方法来施用细胞因子。可以向受试者施用外源细胞因子，或者，可以使用合适的载体将编码细胞因子的核酸递送至受试者，并且在体内产生细胞因子。受试者、药物制剂和施用方式根据本发明的病毒载体和aav颗粒应用于兽医和医学应用两者。合适的受试者包括禽类和哺乳动物。如本文所用的术语“禽类”包括，但不限于，鸡、鸭、鹅、鹌鹑、火鸡、雉、鹦鹉、长尾小鹦鹉等。如本文所用的术语“哺乳动物”包括，但不限于，人、非人灵长类动物、牛科动物、绵羊、山羊、马科动物、猫科动物、犬科动物、兔形目（lagomorphs）等。人受试者包括新生儿、婴儿、幼年、成年和老年受试者。在代表性的实施方案中，受试者“需要”本发明的方法。在特定的实施方案中，本发明提供了药物组合物，其包含在药学上可接受的载剂中的本发明的病毒载体和/或衣壳和/或aav颗粒，以及任选地，其它药用剂、药物剂、稳定剂、缓冲剂、载剂、辅药、稀释剂等。对于注射，载剂一般将是液体。对于其它施用方法，载剂可以是固体或液体。对于吸入施用，载剂将是适于呼吸的，并且任选地可以是固体或液体颗粒形式。对于施用于受试者或用于其它药物用途，载剂将是无菌的和/或生理相容的。所谓“药学上可接受的”指的是不有毒或在其它方面不期望的材料，即，所述材料可以在不引起任何不期望的生物学作用的情况下施用于受试者。本发明的一个方面是在体外将核酸分子转移至细胞的方法。可以根据适合于特定靶细胞的标准转导方法，以适当的感染复数将病毒载体引入细胞。取决于靶细胞的类型和数目以及特定的病毒载体，要施用的病毒载体的滴度可以变化，并且可以由本领域技术人员在没有过度实验的情况下确定。在代表性的实施方案中，将至少约103的感染单位，任选地至少约105的感染单位引入细胞。向其中导入病毒载体的一种或多种细胞可以是任何类型，包括但不限于神经细胞（包括周围和中枢神经系统的细胞，特别是脑细胞，例如神经元和少突胶质细胞（oligodendricytes））、肺细胞、眼细胞（包括视网膜细胞、视网膜色素上皮和角膜细胞）、上皮细胞（例如，肠道和呼吸上皮细胞）、肌肉细胞（例如，骨骼肌细胞、心肌细胞、平滑肌细胞和/或膈肌细胞）、树突细胞、胰细胞（包括胰岛细胞）、肝细胞、心肌细胞、骨细胞（例如，骨髓干细胞）、造血干细胞、脾细胞、角质形成细胞、成纤维细胞、内皮细胞、前列腺细胞、生殖细胞等。在代表性的实施方案中，细胞可以是任何祖细胞。作为进一步的可能性，细胞可以是干细胞（例如，神经干细胞、肝干细胞）。作为再进一步的备择方案，细胞可以是癌或肿瘤细胞。此外，如上文所述的，细胞可以来自任何起源的物种。为了将修饰的细胞施用于受试者起见，可以将病毒载体体外引入细胞中。在特定的实施方案中，已经从受试者中取出细胞，将病毒载体引入其中，且然后将细胞施用回受试者中。从受试者中取出细胞用于离体操作继之以引入回受试者中的方法在本领域中是已知的（参见，例如，美国专利号5,399,346）。或者，可以将重组病毒载体引入来自供体受试者的细胞、培养的细胞或来自任何其它合适来源的细胞中，并将所述细胞施用于需要其的受试者（即，“接受者”受试者）。用于离体核酸递送的合适细胞如上所述。施用于受试者的细胞剂量将根据受试者的年龄、状况和物种，细胞的类型，由细胞表达的核酸，施用方式等而变化。一般，在药学上可接受的载剂中每剂将施用至少约102至约108个细胞或至少约103至约106个细胞。在特定的实施方案中，将用病毒载体转导的细胞与药学载剂组合以治疗有效或预防有效量施用于受试者。在一些实施方案中，将病毒载体引入细胞中，并且可以将细胞施用给受试者以引出针对所递送的多肽（例如，作为转基因表达的或在衣壳中）的免疫原性应答。一般，施用与药学上可接受的载剂组合的一定量的表达免疫原性有效量的多肽的细胞。“免疫原性有效量”是表达的多肽的量，其足以在向其施用药物制剂的受试者中引起针对所述多肽的主动免疫应答。在特定的实施方案中，所述剂量足以产生保护性免疫应答（如上文所定义的）。所赋予的保护的程度不需要是完全的或永久的，只要施用免疫原性多肽的益处多于其任何缺点。本发明的进一步的方面是向受试者施用病毒载体和/或病毒衣壳的方法。根据本发明的病毒载体和/或衣壳向需要其的人受试者或动物的施用可以通过本领域已知的任何方式进行。任选地，病毒载体和/或衣壳在药学上可接受的载剂中以治疗有效或预防有效剂量递送。可进一步施用本发明的病毒载体和/或衣壳以引出免疫原性应答（例如，作为疫苗）。一般，本发明的免疫原性组合物包含与药学上可接受的载剂组合的免疫原性有效量的病毒载体和/或衣壳。任选地，所述剂量足以产生保护性免疫应答（如上文所定义的）。所赋予的保护的程度不需要是完全的或永久的，只要施用免疫原性多肽的益处多于其任何缺点。受试者和免疫原如上文所述。施用于受试者的病毒载体和/或衣壳的剂量取决于施用方式、待治疗和/或预防的疾病或状况、个别受试者的状况、特定的病毒载体或衣壳以及要递送的核酸等，且可以以常规方式确定。用于获得治疗效果的示例性剂量是至少约105、106、107、108、109、1010、1011、1012、103、1014、1015的转导单位，任选约108至约1013的转导单位的滴度。在特定的实施方案中，可以使用不止一次施用（例如，两次、三次、四次、五次、六次、七次、八次、九次、十次等，或更多次施用）以在各种时间间隔的时间段范围内达到所期望的基因表达水平，例如，每小时、每天、每周、每月、每年等。示例性的施用方式包括口服、直肠、跨黏膜、鼻内、吸入（例如，通过气溶胶），口腔的（例如，舌下）、阴道、鞘内、眼内、经皮、在宫内（或卵内（inovo））、肠胃外（例如静脉内、皮下、皮内、肌内[包括对骨骼肌、膈肌和/或心肌的施用]、皮内、胸膜内、脑内和关节内）、局部（例如，对皮肤和黏膜表面两者，包括呼吸道表面，和经皮施用）、淋巴管内等，以及直接组织或器官注射（例如，向肝、骨骼肌、心肌、膈肌或脑）。也可以施用于肿瘤（例如，在肿瘤或淋巴结中或附近）。在任何给定情况下，最合适的途径将取决于正被治疗和/或预防的状况的特性和严重性，以及正被使用的特定载体的特性。病毒载体和/或衣壳可以通过静脉内施用、动脉内施用、腹膜内施用、肢灌注（limbperfusion）（任选地，腿和/或臂的独立肢灌注；参见，例如，arruda等人(2005)blood105:3458-3464）和/或直接肌内注射进行递送。在特定实施方案中，通过肢灌注，任选地独立肢灌注（例如，通过静脉内或关节内施用）将病毒载体和/或衣壳施用至受试者（例如，患有肌营养不良例如dmd的受试者）的肢（臂和/或腿）。在本发明的实施方案中，本发明的病毒载体和/或衣壳可以有利地在不使用“流体动力学”技术的情况下施用。现有技术载体的组织递送（例如，向肌肉）经常通过流体力学技术（例如，大体积的静脉内/静脉内施用）来增强，这增加了脉管系统中的压力并促进了载体跨越内皮细胞屏障的能力。在特定的实施方案中，本发明的病毒载体和/或衣壳可以在没有流体动力学技术例如大体积输注和/或升高的血管内压（例如，大于正常收缩压，例如，比起正常收缩压来小于或等于5％、10％、15％、20％、25％的血管内压增加）的情况下施用。这种方法可以减少或避免与流体力学技术有关的副作用，例如水肿、神经损伤和/或间隔综合征。还可以实践本发明以产生用于全身递送的反义rna、rnai或其它功能性rna（例如，核酶）。注射物质（injectables）可以以常规形式制备，作为液体溶液或悬浮液，适于在注射前在液体中的溶液或悬浮液的固体形式，或者作为乳剂。或者，人们可以以局部而非全身的方式，例如，在贮存（depot）或持续释放制剂中施用本发明的病毒载体和/或病毒衣壳。进一步地，病毒载体和/或病毒衣壳可以黏附在可外科手术植入的基质上递送（例如，如美国专利公开号us-2004-0013645-a1中所述的）。在特定的实施方案中，可以施用本发明的递送载体以治疗cns的疾病，包括遗传性障碍、神经变性病症、精神病性障碍和肿瘤。cns的举例说明性疾病包括，但不限于，阿尔茨海默氏病，帕金森氏病，亨廷顿舞蹈病，卡纳万病，利氏病，雷夫叙姆病，图雷特综合症，原发性侧索硬化，肌萎缩性侧索硬化症，进行性肌萎缩，皮克氏病，肌营养不良，多发性硬化，重症肌无力，宾斯旺格氏病，由于脊髓或头损伤的创伤，泰-萨病，lesch-nyan病，癫痫，大脑梗塞，精神病性障碍，包括情感障碍（例如，抑郁、双相情感障碍、持续性情感障碍、继发性情感障碍），精神分裂症，药物依赖（例如，酒精中毒和其它物质依赖），神经机能病（例如，焦虑、强迫性障碍（obsessionaldisorder）、躯体形式障碍（somatoformdisorder）、分离性障碍、悲伤、产后抑郁），精神病（例如，幻觉和妄想），痴呆，偏执狂，注意力缺陷障碍，性心理障碍（psychosexualdisorders），睡眠障碍，疼痛障碍（paindisorders），进食或体重障碍（例如，肥胖、恶病质、神经性厌食和食欲过盛（bulemia））以及cns的癌症和肿瘤（例如，垂体瘤）。cns的病症包括涉及视网膜、后束（posteriortract）和视神经的眼病症（例如，色素性视网膜炎、糖尿病性视网膜病和其它视网膜变性疾病、葡萄膜炎、年龄相关性黄斑变性、青光眼）。大多数（如果不是全部的话）眼疾病和病症与以下三种类型的适应症中的一种或多种有关：（1）血管发生，（2）炎症，和（3）变性。本发明的递送载体可被用于递送抗血管生成因子；抗炎因子；延迟细胞变性、促进细胞免毒现象或促进细胞生长的因子以及上述的组合。例如，糖尿病性视网膜病的特征在于血管发生。糖尿病性视网膜病可通过眼内（例如，在玻璃体中）或眼周围（例如，在眼球筋膜下区域（sub-tenon'sregion）中）递送一种或多种抗血管生成因子来治疗。一种或多种神经营养因子也可以在眼内（例如，玻璃体内）或眼周围共递送。葡萄膜炎涉及炎症。一种或多种抗炎因子可以通过眼内（例如，玻璃体或前房）施用本发明的递送载体来施用。相比之下，色素性视网膜炎的特征在于视网膜变性。在代表性的实施方案中，色素性视网膜炎可以通过眼内（例如，玻璃体施用）编码一种或多种神经营养因子的递送载体进行治疗。年龄相关性黄斑变性涉及血管发生和视网膜变性两者。可通过眼内（例如，玻璃体）施用编码一种或多种神经营养因子的本发明递送载体和/或眼内或眼周围（例如，在眼球筋膜下区域中）施用一种或多种抗血管生成因子来治疗所述病症。青光眼的特征是升高的眼压（ocularpressure）和视网膜神经节细胞的丧失。青光眼的治疗包括使用本发明的递送载体施用一种或多种保护细胞免受兴奋性神经毒性损伤的神经保护剂（neuroprotectiveagents）。这种试剂包括眼内，任选地玻璃体内递送的n-甲基-d-天冬氨酸（nmda）拮抗剂、细胞因子和神经营养因子。在其它实施方案中，本发明可用于治疗发作，例如，以降低发作的发病、发病率或严重性。发作的治疗性治疗的功效可以通过行为（例如，眼或口的摇动，抽搐（ticks））和/或电描记手段（大多数发作具有特征性电描记异常）来评估。因此，本发明还可以用于治疗癫痫，其标志在于随着时间过去的多次发作。在一个代表性的实施方案中，使用本发明的递送载体将促生长素抑制素（或其活性片段）施用于脑以治疗垂体瘤。根据所述实施方案，编码促生长素抑制素（或其活性片段）的递送载体通过微输注（microinfusion）到垂体中进行施用。同样，这种治疗可用于治疗肢端肥大症（来自垂体的异常生长激素分泌）。促生长素抑制素的核酸序列（例如，genbank登记号j00306）和氨基酸（例如，genbank登记号p01166；含有加工的活性肽促生长素抑制素-28和促生长素抑制素-14）序列是本领域已知的。在特定的实施方案中，载体可以包含分泌信号，如美国专利号7,071,172中所述的。在本发明的代表性实施方案中，病毒载体和/或病毒衣壳在全身施用后被递送至cns（例如，到脑或到眼）。病毒载体和/或衣壳可被引入脊髓、脑干（延髓、脑桥）、中脑（下丘脑、丘脑、上丘脑、脑垂体、黑质、松果体）、小脑、端脑（纹状体，大脑，包括枕叶、颞叶、顶叶和额叶，皮质，基底神经节，海马和杏仁核（portaamygdala））、边缘系统、新皮质、纹状体、大脑和下丘。外周施用后，病毒载体和/或衣壳也可被递送到眼的不同区域，例如视网膜、角膜和/或视神经。病毒载体和/或衣壳可以被递送到脑脊液中（例如，通过腰椎穿刺），用于递送载体的更分散的施用。在已经干扰了血-脑屏障的情况中（例如，脑肿瘤或大脑梗塞），可以进一步将病毒载体和/或衣壳血管内施用于cns。可以通过本领域已知的任何途径将病毒载体和/或衣壳施用至身体的一个或多个所期望的区域，包括但不限于，鞘内，眼内，脑内，心室内，静脉内（例如，在有糖例如甘露糖醇的情况下），鼻内，耳内，眼内（例如，玻璃体内、视网膜下、前房）和眼周围（例如，眼球筋膜下区域）递送以及在逆向递送至运动神经元的情况下的肌内递送。在特定实施方案中，病毒载体通过直接注射（例如，立体定向注射（stereotacticinjection））在液体制剂中施用至cns中的期望区域或区室。在其它实施方案中，病毒载体和/或衣壳可以通过局部应用至所期望的区域或通过鼻内施用气溶胶制剂来提供。对眼的施用可以通过液滴的局部应用。作为进一步的备择方案，病毒载体和/或衣壳可以作为固体、缓释制剂施用（参见，例如，美国专利号7,201,898）。在再额外的实施方案中，病毒载体可以用于逆向转运以治疗和/或预防涉及运动神经元的疾病和病症（例如，肌萎缩性侧索硬化症（als）；脊髓型肌萎缩（sma）；等）。例如，可以将病毒载体递送至肌肉组织，病毒载体可以从其中迁移至神经元中。本发明可如以下编号段落中任何一项所定义：1.一种重组核酸分子，其包含腺伴随病毒(aav)5’反向末端重复(itr)、与启动子可操作地缔合的目的核苷酸序列(noi)和aav3’itr，其中所述重组核酸分子进一步包含：a)5’itr的下游和启动子的上游的以3’至5’定向的聚a(pa)序列和3’itr的上游和noi的下游的以3’至5’定向的pa序列；b)3’itr的上游和noi的下游的以3’至5’定向的pa序列；c)3’itr的上游和noi的下游的以3’至5’定向的第一pa序列和第一pa序列的下游和3’itr的上游的以5’至3’定向的第二pa序列；d)3’itr的上游和noi的下游的以3’至5’定向的第一pa序列和noi的下游和第一pa的上游的以5’至3’定向的第二pa序列；e)3’itr的上游和noi的下游的以3’至5’定向的第一pa序列和5’itr的下游和启动子的上游的以5’至3’定向的第二pa序列；f)5’itr的下游和启动子的上游的以3’至5’定向的第一pa序列、noi的下游和第三pa序列的上游的以5’至3’定向的第二pa序列和第二pa序列的下游和3’itr的上游的以3’至5’定向的第三pa序列；g)5’itr的下游和启动子的上游的以5’至3’定向的第一pa序列、noi的下游和第三pa序列的上游的以3’至5’定向的第二pa序列和第二pa序列的下游和3’itr的上游的以5’至3’定向的第三pa序列；h)5’itr的下游和启动子的上游的以5’至3’定向的第一pa序列、noi的下游和第三pa序列的上游的以5’至3’定向的第二pa序列和第二pa序列的下游和3’itr的上游的以3’至5’定向的第三pa序列；i)5’itr的下游和启动子的上游的以5’至3’定向的第一pa序列、noi的下游和第三pa序列的上游的以3’至5’定向的第二pa序列和第二pa序列的下游和3’itr的上游的以5’至3’定向的第三pa序列；j)5’itr的下游和第二pa序列的上游的以3’至5’定向的第一pa序列、第一pa序列的下游和启动子的上游的以5’至3’定向的第二pa序列、noi的下游和第四pa序列的上游的以5’至3’定向的第三pa序列和第三pa序列的下游和3’itr的上游的以3’至5’定向的第四pa序列；k)5’itr的下游和第二pa序列的上游的以3’至5’定向的第一pa序列、第一pa序列的下游和启动子的上游的以5’至3’定向的第二pa序列、noi的下游和第四pa序列的上游的以3’至5’定向的第三pa序列和第三pa序列的下游和3’itr的上游的以5’至3’定向的第四pa序列；l)5’itr的下游和第二pa序列的上游的以5’至3’定向的第一pa序列、第一pa序列的下游和启动子的上游的以3’至5’定向的第二pa序列、noi的下游和第四pa序列的上游的以5’至3’定向的第三pa序列和第三pa序列的下游和3’itr的上游的以3’至5’定向的第四pa序列；和/或m)5’itr的下游和第二pa序列的上游的以5’至3’定向的第一pa序列、第一pa序列的下游和启动子的上游的以3’至5’定向的第二pa序列、noi的下游和第四pa序列的上游的以3’至5’定向的第三pa序列和第三pa序列的下游和3’itr的上游的以5’至3’定向的第四pa序列。2.一种重组核酸分子，其包含第一aav血清型的腺伴随病毒(aav)载体盒，所述载体盒包含aav5'反向末端重复(itr)、与启动子可操作地缔合的目的核苷酸序列(noi)和aav3’itr，其中所述aav5’itr和/或aav3’itr来自不同于第一aav血清型的第二aav血清型。3.段落2的重组核酸分子，其中所述第一aav血清型是aav2和所述第二aav血清型是aav5。4.一种重组核酸分子，其包含腺伴随病毒(aav)5'反向末端重复(itr)、与启动子可操作地缔合的目的核苷酸序列(noi)和aav3’itr，其中所述5’itr和/或3’itr经修饰以减少或消除来自5’itr和/或3’itr的启动子活性。5.一种重组核酸分子，其包含aav5’itr、与启动子可操作地缔合的noi、以3’至5’定向的pa序列和aav3’itr，其中所述noi序列与一个或多于一个核苷酸序列融合，所述核苷酸序列编码靶向细胞质dsrna传感器的干扰rna序列。6.一种重组核酸分子，其包含aav5’itr、与第一启动子可操作地缔合的noi、以3’至5’定向的第一pa序列、与第二启动子可操作地缔合的编码靶向细胞质dsrna传感器的干扰rna序列的核苷酸序列、第二pa序列和aav3’itr。7.一种重组核酸分子，其包含aav5’itr、与第一启动子可操作地缔合的noi、以3’至5’定向的pa序列、与第二启动子可操作地缔合的靶向细胞质dsrna传感器的短发夹rna(shrna)序列和aav3’itr。8.一种重组核酸分子，其包含aav5’itr、与第一启动子可操作地缔合的靶向细胞质dsrna传感器的shrna、与第二启动子可操作地缔合的noi、以3’至5’定向的pa序列和aav3’itr。9.一种重组核酸分子，其按以下顺序包含：aav5’itr、均与启动子可操作地缔合的noi和靶向细胞质dsrna传感器的微小rna(mirna)序列、以3’至5’定向的pa序列和aav3’itr。10.一种重组核酸分子，其按以下顺序包含：aav5’itr、均与启动子可操作地缔合的靶向细胞质dsrna传感器的mirna和noi、以3’至5’定向的pa序列和aav3’itr。11.一种重组核酸分子，其按以下顺序包含：aav5’itr、noi、以3’至5’定向的pa序列和aav3’itr，所述noi包含在所述noi内的mirna内含子序列，所述noi与启动子可操作地缔合。12.一种组合物，其包含第一重组核酸分子和第二重组核酸分子，所述第一重组核酸分子包含aav5’itr、与启动子可操作地缔合的noi、以3’至5’定向的pa序列和aav3’itr，所述第二重组核酸分子包含靶向细胞质dsrna传感器的干扰rna序列。13.段落12的组合物，其中所述干扰rna序列是shrna。14.一种重组核酸分子，其包含：aav5’itr；noi和mavs信号转导的抑制剂，二者均与启动子可操作地缔合；以3’至5’定向的pa序列；和aav3’itr。15.段落14的重组核酸分子，其中所述mavs信号转导的抑制剂选自：来自丙型肝炎病毒的丝氨酸蛋白酶ns3–4a、来自甲型肝炎病毒的蛋白酶、来自gb病毒b的蛋白酶、乙型肝炎病毒(hbv)x蛋白、聚(rc)-结合蛋白2、20s蛋白酶体亚基psma7、线粒体融合蛋白2和其任何组合。16.一种重组核酸分子，其包含：aav5’itr；与第一启动子可操作地缔合的noi；以3’至5’定向的第一pa序列；与第二启动子可操作地缔合的mavs信号转导的抑制剂；以3’至5’定向的第二pa序列；和aav3’itr。17.一种raav载体基因组，其包含段落1-12和13-16中任一项的重组核酸分子。18.一种raav颗粒，其包含段落17的raav基因组。19.一种组合物，其包含段落18的raav颗粒。20.一种组合物，其包含第一重组核酸分子和第二重组核酸分子，所述第一重组核酸分子包含aav5’itr、与启动子可操作地缔合的noi、以3’至5’定向的pa序列和aav3’itr，所述第二重组核酸分子包含mavs信号转导的抑制剂和以3’至5’定向的pa序列。21.一种增强aav载体在受试者的细胞中的转导的方法，包括向受试者施用aav载体和在受试者的细胞中干扰dsrna活化途径的试剂。22.段落21的方法，其中所述在受试者的细胞中干扰dsrna活化途径的试剂是2-氨基嘌呤。23.段落21-22的方法，其中所述aav载体和所述试剂同时向受试者施用。24.段落21-22的方法，其中所述aav载体和所述试剂以分开的时间施用。本发明的主题现在将在下文中参考随附的实施例更充分描述，在实施例中显示了目前所公开的主题的代表性实施方案。然而，目前所公开的主题可以不同的形式体现，并且不应解释为限于本文提供的实施方案。而是，提供这些实施方案，使得本公开内容将是全面和完整的，并且将目前所公开的主题的范围充分传达给本领域技术人员。实施例以下实施例提供了说明性的实施方案。以下实施例的某些方面根据本发明人发现或预期在实施方案的实践中良好起作用的技术和程序公开。根据本公开内容和本领域的一般技术水平，技术人员将意识到，以下实施例意图仅是示例性的，并且许多变化、修改和改变可在不脱离目前所要求保护的主题的范围的情况下使用。实施例1细胞。hela细胞、293细胞、huh7细胞和hepg2细胞在37℃下在5%co2中在具有10%fbs和1%青霉素–链霉素的dulbecco改良的eagle培养基中生长。人原代肝细胞购自triangleresearchlabs。关于新鲜人原代肝细胞的信息列于表1。原代肝细胞在具有hepatocytethawingandplatingsupplementpack的williams'e培养基(thermofisherscientific)中铺板，并且在具有hepatocytemaintenancesupplementpackandhepextend™supplement的williams'e培养基(thermofisherscientific)中维持。aav病毒产生。在使用三重质粒转染之前描述aav病毒产生。简言之，hek-293细胞用aav转基因质粒(单链(ss)ptr-cba-萤光素酶、双链(ds)ptr-cbh-gfp、ssptr-cmv-gfp、ssptr-cba-aat、dsptr-shrna-混杂和dsptr-ttr-fιx-opt)、rep和capaav辅助质粒和腺病毒辅助质粒pxx6-80转染。转染后48小时，收获细胞。裂解hek-293细胞后，aav病毒通过氯化铯(cscl)梯度密度离心纯化。通过q-pcr测定病毒滴度。小鼠。具有70%人肝细胞再生的人异种移植小鼠购自yecuris公司。小鼠维持在chapelhill的北卡罗来纳大学的无特定病原体的设施中。北卡罗来纳大学机构动物管理和使用委员会批准了所有程序。体外转导。hela、huh7、293或hepg2细胞通过每细胞5×103个aav载体颗粒转导。在不同时间点收获转导的细胞。对于长期aav转导研究，在6孔板中1×105个hela细胞通过每细胞5×103个aav颗粒转导。在转导后第3天，细胞按1:5分传，然后细胞培养至多5天，其中每天更换培养基。在指定的时间点收获aav转导的细胞，使用细胞裂解物来测量萤光素酶活性。人原代肝细胞的转导。将悬浮的肝细胞铺板到胶原蛋白i包被的板，和以剂量5×103个颗粒/细胞加入aav载体(aav2/gfp或aav2/fiχ-opt)。一天后，更换铺板培养基为维持培养基。原代肝细胞培养10天，同时每天更换培养基。在不同的时间点收获肝细胞用于检测mda-5、rig-1和ifn-β。小鼠实验。来自异种移植小鼠的人肝细胞以3x1011个aav8/fix-opt颗粒通过眶后注射施用。aav注射后第4或8周，处死小鼠和收获肝脏用于rna提取和蛋白质印迹的蛋白分析。萤光素酶测定。通过aav2/萤光素酶转导的细胞用被动裂解缓冲液(promega)处理20min。萤光素酶活性用萤光素酶测定试剂(promega)按照制造商的说明书测量。萤光素酶活性用wallac1420victor3读板器测量。转染测定。对于聚(i:c)转染，在12孔板中在不同的时间点，细胞用2µg聚(i:c)通过lipofectamin3000(thermofisherscientific)转染：aav转导前18h，同时或aav转导后3天。对于sirna转染，在aav载体转导后第3天，将hela细胞分传，并且24h后，细胞用1μgsirna(simda5:cugaaucugcuccuucacc(seqidno:1)、simavs:auacaacugacccuguggg(seqidno:2)、simavs-2:uaguugaucucgcggacga(seqidno:3)和ccguuugcugaagacaaga(seqidno:4)、sicontrol:ugugaucaaggacgcuaug,seqidno:5)转染。在转染后48或72小时，收获细胞用于萤光素酶测定或rna提取。rna分离和实时pcr。来自培养的细胞或小鼠肝脏组织的rna使用trizolreagent(invitrogen)分离。使用revertaid第一链cdna合成试剂盒(thermofisherscientific)进行从rna模板合成第一链cdna。实时pcr通过lightcycler480仪器(roche)进行。用于实时pcr的引物列于表2。蛋白质印迹。细胞或组织用ripa缓冲液处理。将每道60μg的蛋白加载到sds-page凝胶。在蛋白转移到nc膜之后，将膜用兔单克隆mda5抗体(thermofisherscientific)或β-肌动蛋白抗体(thermofisherscientific)染色。使用ecl蛋白质印迹检测试剂(ge)检测信号。数据分析使用imagej软件进行。ifn-β启动子报告测定。在6孔板中1×105个hela细胞通过每细胞5×103个aav2/gfp颗粒转导。在转导后第3天细胞按1:5分传。24h后，细胞用ifn-β启动子报告质粒和sirna共转染。然后在转染72h后测量萤光素酶活性。统计学分析。所有统计学计算使用统计学软件(graphpadprism7.0软件)进行。通过studentt检验评价的不同组之间的差异，当p值<0.05时被认为是统计学显著的。ifn-β抑制来自aav转导细胞的转基因表达。i型ifn-β表达是先天免疫激活的标志。为了研究先天免疫应答激活对转基因表达的影响，我们研究了在体外aav转导后ifn-β对转基因表达的影响。hela细胞用编码萤火虫萤光素酶转基因的aav2/luc载体感染，和24hr后，加入不同剂量的ifn-β。在补充ifn-β后的不同时间点，测量萤光素酶活性。与pbs(无ifn)组相比，萤光素酶转基因表达显著降低。抑制是剂量依赖性的(图1a)。当从aav转导后第1天开始每天加入ifn-β时，从长期培养观察到更强的萤光素酶表达抑制(图1b)。该结果表明先天免疫应答激活可抑制aav转导。聚(i:c)抑制aav转导。在临床试验中，在具有血友病的患者中，在aav施用后第6至10周观察到转基因表达的降低。在该时间点，大多数aav病毒体已经进入细胞核用于有效转基因表达。从细胞质中的内体或对于dna的传感器的模式识别受体(prp)触发先天免疫应答的可能性看起来很低。我们假设dsrna可从aav载体介导的转基因递送产生和可激活先天免疫应答。为了确定来自dsrna的先天免疫是否影响来自aav转导的转基因表达，我们用aav2/luc转导细胞，其中在不同的时间点，即在aav2转导前18小时或同时或在aav2转导后第3天，进行作为dsrna的合成类似物的聚肌苷酸-聚胞苷酸(聚(i:c))的转染。聚(i:c)转染后72小时后，收获细胞裂解物用于萤光素酶活性分析。不管时间点如何，在hela细胞和huh7细胞二者中聚(i:c)的转染抑制转基因表达(图2)。数据表明从dsrna触发的先天免疫应答影响aav转导。在hela细胞中双链rna先天免疫应答从晚期aav转导触发。为了研究aav转导是否激活由dsrna触发的先天免疫应答，我们检查了在转录水平上dsrna传感器的表达动力学：mda5和rig1。如图3所示，在hela细胞中在scaav/gfp载体转导后第6天观察到mda5的上调。在转导的第5天之前没有mda5激活(图3a)。在hela细胞中在aav转导期间rig1表达没有增加(图3b)。在第3-6天期间没有ifn-β增加，然而在第8天获得高ifn-β表达(图3c)。我们还检查了在翻译水平上mda-5的表达。在aav转导后第8天，根据蛋白质印迹结果的强度，发现在细胞裂解物中mda-5表达较高(图3d和3e)。该研究暗示，aav转导能够激活dsrna介导的先天免疫应答。aav转导介导的dsrna先天免疫应答激活是细胞特异性的和转基因依赖性的。在临床试验中，在具有血友病b的患者中，转基因fix由肝脏特异性启动子驱动和主要在肝细胞中表达。来自上述研究的结果已证实了在hela细胞(一种非肝细胞细胞系)中dsrna免疫应答在aav转导后的后面时间触发。接着，我们想知道dsrna先天免疫应答是否也在其它人细胞系中被触发，包括衍生自肝细胞的细胞系。在aav2/gfp载体感染后，在不同的时间点，评价了dsrna应答。仅在人肝细胞huh7细胞和hepg2细胞中观察到mda5和ifn-β的上调，但在293细胞中没有(图4a)。为了研究dsrna介导的先天免疫应答从不同的转基因的激活，我们用编码不同的转基因的aav2转导hela细胞，包括萤光素酶、shrna-混杂和抗胰蛋白酶。在aav转导后第8天，检测到mda5转录。与对照组相比，在用ssaav/gfp、aav2/luc、aav2/shrna-混杂转导的hela细胞中观察到更高mda-5表达，但用aav2/aat转导不是如此(图4b)。然而，不管转基因如何，ifn-β表达在所有aav2载体转导的细胞中上调。dsrna先天免疫应答在aav/gfp转导的原代人肝细胞中被诱导。已表明，在人肝细胞细胞系huh7细胞中aav转导触发dsrna先天免疫应答，并且如上所述，我们想知道该发现是否可适用于人原代肝细胞。已证实aav2可有效地体外转导原代人肝细胞。我们使用scaav2/gfp载体转导来自6个不同的受试者的原代人肝细胞。在aav2转导后的不同时间点，从人肝细胞收获rna用于转录表达mda5、rig1和ifn-β。aav转导后第5天后，mda5在12个受试者的6中上调(图5a)，其中较高的rig1表达仅在3个受试者中观察到(受试者1、5和12)。另外6个受试者没有显示mda5或rig-i表达变化(图5b)。然而，在aav转导后在所有受试者中检测到较高的ifn-β表达(图5)。mda5表达在aav转导后第5天或更后时间达到峰值，然后降低至基线。高ifn-β表达没有特定模式，和在大多数情况下在aav转导后的后面时间点(≥5天)，增加的ifn-β表达伴随着mda5表达。在一些受试者中，在aav转导后的非常早期时间点(在1天内)检测到高ifn-β表达(受试者1、3、7和9)，但对于dsrna传感器没有变化。该结果可能支持通过dsdna-tlr9途径的先天免疫应答激活，如其它研究中所报道的。dsrna先天免疫应答在aav/fix-opt转导的原代人肝细胞中被诱导。接下来，我们测试了aav载体递送治疗性转基因fix是否也触发dsrna先天免疫应答。我们用aav载体转导来自10个受试者的人原代肝细胞，以递送临床使用的fix盒-优化的人fix(其具有在r338l的突变用于增强凝固活性)(hfix-r338l-opt)。在用aav2/hfix-r338l-opt转导后，在aav感染的第5天或之后在10个受试者的5个中mda5和ifn-β上调(图6a)，和其它5个受试者仅显示高ifn-β表达(图6b)。在aav转导后第7天rig-i在受试者8和12中上调(图6a)。该结果表明dsrna先天免疫应答在用编码临床治疗性转基因的aav载体转导的人原代肝细胞中被激活(图6)。从人源化小鼠中在来自aav转导的人肝细胞中dsrna先天免疫应答的激活。所有上述结果支持了在人细胞中细胞溶质dsrna先天免疫应答在体外aav转导后的后面时间被激活。接下来，我们使用人嵌合小鼠模型体内检查了在人肝细胞中的dsrna先天免疫应答。在这些小鼠中，以70%再生将人肝细胞移植到小鼠肝脏中。在第一组实验中，我们在两只小鼠中注射临床载体aav8/hfix-opt，和在第8周，收获小鼠肝脏用于rna提取。然后，在人肝细胞中在转录水平上检测mda5和rig1表达。如图7a所示，mda5和rig1二者的表达增加。此外，ifn-β表达在aav8/hfix-opt处理的小鼠中高于没有处理的小鼠。在第二实验中，在aav8/hfix-opt注射后，在第4和8周，收获小鼠肝脏用于分析dsrna免疫应答。对于mda和rig-1二者的mrna水平在第4周增加，并在aav8施用后第8周降低至对照水平(图7b)。在蛋白水平上证实了较高mda5表达(图7c)。不仅在第4周而且在第8周，aav处理的小鼠具有高ifn-β表达(图7)。dsrna活化途径的阻断从aav转导细胞增加转基因表达和抑制ifn-β表达。在所述描述的实验中，诱导先天免疫应答和加入ifn-β降低aav转导。接下来，我们想知道阻断dsrna先天免疫应答是否在aav转导后的后面时间点影响转基因表达。因为mad5是在具有aav转导的hela细胞中主要的dsrna传感器，我们使用对mda5和mavs(mda5和rig1的共同衔接子)特异性的sirna，以敲减它们的表达，和研究转基因表达和ifn-β表达。sirna的转染能够有效地抑制mda5和mavs的转录表达(图8a)。最初，我们检查了sirna对聚(i:c)关于aav转基因表达的抑制的影响。在aav2/luc转导后第3天，加入聚(i:c)。在第4天转染sirna。在sirna后48或72小时，测量转基因表达。当使用对于mda5或mavs的sirna时，萤光素酶表达在48和72小时均显著增加。接下来，在aav转导后第4天，转染sirna，48和72小时后测量ifn-β表达。类似于来自聚(i:c)应用的发现，通过施用sirna实现较高的萤光素酶表达。最后，我们研究了在aav转导后sirna对ifn-β表达的影响。与上述研究一致，通过sicontrolrna转染显示了高ifn-β表达(图8b)。如所预期的，当使用对mda5或mavs的sirna时在转录和翻译两个水平上ifn-β表达几乎完全被抑制(图8c和图8d)。重要的是注意到，当使用simavs时mda5上调被拯救(图8e)。这些结果表明，dsrna活化途径的阻断能够在aav转导后的后期阶段减弱先天免疫应答，这导致较高的转基因表达。先天免疫应答系统是针对病原体的第一线防御，并且已经研究了其在aav转导中的激活。与其它病原性病毒相比，在aav转导后腺伴随病毒(aav)感染或其重组载体转导仅诱导瞬时和低的先天免疫。此外，关于对病毒的先天免疫应答的所有研究关注病毒感染后的早期时间点。在本研究中，我们首次证实先天免疫应答在长期aav转导后在后面的时间点被触发。晚期先天免疫应答激活在不同的细胞系和人原代肝细胞中发生。最重要地，晚期先天免疫应答在aav转导后在来自人异种移植小鼠的肝脏的人肝细胞中也被检出。晚期先天免疫应答通过dsrna活化途径介导。dsrna传感器或衔接子的阻断能够减弱先天免疫应答和增加aav转导。对于先天免疫应答激活，通常通过模式识别受体(prr)识别病原体相关分子模式(pamp)上调共刺激分子和炎性细胞因子产生。prr已被分成数个家族：toll-样受体(tlr)、rig-i样受体(rlr)、nod-样受体(nlr)、c-型凝集素受体(clr)、aim2-样受体(alr)和胞质溶胶dna传感器。之前的研究已经证实，先天免疫应答通过类浆细胞dc中的tlr9-myd88途径和人非实质肝脏细胞中的tlr2，从aav感染诱导。另一研究已表明，当通过全身施用在小鼠中施用aav载体时，在肝脏中观察到增加的tlr9信号转导。根据这些研究，先天免疫应答在24小时内检出。在进一步的研究中，发现在pdc通过aav转导感染后18小时实现强ifn-α分泌。先天免疫应答的激活在24小时内在非实质肝脏细胞(npc)中被触发。已证实，在小鼠中，全身施用aav载体导致快速诱导炎性细胞因子，其在aav注射后6h回到基线。先天免疫应答的这种早期激活影响aav转导后的长期稳定转基因表达。然而，在aav载体肝脏靶向后，在第6周后在具有血友病b的一些患者中先天免疫应答的早期激活可不促进转基因表达的下降。在该研究中，在aav转导后第6天在hela细胞中观察到ifn-β表达的上调。在原代人肝细胞中，ifn-β表达的模式是不一致的。通常，在所有样品中在第5天后实现ifn-β的高表达。最后，我们还检测了在aav施用后从第4周至第8周在来自人源化小鼠的人肝细胞中ifn-β的上调。这些结果强烈支持了先天免疫应答的激活从长期aav转导引发的观点。这可抑制晚期转基因表达，如在具有血友病的一些患者中在临床试验中表明的。在一些原代人肝细胞中在aav转导的第1天的ifn-β高表达可归因于tlr9介导的先天免疫应答，但不归因于tlr2途径，如从早期研究提示的。尚未研究在aav转导后的后面时间点ifn-β上调的机制。不可能的是，在后期阶段的先天免疫应答的激活通过与aav转导后的早期阶段相同的机制触发。在早期aav感染时，tlr9识别dsaav基因组或tlr2识别aav衣壳分别在pdc或非实质肝脏细胞中起重要作用以激活先天免疫应答。tlr仅识别位于细胞表面上或内体中的prr。在长期aav转导后，如果来自aav载体(dsdnaaav基因组或aav衣壳蛋白)的prr仍保留在内体中，tlr应该继续识别这些prr和诱导持续的ifn-β表达。该假设与我们在本研究中在hela细胞中在aav转导后第2-4天期间ifn-β表达处于基线水平的观察结果相反。因此，一些其它机制应该牵扯在aav转导后的后期阶段的先天免疫应答的激活。除了跨膜tlr之外，细胞质prr也可检测来自病毒感染的病毒核酸或蛋白。通常，rig-i和mda5能过识别来自rna病毒的细胞溶质dsrna，和已鉴定了细胞质中的数种dna传感器。nlr蛋白还参与对病毒感染的先天免疫应答。已证实了aavitr具有启动子功能和3’itr可转录负链rna，其用作反义以抑制转基因表达(图9)。这种反义rna可通过在细胞质中退火，结合有义rna以形成dsrna。从aav载体转导产生的dsrna通过调节rig-1和mda5表达，具有触发dsrna先天免疫应答的潜力。mda-5和rig-1结合共同的衔接子mavs，通过激活几种必需的转录因子，包括干扰素-调节因子(irf)和nf-κb以产生ifn-β和炎性细胞因子，来促进许多基因的直接或间接转录诱导。事实上，在aav转导后的后面时间点，在hela细胞、原代人肝细胞和来自人源化小鼠的肝细胞中观察到mda5的激活。上调mda5，但不上调rig-1，进一步支持了我们的假设，即因为mda5识别长dsrna，dsrna可从来自aav3’-itr的负链rna形成。该结果表明，dsrna介导的先天免疫应答激活在长期aav转导后被触发。使用sirna阻断dsrna传感器mda5或衔接子mavs，在aav感染的后面时间点ifn-β表达被抑制和转基因表达被增加。这些结果进一步支持了在具有血友病b的接受aav基因疗法的患者中，dsrna激活的先天免疫应答在后期时间促进治疗性fix降低。关于dsrna介导的先天免疫应答激活如何仅在aav转导的晚期阶段被检出，可能的机制之一是aavitr的启动子非常弱。因此，它需要相对长的时间来从aav3’itr产生足够的反义rna以达到阈值和形成dsrna。此外，aav载体转导的生物学可在aav转导的后期阶段在dsrna形成中起作用。不像腺病毒载体，转基因表达在临床前和临床试验中在第6周达到其峰值，并在aav载体施用后长期保持不变。因此，大量的负链rna可仅在aav转导的后期阶段合成。简言之，我们的研究揭示了长期aav转导通过转导细胞中的细胞质dsrna识别途径(这导致产生i型ifn-β)来激活先天免疫应答的新机制。在aav转导细胞中瞬时阻断dsrna途径降低ifn-β表达和增加转基因表达。这些结果提供了有价值的信息，其帮助我们设计有效方法来干扰dsrna途径以改进aav转导。实施例2阻断aavitr启动子功能。dsrna从aav转导诱导先天免疫应答的准确机制是未知的。一种可能性是itr的启动子功能和用于转基因表达的启动子的潜在双向功能。来自3’-itr或启动子的负链rna转录，和来自启动子或5’-itr的正链rna可形成双链rna，其触发先天免疫应答。为了阻止通过itr起始的转录，我们在5’-itr的下游或启动子和3’-itr的上游加入聚(a)以阻断长rna转录物。聚(a)可作为单一段(图10a)或以组合(图10b)位于不同的位置。修饰aavitr以减少其启动子功能或使用来自不同的血清型的没有启动子功能的可选择itr。直到最近，已分离了13种aav血清型和超过100种变体。这些aav血清型和突变体使用不同的itr用于病毒复制和包装。特别地，我们研究了来自aav5itr的启动子功能，这是因为在aav5itr和aav2itr之间存在一些差异(图11和表7)。aav5itr具有对于rbe的5个重复和在rbe和trs之间的较长间隔区(图11和表7)。为了比较来自不同的itr的启动子功能，首先我们用不同的itr产生盒以驱动gfp转基因。在共转染质粒与cmv/laz作为内部对照至293细胞中后，2天后293细胞在荧光显微镜下可视化和用lacz染色(图12)。当与itr2/gfp相比时，从itr5/gfp的转染几乎没有见到gfp阳性细胞。为了进一步证实来自gfp表达的结果，我们使用itr产生其它盒以驱动人α-1抗胰蛋白酶转基因(aat)。在转染到不同的细胞中后，在所有测试的细胞系中在上清液中的aat水平在itr5组中显著低于itr2组(图13)。我们包装itr5/aat或itr2/aat到aav2或aav5衣壳中。在转导293细胞后，与来自质粒转染的结果一致，从aav/itr5/aat转导观察到较低的aat表达，而不管不同的衣壳如何(图14)。在肌肉注射这些载体后，在aav施用后第4周测量血液中的aat表达。类似于体外转导数据，itr5诱导比aav2显著更低的aat表达(图15)。总之，这些结果暗示，aav5itr具有比aav2itr更弱的启动子功能。可能的是，来自其它血清型或变体的itr可没有启动子功能。没有启动子功能的这些itr将用于产生aav盒。敲减dsrna传感器。mda5和rig-i以及蛋白激酶(pkr)是细胞质dsrna传感器。沉默这些分子能够阻断由细胞质dsrna触发的先天免疫应答。在aav转导后在不同的时间点可使用对于特定传感器的sirna。对于用于特定传感器的转基因表达，由rna聚合酶iii驱动的shrna或由相同的rna聚合酶ii驱动的mirna可使用单独的载体(图16，图示a)或作为与转基因盒连接的单一载体应用。当使用单一载体时，shrna或mirna可位于不同的位置。1.对于shrna在聚(a)和3’aavitr之间(图16,图示b)2.对于shrna在5’aavitr和启动子之间(图16,图示c)3.对于mirna在转基因和3’aavitr之间(图16,图示d)4.对于mirna在启动子和转基因之间(图16,图示e)5.mirna插入在转基因内含子内(图16,图示f)沉默参与dsrna先天免疫应答活化途径的分子。细胞溶质病毒rna被受体rig-i和mda5识别，所述受体通过半胱天冬酶-募集结构域(card)–card相互作用，激活线粒体抗病毒信号转导蛋白(mavs)。mavs募集各种信号转导分子以触发下游信号转导，例如tnf受体相关因子6(traf6)和traf5。traf6以及其它细胞内蛋白通过受体-相互作用蛋白1(rip1)和fas-相关死亡结构域蛋白(fadd)，激活nf-κb信号转导。nf-κb信号转导将nf-κb抑制剂-α(iκbα)磷酸化，和起始促炎细胞因子基因表达。mavs还激活干扰素调节因子(irf)信号转导。利用与上述相同的策略来敲减mavs或参与mavs下游信号转导的分子将阻断dsrna先天免疫应答。mavs信号转导还可被来自病毒感染的各种分子抑制。例如，来自丙型肝炎病毒的丝氨酸蛋白酶ns3–4a、来自甲型肝炎病毒和gb病毒b的蛋白酶以及乙型肝炎病毒(hbv)x蛋白。在病毒感染期间，一些内源蛋白，例如聚(rc)-结合蛋白2、20s蛋白酶体亚基psma7和线粒体融合蛋白2，可抑制mavs信号转导。这些蛋白(抑制剂)可用不同的载体(图17,图示a)或在融合至转基因的单一载体中(图17,图示b)表达，或由不同的启动子驱动(图17,图示c)以阻断在治疗性转基因表达期间的dsrna免疫应答。阻断dsrna先天免疫应答活化途径。除了阻断dsrna先天免疫应答的遗传途径之外，也可使用化学品来干扰dsrna活化途径。pkr通过dsrna被磷酸化和激活，并促进诱导i型干扰素，例如ifn-β，这可进一步增加其表达。2-氨基嘌呤(2-ap)是双链rna(dsrna)-活化蛋白激酶(pkr)的有效抑制剂。也可使用类固醇，例如氢化可的松(图18和19)。实施例3在aav转导后从aav3′-itr的负链rna产生。为了研究负链rna是否可从aav3′-itr启动子产生，hela细胞用aav2/萤光素酶载体感染，并在之后8天收获用于rna提取。使用萤光素酶转基因的有义或反义引物(表2)进行cdna合成。两对萤光素酶特异性pcr引物用于检测正链或负链转录物(图20a)。正链和负链转录物二者在aav转导后检测，和当rna用作模板时没有pcr产物(图20b)。负链转录物仅当cdna模板200倍稀释时检出。然而，即使在2,000倍稀释的cdna模板时，我们仍能够检出正链转录物(图20b)。该结果表明，反向定向的转录物可从aav转导产生，和负链rna形成的效率显著低于正链rna。还支持了从不同定向产生的正链rna和负链rna能够在aav-转导细胞中形成dsrna的可能性。在具有mavs敲减的细胞中增加的aav转导。用sirna寡聚物抑制mavs表达已表明增加aav转导。我们检查了在具有mavs缺乏的细胞中的转导效率。在转导aav2/luc载体后，在具有mavs敲减的人肝细胞细胞系(ph5ch8-mavs-ko)中比在ph5ch8细胞中一致实现较高的转基因表达(图21)。增加的转导独立于载体剂量和转导持续时间。用mavsshrna的有效敲减。我们设计了5种由u6启动子驱动的shrna，其具有沉默人mavs的潜力(图22a)。在转染shrna质粒到hela细胞中后，我们检查了mavs的表达和发现#31诱导最强的mavs敲减能力(图22b)。因此，mavsshrna#31被选择用于后面的研究。在具有mavs的shrna沉默的细胞中增强的aav转导。为了研究用shrna敲减mavs是否增加aav转导，我们首先转染mavsshrna#31到hela细胞中。第二天加入aav2/luc载体。在aav转导后第1天和第4天检测转基因表达。如图23所示，在具有mavs沉默的细胞中观察到较高的aav转导。总之，当靶细胞缺乏mavs时能够实现增加的aav转导。该结果表明整合mavsshrna到aav盒内通过阻断dsrna介导的先天免疫应答激活，可诱导较高的aav转导。尽管显示和描述了本发明的具体实施方案，但应理解，本发明不限于此，而是可在随附权利要求的范围内以其它方式体现和实施。因为本发明的许多修改和可选实施方案对本领域技术人员是显而易见的，该描述应解释为仅是说明性的，和用于教导本领域技术人员实施本发明的最佳方式的目的。因此，所有合适的修改和等同方案可视为落入随附权利要求的范围内。表1：关于人原代肝细胞受试者的信息表2:本研究中使用的引物表3:表4：氨基酸残基和缩写表5:表6:表7：tr2和tr5的比较当前第1页12当前第1页12