表达嵌合抗原受体的修饰的单核细胞/巨噬细胞/树突细胞和在蛋白质聚集体相关的疾病和失调中的用途的制作方法
相关申请的交叉引用
根据35u.s.c.§119(e)，本申请享有2018年2月2日提交的美国临时专利申请号62/625,487和2018年12月31日提交的美国临时专利申请号62/786,875的优先权，通过引用将其全部内容并入本文。
背景技术：
越来越多的疾病和失调显示与蛋白质的不适当折叠和/或蛋白质和脂蛋白以及传染性蛋白质物质的不适当沉积和聚集有关。这些包括阿尔茨海默氏病中得到确认的β-淀粉样蛋白和tau(τ)聚集体，帕金森氏病中的α-突触核蛋白聚集体，在包括肌萎缩性脊髓侧索硬化症(als)的病症中的fus、tdp-43、optn和c9orf72聚集体，和全身性淀粉样变性病的淀粉样蛋白纤维和斑块特征。蛋白质和/或脂蛋白的致病性聚集不仅发生在神经退行性疾病中，而且还发生在许多其他疾病中，比如炎症性疾病、纤维变性疾病(例如，胶原蛋白)和心血管疾病(例如，动脉粥样硬化斑块中的ldl)。
目前正在研究基于高度特异性抗体的治疗性方法，其利用靶向病理性聚集体的不同组分或旨在消耗用于聚集体形成的前体蛋白质的抗体，从而抑制或阻断聚集体形成，来治疗这些疾病。这些抗体也可用于消耗聚集的蛋白质本身，从而抑制它们扩散到周围细胞/组织和/或阻断它们作为种子形成另外的聚集体和/或防止发挥其病理作用。然而，仍存在需要被解决的治疗性抗体的功能限定，比如药代动力学不足、无法参与细胞免疫系统、在靶组织中缺乏驻留或组织渗透(比如血脑屏障)、非现场组织毒性和在慢性疾病状况中缺乏长期维持作用。
在患有全身性淀粉样变性病的患者中，正常细胞内蛋白质的细胞外沉积导致淀粉样蛋白(原纤维)的不溶性聚集体的积聚，以及器官比如心脏、肝脏、肾脏、神经和血管的功能受损。目前的治疗范围从器官移植到化学疗法，其导致严重的副作用，并且在大多数情况下，效果有限。针对血清淀粉样蛋白p组分(sap)的单克隆抗体(mab)的引入导致淀粉样蛋白的清除(richards等人，nengljmed2015；373:1106-1114)；然而，长期维持致命的疾病状态仍未解决。
在朊病毒病的模型中，靶向朊病毒蛋白质(prp)的抗体导致不溶性致病性朊病毒蛋白质形式prp(sc)的减少和脑损害的降低(ohsawa等人，microbiolimmunol.2013apr；57(4):288-97)。然而，由于血脑屏障(bbb)和主动运输离开脑脊髓液，脑mab浓度比循环血液中的浓度低1000倍，使得难易在治疗水平下递送mab至脑。
在心血管疾病中，已经采取了许多单克隆抗体方法，例如，开发了靶向蛋白原转化酶枯草杆菌蛋白酶/kexin9型(pcsk9)的抗体。然而，抗pcsk9抗体的作用机制通过使低密度脂蛋白(ldl)受体更易于结合ldl并从循环去除那些颗粒而降低了循环ldl的水平。这些方法不直接靶向ldl颗粒及其去除，这在其中ldl已经在动脉粥样硬化斑块的背景中积聚的情况下是有帮助的。动脉粥样硬化病变包括可以用抗体和其他靶向部分靶向的各种蛋白质和脂蛋白，理想地是通过可以穿透血管内皮/行进到组织中并直接去除斑块堆积组分的药物物质。另外，由于巨噬细胞用作泡沫细胞的前体，因此已知动脉粥样硬化斑块富含巨噬细胞。在动脉粥样硬化疾病中，血管内皮对细胞更通透，并且单核细胞容易渗入内膜中，在此它们分化为巨噬细胞并有助于形成斑块(lee等人，2017.lipidshealthdis.2017；16：12)。
动脉粥样硬化的主要治疗是脂质降低、糖尿病和高血压控制以及戒烟。患有证实的动脉粥样硬化的患者经历支架插入或搭桥手术。然而，再狭窄和治疗副作用是常见的，并且需要开发用于治疗动脉粥样硬化的新的治疗方法。动脉粥样硬化血管的持续炎性环境吸引了免疫系统细胞，为探索疗法提供了机会，在这种疗法中，被吸引到斑块中但具有清除斑块组分的靶向能力的单核细胞、巨噬细胞或树突细胞可直接用于减少动脉粥样硬化的斑块负担。
许多慢性炎症性疾病导致纤维变性的发展，这种病症的特征是包括胶原蛋白的细胞外基质组分的病理性沉积。纤维变性影响身体的不同器官，特别是肺(例如，特发性肺纤维变性)，而且也影响肝脏、肾脏、心脏、皮肤等。当前的纤维变性治疗试图控制潜在的炎症性病症，但并不直接靶向异常胶原蛋白质沉积物的消除。
因此，存在对于开发新的治疗方式的需要，该治疗方式被优化以靶向特定抗原、蛋白质、糖蛋白或脂蛋白，特别是针对基于蛋白质错误折叠和聚集的病理性疾病以及异质聚集体的情况。本发明解决了这一需要。
技术实现要素：
本发明至少部分地基于以下见解：包括一个或多个抗原-结合结构域的细胞和/或组合物可用于治疗与蛋白质聚集体的形成相关的疾病、失调和/或病症。本发明的前提是基于以下认识：单核细胞、巨噬细胞和/或树突细胞——包括经修饰以表达嵌合抗原受体或其他抗原结合结构域的单核细胞、巨噬细胞和/或树突细胞，可用于破坏各种疾病、失调和/或病症中发现的蛋白质聚集体，等等。通过非限制性实例，在一些实施方式中，破坏蛋白质聚集体可以是或包括：减小先前形成的蛋白质聚集体的大小，减慢或防止蛋白质聚集体的生长，和/或减慢或防止蛋白质聚集体的形成。因此，本文提供的方法、细胞和组合物代表用于一系列使人衰弱的疾病、失调和/或病症的有力的新型治疗。
在一些实施方式中，提供的细胞和/或组合物可以包括结合蛋白质聚集体中或蛋白质聚集体上的蛋白质的抗原结合结构域。在一些实施方式中，提供的细胞和/或组合物可以包括与蛋白质聚集体的结构表位结合的抗原结合结构域，该蛋白质聚集体包括多于单个蛋白质的部分(例如，新表位)。在一些实施方式中，提供的细胞和/或组合物可以包括与蛋白质聚集体的非蛋白质组分结合的抗原结合结构域。
在一些实施方式中，本发明提供了包括嵌合抗原受体(car)的细胞，其中car包括抗原结合结构域、跨膜结构域和细胞内结构域，其中抗原结合结构域能够结合蛋白质聚集体的抗原，并且其中细胞是表达car的单核细胞、巨噬细胞和/或树突细胞。在一些实施方式中，本公开内容提供了包括下列一个或多个的car：接头/间隔结构域、共刺激结构域和去稳定结构域。在一些实施方式中，本公开内容提供了细胞，其中细胞是表达car的单核细胞、巨噬细胞和/或树突细胞，其中细胞还表达选自下列的一个或多个控制系统：安全开关(例如，打开开关、关闭开关或自杀开关)和逻辑门(例如，和and、or或not门)。
在一些实施方式中，本发明提供了包括编码嵌合抗原受体(car)的分离的核酸序列的细胞，其中分离的核酸序列包括编码抗原结合结构域的核酸序列、编码跨膜结构域的核酸序列和编码细胞内结构域的核酸序列，其中抗原结合结构域能够结合蛋白质聚集体的抗原，并且其中细胞是表达car的单核细胞、巨噬细胞和/或树突细胞。
根据若干实施方式，可以使用各种抗原结合结构域中的任一种。在一些实施方式中，抗原结合结构域能够结合患有神经退行性疾病、炎症性疾病、心血管疾病、纤维变性疾病或淀粉样变性病的受试者的组织中的蛋白质聚集体的抗原。在一些实施方式中，抗原结合结构域是或包括抗体剂。在一些实施方式中，抗原结合结构域是或包括选自单克隆抗体、多克隆抗体、合成抗体、人抗体、人源化抗体、单结构域抗体、单链可变片段及其抗原-结合片段的抗体剂。在一些实施方式中，抗体剂是或包括tau抗体、tdp-43抗体、β-淀粉样蛋白抗体、淀粉样蛋白抗体、胶原蛋白抗体和/或前述抗体中的任一种的scfv。
根据各种实施方式，可以使用各种细胞内结构域中的任一种。在一些实施方式中，细胞内结构域是或包括共刺激分子和信号传导结构域中的至少一个。在一些实施方式中，car的细胞内结构域包括双重信号传导结构域。在一些实施方式中，car的细胞内结构域包括多于两个信号传导结构域。在一些实施方式中，细胞内结构域来自选自下列的共刺激分子：tcr、cd3ζ、cd3γ、cd3δ、cd3ε、cd86、常见的fcrγ、fcrβ(fcεr1b)、cd79a、cd79b、fcγriia、dap10、dap12、t细胞受体(tcr)、cd27、cd28、4-1bb(cd137)、ox40、cd30、cd40、pd-1、icos、淋巴细胞功能相关的抗原-1(lfa-1)、cd2、cd7、light、nkg2c、b7-h3、与cd83特异性结合的配体、cds、icam-1、gitr、baffr、hvem(lightr)、slamf7、nkp80(klrf1)、cd127、cd160、cd19、cd4、cd8α、cd8β、il2rβ、il2rγ、il7rα、itga4、vla1、cd49a、itga4、ia4、cd49d、itga6、vla-6、cd49f、itgad、cd11d、itgae、cd103、itgal、cd11a、lfa-1、itgam、cd11b、itgax、cd11c、itgb1、cd29、itgb2、cd18、lfa-1、itgb7、tnfr2、trance/rankl、dnam1(cd226)、slamf4(cd244、2b4)、cd84、cd96(触觉的)、ceacam1、crtam、ly9(cd229)、cd160(by55)、psgl1、cd100(sema4d)、cd69、slamf6(ntb-a、ly108)、slam(slamf1、cd150、ipo-3)、blame(slamf8)、selplg(cd162)、ltbr、lat、gads、slp-76、pag/cbp、nkp44、nkp30、nkp46、nkg2d及其任何组合。在一些实施方式中，细胞内结构域是或包括cd3ζ。在一些实施方式中，细胞内结构域是或包括fceri、cd16、cd32、cd64、补体受体、清除剂受体、钙网蛋白受体、itgam、slamf7、trem2、dectin-1、tlr1、2、3、4、5、6、7、8、9；marco、dap12、megf10、cd19。
特别考虑经由使用某些实施方式可以解决(例如，治疗、治愈，预防、改善和/或展现缓慢进展)各种神经退行性疾病中的任一种。例如，在一些实施方式中，神经退行性疾病选自tau蛋白病、早老性痴呆症、老年性痴呆症、阿尔茨海默氏病、与第17位染色体相关的帕金森症(ftdp-17)、进行性核上性麻痹(psp)、皮克氏病、原发性进行性失语症、额颞叶痴呆症、皮层基底节痴呆症、帕金森氏病、伴有痴呆症的帕金森氏病、路易体痴呆症、唐氏综合征、多系统萎缩症、肌萎缩性脊髓侧索硬化症(als)、哈-斯二氏综合征、多聚谷氨酰胺病、三核苷酸重复病、家族性英国痴呆症、致命性家族性失眠症、gss(gerstmann-straussler-scheinker)综合症、伴有淀粉样变性病的遗传性脑出血(冰岛型)(hchwa-i)、散发性致命性失眠症(sfi)、变异性蛋白酶敏感性朊蛋白病(vpspr)、家族性丹麦型痴呆症、克雅氏病(cjd)、变体型克雅氏病(vcjd)和朊病毒病。
还考虑可以经由使用某些实施方式解决(例如，治疗、治愈、预防、改善和/或展现缓慢进展)各种炎症性疾病中的任一种。在一些实施方式中，炎症性疾病选自系统性红斑狼疮、血管炎、类风湿性关节炎、牙周炎、溃疡性结肠炎、鼻窦炎、哮喘、结核病、克罗恩氏病、慢性感染、遗传性周期性发热、恶性肿瘤、全身性血管炎、容易引起反复感染的疾病、囊性纤维变性、支气管扩张、大疱性表皮松解症、周期性中性粒细胞减少症、获得性或遗传性免疫缺陷、注射吸毒(injection-druguse)和聚合性痤疮、穆-韦二氏(mws)疾病和家族性地中海发热(fmf)。
特别考虑可以经由使用某些实施方式解决(例如，治疗、治愈、预防、改善和/或展现缓慢进展)各种类型的淀粉样变性病中的任一种。例如，在一些实施方式中，淀粉样变性病选自原发性淀粉样变性病(al)、继发性淀粉样变性病(aa)、家族性淀粉样变性病(attr)、其他家族性淀粉样变性病、β-2微球蛋白淀粉样变性病、局部淀粉样变性病、重链淀粉样变性病(ah)、轻链淀粉样变性病(al)、原发性全身性淀粉样变性病、apoai淀粉样变性病、apoaii淀粉样变性病、apoaiv淀粉样变性病、载脂蛋白c2淀粉样变性病、载脂蛋白c3淀粉样变性病、角膜乳铁蛋白淀粉样变性病、甲状腺素转运蛋白相关的淀粉样变性病、透析性淀粉样变性病、纤维蛋白原淀粉样变性病、lect2淀粉样变性病(alect2)和溶菌酶淀粉样变性病。
进一步考虑可以经由使用某些实施方式解决(例如，治疗、治愈、预防、改善和/或展现缓慢进展)各种心血管疾病中的任一种。在一些实施方式中，心血管疾病选自动脉粥样硬化、冠状动脉疾病、外周动脉疾病、高血压性心脏病、代谢综合症、高血压、脑血管疾病和心力衰竭。
进一步预期可以经由使用某些实施方式解决(例如，治疗、治愈、预防、改善和/或展现缓慢进展)各种纤维变性疾病中的任一种。在一些实施方式中，纤维变性疾病选自肺纤维变性、特发性肺纤维变性、肝硬化、囊性纤维变性、硬皮病、心脏纤维变性、辐射诱导的肺损伤、脂肪性肝炎、肾小球硬化症、间质性肺病、肝纤维变性、纵隔纤维变性、腹膜后腔纤维变性、骨髓纤维变性和皮肤纤维变性。
根据若干实施方式，提供了可以展现几种有益活性(例如，在受试者或患者中)的任一种的细胞和组合物。在一些实施方式中，细胞展现选自吞噬作用、靶向细胞毒性、抗原呈递和细胞因子分泌的一种或多种活性。另外，在一些实施方式中，可以使用各种方法中的任一种来增强或以其他方式调节提供的细胞的一种或多种活性。通过具体实例，在一些实施方式中，通过抑制cd47和/或sirpα活性来增强提供的细胞的活性。
特别考虑的是，在一些实施方式中，提供的细胞和/或组合物可以用作组合疗法的组分。在一些实施方式中，提供的细胞(一种或多种)和/或组合物可以进一步包括选自下列的至少一种试剂：核酸、抗生素、消炎剂、抗体或其抗体片段、生长因子、细胞因子、酶、蛋白质、肽、融合蛋白、合成分子、有机分子、碳水化合物、脂质、激素、微粒体及其任何组合。
特别考虑的是，在一些实施方式中，提供的细胞和/或组合物可用于制造在需要其的受试者中用于治疗神经退行性疾病、炎症性疾病、心血管疾病、纤维变性疾病或淀粉样变性病的药物。
根据各种实施方式，本发明提供了包括提供的细胞和药学上可接受的载体的药物组合物。在一些实施方式中，药物组合物进一步包括选自下列的至少一种试剂：核酸、抗生素、消炎剂、抗体或其抗体片段、生长因子、细胞因子、酶、蛋白质、肽、融合蛋白、合成分子、有机分子、碳水化合物、脂质、激素、微粒体及其任何组合。
根据各种实施方式，本发明提供了在需要其的受试者中治疗神经退行性疾病、炎症性疾病、心血管疾病、纤维变性疾病或淀粉样变性病的方法，该方法包括将治疗有效量的本发明的药物组合物施用至受试者。
根据各种实施方式，本发明提供了在患有神经退行性疾病、炎症性疾病、心血管疾病、纤维变性疾病或淀粉样变性病的受试者中刺激对靶细胞或组织的免疫应答的方法，该方法包括将治疗有效量的本发明的药物组合物施用至受试者。
根据各种实施方式，本发明提供了修饰细胞的方法，该方法包括将嵌合抗原受体(car)引入单核细胞、巨噬细胞和/或树突细胞中，其中car包括抗原结合结构域、跨膜结构域和细胞内结构域，其中抗原结合结构域是或包括能够结合蛋白质聚集体的抗原的抗体剂。在一些实施方式中，将car引入细胞中包括将编码car的核酸序列引入细胞中。在一些实施方式中，将核酸序列引入细胞中包括将编码car的mrna电穿孔到细胞中。在一些实施方式中，将核酸序列引入细胞中包括选自电穿孔、慢病毒转导、腺病毒转导、逆转录病毒转导和基于化学的转染中的至少一个程序。在一些实施方式中，该方法进一步包括修饰细胞以将选自核酸、抗生素、消炎剂、抗体、生长因子、细胞因子、酶、蛋白质、肽、融合蛋白、合成分子、有机分子、碳水化合物等、脂质、激素、微粒体及其任何组合的试剂递送至靶标。在一些实施方式中，本发明包括一种组合物，该组合物包括通过本发明的方法制成的细胞。
在下面的详细描述中，本发明的其他特征、目的和优点是显而易见的。然而，应当理解，尽管详细描述指示了本发明的实施方式，但是仅以示例的方式给出，而非限制性的。根据详细描述，本发明范围内的各种改变和修改对于本领域技术人员将变得显而易见。
附图说明
通过以下结合附图对说明性实施方式的详细描述，将更充分地理解本发明的前述和其他特征和优势。应当理解，本发明不限于附图中显示的实施方式的精确布置和工具(instrumentality)。
图1是一组代表性流程图，其显示了抗淀粉样蛋白car在thp1巨噬细胞上的表达。
图2显示了使用连接至akta纯化系统的sephadex7530/100柱(ge)的游离轻链的洗脱曲线。
图3显示了通过page分析的由尺寸排阻色谱法分离的蛋白质级分。在第二和第三级分中鉴定出不含重链的轻链。
图4显示了热变性的游离轻链的电子显微照片。em阴性染色显示了长的蛋白质纤维。
图5图解了通过表达car的巨噬细胞对荧光标记的轻链淀粉样蛋白原纤维的摄取。图底部一行的直方图中的mfi(平均荧光强度)的增加图解了淀粉样蛋白原纤维的摄取。
具体实施方式
定义
除非另有定义，否则本文中所使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同的含义。尽管在实践中可以使用与本文描述的那些类似或等同的任何方法和材料用于测试本发明，但是本文描述了优选的材料和方法。在描述和要求保护本发明时，将使用以下术语。
还应该理解，本文所使用的术语仅出于描述具体实施方式的目的，而不旨在是限制性的。
冠词“一(a)”和“一(an)”在本文中用于指代一个或多于一个(即，至少一个)该冠词的语法对象。举例来说，“元件”是指一个元件或多于一个元件。
当指的是可测量值比如量、持续时间等时，本文所使用的“约(about)”意指包括与规定值相差±20％或±10％、更优选地±5％、甚至更优选地±1％和仍更优选地±0.1％的变化，因为这样的变化适合于执行所公开的方法。如本申请中所使用的，术语“约”和“近似(approximately)”用作等同词语。在本申请中使用的具有或不具有约/近似的任何数字旨在涵盖相关领域的普通技术人员所理解的任何正常波动。
如本文所使用的，“激活(activation)”是指已被充分刺激以诱导可检测的细胞增殖或已被刺激以发挥其效应子功能的单核细胞/巨噬细胞/树突细胞的状态。激活还可以与诱导的细胞因子产生、吞噬作用、细胞信号传导、靶细胞杀伤或抗原加工和呈递相关。
术语“激活的单核细胞/巨噬细胞/树突细胞”是指经历细胞分裂或发挥效应子功能的单核细胞/巨噬细胞/树突细胞，等等。术语“激活的单核细胞/巨噬细胞/树突细胞”是指执行效应子功能或发挥在静息状态下不可见的任何活性的细胞，包括吞噬作用、细胞因子分泌、增殖、基因表达变化、代谢变化和其他功能，等等。
如本文所使用的，术语“试剂(agent)”或“生物剂(biologicalagent)”或“治疗剂(therapeuticagent)”是指可以通过本文描述的修饰的细胞表达、释放、分泌或递送至靶标的分子。试剂包括但不限于核酸、抗生素、消炎剂、抗体、抗体剂或其片段、生长因子、细胞因子、酶、蛋白质、肽、融合蛋白、合成分子、有机分子(例如，小分子)、碳水化合物等、脂质、激素、微粒体、其衍生物或变体及其任何组合。该试剂可以结合靶标或靶细胞上存在的任何细胞部分，比如受体、抗原决定簇或其他结合位点。试剂可以扩散或转运到细胞中，在此它可以细胞内起作用。
如本文所使用的，术语“抗体”是指包括足以赋予特定靶抗原特异性结合的规范性免疫球蛋白序列元件的多肽。如本领域已知的，天然产生的完整抗体是近似150kd的四聚体试剂，其由两条相同的重链多肽(每条约50kd)和两条相同的轻链多肽(每条约25kd)组成，它们彼此缔合成通常所称的“y形”结构。每条重链由至少四个结构域(每个长为约110氨基酸)组成——氨基末端可变(vh)结构域(位于y结构的顶端)，随后是三个恒定结构域：ch1、ch2和羧基末端ch3(位于y的茎基部)。短区域，称为“开关”，连接重链可变区和恒定区。“铰链”将ch2和ch3结构域连接至抗体的其余部分。该铰链区中的两个二硫键在完整抗体中将两个重链多肽彼此连接。每条轻链由通过另一个“开关”彼此分开的两个结构域组成——氨基末端可变(vl)结构域，随后是羧基末端恒定(cl)结构域。完整的抗体四聚体由两个重链-轻链二聚体组成，其中重链和轻链通过单个二硫键彼此连接；两个其他二硫键将重链铰链区彼此连接，从而使二聚体彼此连接并形成四聚体。天然产生的抗体通常在ch2结构域也被糖基化。天然抗体中的每个结构域具有特征在于“免疫球蛋白折叠”的结构，该“免疫球蛋白折叠”由彼此堆挤(pack)在压缩的反平行β桶形结构中的两个β片层(例如3-、4-或5-链的片层)形成。每个可变结构域包含三个称为“互补决定区”(cdr1、cdr2和cdr3)的高变环和四个略有变化的“框架”区(fr1、fr2、fr3和fr4)。当天然抗体折叠时，fr区形成提供结构域的结构框架的β片层，并且来自重链和轻链二者的cdr环区在三维空间中聚集在一起，从而它们产生位于y结构的顶端处的单个高变抗原结合位点。天然存在的抗体的fc区与补体系统的元件结合，并且还与效应细胞(包括例如介导细胞毒性的效应细胞)上的受体结合。如本领域中已知的，可以通过糖基化或其他修饰来调节fc区对fc受体的亲和力和/或其他结合属性。在一些实施方式中，根据本发明产生和/或利用的抗体(例如，作为car的组分)包括糖基化的fc结构域，包括具有经修饰或工程化的这种糖基化的fc结构域。出于本发明的目的，在某些实施方式中，包括天然抗体中发现的足够的免疫球蛋白结构域序列的任何多肽或多肽复合物都可以被称为和/或用作“抗体”，无论这种多肽是天然产生的(例如，通过有机体与抗原反应产生的)，还是由重组工程、化学合成或其他人工系统或方法产生的。在一些实施方式中，抗体是多克隆的；在一些实施方式中，抗体是单克隆的。在一些实施方式中，抗体具有恒定区序列，其是小鼠、兔子、灵长类或人抗体的特征。在一些实施方式中，如本领域已知的，抗体序列元件是人源化的、灵长类源化的、嵌合的等。此外，如本文所使用的术语“抗体”在适当的实施方式中(除非另有说明或从上下文中可清楚看出)可指代在可选展示中利用抗体结构和功能特征的任何本领域已知的或开发的构建体或形式。例如，根据本发明使用的抗体的实施方式的形式选自但不限于完整的iga、igg、ige或igm抗体；双特异性或多特异性抗体(例如，
术语“抗体剂”是指与特定抗原特异性结合的试剂。在一些实施方式中，该术语涵盖包括足以赋予特异性结合的免疫球蛋白结构元件的任何多肽或多肽复合物。示例性抗体剂包括但不限于单克隆抗体或多克隆抗体。在一些实施方式中，抗体剂可以包括一个或多个恒定区序列，其是小鼠、兔子、灵长类或人抗体的特征。在一些实施方式中，如本领域已知的，抗体剂可以包括被人源化的、灵长类源化的、嵌合的等一个或多个序列元件。在许多实施方式中，术语“抗体剂”用于指代在可选展示中利用抗体结构和功能特征的一种或多种本领域已知的或开发的构建体或形式。例如，在一些实施方式中，根据本发明使用的抗体剂的形式选自但不限于完整的iga、igg、ige或igm抗体；双特异性或多特异性抗体(例如，
术语“抗体片段”是指完整抗体的一部分，并且是指完整抗体的抗原决定可变区。抗体片段的实例包括但不限于fab、fab’、f(ab’)2和fv片段、直链抗体、scfv抗体和多特异性抗体，其由抗体片段及其人和人源化形式形成。
如本文所使用的，“抗体重链”是指以其天然存在的构型存在于所有抗体分子中的两种类型的多肽链中的较大者。
如本文所使用的，“抗体轻链”是指以其天然存在的构型存在于所有抗体分子中的两种类型的多肽链中的较小者。α和β轻链是指两种主要的抗体轻链同种型。
如本文所使用的，术语“合成抗体”是指使用重组dna技术产生的抗体，例如，由本文描述的由噬菌体表达的抗体。该术语还应解释为意指通过合成编码该抗体的dna分子(并且该dna分子表达抗体蛋白)或规定该抗体的氨基酸序列而产生的抗体，其中该dna或氨基酸序列使用本领域已知的合成dna或氨基酸序列技术获得。
如本文所使用的术语“抗原”或“ag”定义为能够引起免疫应答的分子。这种免疫应答可能涉及抗体的产生，或特定免疫感受态细胞的激活，或二者。技术人员将理解，任何大分子，包括实际上所有的蛋白质或肽，都可以用作抗原。此外，抗原可以是重组dna或基因组dna或衍生自重组dna或基因组dna。因此，技术人员将理解，包括编码引起免疫应答的蛋白质的核苷酸序列或部分核苷酸序列的任何dna编码“抗原”，如该术语在本文中所使用的。此外，本领域技术人员将理解，抗原不需要仅由基因的全长核苷酸序列编码。容易显而易见的是，本发明包括但不限于使用多于一个基因的部分核苷酸序列，并且这些核苷酸序列以各种组合排列以引发所需的免疫应答。此外，技术人员将理解，抗原根本不需要由“基因”编码。容易显而易见的是，抗原可以合成产生或可以源自生物样品。这样的生物样品可以包括但不限于组织样品、肿瘤样品、细胞或生物流体。
根据本发明，术语“自身抗原”是指被免疫系统识别为外源的任何自体抗原。自身抗原包括但不限于细胞蛋白、磷蛋白、细胞表面蛋白、细胞脂质、核酸、糖蛋白，其包括细胞表面受体。
如本文所使用的术语“自身免疫性疾病”定义为由自身免疫应答引起的失调。自身免疫性疾病是对自体抗原不适当的和过度反应的结果。自身免疫性疾病的实例包括但不限于阿狄森病、斑秃、强直性脊柱炎、自身免疫肝炎、自身免疫腮腺炎、克罗恩氏病、糖尿病(i型)、营养不良性大疱性表皮松解症、单纯大疱性表皮松解症、附睾炎、肾小球性肾炎、格雷夫斯病、吉兰-巴雷综合征、桥本氏疾病、溶血性贫血、系统性红斑狼疮、多发性硬化症、重症肌无力、寻常型天疱疮、牛皮癣、风湿热、类风湿性关节炎、结节病、硬皮病、干燥综合征、脊椎关节病变、甲状腺炎、血管炎、白癜风、粘液性水肿、恶性贫血、溃疡性结肠炎等等。
如本文所使用的，术语“自体的”是指源自相同个体的任何物质，之后将该物质重新引入该个体。
“同种异体的”是指源自相同物种的不同动物的移植物。
“异种的”是指源自不同物种的动物的移植物。
如本文所使用的，术语“嵌合抗原受体”或“car”是指人工t细胞表面受体，其被工程化以在免疫效应细胞上表达并特异性靶向细胞和/或结合抗原。car可以用作过继性细胞转移的疗法。从患者中移出单核细胞、巨噬细胞和/或树突细胞(例如，经由血液或腹水)并进行修饰，使得它们表达对特定形式的抗原特异性的受体。例如，在一些实施方式中，已经表达car对淀粉样蛋白抗原具有特异性。car也可以包含细胞内激活结构域、跨膜结构域和细胞外结构域，其包括例如淀粉样蛋白抗原结合区。在一些方面，car包括单链可变片段(scfv)衍生的单克隆抗体、cd3-ζ跨膜结构域和细胞内结构域的融合体。car设计的特异性可以源自受体(例如肽)的配体。在一些实施方式中，car可以通过重新定向表达对与疾病/失调相关的蛋白质聚集体特异性的car的单核细胞、巨噬细胞或树突细胞而靶向神经退行性、炎症性、心血管、纤维变性或其他疾病/失调。
术语“嵌合细胞内信号传导分子”是指包括一种或多种刺激和/或共刺激分子的一个或多个细胞内结构域的重组受体。嵌合细胞内信号传导分子基本上缺乏细胞外结构域。在一些实施方式中，嵌合细胞内信号传导分子包括另外的结构域，比如跨膜结构域、可检测标签和间隔结构域。
如本文所使用的，术语“保守序列修饰”是指不显著影响或改变包含氨基酸序列的抗体的结合特性的氨基酸修饰。这样的保守修饰包括氨基酸取代、添加和缺失。可以通过本领域已知的标准技术将修饰引入本发明的抗体中，比如定点诱变和pcr介导的诱变。保守氨基酸取代是其中氨基酸残基被具有相似侧链的氨基酸残基取代的氨基酸取代。具有相似侧链的氨基酸残基家族已在本领域中定义。这些家族包括具有下列的氨基酸：碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、非极性侧链(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸)、β-支链侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香族侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。因此，抗体的cdr区内的一个或多个氨基酸残基可以被来自相同侧链家族的其他氨基酸残基替代，并且可以使用本文描述的功能测定法测试改变的抗体结合抗原的能力。
如本文使用的术语“共刺激配体”包括抗原呈递细胞(例如，aapc、树突细胞、b细胞等)上的分子，该分子特异性结合单核细胞/巨噬细胞/树突细胞上的关联共刺激分子，从而提供介导单核细胞/巨噬细胞/树突细胞应答的信号，其包括但不限于增殖、激活、分化等。共刺激配体可以包括但不限于cd7、b7-1(cd80)、b7-2(cd86)、pd-l1、pd-l2、4-1bbl、ox40l、诱导型共刺激配体(icos-l)、细胞间粘附分子(icam)、cd30l、cd40、cd70、cd83、hla-g、mica、micb、hvem、淋巴毒素β受体、3/tr6、ilt3、ilt4、hvem，与toll配体受体结合的激动剂或抗体和与b7-h3特异性结合的配体。共刺激配体还具体包括与存在于单核细胞/巨噬细胞/树突细胞上的共刺激分子特异性结合的抗体，比如，但不限于cd27、cd28、4-1bb、ox40、cd30、cd40、pd-1、icos、淋巴细胞功能相关的抗原-1(lfa-1)、cd2、cd7、light、nkg2c、b7-h3和与cd83特异性结合的配体。
“共刺激分子”或“共刺激结构域”是指先天免疫细胞上用于增强或减弱初始刺激的分子。例如，与病原体相关的模式识别受体，比如tlr(增强)或cd47/sirpα轴(减弱)，是先天免疫细胞上的分子。共刺激分子包括但不限于tcr、cd3ζ、cd3γ、cd3δ、cd3ε、cd86、常见的fcrγ、fcrβ(fcεr1b)、cd79a、cd79b、fcγriia、dap10、dap12、t细胞受体(tcr)、cd27、cd28、4-1bb(cd137)、ox40、cd30、cd40、pd-1、icos、淋巴细胞功能相关的抗原-1(lfa-1)、cd2、cd7、light、nkg2c、b7-h3、与cd83特异性结合的配体、cds、icam-1、gitr、baffr、hvem(lightr)、slamf7、nkp80(klrf1)、cd127、cd160、cd19、cd4、cd8α、cd8β、il2rβ、il2rγ、il7rα、itga4、vla1、cd49a、itga4、ia4、cd49d、itga6、vla-6、cd49f、itgad、cd11d、itgae、cd103、itgal、cd11a、lfa-1、itgam、cd11b、itgax、cd11c、itgb1、cd29、itgb2、cd18、lfa-1、itgb7、tnfr2、trance/rankl、dnam1(cd226)、slamf4(cd244、2b4)、cd84、cd96(触觉的)、ceacam1、crtam、ly9(cd229)、cd160(by55)、psgl1、cd100(sema4d)、cd69、slamf6(ntb-a、ly108)、slam(slamf1、cd150、ipo-3)、blame(slamf8)、selplg(cd162)、ltbr、lat、gads、slp-76、pag/cbp、nkp44、nkp30、nkp46、nkg2d，本文描述的其他共刺激分子、其任何衍生物、变体或片段，具有相同功能能力的共刺激分子的任何合成序列，及其任何组合。
如本文所使用的，“共刺激信号”是指与初级信号，比如巨噬细胞上的car的激活组合而导致巨噬细胞激活的信号。
术语“细胞毒素(cytotoxic)”或“细胞毒性(cytotoxicity)”是指杀死或破坏细胞。在一个实施方式中，改善了代谢增强的细胞的细胞毒性，例如，增加的巨噬细胞的细胞溶解活性。
“疾病”是这样的动物的健康状况，其中动物无法维持内稳态，并且其中如果疾病没有得到改善，则动物的健康将继续恶化。相比之下，动物的“失调”是这样的健康状态，其中动物能够维持内稳态，但是与没有失调的情况相比，动物的健康状态是不太有利的。如果不治疗，失调不一定会导致动物健康状况进一步下降。
如本文所使用的，术语“神经退行性疾病”是指这样的神经学疾病，其特征在于神经元的丧失或退化和/或神经细胞的细胞质和/或细胞核中或细胞外空间中存在错误折叠的蛋白质聚集体(forman等人，nat.med.10,1055(2004))。神经退行性疾病包括与失忆和/或痴呆相关的神经退行性运动失调和神经退行性病症。神经退行性疾病包括tau蛋白病和α-突触核蛋白病。神经退行性疾病的实例包括但不限于早老性痴呆、老年性痴呆、阿尔茨海默氏病、与第17位染色体相关的帕金森症(ftdp-17)、进行性核上性麻痹(psp)、皮克氏病、原发性进行性失语症、额颞叶痴呆症、皮层基底节痴呆症、帕金森氏病、伴有痴呆症的帕金森氏病、路易体痴呆症、唐氏综合征、多系统萎缩症、肌萎缩性脊髓侧索硬化症(als)和哈-斯二氏综合征。
“有效量”或“治疗有效量”在本文中可互换使用，并且是指有效实现特定生物学结果或提供治疗或预防益处的本文所描述的化合物、制剂、材料或组合物的量。
“编码”是指多核苷酸中的具体核苷酸序列，比如基因、cdna或mrna在生物过程中用作合成其他聚合物和大分子的模板的固有特性，其他聚合物和大分子具有限定的核苷酸序列(即，rrna、trna和mrna)或限定的氨基酸序列以及由此产生的生物学特性。因此，如果对应于基因的mrna的转录和翻译在细胞或其他生物系统中产生蛋白质，则该基因编码该蛋白质。核苷酸序列与mrna序列相同且通常在序列表中提供的编码链和用作基因或cdna转录模板的非编码链二者都可以称为编码该基因或cdna的蛋白质或其他产物。
如本文所使用的，“内源的(endogenous)”是指来自生物体、细胞、组织或系统内部或在其内部产生的任何物质。
如本文所使用的，术语“外源的(exogenous)”是指从生物体、细胞、组织或系统外部引入或在生物体、细胞、组织或系统外部产生的任何物质。
如本文所使用的，术语“扩展(expand)”是指数目的增加，如单核细胞、巨噬细胞或树突细胞的数目的增加。在一个实施方式中，离体扩展的单核细胞、巨噬细胞或树突细胞的数量相对于培养物中最初存在的数量增加。在另一个实施方式中，离体扩展的单核细胞、巨噬细胞或树突细胞的数量相对于培养物中的其他细胞类型增加。如本文所使用的，术语“离体”是指已经从活生物体(例如，人)中移出并在该生物体之外(例如，在培养皿、试管或生物反应器中)繁殖的细胞。
如本文所使用的术语“表达”定义为由其启动子驱动的特定核苷酸序列的转录和/或翻译。
“表达载体”是指包括重组多核苷酸的载体，该重组多核苷酸包括可操作地连接至待表达的核苷酸序列的表达控制序列。表达载体包括用于表达的足够的顺式作用元件；其他表达元件可以由宿主细胞或在体外表达系统中供应。表达载体包括本领域已知的所有那些，比如粘粒、质粒(例如，裸露或包含在脂质体中)和病毒(例如，慢病毒、逆转录病毒、腺病毒(例如，ad5f35)和腺伴随病毒)，其并入重组多核苷酸。
如本文所使用的，“同源的”是指两个聚合物分子之间，例如两个核酸分子，比如两个dna分子或两个rna分子之间，或两个多肽分子之间的亚基序列同一性。当两个分子中亚基位置都被相同的单体亚基占据时；例如，如果两个dna分子中每一个的位置都被腺嘌呤占据，那么它们在那个位置是同源的。两个序列之间的同源性是匹配位置或同源位置数目的直接函数，例如，如果两个序列中一半的位置(例如，长度为十个亚基的聚合物中的五个位置)是同源的，则两个序列是50％同源的；如果90％的位置(例如，10个中的9个)是匹配的或同源的，则两个序列是90％同源的。当应用于核酸或蛋白质时，如本文所使用的“同源的”是指具有约50％序列同一性的序列。更优选地，同源序列具有约75％序列同一性，甚至更优选地，具有至少约80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性。
“人源化”形式的非人(例如，鼠)抗体是嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其片段(比如fv、scfv、fab、fab’、f(ab’)2或抗体的其他抗原结合亚序列)，其含有最少的源自非人免疫球蛋白的序列。在大多数情况下，人源化抗体是人免疫球蛋白(受体抗体)，其中受体的互补决定区(cdr)的残基被具有期望的特异性、亲和力和能力的非人物种(供体抗体)比如小鼠、大鼠或兔子的cdr的残基替代。在一些情况下，人免疫球蛋白的fv框架区(fr)残基被相应的非人残基替代。此外，人源化抗体可以包括在受体抗体中或输入的cdr或框架序列中均未发现的残基。进行这些修饰是为了进一步完善和优化抗体性能。通常，人源化抗体将包括基本上所有的至少一个可变区，并且通常是两个可变区，其中所有或基本上所有的cdr区对应于非人免疫球蛋白的那些cdr区，以及所有或基本上所有的fr区是人免疫球蛋白序列的那些fr区。人源化抗体最佳地还将包括免疫球蛋白恒定区(fc)，通常是人免疫球蛋白恒定区的至少一部分。对于进一步细节，参见jones等人，nature,321:522-525,1986；reichmann等人，nature,332:323-329,1988；presta,curr.op.struct.biol.,2:593-596,1992。
“完全人”是指免疫球蛋白，比如抗体，其中整个分子是人源的或由与人形式的抗体相同的氨基酸序列组成。
如本文所使用的，“同一性”是指两个聚合物分子之间，特别是两个氨基酸分子之间，比如两个多肽分子之间的亚基序列同一性。当两个氨基酸序列在相同位置具有相同残基时；例如，如果两个多肽分子中的每一个的位置都被精氨酸占据，那么它们在那个位置是同一的。两个氨基酸序列在比对中的相同位置处具有相同残基的同一性或程度通常表示为百分比。两个氨基酸序列之间的同一性是匹配位置或同一位置的数目的直接函数；例如，如果两个序列中一半的位置(例如，长度为十个氨基酸的聚合物中的五个位置)是同一的，则两个序列是50％同一的；如果90％的位置(例如10个中的9个)是匹配的或同一的，则两个氨基酸序列是90％同一的。
“基本上同一”意思是展现与参考氨基酸序列(例如，本文描述的氨基酸序列中的任一个)或核酸序列(例如，本文描述的核酸序列中的任一个)具有至少50％同一性的多肽或核酸分子。优选地，这种序列与用于比较的序列在氨基酸或核酸水平是至少60％、更优选地80％或85％和更优选地90％、95％或甚至99％同一的。
指导核酸序列可以与双链dna靶位点的一条链(核苷酸序列)互补。指导核酸序列和靶序列之间的互补百分比可以为至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、63％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。指导核酸序列的长度可以为至少10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35或更多个核苷酸。在一些实施方式中，指导核酸序列包括10至40个核苷酸的连续一段序列(stretch)。可变靶向结构域可以由dna序列、rna序列、修饰dna序列、修饰rna序列(参见例如本文描述的修饰)或其任何组合组成。
序列同一性通常使用序列分析软件(例如，sequenceanalysissoftwarepackageofthegeneticscomputergroup，威斯康星大学生物技术中心(universityofwisconsinbiotechnologycenter)，1710universityavenue,madison，wis.53705,blast,bestfit,gap,或pileup/prettybox程序)测量。这样的软件通过将同源性程度分配给各种取代、缺失和/或其他修饰来匹配相同或相似的序列。保守取代通常包括下述组内的取代：甘氨酸，丙氨酸；缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸；天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺；丝氨酸、苏氨酸；赖氨酸、精氨酸；和苯丙氨酸、酪氨酸。在确定同一性程度的示例性方法中，可以使用blast程序，其中在e-3和e-100之间的概率得分指示密切相关的序列。
如本文所使用的，术语“免疫球蛋白”或“ig”定义为一类蛋白质，其起抗体的作用。由b细胞表达的抗体有时称为bcr(b细胞受体)或抗原受体。这类蛋白质中包括的五个成员是iga、igg、igm、igd和ige。iga是存在于身体分泌物比如唾液、眼泪、母乳、胃肠道分泌物以及呼吸道和泌尿生殖道的粘液分泌物中的初级抗体。igg是最常见的循环抗体。在大多数受试者中，igm是初级免疫应答中产生的主要免疫球蛋白。它是凝集、补体结合和其他抗体反应中最有效的免疫球蛋白，并且对于防御细菌和病毒是重要的。igd是没有已知抗体功能的免疫球蛋白，但可以用作抗原受体。ige是通过暴露于过敏原后引起肥大细胞和嗜碱性粒细胞释放介体来介导即时超敏反应的免疫球蛋白。
如本文所使用的，术语“免疫应答”定义为当淋巴细胞将抗原分子识别为外来的并诱导抗体形成和/或激活淋巴细胞以去除该抗原时发生的对抗原的细胞应答。
如本文所使用的，“指导材料”包括出版物、记录、图表或可用于传达本发明的组合物和方法的有用性的任何其他表达介质。本发明的试剂盒的指导材料可以例如粘附在含有本发明的核酸、肽和/或组合物的容器，或者与含有核酸、肽和/或组合物的容器一起运输。可选地，指导材料可以与容器分开运输，意图是指导材料和化合物被接受者协同使用。
“分离的(isolated)”是指从天然状态改变或移出。例如，天然存在于活体动物中的核酸或肽不是“分离的”，但是与其天然状态的共存材料部分或完全分开的相同的核酸或肽是“分离的”。分离的核酸或蛋白质可以以基本上纯化形式存在，或者可以存在于非天然环境比如例如宿主细胞中。
如本文所使用的，“慢病毒”是指逆转录病毒科的一种属。慢病毒在逆转录病毒中在能够感染非分裂细胞方面是独特的；它们可以将显著量的遗传信息递送到宿主细胞的dna中，因此它们是基因递送载体中最有效的方法之一。hiv、siv和fiv都是慢病毒的实例。源自慢病毒的载体提供了在体内实现显著水平的基因转移的手段。
术语“路易体(一个或多个)”和“路易神经突”是指在神经细胞中发育的异常的蛋白质聚集体。
如本文所使用的，术语“修饰的”是指本发明的分子或细胞的改变的状态或结构。分子可以以多种方式被修饰，包括化学地、结构地和功能地修饰。可以通过引入核酸来修饰细胞。
如本文所使用的，术语“调节”是指与在不存在治疗或化合物的情况下受试者的应答水平相比，和/或与其他相同但未经治疗的受试者的应答水平相比，介导受试者中的应答水平可检测的增加或降低。该术语包括干扰和/或影响天然信号或应答，从而在受试者，优选人中介导有益的治疗应答。
在本发明的上下文中，对于常见的核酸碱基使用以下缩写。“a”是指腺苷，“c”是指胞嘧啶，“g”是指鸟苷，“t”是指胸苷，和“u”是尿苷。
除非另有说明，“编码氨基酸序列的核苷酸序列”包括彼此为简并形式并且编码相同氨基酸序列的所有核苷酸序列。短语编码蛋白质或rna的核苷酸序列还可以包括内含子，在这个意义上，编码蛋白质的核苷酸序列在一些形式中可以包含内含子(一个或多个)。
术语“可操作地连接”是指调控序列和异源核酸序列之间的功能连接，其导致异源核酸序列的表达。例如，当第一核酸序列与第二核酸序列处于功能关系时，第一核酸序列与第二核酸序列可操作地连接。例如，如果启动子影响编码序列的转录或表达，则该启动子可操作地连接至编码序列。通常地，可操作地连接的dna序列是连续的，并且在需要时，在同一阅读框中连接两个蛋白质编码区。
免疫原性组合物的“肠胃外”施用包括例如皮下(s.c.)、静脉内(i.v.)、肌内(i.m.)、肿瘤内(i.t.)或腹膜内(i.p.)或胸骨内注射或输注技术。
如本文所使用的，术语“多核苷酸”定义为核苷酸链。此外，核酸是核苷酸的聚合物。因此，如本文所使用的核酸和多核苷酸是可互换的。本领域技术人员具有核酸是多核苷酸的常识，该多核苷酸可以被水解成单体“核苷酸”。单体核苷酸可以被水解成核苷。如本文所使用的，多核苷酸包括但不限于通过本领域可用的任何手段获得的所有核酸序列，包括但不限于重组手段，即，使用普通克隆技术和pcrtm等和通过合成手段从重组文库或细胞基因组克隆核酸序列。
如本文所使用的，术语“肽”、“多肽”和“蛋白质”可以互换使用，并且是指由通过肽键共价连接的氨基酸残基组成的化合物。蛋白质或肽必须至少含有两个氨基酸，并且对构成蛋白质或肽序列的最大氨基酸数量没有限制。多肽包括包含通过肽键彼此连接的两个或更多个氨基酸的任何肽或蛋白质。如本文所使用的，该术语是指短链和长链二者，短链在本领域中通常也被称为肽、寡肽和寡聚体，长链在本领域中一般被称为蛋白质，该蛋白质存在很多类型。“多肽”包括例如生物活性片段、基本上同源的多肽、寡肽、同型二聚体、异二聚体、多肽的变体、修饰的多肽、衍生物、类似物、融合蛋白等等。多肽包括天然肽、重组肽、合成肽或其任何组合。
如本文所使用的，术语“蛋白质聚集体”是指在受试者的组织中聚集在一起以产生病理病症或使受试者处于病理病症的风险的两种或更多种蛋白质(例如，两种或更多种相同的蛋白质，两种或更多种不同的蛋白质等)。在一些实施方式中，蛋白质聚集体可以是或包括以下一种或多种：错误折叠的蛋白质(一种或多种)、以其他方式不适当地形成的/畸形的蛋白质(一种或多种)(例如，由于可能不影响折叠但确实影响功能的突变)，和/或蛋白质和非蛋白质组分(例如，核酸、小分子等)的聚集。这种蛋白质聚集体的非限制性实例包括淀粉样蛋白的聚集体、tau蛋白质的聚集体、tdp-43蛋白质的聚集体、免疫球蛋白轻链或甲状腺素转运蛋白的聚集体、朊病毒蛋白质的聚集体等。
如本文所使用的，术语“启动子”定义为启动多核苷酸序列的特异性转录所需的由细胞的合成机器或引入的合成机器识别的dna序列。
如本文所使用的，术语“启动子/调控序列”是指表达可操作地连接至启动子/调控序列的基因产物所需的核酸序列。在一些情况下，该序列可以是核心启动子序列，并且在其他情况下，该序列也可以包括表达基因产物所需的增强子序列和其他调控元件。启动子/调控序列可以是例如以组织特异性方式表达基因产物的启动子/调控序列。
“组成型”启动子是这样的核苷酸序列，当其与编码或指定基因产物的多核苷酸可操作地连接时，引起该基因产物在细胞的大多数或全部生理条件下在细胞中产生。
“诱导型”启动子是这样的核苷酸序列，当其与编码或指定基因产物的多核苷酸可操作地连接时，基本上仅当对应于该启动子的诱导剂存在于细胞中时，才导致基因产物在细胞中产生。
“组织特异性”启动子是这样的核苷酸序列，当其与由基因编码或指定的多核苷酸可操作地连接时，仅当该细胞是对应于启动子的组织类型的细胞，才引起基因产物在细胞中产生。
术语“对免疫抑制的抗性”是指对免疫系统活性或激活缺乏抑制或抑制降低。
“信号转导途径”是指在信号从细胞的一部分传输到细胞的另一部分中起作用的各种信号转导分子之间的生化关系。短语“细胞表面受体”包括能够接收信号并跨越细胞的质膜传输信号的分子和分子复合物。
“单链抗体”是指通过重组dna技术形成的抗体，其中免疫球蛋白重链和轻链片段经由工程化的氨基酸跨度(engineeredspanofaminoacid)连接到fv区。产生单链抗体的各种方法是已知的，包括在美国专利号4,694,778；bird,1988,science242:423-442；huston等人，1988,proc.natl.acad.sci.usa85:5879-5883；ward等人，1989,nature334:54454；skerra等人，1988,science242:1038-1041中描述的那些。
如本文所使用的，关于抗原结合结构域，例如抗体剂，术语“特异性结合”是指识别特定抗原但基本上不识别或结合样品中的其他分子的抗原结合结构域或抗体剂。例如，特异性结合来自一个物种的抗原的抗原结合结构域或抗体剂也可以结合一个或多个物种的该抗原。但是，这种跨物种反应性本身并不改变抗原结合结构域或抗体剂的分类为特异性的。在另一个实例中，特异性结合抗原的抗原结合结构域或抗体剂也可以结合抗原的不同等位基因形式。然而，这种交叉反应性本身并不改变抗原结合结构域或抗体剂的分类为特异性的。在一些情况下，术语“特异性结合”或“特异性地结合”可用于指抗原结合结构域或抗体剂、蛋白质或肽与第二化学种类的相互作用，以表示该相互作用取决于化学种类上特定结构(例如，抗原决定簇或表位)的存在；例如，抗原结合结构域或抗体剂识别并结合特定的蛋白质结构，而不是一般地识别并结合蛋白质。如果抗原结合结构域或抗体剂对表位“a”具有特异性，则在包含标记“a”与抗原结合结构域或抗体剂的反应中，存在包含表位a(或游离的、未标记的a)的分子将减少与抗体结合的标记a的数量。
术语“刺激”是指通过刺激分子(例如，tcr/cd3复合物)与其关联配体结合从而介导信号转导事件而诱导的初级应答，信号转导事件比如，但不限于经由fc受体机器或经由合成car的信号转导。刺激可以介导某些分子改变的表达，比如tgf-β的下调和/或细胞骨架结构的重组等。
如本文所使用的术语“刺激分子”是指与存在于抗原呈递细胞上的关联刺激配体特异性结合的单核细胞、巨噬细胞或树突细胞的分子。
如本文所使用的，“刺激配体”是指这样的配体，当存在于抗原呈递细胞(例如，aapc、树突细胞、b细胞等)或肿瘤细胞上时可以与单核细胞、巨噬细胞或树突细胞上的关联结合伴侣(在本文中称为“刺激分子”)特异性结合，从而介导免疫细胞的应答，包括但不限于激活、启动免疫应答、增殖等。刺激配体在本领域中是众所周知的，并且包括toll样受体(tlr)配体、抗toll样受体抗体、激动剂和单核细胞/巨噬细胞受体的抗体，等等。另外，细胞因子比如干扰素-γ是巨噬细胞的有效刺激物。
术语“受试者”旨在包括在其中可以引发免疫应答的活生物体(例如，哺乳动物)。如本文所使用的，“受试者”或“患者”可以是人或非人哺乳动物。非人哺乳动物包括例如牲畜和宠物，比如绵羊科、牛科、猪科、犬科、猫科和鼠科哺乳动物。优选地，受试者是人。
如本文所使用的，“基本上纯化的”细胞是基本上不含其他细胞类型的细胞。基本上纯化的细胞还指已经与其他细胞类型分开的细胞，该细胞通常在其天然存在状态中与其他细胞类型相关联(associate)。在一些情况下，基本上纯化的细胞群是指同质的细胞群。在其他情况下，该术语简单地指的是与在细胞的天然状态下与其天然相关联的细胞分开的细胞。在一些实施方式中，细胞在体外培养。在其他实施方式中，细胞不在体外培养。
“靶位点”或“靶序列”是指基因组核酸序列，其限定了在足以发生结合的条件下结合分子可以特异性结合的核酸的一部分。
“靶标”是指需要治疗的人体内的细胞、器官、组织或位点(例如蛋白质聚集体)。
如本文所使用的，术语“t细胞受体”或“tcr”是指响应于抗原呈递而参与t细胞激活的膜蛋白复合物。tcr负责识别与主要组织相容性复合物分子结合的抗原。tcr由阿尔法(α)和贝塔(β)链的异二聚体组成，但是在一些细胞中，tcr由γ和δ(γ/δ)链组成。tcr可能以α/β和γ/δ形式存在，其在结构上相似，但是具有不同的解剖位置和功能。每条链由两个细胞外结构域——可变结构域和恒定结构域组成。在一些实施方式中，可以在包括tcr的任何细胞上修饰tcr，所述细胞包括例如，辅助t细胞、细胞毒素t细胞、记忆t细胞、调控t细胞、天然杀伤t细胞和γδt细胞。
如本文所使用的，术语“治疗的(therapeutic)”是指治疗和/或预防。通过抑制、缓解或根除疾病状态可以获得治疗效果。
如本文所使用的，术语“转染的(transfected)”或“转化的(transformed)”或“转导的(transduced)”是指将外源核酸转移或引入宿主细胞的过程。“转染的”或“转化的”或“转导的”细胞是已经用外源核酸转染、转化或转导的细胞。该细胞包括原代受试者细胞及其后代。
如本文所使用的术语“治疗”疾病是指降低受试者经历的疾病或失调的至少一种体征或症状的频率或严重程度。
如本文所使用的，短语“在转录控制下”或“可操作地连接”是指启动子相对于多核苷酸处于正确的位置和取向，以控制rna聚合酶的转录启动和多核苷酸的表达。
“载体”是包括分离的核酸并且可用于将分离的核酸递送至细胞内部的物质组合物。许多载体在本领域是已知的，其包括但不限于线性多核苷酸、与离子或两亲分子化合物相关联的多核苷酸、质粒和病毒。因此，术语“载体”包括自主复制质粒或病毒。该术语还应解释为包括有助于核酸转移到细胞中的非质粒和非病毒化合物，比如例如聚赖氨酸化合物、脂质体等。病毒载体的实例包括但不限于腺病毒载体、腺伴随病毒载体、逆转录病毒载体、慢病毒载体等。
范围：在整个公开内容中，本发明的各个方面可以以范围格式呈现。应当理解，范围格式的描述仅是为了方便和简洁，而不应被解释为对本发明的范围的僵化限制。因此，应该将范围的描述视为已明确公开了所有可能的子范围以及该范围内的单个数值。例如，对范围1到6的描述应视为已明确公开了1到3、1到4、1到5、2到4、2到6、3到6的子范围等，以及该范围内的单个数字，例如1、2、2.7、3、4、5、5.3和6。无论范围的广度如何，这都适用。
描述
本发明包括用于治疗受试者中与蛋白质聚集体相关的疾病或失调的组合物和方法等等。疾病可以包括神经退行性疾病、炎症性疾病、心血管疾病、纤维变性疾病、淀粉样变性病或具有基于蛋白质的聚集和/或错误折叠或基于蛋白质感染颗粒的存在或活性的病理学的任何其他疾病或失调。本发明包括在单核细胞、巨噬细胞或树突细胞中表达任何设计的嵌合抗原受体(car)。在一些实施方式中，这种修饰的细胞被募集或直接注入或应用于患病的组织微环境，在此它通过渗透和/或与组织相互作用并修饰、中和或消除蛋白质聚集体(包括异质聚集体)中的靶蛋白/脂蛋白、错误折叠的蛋白质或传染性蛋白质而充当有效的免疫效应物。
在本公开内容涵盖的优点中，使用细胞比如单核细胞、巨噬细胞和树突细胞表达car允许经由吞噬过程清除不溶性蛋白质。吞噬细胞的摄取可能导致病原性蛋白质聚集体的分解和消化。其他细胞，比如t细胞和nk细胞，没有吞噬作用的能力。不希望受特定理论的束缚，在本公开内容所涵盖的优点中，使用细胞比如单核细胞、巨噬细胞和树突细胞避免了“细胞因子风暴”，也称为“细胞因子释放综合征”(crs)的可能性，其已被证明是传统细胞疗法(例如car-t)中的显著的安全问题。
在一些实施方式中，本公开内容提供了细胞(例如，单核细胞、巨噬细胞或树突细胞)，其包括选自下列的一个或多个控制系统：安全开关(例如，打开开关、关闭开关或自杀开关)和逻辑门(例如，与and、or或not门)。在一些实施方式中，本公开内容提供了包括“安全开关”(例如，杀死开关、自杀基因、打开开关、关闭开关)的细胞(例如，单核细胞、巨噬细胞或树突细胞)。在一些实施方式中，安全开关包含参与程序性细胞死亡的酶和小分子激活剂。在一些实施方式中，安全开关包含参与程序性细胞死亡的酶和抗体激活剂。在一些实施方式中，将编码酶的基因离体转导入细胞(例如，单核细胞、巨噬细胞或树突细胞)。在一些实施方式中，安全开关的激活导致其中安全开关已被激活的细胞的死亡。在一些实施方式中，安全开关的激活导致其中安全开关已被激活的细胞的活性下调，其中该细胞将来可以被重新激活。在一些实施方式中，默认情况下细胞的活性被下调并且安全开关的激活导致细胞活性的上调，其中该细胞将来可以被失活。
淀粉样蛋白/淀粉样变性病
淀粉样变性病是用来描述具有不正确折叠蛋白质(称为淀粉样蛋白或淀粉样蛋白原纤维)的异常堆积的常见病理特征的一组疾病的术语(chitianddobson.2006.annreviewbiochem,75:333-366；sipe等人，amyloid21(4):221-224)。淀粉样蛋白原纤维是由于可溶性前体蛋白错误折叠而在细胞外沉积的不溶性蛋白质复合物(nienhuis等人，kidneydis(basel).2016apr；2(1):10–19)。淀粉样蛋白原纤维的形成是有缺陷蛋白质的寡聚和聚集的结果。淀粉样变性病可以是局部性的或全身性的，可以根据一种方法分为6组：原发性淀粉样变性病(al)，其中淀粉样蛋白原纤维由免疫球蛋白轻链蛋白质组成；继发性淀粉样变性病(aa)，其中淀粉样蛋白的来源是炎症引起的血清淀粉样蛋白a(saa)；家族性淀粉样变性病(attr)，通常是甲状腺素转运蛋白突变的结果；具有不同蛋白质错误折叠的其他家族性淀粉样蛋白，导致疾病病理；β-2微球蛋白淀粉样变性病，其中病理聚集体由β-2微球蛋白组成；和局部淀粉样变性病，其与不同组织和器官中的各种蛋白质相关(波士顿大学淀粉样变性病中心(bostonuniversityamyloidosiscenter))。
免疫球蛋白轻链淀粉样变性病(al)是一种多系统致命性失调，其特征在于源自潜在浆细胞肿瘤的淀粉样蛋白原纤维沉积引起的器官功能失调。al是一种罕见病症，在美国，每年有～3,000名患者被诊断。当前的治疗方法是针对浆细胞的化学疗法，并且因此是非特异性的。这种治疗的副作用与较高的早期死亡率(在第一年内死亡约三分之一)以及淀粉样蛋白质沉积物从器官延迟和不完全的清除相关。这使患者患有心力衰竭、肾病综合征和致残性神经病的慢性病，以及持续的死亡风险。为了改善al的结果，需要浆细胞以外的疗法，特别是清除沉积的淀粉样蛋白轻链。本文中，基于表达嵌合抗原受体(car巨噬细胞)的巨噬细胞开发了治疗平台，该嵌合抗原受体识别淀粉样蛋白的器官沉积物并通过吞噬作用清除该沉积物，因此导致器官功能的改善、发病率的降低和al中生存期的改善。该治疗平台可以扩展到另外类型的淀粉样变性病以及与错误折叠的蛋白质的细胞外沉积物相关的其他疾病。
另外类型的淀粉样变性病包括但不限于重链淀粉样变性病(ah)、原发性全身性淀粉样变性病、apoai淀粉样变性病、apoaii淀粉样变性病、apoaiv淀粉样变性病、载脂蛋白c2淀粉样变性病和载脂蛋白c3淀粉样变性病、角膜乳铁蛋白淀粉样变性病、甲状腺素转运蛋白相关的淀粉样变性病、透析性淀粉样变性病、纤维蛋白原淀粉样变性病、lect2淀粉样变性病(alect2)和溶菌酶淀粉样变性病。
另外的与淀粉样蛋白相关的疾病的实例包括：阿尔茨海默氏病，其中观察到tau蛋白和β-淀粉样蛋白的聚集；海绵状脑病(朊病毒病)，其中突变的朊病毒蛋白质构成有毒的聚集体；白内障，由蛋白质晶体蛋白的聚集引起；2型糖尿病，具有由胰淀素(amylin)和其他制成的聚集体(caugheyandlansbury.2003.annurevneurosci.26:267-98；valastyanandlindquist,diseasemodels&mechanisms(2014)7,9-14)。
参与淀粉样变性病的蛋白质包括但不限于血清淀粉样蛋白a(saa)、单克隆免疫球蛋白轻蛋白(κ或λ)、免疫球蛋白重链蛋白质、甲状腺素转运蛋白、载脂蛋白a-i(aapoai)、载脂蛋白a-ii(aapoaii)、载脂蛋白a-iv(aapoaiv)、载脂蛋白c2(apoc2)、载脂蛋白c3(apoc3)、角蛋白、淀粉样蛋白dan(adan)、乳铁蛋白、凝溶胶蛋白(agel或gsn)、纤维蛋白原(afib)、纤维蛋白原α链(fga)、溶菌酶(alys或lyz)、lect2、β-2微球蛋白、淀粉样蛋白β、晶体蛋白、胰淀素(胰岛淀粉样肽)、朊病毒蛋白质(prp)、白细胞衍生的趋化因子2(lect2)、胱抑素c(cst3)、抑瘤素m受体(osmr)、膜内在蛋白2b(itm2b)、催乳素(prl)、角膜上皮蛋白和心房钠尿肽(anf)。淀粉样变性病可经由各种体征或症状中的任一种呈现，其包括但不限于四肢特别是脚踝和/或腿部肿胀、疲劳、呼吸急促、体重减轻、心律不齐、手或脚麻木、手或脚麻刺感或疼痛和/或呼吸急促。这些临床表现反映了大多数主要器官系统特别是心脏、肾脏和周围神经的参与。
在一些实施方式中，提供的组合物可以与淀粉样变性病的一种或多种其他治疗一起使用，其包括但不限于化学疗法、干细胞疗法、消炎剂或针对骨髓瘤的疗法，比如蛋白酶体抑制剂等等。
本文公开的组合物和方法可以包括针对淀粉样蛋白聚集体的共同表位或对于有助于形成淀粉样蛋白原纤维的不同错误折叠蛋白质(本文称为“淀粉样蛋白”)不同的表位的抗体、抗体剂和/或其他抗原结合结构域。术语淀粉样蛋白包括野生型和突变的天然存在的人氨基酸序列以及片段、类似物——包括等位基因、物种和诱导的变体。当类似物和人序列最大比对时，类似物的氨基酸被分配与天然人序列中的相应氨基酸相同的编号。类似物通常在一个、两个或几个位置上(通常由于保守取代)与天然存在的肽不同。术语“等位基因变体”用于指相同物种中不同个体的基因之间的变异和由该基因编码的蛋白质的相应变异。抗淀粉样蛋白抗体、其片段和类似物可以通过固相肽合成或重组表达来合成，或者可以从天然来源获得。自动肽合成仪可从许多供应商处购得，比如appliedbiosystems,fostercity,calif。
淀粉样蛋白β/阿尔茨海默氏病
阿尔茨海默氏病(ad)是一种类型的进行性痴呆症，其特征是随着时间的流逝而使失忆加重。该疾病是美国第六大死亡原因，并且目前尚无治疗ad潜在病理的疗法。在ad患者的大脑中观察到的主要病理是由包括aβ42的淀粉样β蛋白组成的细胞外聚集体/斑块的积累(sadigh-eteghad等人，2014.medicalprinciplesandpractice.24(1):1–10)。β淀粉样蛋白可在其他疾病病症比如其他痴呆症(路易体)或肌肉疾病下形成斑块。
尽管ad受害者可能表现出各种体征或症状中的任一个，但常见的体征或症状包括失忆(例如短期记忆或长期记忆)、推理能力受到抑制、决策能力受到抑制或丧失、计划能力受损、性格改变和/或行为方式改变(例如，抑郁、情绪波动、抑制力丧失、冷漠和退缩)。
ad的症状会随着时间的推移而恶化，尽管疾病进展的速度不同。平均而言，患有ad的受试者在诊断后存活四到八年，但是根据其他因素，可以存活长达20年。与ad相关的大脑变化在任何疾病迹象之前数年开始。这个可以持续数年的时间段被称为临床前ad。
处于ad早期(轻度ad)的受试者可以独立活动，例如驾驶、工作和参加社交活动。在一些实施方式中，患有早期ad的受试者可能感觉他或她好像正在经历记忆丧失，比如忘记熟悉的单词或日常物体的位置。在一些实施方式中，与患有早期ad的受试者接近的朋友、家人或其他人开始注意到困难。在一些实施方式中，对患有早期ad的受试者进行详细医学访谈的医生可能能够检测到记忆或注意力集中的问题。在一些实施方式中，患有早期ad的受试者经历选自下列的一种或多种困难：想出(comeupwith)正确的单词或名字的问题；当向其介绍新人时记住名字有困难；在社交或工作环境中执行任务的挑战；忘记刚刚读过的材料；丢失或放错贵重物品；和增加了计划或组织的麻烦。
ad的中期(中度ad)通常是最长的阶段，并且可以持续很多年。随着疾病进展，患有ad的受试者将需要更高水平的护理。在一些实施方式中，患有中期ad的受试者可以经历选自下列的症状：混淆的单词，沮丧或生气以及以意想不到的方式行动(例如，拒绝洗澡或其他性格改变)。患有中度ad的受试者的大脑中的神经变性可能使受试者难以表达思想和执行常规任务。在一些实施方式中，患有中期ad的受试者的症状对于近亲属以外的其他人也将是明显的。在一些实施方式中，患有中期ad的受试者经历选自下列的一种或多种困难：并且可以包括：遗忘事件或关于受试者自己的个人历史、情绪低落或退缩(特别是在社交或精神上具有挑战性的情况中)、无法回忆起受试者自己的地址或电话号码或受试者毕业的高中或大学、对受试者身在哪里或今天是哪一天感到困惑、选择适合季节或场合的服装需要帮助、控制膀胱和大便有困难、睡眠方式的变化(例如，白天睡觉，并且晚上变得不安宁)、流浪和迷路的风险增加、性格和行为改变(例如，疑心和妄想)以及强迫性、重复性行为(例如手拧或撕纸巾)。
在ad的末期(严重ad)，受试者失去了对他或她的环境做出反应，进行交谈并最终控制运动的能力。在一些实施方式中，患有末期ad的受试者仍可以说单词或短语，但是传达疼痛变得困难。在一些实施方式中，患有末期ad的受试者经历显著的性格改变。在一些实施方式中，患有末期ad的受试者需要日常活动的大量帮助。在一些实施方式中，患有末期ad的受试者经历选自下列的一种或多种困难：需要日常活动和个人护理的全天候帮助；对最近的经历以及周围环境的意识丧失；经历身体能力的变化(例如，走路、坐和最终吞咽的能力)；沟通困难增加；和容易受到感染(例如，肺炎)。
在一些实施方式中，将根据本发明的组合物施用于患有早期ad的受试者。在一些实施方式中，将根据本发明的组合物施用于患有中期ad的受试者。在一些实施方式中，将根据本发明的组合物施用于患有末期ad的受试者。
目前对ad的治疗包括乙酰胆碱酯酶抑制剂和n-甲基-d-天冬氨酸受体拮抗剂美金刚，但提供有症状的而非疾病改善的益处(malikandrobertson.2017.jneurol264:416–418)。在一些实施方式中，本发明包括用组合物治疗患有ad的受试者，该组合物包括如本文描述的包含嵌合抗原受体(car)的修饰细胞。在一些实施方式中，治疗患有ad的受试者包括单独或与另外的(非car)治疗组合物组合施用本文描述的基于car的治疗组合物。在一些实施方式中，与仅用另外的(非car)治疗组合物治疗患有ad的受试者相比，仅用本文描述的基于car的治疗组合物治疗患有ad的受试者对受试者的ad症状和/或病理有更大的作用。在一些实施方式中，用本文描述的基于car的治疗组合物和另外的治疗组合物的组合治疗患有ad的受试者对受试者的ad症状和/或病理具有协同作用。在一些实施方式中，另外的治疗组合物包括选择性靶向聚集的aβ的人单克隆抗体。在一些实施方式中，选择性靶向聚集的aβ的人单克隆抗体是阿杜那单抗(aducanumab)。在一些实施方式中，另外的治疗组合物包括tau蛋白聚集的选择性抑制剂。在一些实施方式中，tau蛋白聚集的选择性抑制剂是白细胞-甲基硫
在一些实施方式中，使用阿尔茨海默氏病评估量表-认知分量表(adas-cog)和/或日常生活活动量表的ad合作研究活动(adcs-adl)评估ad治疗对受试者的ad症状的影响。在一些实施方式中，通过测量受试者的大脑中蛋白质聚集体的水平来评估ad治疗对受试者中的ad病理的影响。在一些实施方式中，蛋白质聚集体是聚集的aβ(例如，aβ42)。在一些实施方式中，蛋白质聚集体是tau蛋白聚集体。
胶原蛋白/纤维变性疾病
胶原蛋白的异常沉积在全身性失调比如全身性硬化症(硬皮病)和慢性移植物抗宿主病中以及器官特异性失调比如各种肺纤维变性失调和肝硬化中均会发生。
全身性硬化症
全身性硬化症(ssc)是一种结缔组织疾病(ctd)，它会影响皮肤、血管、心脏、肺、肾脏、胃肠道(gi)和肌肉骨骼系统，并且包括胶原蛋白质聚集体的发展作为表征特征。内脏器官的涉及会导致患有ssc的患者显著的发病率和死亡率(kowal-bieleckao,etal.annrheumdis2017；76:1327–1339)。在一些实施方式中，ssc的症状包括皮肤斑块(patch)的硬化和拉紧。在一些实施方式中，ssc的症状包括对寒冷温度或情感抑郁的夸张反应，其可能导致手指或脚趾麻木、疼痛或颜色变化(也称为“雷诺现象”)。在一些实施方式中，ssc的症状包括胃酸反流和/或吸收营养物的问题(例如，如果肠肌肉不能适当地移动食物通过肠道的话)。在一些实施方式中，ssc的症状包括不同程度的心脏、肺或肾脏的异常功能。
目前对患有全身性硬化症的受试者中的雷诺现象(rp)的疗法包括二氢吡啶型钙拮抗剂(例如，硝苯地平)、pde-5抑制剂、前列腺素类(例如静脉注射伊洛前列素)和氟西汀。目前对患有全身性硬化症的受试者中的指溃疡的疗法包括静脉注射伊洛前列素、pde-5抑制剂和波生坦。目前对肺动脉高压(pah)的疗法包括内皮素受体拮抗剂(例如安贝生坦、波生坦和马西替坦)、pde-5抑制剂(例如西地那非和他达拉非)和利奥西呱。目前对患有全身性硬化症的受试者中的皮肤和肺部问题的疗法包括甲氨蝶呤、环磷酰胺和造血干细胞移植(hsct)。目前对患有全身性硬化症的受试者中的硬皮病肾危象的疗法包括ace抑制剂。目前对ssc相关的胃肠道疾病的疗法包括质子泵抑制剂、促动力药物以及间歇性或旋转性抗生素(以治疗有症状的小肠细菌过度生长)。
在一些实施方式中，本发明提供了包括用组合物治疗患有ssc的受试者的步骤的方法，该组合物包括如本文描述的包含嵌合抗原受体(car)的修饰细胞。在一些实施方式中，治疗患有ssc的受试者包括单独或与另外的(非car)治疗组合物组合施用本文描述的基于car的治疗组合物。在一些实施方式中，与仅用另外的(非car)治疗组合物治疗患有ssc的受试者相比，仅用如本文描述的基于car的治疗组合物治疗患有ssc的受试者对受试者的ssc症状和/或病理具有更大的作用。在一些实施方式中，用本文描述的基于car的治疗组合物和另外的治疗组合物的组合治疗患有ssc的受试者对受试者的ssc症状和/或病理具有协同作用。
移植物抗宿主疾病
慢性移植物抗宿主病(gvhd)是同种异体造血干细胞移植(hsct)的最严重和最常见的长期并发症，在20％至70％的人——存活超过100天——中出现(lee,s.j.blood.2005jun1；105(11):4200–4206)。大约一半的患病患者具有3个或更多个受累器官，并且治疗通常需要中值为1到3年的免疫抑制药物。尽管慢性gvhd对同种异体移植的长期成功具有不利影响是公认的，但对其病理生理学了解甚少，并且尚未建立全身性皮质类固醇以外的管理策略。
在一些实施方式中，慢性gvhd的体征和症状包括：关节或肌肉疼痛、呼吸急促、持续咳嗽、视力改变(例如干眼)、皮肤改变(例如皮肤下的疤痕或皮肤僵硬)、皮疹、皮肤或眼白变黄(黄疸)、口干、口疮、腹痛、腹泻、恶心和呕吐。
针对靶组织的治疗可以使患有慢性gvhd的受试者的发病率降至最低，并改善其功能。主要的使组织衰弱的反应之一是纤维变性。已将常山酮局部或全身性给予以抑制tgf-β–诱导的胶原蛋白α1基因过度表达。常山酮经由依赖于蛋白质合成的机制抑制smad3磷酸化，特别是在通过tgf-β激活或激活突变而诱导过度分泌胶原蛋白的成纤维细胞中。也可以通过身体康复来防止过多的胶原蛋白沉积，这类似于烧伤受害者和患有硬皮病的人的治疗，他们的许多还遭受过量的胶原蛋白沉积。积极的热疗、按摩和被动运动范围的锻炼可以帮助维持功能，直到可以控制硬化过程。
在一些实施方式中，本发明提供了包括用组合物治疗患有慢性gvhd的受试者的步骤的方法，该组合物包括如本文描述的包含嵌合抗原受体(car)的修饰细胞。在一些实施方式中，治疗患有慢性gvhd的受试者包括单独或与另外的(非-car)治疗组合物组合施用本文描述的基于car的治疗组合物。在一些实施方式中，与仅用另外的(非car)治疗组合物治疗患有慢性gvhd的受试者相比，仅用如本文描述的基于car的治疗组合物治疗患有慢性gvhd的受试者对受试者的慢性gvhd症状和/或病理具有更大的作用。在一些实施方式中，用如本文描述的基于car的治疗组合物和另外的治疗组合物的组合治疗患有慢性gvhd的受试者对受试者的慢性gvhd症状和/或病理具有协同作用。在一些实施方式中，另外的(非car)治疗组合物包括常山酮。
肺纤维变性
肺纤维变性(pf)是在肺组织受损和结疤时发生的肺部疾病。这种增厚的、僵硬的组织使肺部更难以适当地工作。随着肺纤维变性恶化，呼吸急促逐渐恶化。与肺纤维变性相关的结疤可能是由多种因素引起的，但是在大多数情况下，医生无法确定pf的病因，而当找不到病因时，该病症称为特发性肺纤维变性。在一些实施方式中，pf的体征和症状包括：呼吸急促(呼吸困难)、干咳、疲劳、无法解释的体重减轻、肌肉和关节疼痛以及手指或脚趾的尖端变宽和变圆(杵状指)。
pf的当前疗法包括尼达尼布(ofev，一种酪氨酸激酶抑制剂，其靶向多种酪氨酸激酶，包括血管内皮生长因子、成纤维细胞生长因子和pdgf受体)和吡非尼酮(esbriet，一种吡啶酮，其降低成纤维细胞增殖、抑制tgf-β刺激的胶原蛋白产生并减少致纤维化介质比如tgf-β的产生。
在一些实施方式中，本发明提供包括用组合物治疗患有pf的受试者的步骤的方法，该组合物包括如本文描述的包含嵌合抗原受体(car)的修饰细胞。在一些实施方式中，治疗患有pf的受试者包括单独或与另外的(非car)治疗组合物组合施用如本文描述的基于car的治疗组合物。在一些实施方式中，与仅用另外的(非car)治疗组合物治疗患有pf的受试者相比，仅用如本文描述的基于car的治疗组合物治疗患有pf的受试者对受试者的pf症状和/或病理具有更大的作用。在一些实施方式中，用如本文描述的基于car的治疗组合物和另外的治疗组合物的组合治疗患有pf的受试者对受试者的pf症状和/或病理具有协同作用。在一些实施方式中，另外的(非car)治疗组合物包括尼达尼布。在一些实施方式中，另外的(非car)治疗组合物包括吡非尼酮。
肝硬化
肝硬化是已导致正常肝结构广泛扭曲的晚期肝纤维变性。在一些实施方式中，肝硬化的特征是被致密的纤维变性组织包围的再生结节。在一些实施方式中，肝硬化的体征和症状包括：疲劳、容易出血、容易瘀伤、皮肤发痒、黄疸、腹水(腹部中流体积聚)、食欲不振、恶心、腿肿胀、体重减轻、肝性脑病(混乱、嗜睡和言语不清)、皮肤上的蜘蛛状血管、手掌发红、睾丸萎缩和乳房增大(男性)。
当前用于肝硬化的疗法本质上是支持性的，并且包括停止有害药物，提供营养并治疗潜在的失调和并发症。肝移植适用于终末期肝病患者。
在一些实施方式中，本发明提供了包括用组合物治疗患有肝硬化的受试者的步骤的方法，该组合物包括如本文描述的包含嵌合抗原受体(car)的修饰细胞。在一些实施方式中，治疗患有肝硬化的受试者包括单独或与另外的(非car)治疗组合物组合施用如本文描述的基于car的治疗组合物。在一些实施方式中，与仅用另外的(非car)治疗组合物治疗患有肝硬化的受试者相比，仅用如本文描述的基于car的治疗组合物治疗患有肝硬化的受试者对受试者的肝硬化症状和/或病理具有更大的作用。在一些实施方式中，用如本文描述的基于car的治疗组合物和另外的治疗组合物的组合治疗患有肝硬化的受试者对受试者的肝硬化症状和/或病理具有协同作用。
脂蛋白/心血管疾病
动脉粥样硬化是一种血管疾病，其中由脂质、脂蛋白、蛋白质和其他物质组成的异质斑块堆积在动脉壁中，阻塞了血管腔，并经常导致疼痛和组织损伤。动脉粥样硬化斑块的主要成分是低密度脂蛋白(ldl)，它被认为是通过受损的上皮细胞层进入血管内壁(lining)来启动斑块的形成。吸烟、糖尿病或其他病症可能会损坏上皮。ldl的积累导致吸引单核细胞(最终变成泡沫细胞)的炎症反应，并催化斑块生长。
在一些情况下，斑块可能“破裂”，并且所得到的凝块可能引起心肌梗塞或中风。由动脉粥样硬化斑块引起的三种主要疾病是冠状动脉疾病(当斑块位于冠状动脉内时并可导致胸痛或心绞痛)、脑血管疾病(当动脉粥样硬化斑块在脑内时，并且可引起短暂性缺血发作)和外周动脉疾病(导致四肢血液循环不良、疼痛、行走困难、伤口愈合不良，并且在极端情况下需要截肢)。
动脉粥样硬化是一种慢性疾病，伴随并存病而发展多年，必须每天用药物维持，该药物的目标是降低ldl、血液变稀、血压降低等，但并不直接以斑块的溶解为目标。多年服用用于动脉粥样硬化的维持药物可能会损害肝脏。除药物外，还可通过医疗程序治疗动脉粥样硬化，比如在有或没有支架的情况下重新打开血管(经皮冠状动脉介入或pci)、冠状动脉旁路移植(cabg)手术、四肢中旁路移植或颈动脉内膜切除术。
可以用本发明的主题car治疗的其他适应症包括但不限于伴有皮下梗死和脑白质病(cadasil)的脑常染色体显性动脉病、脑β-淀粉样血管病、苯丙酮尿症(pku)、肺泡蛋白沉积症(自身免疫)和肺泡蛋白沉积症(先天的)。
嵌合抗原受体(car)
在本发明的一个方面中，修饰的单核细胞、巨噬细胞或树突细胞通过在其中表达car而产生。因此，本发明涵盖提供的car以及编码提供的car的核酸构建体，其中car包括抗原结合结构域、跨膜结构域和细胞内结构域。在某些情况下，包括car的单核细胞、巨噬细胞或树突细胞在本文中被称为car-巨噬细胞。
在一个方面中，本发明包括包含嵌合抗原受体(car)的细胞，其中car包括抗原结合结构域、跨膜结构域和细胞内结构域，其中抗原结合结构域能够结合蛋白质聚集体的抗原，并且其中细胞是表达car的单核细胞、巨噬细胞和/或树突细胞。
在另一方面中，本发明提供了包括编码嵌合抗原受体(car)的核酸序列(例如，分离的核酸序列)的细胞，其中核酸序列包括编码抗原结合结构域的核酸序列、编码跨膜结构域的核酸序列和编码细胞内结构域的核酸序列，其中抗原结合结构域能够结合蛋白质聚集体的抗原，并且其中细胞是表达car的单核细胞、巨噬细胞和/或树突细胞。在一些实施方式中，单一核酸序列可以编码抗原结合结构域、跨膜结构域和细胞内结构域中的至少两个。
在一个方面中，本发明包括包含嵌合抗原受体(car)的修饰细胞，其中car包括抗原结合结构域、跨膜结构域和共刺激分子的细胞内结构域，其中抗原结合结构域包括抗体剂或其片段，其能够结合患有神经退行性疾病、炎症性疾病、心血管疾病、纤维变性疾病或淀粉样变性病的受试者的组织中的蛋白质聚集体中的蛋白质，并且其中修饰细胞是具有靶向的效应子活性的单核细胞、巨噬细胞或树突细胞。在另一方面中，本发明包括修饰细胞，该修饰细胞包括编码嵌合抗原受体(car)的核酸序列，其中核酸序列包括编码抗原结合结构域的核酸序列、编码跨膜结构域的核酸序列和编码共刺激分子的细胞内结构域的核酸序列，其中编码抗原结合结构域的核酸序列包括抗体或其片段，其能够结合在患有神经退行性疾病、炎症性疾病、心血管疾病、纤维变性疾病或淀粉样变性病的受试者的组织中的蛋白质聚集体中的蛋白质，并且其中细胞是表达car并具有靶向的效应子活性的单核细胞、巨噬细胞或树突细胞。在一个实施方式中，靶向的效应子活性针对特异性结合car的抗原结合结构域的靶细胞上的抗原。在另一个实施方式中，靶向的效应子活性选自吞噬作用、靶向的细胞毒性、抗原呈递和细胞因子分泌。
抗原结合结构域
在一些实施方式中，提供的car包括结合蛋白质聚集体的抗原和/或靶细胞表面上的抗原的一个或多个抗原结合结构域。可以充当与car的抗原结合结构域结合的抗原的细胞表面标记的实例包括与病毒、细菌和寄生虫感染、自身免疫性疾病/失调、神经退行性疾病/失调、炎症性疾病/失调、心血管疾病/失调、纤维变性疾病/失调和淀粉样变性病相关的那些。
抗原结合结构域的选择取决于蛋白质聚集体中或靶细胞表面上存在的抗原的类型和数量。例如，可以选择抗原结合结构域以识别充当与特定疾病或失调状态相关的靶细胞上的细胞表面标记的抗原。
在一些实施方式中，抗原结合结构域结合错误折叠的蛋白质抗原或蛋白质聚集体的蛋白质，比如对于所关注的疾病/失调具有特异性的蛋白质。在一些实施方式中，疾病/失调是神经退行性疾病/失调、炎症性疾病/失调、心血管疾病/失调、纤维变性疾病/失调或淀粉样变性病(例如，由免疫球蛋白轻链或甲状腺素转运蛋白的蛋白质聚集体介导)。在一些实施方式中，神经退行性疾病/失调选自tau蛋白病、α-突触核蛋白病、早老性痴呆、老年性痴呆、阿尔茨海默氏病(由β-淀粉样蛋白的蛋白质聚集体介导)、与第17位染色体相关的帕金森症(ftdp-17)、进行性核上性麻痹(psp)、皮克氏病、原发性进行性失语症、额颞叶痴呆症、皮层基底节痴呆症、帕金森氏病、伴有痴呆症的帕金森氏病、路易体痴呆症、唐氏综合症、多系统萎缩症、肌萎缩性脊髓侧索硬化症(als)、哈-斯二氏综合征、多聚谷氨酰胺病、三核苷酸重复病、家族性英国痴呆症、致命性家族性失眠症、gss综合症、伴有淀粉样变性病的遗传性脑出血(冰岛型)(hchwa-i)、散发性致命性失眠症(sfi)、变异性蛋白酶敏感性朊蛋白病(vpspr)、家族性丹麦型痴呆症和朊病毒病(比如，克雅氏病、cjd和变体型克雅氏病(vcjd))。
抗原结合结构域可以包括结合抗原的任何结构域，并且可以是或包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、合成抗体、人抗体、人源化抗体、非人抗体及其任何片段，例如scfv。另外，在一些实施方式中，抗原结合结构域可以是或包括适配体、darpin、天然存在的或合成的受体、亲和体、或其他工程化的蛋白质识别分子。因此，在一些实施方式中，抗原结合结构域部分包括哺乳动物抗体或其片段。在另一个实施方式中，car的抗原结合结构域选自抗tau抗体、抗tdp-43抗体、抗β-淀粉样蛋白抗体、抗淀粉样蛋白抗体和抗胶原蛋白抗体或其片段(例如，scfv)。
在一些情况下，抗原结合结构域全部或部分源自最终将在其中使用car的相同物种。例如，在人中使用，在一些实施方式中，car的抗原结合结构域可以是或包括人抗体、人源化抗体或其片段。
在本发明的一些方面中，抗原结合结构域可操作地连接至所提供的car的另一个结构域，比如跨膜结构域或细胞内结构域，以在细胞中表达。在一些实施方式中，编码抗原结合结构域的核酸可操作地连接至编码跨膜结构域的核酸，并且跨膜结构域可操作地连接至编码细胞内结构域的核酸。在一些实施方式中，包括car的修饰的细胞(例如，修饰的单核细胞、巨噬细胞或树突细胞)进一步包括激活所需的另外的抗原-结合结构域(例如，双特异性car或双特异性修饰细胞)。在一些实施方式中，双特异性修饰的细胞可以通过要求存在两种抗原来减少脱靶和/或中靶脱组织(on-targetoff-tissueeffect)影响。在一些实施方式中，car和另外的抗原结合结构域提供了不同的信号，这些信号分离时不足以介导修饰细胞的激活，但是协同在一起刺激修饰细胞的激活。在一些实施方式中，这种构建体可以被称为“and”逻辑门。
在一些实施方式中，双特异性修饰的细胞可以通过要求在刺激细胞活性之前存在一种抗原(例如，错误折叠的蛋白质抗原或蛋白质聚集体的蛋白质)和不存在第二种正常的蛋白质抗原来减少脱靶和/或中靶脱组织影响。在一些实施方式中，这样的构建体可以被称为“not”逻辑门。与and门相反，非门控的car修饰的细胞通过结合单个抗原而被激活。然而，第二种受体与第二种抗原的结合起着超越(override)通过car延续的激活信号的作用。该抑制受体将针对在正常组织中大量表达但在错误折叠的蛋白质或蛋白质聚集体中不存在的抗原。
跨膜结构域
关于跨膜结构域，可以将提供的car设计为包括将car的抗原结合结构域连接至细胞内结构域的跨膜结构域。在一些实施方式中，跨膜结构域可以与car中的一个或多个结构域天然相关联。在一些情况下，可以通过氨基酸取代来选择或修饰跨膜结构域，以避免这种结构域(一个或多个)与相同或不同表面膜蛋白的跨膜结构域结合，以使与受体复合物的其他成员的相互作用最小化。
在一些实施方式中，跨膜结构域可以源自天然或合成来源。在来源是天然的情况下，该结构域可以源自任何膜结合蛋白或跨膜蛋白。在一些实施方式中，特定用途的跨膜区可源自(即包括至少下列的跨膜区(一个或多个))t-细胞受体的α、β或ζ链、cd28、cd3ε、cd45、cd4、cd5、cd8、cd9、cd16、cd22、cd33、cd37、cd64、cd80、cd86、cd134、cd137、cd154、toll样受体1(tlr1)、tlr2、tlr3、tlr4、tlr5、tlr6、tlr7、tlr8和tlr9。在一些实施方式中，跨膜区可以包括一个或多个铰链区。在一些情况下，还可以使用包括人ig(免疫球蛋白)铰链区的各种人铰链区(例如，cd28或cd8铰链区)中的任一个。
在一些实施方式中，跨膜结构域可以是合成的，在这种情况下，其将主要包括疏水残基，比如亮氨酸和缬氨酸。在一些实施方式中，将在合成跨膜结构域的每个末端发现苯丙氨酸、色氨酸和缬氨酸的三联体。
细胞内结构域
在一些实施方式中，car的细胞内结构域或其他细胞质结构域可以是或包括与本文其他地方描述的嵌合细胞内信号传导分子相似或相同的细胞内结构域，并负责激活在其中表达car的细胞。
在一些实施方式中，car的细胞内结构域包括负责信号激活和/或转导的结构域。
在一些实施方式中使用的细胞内结构域的实例包括但不限于表面受体的细胞质部分、共刺激分子以及在单核细胞、巨噬细胞或树突细胞中合作起启动信号转导作用的任何分子，以及这些元件的任何衍生物或变体以及具有相同功能能力的任何合成序列。
在一些实施方式中有用的细胞内结构域的实例包括包含来自一个或多个分子或受体的片段或结构域的那些，其包括但不限于tcr、cd3ζ、cd3γ、cd3δ、cd3ε、cd86、常见的fcrγ、fcrβ(fcεr1b)、cd79a、cd79b、fcγriia、dap10、dap12、t细胞受体(tcr)、cd27、cd28、4-1bb(cd137)、ox40、cd30、cd40、pd-1、icos、淋巴细胞功能相关的抗原-1(lfa-1)、cd2、cd7、light、nkg2c、b7-h3、与cd83特异性结合的配体、cds、icam-1、gitr、baffr、hvem(lightr)、slamf7、nkp80(klrf1)、cd127、cd160、cd19、cd4、cd8α、cd8β、il2rβ、il2rγ、il7rα、itga4、vla1、cd49a、itga4、ia4、cd49d、itga6、vla-6、cd49f、itgad、cd11d、itgae、cd103、itgal、cd11a、lfa-1、itgam、cd11b、itgax、cd11c、itgb1、cd29、itgb2、cd18、lfa-1、itgb7、tnfr2、trance/rankl、dnam1(cd226)、slamf4(cd244、2b4)、cd84、cd96(触觉的)、ceacam1、crtam、ly9(cd229)、cd160(by55)、psgl1、cd100(sema4d)、cd69、slamf6(ntb-a、ly108)、slam(slamf1、cd150、ipo-3)、blame(slamf8)、selplg(cd162)、ltbr、lat、gads、slp-76、pag/cbp、nkp44、nkp30、nkp46、nkg2d、toll样受体1(tlr1)、tlr2、tlr3、tlr4、tlr5、tlr6、tlr7、tlr8、tlr9，本文描述的其他共刺激分子、其任何衍生物、变体或片段，具有相同功能能力的共刺激分子的任何合成序列，及其任何组合。
在一些实施方式中，car的细胞内结构域包括双重信号传导结构域，比如41bb、cd28、icos、tlr1、tlr2、tlr3、tlr4、tlr5、tlr6、tlr7、tlr8、tlr9、tlr10、tlr11、cd116受体β链、csf1-r、lrp1/cd91、sr-a1、sr-a2、marco、sr-cl1、sr-cl2、sr-c、sr-e、cr1、cr3、cr4、dectin1、dec-205、dc-sign、cd14、cd36、lox-1、cd11b，连同以任何组合的上述段落中列出的信号传导结构域中的任一个。在一些实施方式中，car的细胞内结构域包括一个或多个共刺激分子的任何部分，比如来自cd3、fcεriγ链的至少一个信号传导结构域，其任何衍生物或变体，具有相同功能能力的其任何合成序列，及其任何组合。
在一些实施方式中，在所提供的car的抗原结合结构域和跨膜结构域之间，或在所提供的car的细胞内结构域和跨膜结构域之间，可以并入间隔结构域。如本文所使用的，术语“间隔结构域”通常是指起将跨膜结构域连接至多肽链中的抗原结合结构域或细胞内结构域的功能的任何寡肽或多肽。在一些实施方式中，间隔结构域可以包括至多300个氨基酸，优选地10至100个氨基酸和最优选地25至50个氨基酸。在一些实施方式中，短的寡肽或多肽接头，优选地长度在2和10个氨基酸之间，可以形成car的跨膜结构域和细胞内结构域之间的连接。接头的实例包括甘氨酸-丝氨酸双联体。
人抗体
在一些实施方式中，可能优选使用人抗体或其片段作为car的抗原结合结构域。完整的人抗体对于治疗人受试者是特别期望的。可以通过本领域已知的各种方法来制备人抗体，包括使用源自人免疫球蛋白序列的抗体文库的噬菌体展示方法，包括对这些技术的改进。还参见美国专利号4,444,887和4,716,111；和pct公开wo98/46645、wo98/50433、wo98/24893、wo98/16654、wo96/34096、wo96/33735和wo91/10741；其每一篇通过引用以其整体并入本文。
人抗体也可以使用不能表达功能性内源免疫球蛋白但是可以表达人免疫球蛋白基因的转基因小鼠产生。例如，可以将人重链和轻链免疫球蛋白基因复合物随机地或通过同源重组引入小鼠胚胎干细胞中。可选地，除了人重链和轻链基因以外，还可以将人可变区、恒定区和多变区引入小鼠胚胎干细胞中。可通过同源重组使得小鼠重链和轻链免疫球蛋白基因与引入人免疫球蛋白基因座分开地或同时地失去功能。例如，已经描述了在嵌合和种系突变小鼠中抗体重链连接区(jh)基因的纯合缺失导致内源抗体产生的完全抑制。将修饰的胚胎干细胞扩展并显微注射到胚泡中以产生嵌合小鼠。然后繁殖嵌合小鼠以产生表达人抗体的纯合子代。用选择的抗原，例如本发明的全部或部分多肽，以正常方式免疫转基因小鼠。可以使用常规杂交瘤技术从免疫的转基因小鼠中获得针对所选靶标的抗体。转基因小鼠携带(harbor)的人免疫球蛋白转基因在b细胞分化期间会重排，并且然后经历类型转换和体细胞突变。因此，使用这种技术，可能产生治疗上有用的igg、iga、igm和ige抗体，包括但不限于igg1(γ1)和igg3。对于产生人抗体的这项技术的概述，参见lonberg和huszar(int.rev.immunol.,13:65-93(1995))。对于产生人抗体和人单克隆抗体的这项技术和产生这种抗体的方案的详细讨论，参见例如pct公开号wo98/24893、wo96/34096和wo96/33735；和美国专利号5,413,923；5,625,126；5,633,425；5,569,825；5,661,016；5,545,806；5,814,318；和5,939,598，其每一篇通过引用以其整体并入本文。另外，使用类似于上述的技术，公司比如abgenix,inc.(freemont,calif.)和genpharm(sanjose,calif.)可以参与提供针对所选抗原的人抗体。对于在种系突变体小鼠中转移人种系免疫球蛋白基因阵列(这将在抗原攻击后导致人抗体的产生)的具体讨论，参见例如jakobovits等人，1993,proc.natl.acad.sci.usa,90:2551；jakobovits等人，1993,nature,362:255-258；bruggermann等人，1993,yearinimmunol.,7:33；和duchosal等人，1992,nature,355:258。
人抗体也可以源自噬菌体展示文库(hoogenboom等人，j.mol.biol.,227:381(1991)；marks等人，j.mol.biol.,222:581-597(1991)；vaughan等人，naturebiotech.,14:309(1996))。噬菌体展示技术(mccafferty等人，nature，348:552-553(1990))可用于在体外从未免疫供体的免疫球蛋白可变(v)结构域基因库(repertoire)产生人抗体和抗体片段。根据该技术，将抗体v结构域基因框内克隆到丝状噬菌体例如m13或fd的主要或次要外壳蛋白基因中，并作为功能性抗体片段展示在噬菌体颗粒的表面上。因为丝状颗粒包含噬菌体基因组的单链dna拷贝，所以基于抗体的功能特性的选择也导致选择编码展现那些特性的抗体的基因。因此，噬菌体模拟了b细胞的一些特性。噬菌体展示可以多种形式进行，对于它们的综述，参见例如johnson、kevins和chiswell，davidj.,currentopinioninstructuralbiology3:564-571(1993)。v-基因区段的几种来源可用于噬菌体展示。clackson等人，nature，352：624-628(1991)从源自未经免疫的小鼠脾脏的v基因的小型随机组合文库中分离了多种抗
人抗体也可以通过体外激活的b细胞产生(参见美国专利号5,567,610和5,229,275，其每一篇通过引用以其整体并入本文)。人抗体也可以使用杂交瘤技术在体外产生，比如，但不限于roder等人(methodsenzymol.,121:140-167(1986))描述的技术。
人源化抗体
在一些实施方式中，非人抗体可以是人源化的，其中抗体的特异性序列或区域被修饰以增加与人中天然产生的抗体的相似性。例如，在一些实施方式中，抗体或其片段可以包括非人哺乳动物scfv。在一些实施方式中，抗原结合结构域部分是人源化的。
可以使用本领域已知的各种技术来产生人源化抗体，其包括但不限于cdr移植(参见例如欧洲专利号ep239,400；国际公开号wo91/09967；和美国专利号5,225,539、5,530,101和5,585,089，其每一篇通过引用以其整体并入本文)、贴面(veneering)或表面重建(resurfacing)(参见例如欧洲专利号ep592,106和ep519,596；padlan,1991,molecularimmunology,28(4/5):489-498；studnicka等人，1994,proteinengineering,7(6):805-814；和roguska等人，1994,pnas,91:969-973，其每一篇通过引用以其整体并入本文)、链改组(参见例如美国专利号5,565,332，其通过引用以其整体并入本文)，和在例如美国专利申请公开号us2005/0042664、美国专利申请公开号us2005/0048617、美国专利号6,407,213、美国专利号5,766,886、国际公开号wo9317105、tan等人，j.immunol.,169:1119-25(2002)、caldas等人，proteineng.,13(5):353-60(2000)、morea等人，methods,20(3):267-79(2000)、baca等人，j.biol.chem.,272(16):10678-84(1997)、roguska等人，proteineng.,9(10):895-904(1996)、couto等人，cancerres.,55(23supp):5973s-5977s(1995)、couto等人，cancerres.,55(8):1717-22(1995),sandhujs,gene,150(2):409-10(1994)和pedersen等人，j.mol.biol.,235(3):959-73(1994)中公开的技术，其每一篇通过引用以其整体并入本文。通常，框架区中的框架残基将被来自cdr供体抗体的相应残基取代，以改变，优选改善抗原结合。通过本领域熟知的方法，例如通过对cdr和框架残基的相互作用建模以鉴定对抗原结合重要的框架残基，以及通过序列比较以鉴定在特定位置处的异常框架残基，来鉴定这些框架取代(参见例如queen等人，美国专利号5,585,089；和riechmann等人，1988，nature，332:323，其通过引用以它们的整体并入本文)。
人源化抗体具有从非人来源引入的一个或多个氨基酸残基。这些非人氨基酸残基通常被称为“输入”残基，其通常获得自“输入”可变结构域。因此，人源化抗体包含来自非人免疫球蛋白分子的一个或多个cdr和来自人的框架区。抗体的人源化是本领域众所周知的，并且基本上可以按照winter和同事的方法(jones等人，nature，321:522-525(1986)；riechmann等人，nature，332:323-327(1988)；verhoeyen等人，science，239:1534-1536(1988))，通过用啮齿动物cdr或cdr序列取代相应的人抗体序列，即，cdr-移植(ep239,400；pct公开号wo91/09967；和美国专利号4,816,567；6,331,415；5,225,539；5,530,101；5,585,089；6,548,640，在此其内容通过引用以其整体并入本文)来进行。在这种人源化嵌合抗体中，基本上少于完整的人可变结构域已被来自非人物种的相应序列取代。在实践中，人源化抗体通常是人抗体，其中一些cdr残基和可能的一些框架(fr)残基被啮齿动物抗体中类似位点的残基取代。抗体的人源化也可以通过贴面或表面重建(ep592,106；ep519,596；padlan,1991,molecularimmunology,28(4/5):489-498；studnicka等人，proteinengineering,7(6):805-814(1994)；和roguska等人，pnas,91:969-973(1994))或链改组(美国专利号5,565,332)来实现，其内容通过引用以其整体并入本文。
用于制备人源化抗体的人轻链和重链可变结构域的选择通常是为了降低抗原性。根据所谓的“最佳拟合”方法，针对已知的人可变结构域序列的整个文库筛选啮齿动物抗体的可变结构域的序列。然后将最接近啮齿动物的序列的人序列接受为人源化抗体的人框架(fr)(sims等人，j.immunol.,151:2296(1993)；chothia等人，j.mol.biol.,196:901(1987)，其内容通过引用以其整体并入本文)。另一种方法使用源自轻链或重链特定亚组的所有人抗体的共有序列的特定框架。相同的框架可用于几种不同的人源化抗体(carter等人，proc.natl.acad.sci.usa,89:4285(1992)；presta等人，j.immunol.,151:2623(1993)，其内容通过引用以其整体并入本文)。
抗体可以被人源化，其保留对靶抗原的高亲和力并具有其他有利的生物学特性。根据本发明的一个方面，通过使用亲本和人源化序列的三维模型对亲本序列和各种概念性人源化产物的分析过程来制备人源化抗体。三维免疫球蛋白模型是普遍可获得的并且为本领域技术人员所熟悉。可获得计算机程序，其说明并展示了所选的候选免疫球蛋白序列的可能的三维构象结构。对这些展示的检查允许分析残基在候选免疫球蛋白序列的功能中的可能作用，即，分析影响候选免疫球蛋白结合靶抗原的能力的残基。以这种方式，可以从受体和输入序列中选择并组合fr残基，从而实现期望的抗体特征，比如对靶抗原的增加的亲和力。通常，cdr残基直接且最实质地参与影响抗原结合。
在一些实施方式中，人源化抗体保留与原始抗体相似的抗原特异性。然而，使用某些人源化方法，可以使用“定向进化”的方法来提高抗体与靶抗原结合的亲和力和/或特异性，如wu等人，j.mol.biol.,294:151(1999)所描述的，其内容通过引用以其整体并入本文。
载体
在一些实施方式中，如本文其他地方所描述的，可以使用载体将car引入单核细胞、巨噬细胞或树突细胞。在一个方面中，本发明包括包含编码如本文描述的car的核酸序列的载体。在一些实施方式中，载体包括质粒载体、病毒载体、逆转录转座子(例如，背驮式(piggyback)、睡美人(sleepingbeauty))、定点插入载体(例如，crispr、zn指核酸酶、talen)或自杀表达载体，或本领域其他已知的载体。
在一些实施方式中，上述构建体能够与第三代慢病毒载体质粒、其他病毒载体或被批准用于人细胞的rna一起使用。在一些实施方式中，载体是病毒载体，比如慢病毒载体。在一些实施方式中，载体是rna载体。
本文描述的任何分子的产生可以通过测序来验证。全长蛋白质的表达可以使用免疫印迹、免疫组织化学、流式细胞术或本领域熟知和可获得的其他技术来验证。
在一些实施方式中，本发明还提供其中插入了本发明的dna的载体。载体，包括源自逆转录病毒比如慢病毒的那些，是实现长期基因转移的合适工具，因为它们允许转基因长期稳定地整合及其在子代细胞中繁殖。慢病毒载体与源自癌逆转录病毒比如鼠白血病病毒的载体相比具有附加优点，因为它们可以转导非增殖细胞比如肝细胞。它们还具有在引入它们的受试者中产生低免疫原性的附加优点。
天然或合成核酸的表达通常通过将核酸或其部分可操作地连接至启动子，并将构建体并入表达载体中来实现。该载体是通常能够在哺乳动物细胞中复制和/或也能够整合到哺乳动物的细胞基因组中的载体。典型的载体包含可用于调节期望核酸序列表达的转录和翻译终止子、初始序列和启动子。
根据各种实施方式，可以将核酸克隆到任何数量的不同类型的载体中。例如，在一些实施方式中，可以将核酸克隆到载体中，该载体包括但不限于质粒、噬菌粒、噬菌体衍生物、动物病毒和粘粒。在一些实施方式中，特别感兴趣的载体包括表达载体、复制载体、探针产生载体和测序载体。
在一些实施方式中，表达载体可以以病毒载体的形式提供给细胞。病毒载体技术是本领域众所周知的，并且描述于例如sambrook等人，2012,molecularcloning:alaboratorymanual，第1-4卷，coldspringharborpress,ny，以及其他病毒学和分子生物学手册中。可用作载体的病毒包括但不限于逆转录病毒、腺病毒、腺伴随病毒、疱疹病毒和慢病毒。通常地，合适的载体包含在至少一种生物中起作用的复制起点、启动子序列、方便的限制性核酸内切酶位点和一种或多种选择标记(例如，wo01/96584；wo01/29058；和美国专利号6,326,193，其内容通过引用以其整体并入本文)。
另外的启动子元件比如增强子，调节转录起始的频率，并且在一些实施方式中可能是有用的。通常，这些位于起始位点上游30-110bp的区域中，尽管最近已显示许多启动子也包含起始位点下游的功能元件。启动子元件之间的间隔通常是柔性的，因此当元件相对于彼此反转或移动时，启动子功能得以保留。在胸苷激酶(tk)启动子中，启动子元件之间的间隔可在活性开始下降之前增加到隔开50bp。取决于启动子，似乎个体元件可以协同或独立地起作用以激活转录。
启动子的一个实例是即时早期巨细胞病毒(cmv)启动子序列。该启动子序列是强的组成型启动子序列，能够驱动与其可操作地连接的任何多核苷酸序列的高水平表达。然而，根据不同的实施方式，也可以使用其他组成型启动子序列，其包括但不限于猿猴病毒40(sv40)早期启动子、小鼠乳腺肿瘤病毒(mmtv)、人免疫缺陷病毒(hiv)长末端重复序列(ltr)启动子、momulv启动子、禽白血病病毒启动子、埃-巴二氏病毒即时早期启动子、劳斯肉瘤病毒启动子(roussarcomaviruspromoter)、延伸因子-1α启动子以及人基因启动子，比如，但不限于肌动蛋白启动子、肌球蛋白启动子、血红蛋白启动子和肌酸激酶启动子。此外，本发明不应限于使用组成型启动子。诱导型启动子也被认为是本发明的一部分。诱导型启动子的使用提供了分子开关，其能够在期望这种表达时开启与其可操作地连接的多核苷酸序列的表达，或者在不期望该表达时关闭该表达。诱导型启动子的实例包括但不限于金属硫蛋白(metallothionine)启动子、糖皮质激素启动子、孕酮启动子和四环素启动子。
为了评估多肽或其部分的表达，待引入细胞中的表达载体还可以包含可选择的标记基因或报告基因或二者，以促进从寻求通过病毒载体被转染或感染的细胞群鉴定和选择表达细胞。在其他方面中，可选择的标记可以携带在单独的dna片段上并用于共转染程序。可选择的标记和报告基因均可以侧接合适的调控序列，以使得能够在宿主细胞中表达。有用的可选择的标记包括例如抗生素抗性基因，比如neo等。
在一些实施方式中，报告基因用于鉴定潜在转染的细胞和评估调控序列的功能。通常，报告基因是在受体生物体或组织中不存在或受体生物体或组织不表达并编码多肽的基因，该多肽的表达通过一些易于检测的性质例如酶活性来显现。在将dna引入受体细胞后的适当时间评估报告基因的表达。合适的报告基因可以包括编码荧光素酶、β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰基转移酶、分泌的碱性磷酸酶的基因，或绿色荧光蛋白基因(例如，ui-tei等人，2000febsletters479：79-82，其通过引用以其整体并入本文)。合适的表达系统是众所周知的，并且可以使用已知技术制备或从商业上获得。通常，显示出报告基因的最高表达水平的具有最小的5’侧翼区域的构建体被鉴定为启动子。这样的启动子区可以与报告基因连接，并用于评估试剂调节启动子驱动的转录的能力。
核酸的引入
在一些实施方式中，本发明包括用于修饰细胞的方法，该方法包括将编码一些或所有嵌合抗原受体(car)的核酸序列引入单核细胞、巨噬细胞或树突细胞中，其中car包括抗原结合结构域、跨膜结构域和细胞内结构域，其中抗原结合结构域能够结合蛋白质聚集体的抗原，并且其中细胞是表达car的单核细胞、巨噬细胞和/或树突细胞。
在一些实施方式中，本发明包括用于修饰细胞的方法，该方法包括将编码嵌合抗原受体(car)的核酸序列(例如，分离的或非自然核酸序列)引入单核细胞、巨噬细胞或树突细胞中，其中分离的核酸序列包括编码抗原结合结构域的核酸序列，编码跨膜结构域的核酸序列和编码细胞内结构域的核酸序列，其中抗原结合结构域能够结合蛋白质聚集体的抗原，并且其中细胞是表达car的单核细胞、巨噬细胞和/或树突细胞。在一些实施方式中，抗原结合结构域、跨膜结构域和细胞内结构域中的一个或多个由单独的核酸分子编码。
在一些实施方式中，本发明包括用于修饰细胞的方法，该方法包括将嵌合抗原受体(car)引入单核细胞、巨噬细胞或树突细胞中，其中car包括抗原结合结构域、跨膜结构域和细胞内结构域，其中抗原结合结构域例如抗体、抗体剂等能够结合患有神经退行性疾病/失调、炎症性疾病/失调、心血管疾病/失调、纤维变性疾病/失调或淀粉样变性病的受试者的组织中的蛋白质聚集体，并且其中细胞是表达car并且具有靶向效应子活性的单核细胞、巨噬细胞或树突细胞。在一些实施方式中，将car引入细胞中包括引入编码car(例如，car的一些组分或全部)的核酸序列。在一些实施方式中，引入核酸序列包括将编码car的dna或mrna电穿孔到细胞中。
将基因比如编码car的基因引入细胞中并表达的方法是本领域已知的。在表达载体的情况下，可以通过本领域中的任何方法将载体容易地引入宿主细胞，例如哺乳动物、细菌、酵母或昆虫细胞中。例如，在一些实施方式中，表达载体可以通过物理、化学或生物学手段转移到宿主细胞中。
用于将多核苷酸引入宿主细胞的物理方法包括磷酸钙沉淀、脂质转染、粒子轰击、显微注射、电穿孔、挤压技术等。用于产生包括载体和/或外源核酸的细胞的方法在本领域是众所周知的。参见例如，sambrook等人，2012，molecularcloning：alaboratorymanual，第1-4卷，coldspringharborpress,ny。可以使用商业上可获得的方法将核酸引入靶细胞，其包括电穿孔(amaxanucleofector-ii(amaxabiosystems,cologne,germany))、(ecm830(btx)(harvardinstruments,boston,mass.)或genepulserii(biorad,denver,colo.)、multiporator(eppendort,hamburggermany)。也可以使用阳离子脂质体介导的转染、使用脂质转染、使用聚合物封装、使用肽介导的转染或使用生物弹颗粒递送系统，比如“基因枪”将核酸引入细胞中(参见例如nishikawa等人，humgenether.，12(8):861-70(2001))。
在一些实施方式中，用于将目标多核苷酸引入宿主细胞中的生物学方法可以是或包括使用dna和rna载体。rna载体包括具有rna启动子和/或用于产生rna转录体的其他相关结构域的载体。病毒载体，并且特别是逆转录病毒载体，已成为将基因插入哺乳动物例如人细胞中的最广泛使用的方法。其他病毒载体可以衍生自慢病毒、痘病毒、单纯疱疹病毒、腺病毒(例如ad5f35)和腺伴随病毒等。参见例如美国专利号5,350,674和5,585,362。
在一些实施方式中，本发明提供了修饰细胞的方法，该方法包括将编码嵌合抗原受体(car)的核酸引入单核细胞、巨噬细胞和/或树突细胞中，其中car包括抗原结合结构域、跨膜结构域和细胞内结构域，其中抗原结合结构域是或包括能够结合蛋白质聚集体的抗原的抗体剂。在一些实施方式中，将核酸序列引入细胞中包括腺病毒转导。在一些实施方式中，腺病毒转导包括使用ad5f35腺病毒载体。在一些实施方式中，ad5f35腺病毒载体为辅助依赖性的ad5f35腺病毒载体。在一些实施方式中，ad5f35腺病毒载体是整合的cd46-靶向的辅助依赖性腺病毒hdad5/35++载体系统。
用于将多核苷酸引入宿主细胞中的化学手段包括胶体分散系统，比如大分子复合物、纳米胶囊、微球、珠和基于脂质的系统，包括水包油乳液、胶束、混合胶束和脂质体。在体外和体内用作递送运载体的示例性胶体系统是脂质体(例如，人工膜囊泡)。
在一些实施方式中，在使用非病毒递送系统的情况下，示例性递送运载体可以是或包括脂质体。考虑使用脂质制剂将核酸引入宿主细胞中(体外、离体或体内)。另一方面，核酸可以与脂质缔合。在一些实施方式中，与脂质缔合的核酸可以被封装在脂质体的水性内部中、散布在脂质体的脂质双层中、经由与脂质体和寡核苷酸均缔合的连接分子与脂质体附连、截留在脂质体中、与脂质体复合、分散在含有脂质的溶液中、与脂质混合、与脂质组合、作为悬浮液包含脂质中、与胶束一起包含或复合或以其他方式与脂质缔合。与组合物缔合的脂质、脂质/dna或脂质/表达载体不限于溶液中的任何具体结构。例如，它们可以以双层结构、作为胶束或以“塌陷”结构存在。它们也可以简单地散布在溶液中，可能形成大小或形状不均匀的聚集体。脂质是脂肪物质，该脂肪物质可以是天然存在的或合成的脂质。例如，脂质包括天然存在于细胞质中的脂肪滴以及包含长链脂族烃及其衍生物的一类化合物，比如脂肪酸类、醇类、胺类、氨基醇类和醛类。
可以从商业来源获得适合使用的脂质。例如，二肉豆蔻基磷脂酰胆碱(“dmpc”)可以获得自sigma,st.louis,mo；磷酸二鲸蜡酯(“dcp”)可以获得自k&klaboratories(plainview,ny)；胆固醇(“choi”)可以获得自calbiochem-behring；二肉豆蔻基磷脂酰甘油(“dmpg”)和其他脂质可以得自avantipolarlipids,inc.(birmingham,al.)。脂质在氯仿或氯仿/甲醇中的储备溶液可在-20℃下存储。氯仿用作唯一的溶剂，因为它比甲醇更容易蒸发。“脂质体”是通用术语，其涵盖通过产生封闭的脂质双层或聚集体而形成的各种单一和多层脂质运载体。脂质体可以被表征为具有带有磷脂双层膜和内部水介质的囊泡结构。多层脂质体具有被水介质分开的多个脂质层。当磷脂悬浮在过量的水溶液中时，它们会自发形成。脂质组分在形成闭合结构之前经历自我重排，并在脂质双层之间截留水和溶解的溶质(ghosh等人，1991glycobiology5：505-10)。然而，还涵盖了在溶液中具有与正常囊泡结构不同的结构的组合物。例如，脂质可以呈现胶束结构或仅作为脂质分子的不均匀聚集体存在。还考虑了脂质转染胺(lipofectamine)-核酸复合物。
不管用于将外源核酸引入宿主细胞中的方法还是以其他方式使细胞暴露于本文所述的分子的方法如何，为了确认在宿主细胞中核酸的存在，可以进行多种测定法。这样的测定法包括，例如，本领域技术人员众所周知的“分子生物学”测定法，比如dna和rna印迹法、rt-pcr和pcr；“生物化学”测定法，例如通过免疫学手段(elisa和蛋白质印迹法)或通过本文描述的测定法来检测特定肽的存在或不存在，以鉴定落入本发明范围内的试剂。
在一些实施方式中，通过选自转导细胞群、转染细胞群和电穿孔细胞群的方法引入一个或多个核酸序列。在一些实施方式中，细胞群包括本文描述的一种或多种核酸序列。在一些实施方式中，用一种或多种核酸酶(例如，cas9或cas12a)转染、转导和/或电穿孔一种或多种核酸。
在一些实施方式中，引入细胞中的核酸是rna或包括rna。在一些实施方式中，rna是包括体外转录的rna或合成rna的mrna。在一些实施方式中，使用聚合酶链反应(pcr)产生的模板通过体外转录产生rna。来自任何来源的目标dna可以通过pcr直接转化为用于使用适当的引物和rna聚合酶的体外mrna合成的模板。在一些实施方式中，dna的来源可以是例如基因组dna、质粒dna、噬菌体dna、cdna、合成dna序列或任何其他合适来源的dna。在一些实施方式中，用于体外转录的期望模板是car或包含car。
在一些实施方式中，pcr可用于产生用于体外转录mrna——然后将其引入细胞中——的模板。进行pcr的方法在本领域是众所周知的。用于pcr的引物被设计为具有与要用作pcr模板的dna区域基本上互补的区域。如本文所使用的，“基本上互补”是指这样的核苷酸序列，其中引物序列中的大部分或全部碱基是互补的，或一个或多个碱基是非互补的或错配的。基本上互补的序列能够在用于pcr的退火条件下与期望的dna靶标退火或杂交。可以将引物设计成与dna模板的任何部分基本上互补。例如，引物可以被设计为扩增在细胞中正常转录的基因部分(开放阅读框)，包括5’和3’utr。引物也可以被设计成扩增编码特定目标结构域的基因的一部分。在一个实施方式中，引物被设计为扩增人cdna的编码区，包括5’和3’utr的全部或部分。可用于pcr的引物通过本领域众所周知的合成方法产生。“正向引物”是包含与待扩增的dna序列上游的dna模板上的核苷酸基本上互补的核苷酸区域的引物。“上游”在本文中用于指相对于编码链待扩增的dna序列的5’位。“反向引物”是包含与待扩增的dna序列下游的双链dna模板基本上互补的核苷酸区域的引物。“下游”在本文中用于指相对于编码链待扩增的dna序列的3’位。
还可以使用具有促进rna的稳定性和/或翻译效率的能力的化学结构。rna优选地具有5’和3’utr。在一个实施方式中，5’utr的长度在0和3000个核苷酸之间。可以通过不同的方法改变待添加到编码区的5’和3’utr序列的长度，包括但不限于设计退火至utr的不同区域的pcr引物。使用此方法，本领域普通技术人员可以修改实现转染转录的rna之后最佳翻译效率所需要的5'和3'utr长度。
5’和3’utr可以是目标基因的天然存在的内源5’和3’utr。可选地，可以通过将utr序列并入正向和反向引物中或通过模板的任何其他修饰来添加对目标基因非内源性的utr序列。使用对目标基因非内源性的utr序列可用于修改rna的稳定性和/或翻译效率。例如，已知3’utr序列中富含au的元件可降低mrna的稳定性。因此，可以基于本领域众所周知的utr的特性来选择或设计3’utr以增加转录的rna的稳定性。
在一些实施方式中，5’utr可以包含内源基因的kozak序列。可选地，当如上所述通过pcr正在添加对目标基因非内源性的5’utr时，可以通过添加5’utr序列重新设计共有的kozak序列。kozak序列可以增加一些rna转录体的翻译效率，但似乎并非所有rna能够实现有效翻译所必需的。许多mrna的kozak序列的需求是本领域已知的。在其他实施方式中，5’utr可以源自rna病毒，该病毒的rna基因组在细胞中是稳定的。在其他实施方式中，各种核苷酸类似物可用于3’或5’utr以阻止mrna的核酸外切酶降解。
为了能够实现无需基因克隆即可从dna模板合成rna，应将转录启动子附连到待转录序列上游的dna模板。当将充当rna聚合酶启动子的序列添加到正向引物的5’端时，rna聚合酶启动子将被并入待转录的开放阅读框上游的pcr产物中。在一个实施方式中，启动子是t7聚合酶启动子，如本文其他地方所描述的。其他有用的启动子包括但不限于t3和sp6rna聚合酶启动子。t7、t3和sp6启动子的共有核苷酸序列在本领域是已知的。
在一些实施方式中，mrna具有在5’端上的帽和3’聚(a)尾二者，其决定了细胞中的核糖体结合、翻译的起始和mrna的稳定性。在环状dna模板例如质粒dna上，rna聚合酶可产生长的多联体产物(concatamericproduct)，该产物不适合在真核细胞中表达。在3’utr端线性化的质粒dna的转录产生正常大小的mrna，即使在转录后被多聚腺苷酸化，其也无法有效地进行真核转染。
在线性dna模板上，噬菌体t7rna聚合酶可以将转录体的3’端延伸超过模板的最后一个碱基(schenbornandmierendorf,nucacidsres.,13:6223-36(1985)；nachevaandberzal-herranz,eur.j.biochem.,270:1485-65(2003))。
将聚a/t一段序列整合到dna模板中的常规方法是分子克隆。然而，整合到质粒dna中的聚a/t序列可以导致质粒不稳定，这就是为什么从细菌细胞获得的质粒dna模板经常被缺失和其他畸变高度污染的原因。这使得克隆程序不仅费时费力，而且常常是不可靠的。这就是为什么允许构建具有聚a/t3’一段序列的dna模板而无需克隆的方法是高度期望的原因。
转录dna模板的聚a/t区段可以在pcr期间通过使用含有聚t尾，比如100t尾(大小可以为50-5000t)的反向引物产生，或者在pcr之后通过任何其他方法产生，包括不限于dna连接或体外重组。聚(a)尾还可以为rna提供稳定性并减少其降解。通常地，聚(a)尾的长度与转录的rna的稳定性正相关。在一个实施方式中，聚(a)尾在100和5000个腺苷之间。
在体外转录后，可以使用聚(a)聚合酶，比如大肠杆菌聚a聚合酶(e-pap)进一步延长rna的聚(a)尾。在一个实施方式中，将聚(a)尾的长度从100个核苷酸增加到300至400个核苷酸之间，导致rna翻译效率提高约两倍。另外地，将不同的化学基团附连到3’端可以增加mrna的稳定性。这样的附连可以包含修饰的/人工的核苷酸、适配体和其他化合物。例如，可以使用聚(a)聚合酶将atp类似物并入聚(a)尾。atp类似物可以进一步增加rna的稳定性。
5’帽也可以为rna分子提供稳定性。在优选的实施方式中，通过本文公开的方法产生的rna包括5’帽。使用本领域已知的和本文描述的技术提供5’帽(cougot等人，trendsinbiochem.sci.,29:436-444(2001)；stepinski等人，rna,7:1468-95(2001)；elango等人，biochim.biophys.res.commun.,330:958-966(2005))。
在一些实施方式中，通过本文公开的方法产生的rna还可以包含内部核糖体进入位点(ires)序列。ires序列可以是任何病毒的、染色体的或人工设计的序列，该序列启动帽-独立性核糖体与mrna结合并促进翻译的启动。可以包括任何适合细胞电穿孔的溶质，其可以包含促进细胞通透性和活力的因子，比如糖、肽、脂质、蛋白质、抗氧化剂和表面活性剂。
一些体外转录的rna(ivt-rna)载体在文献中是已知的，它们以标准化的方式用作体外转录的模板，并且已经以产生稳定化的rna转录体的方式进行基因修饰。当前本领域中使用的方案基于具有以下结构的质粒载体：能够实现rna转录的5’rna聚合酶启动子，随后是侧翼带有3’和/或5’非翻译区(utr)的目标基因，以及含有50-70a核苷酸的3'聚腺嘌呤基盒。在体外转录之前，通过ii型限制酶(识别序列对应于切割位点)在聚腺嘌呤基盒的下游将环状质粒线性化。因此，聚腺嘌呤基盒对应于转录体中的后面的聚腺苷酸序列。此程序的结果是，在线性化后，一些核苷酸保留为酶切割位点的一部分，并延伸或掩盖在3’端的聚(a)序列。尚不清楚此非生理学突出端(overhang)是否影响从这样的构建体细胞内产生的蛋白质的量。在一些实施方式中，通过电穿孔将rna构建体递送到细胞中。参见例如，如us2004/0014645、us2005/0052630a1、us2005/0070841a1、us2004/0059285a1、us2004/0092907a1中所教导的，将核酸构建体电穿孔到哺乳动物细胞中的制剂和方法。在相关研究文献以及该领域中的许多专利和申请中，包括任何已知细胞类型的电穿孔所需的电场强度的各种参数通常是已知的。参见例如美国专利号6,678,556、美国专利号7,171,264和美国专利号7,173,116。用于电穿孔的治疗应用的装置是商业上可得到的，例如，medpulsertmdna电穿孔治疗系统(inovio/genetronics，sandiego，calif.)，并且在专利比如美国专利号6,567,694；美国专利号6,516,223、美国专利号5,993,434、美国专利号6,181,964、美国专利号6,241,701和美国专利号6,233,482中描述；电穿孔也可用于在体外转染细胞，如在例如us20070128708a1中所描述的。电穿孔也可用于在体外将核酸递送到细胞中。因此，利用本领域技术人员已知的许多可用装置和电穿孔系统中的任一种，将包括核酸的表达构建体电穿孔介导地施用到细胞中提供了令人激动的将目标rna递送至靶标细胞的新手段。
细胞的来源
在一些实施方式中，吞噬细胞用于本文所述的组合物和方法中。在一些实施方式中，吞噬细胞比如单核细胞、巨噬细胞和/或树突细胞的来源获得自受试者。受试者的非限制性实例包括人、狗、猫、小鼠、大鼠及其转基因物种。优选地，受试者是人。在一些实施方式中，细胞可以获得自许多来源，包括外周血单核细胞、骨髓、淋巴结组织、脾组织、脐带和诱导多能干细胞。在某些实施方式中，可以使用本领域可利用的任何数量的单核细胞、巨噬细胞、树突细胞或祖细胞系。在某些实施方式中，可以使用技术人员已知的多种技术，比如ficoll分离，从受试者收集的单位血液中获得细胞。在一些实施方式中，通过单采血液分离术或白细胞分离术从个体的循环血液中获得细胞。单采血液分离术产物通常包含淋巴细胞，该淋巴细胞包括t细胞、单核细胞、粒细胞、b细胞、其他成核白细胞、红细胞和血小板。可以洗涤通过单采血液分离术收集的细胞，以除去血浆部分，并将细胞置于适当的缓冲液或培养基中，比如磷酸盐缓冲盐水(pbs)，或洗涤液中缺少钙，并且可能缺少镁，或者可能缺少许多(如果不是全部)二价阳离子，用于后续处理步骤。在洗涤后，可将细胞重悬浮于多种生物相容的缓冲液中，诸如例如无ca、无mg的pbs中。可选地，可以去除单采血液分离术样品的不期望的成分，并将细胞直接重悬浮在培养基中。
在一些实施方式中，可以使用单核细胞、巨噬细胞或树突细胞的前体(例如干细胞)。非限制性实例包括造血干细胞、常见髓样祖细胞、成肌细胞、单核细胞、幼单核细胞和中间体。在另一个实施方式中，诱导的多能干细胞可以用作产生单核细胞、巨噬细胞和/或树突细胞的来源。
如果使用髓样前体，比如造血干细胞，则它们可以离体分化为单核细胞、巨噬细胞和/或树突细胞，或所述途径的前体。另外，前体(比如，但不限于造血干细胞)可以用作治疗细胞，使得在体内发生髓样分化。细胞可以是自体的，或来源于同种异体或通用供体。在一些实施方式中，可以工程化髓样祖细胞或造血干细胞，使得car的表达处于细胞类型特异性启动子的控制下，该启动子比如已知的髓样、巨噬细胞、单核细胞、树突细胞、小胶质细胞、m1特异性或m2特异性启动子。
在一些实施方式中，在输注本领域技术人员已知的细胞因子之前，单核细胞或前体可以离体分化成小胶质细胞。在一些实施方式中，单核细胞分化成小胶质细胞可以改善中枢神经系统的活性。
在一些实施方式中，诱导多能干细胞可源自正常的人组织，比如外周血、成纤维细胞、皮肤、角蛋白细胞、肾上皮细胞或用基因oct4、sox2、klf4和c-myc重编程的其他细胞。在一些实施方式中，自体、同种异体或通用供体ipsc可以朝向髓系(单核细胞、巨噬细胞、树突细胞和/或其前体)分化。
在一些实施方式中，通过裂解红细胞并消耗淋巴细胞和红细胞，例如通过percolltm梯度离心，从外周血分离细胞。可选地，可以从脐带分离细胞。无论如何，都可以通过阳性或阴性选择技术进一步分离单核细胞、巨噬细胞和/或树突细胞的特定亚群。
如此分离的单核细胞可以被耗尽表达某些抗原的细胞，抗原包括但不限于cd34、cd3、cd4、cd8、cd14、cd19或cd20。这些细胞的耗尽可以使用分离的抗体、包括抗体的生物样品比如腹水，结合至物理支撑物的抗体以及细胞结合的抗体来完成。
通过阴性选择富集单核细胞、巨噬细胞和/或树突细胞群可以使用针对阴性选择细胞特有的表面标记的抗体组合来完成。优选的方法是通过阴性磁性免疫粘附或流式细胞术进行细胞分选和/或选择，该方法使用针对存在于阴性选择的细胞上的细胞表面标记的单克隆抗体混合物(cocktail)。例如，可以通过使用单克隆抗体混合物来实现通过阴性选择富集单核细胞、巨噬细胞和/或树突细胞的细胞群，该单克隆抗体混合物通常包括针对cd34、cd3、cd4、cd8、cd14、cd19或cd20的抗体。
在通过阳性或阴性选择分离期望的细胞群期间，细胞和表面(例如，颗粒比如珠)的浓度可以变化。在某些实施方式中，可能期望的是显著降低珠和细胞混合在一起的体积(即，增加细胞的浓度)，以确保细胞和珠的最大接触。例如，在一个实施方式中，使用20亿个细胞/ml的浓度。在一个实施方式中，使用10亿个细胞/ml的浓度。在另一个实施方式中，使用大于1亿个细胞/ml。在另一个实施方式中，使用10、15、20、25、30、35、40、45或50×106个细胞/ml的细胞浓度。在又另一个实施方式中，使用75、80、85、90、95或100×106个细胞/ml的细胞浓度。在进一步的实施方式中，可以使用1.25或1.5亿个细胞/ml的浓度。高浓度细胞的使用可导致增加的细胞产量、细胞激活和细胞扩展。
在一些实施方式中，细胞群包括本发明的单核细胞、巨噬细胞或树突细胞。细胞群的实例包括但不限于外周血单核细胞、脐带血细胞、纯化的单核细胞群、纯化的巨噬细胞群或纯化的树突细胞群和细胞系。在一些实施方式中，外周血单核细胞包括单核细胞群、巨噬细胞群或树突细胞群。在一些实施方式中，纯化的细胞包括单核细胞群、巨噬细胞群或树突细胞群。
在一些实施方式中，细胞可具有上调的m1标记和/或下调的m2标记。例如，在一些实施方式中，至少一种m1标记比如hladr、cd86、cd80和pdl1在吞噬细胞中是上调的。在另一个实例中，在一些实施方式中，至少一种m2标记比如cd206、cd163在吞噬细胞中是下调的。在一个实施方式中，细胞具有至少一种上调的m1标记和至少一种下调的m2标记。
在一些实施方式中，吞噬细胞中的靶向效应子活性通过抑制cd47或sirpα活性而增强。通过用抗cd47或抗sirpα抗体处理吞噬细胞可以抑制cd47和/或sirpα的活性。可选地，可以通过本领域技术人员已知的任何方法抑制cd47或sirpα的活性。
细胞的扩展
在一些实施方式中，培养包括单核细胞、巨噬细胞或树突细胞的细胞或细胞群以进行扩展。在一些实施方式中，培养包括祖细胞的细胞或细胞群以分化和扩展单核细胞、巨噬细胞或树突细胞。在一些实施方式中，本发明包括扩展包括如本文描述的嵌合抗原受体的单核细胞群、巨噬细胞群或树突细胞群。
如本文公开的数据所证明的，通过本文公开的方法扩展细胞可以扩大约10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍、200倍、300倍、400倍、500倍、600倍、700倍、800倍、900倍、1000倍、2000倍、3000倍、4000倍、5000倍、6000倍、7000倍、8000倍、9000倍、10,000倍、100,000倍、1,000,000倍、10,000,000倍或更多，以及在它们之间的任何和所有全部或部分整数。在一个实施方式中，细胞在约20倍至约50倍的范围内扩展。
在培养后，可将细胞在培养装置的细胞培养基中温育一段时间，或直至细胞达到汇合或进行最佳传代的高细胞密度，然后将细胞传递至另一个培养装置。在一些实施方式中，培养装置可以是通常用于体外培养细胞的任何培养装置。优选地，在将细胞传递到另一个培养装置之前，汇合水平为70％或更高。更优选地，汇合度为90％或更高。时间段可以是适合于体外细胞培养的任何时间。可以在细胞培养期间的任何时间更换培养基。优选地，大约每2-3天更换一次培养基。然后从培养装置中收获细胞，随后可以立即使用细胞或将其储存，用于以后使用。
如本文描述的培养步骤(与试剂接触，如本文描述的)可以非常短，例如小于24小时比如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22或23小时。本文进一步描述的培养步骤(与试剂接触，如本文描述的)可以更长，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或更多天。
在一些实施方式中，可将细胞培养几个小时(约3小时)至约14天或介于两者之间的任何小时整数值。适用于细胞培养的条件包括可包含增殖和生存力所必需的因子的适当培养基(例如，巨噬细胞完全培养基、dmem/f12、dmem/f12-10(invitrogen))，所述因子包括血清(例如胎牛或人血清)、l-谷氨酰胺、胰岛素、m-csf、gm-csf、il-10、il-12、il-15、tgf-β和tnf-α，或技术人员已知的用于细胞生长的任何其他添加剂。用于细胞生长的其他添加剂包括但不限于表面活性剂、人血浆蛋白粉和还原剂，比如n-乙酰基-半胱氨酸和2-巯基乙醇。培养基可以包括rpmi1640、aim-v、dmem、mem、α-mem、f-12、x-vivo15和x-vivo20，optimizer，具有添加的氨基酸、丙酮酸钠和维生素，不含血清的或补充适量血清(或血浆)或限定的激素组，和/或足以使细胞生长和扩展的一定量的细胞因子(一种或多种)。抗生素，例如青霉素和链霉素，仅包括在实验培养物中，而不包括在要输注入受试者的细胞培养物中。将靶细胞维持在支持生长所必需的条件下，例如，合适的温度(例如，37℃)和气氛(例如，空气加5％co2)。
用于培养细胞的培养基可以包括可以激活细胞的试剂。例如，本领域已知的激活单核细胞、巨噬细胞或树突细胞的试剂包括在培养基中。
疗法
在一些实施方式中，本文描述的修饰细胞可以包括在用于治疗受试者的组合物中。在一个方面中，组合物包括包含本文描述的嵌合抗原受体的修饰细胞。在一些实施方式中，提供的组合物可以包括药物组合物，并且进一步包括药学上可接受的载体。在一些实施方式中，可以施用治疗有效量的包括修饰细胞的药物组合物。
在一个方面中，本发明提供了治疗受试者中与神经退行性疾病/失调、炎症性疾病/失调、心血管疾病/失调、纤维变性疾病/失调或淀粉样变性病相关的疾病/失调或病症的方法，该方法包括将治疗有效量的包括如本文描述的修饰细胞的药物组合物施用至受试者。在另一方面中，本发明提供了刺激对受试者中患病的/失调的细胞或组织的靶标的免疫应答的方法，包括将治疗有效量的包括如本文描述的修饰细胞的药物组合物施用至受试者。在仍另一方面中，本发明包括提供的如本文描述的修饰细胞在制造用于治疗在需要其的受试者中的免疫应答的药物的用途。在仍另一方面中，本发明包括提供的如本文描述的修饰细胞在制造用于治疗在需要其的受试者中的神经退行性疾病/失调、炎症性疾病/失调、心血管疾病/失调、纤维变性疾病/失调或淀粉样变性病的药物的用途。
在一些实施方式中，如本文描述的产生的提供的修饰细胞具有靶向效应子活性。在一些实施方式中，提供的修饰细胞具有针对靶细胞上的抗原的靶向效应子活性，比如通过特异性结合car的抗原结合结构域。在一些实施方式中，靶向效应子活性包括但不限于吞噬作用、靶向的细胞毒性、抗原呈递和细胞因子分泌。
在一些实施方式中，本文描述的修饰细胞具有将试剂例如生物剂或治疗剂递送至靶标的能力。在一些实施方式中，细胞可以被修饰或工程化以将试剂递送至靶标，其中试剂选自核酸、抗生素、消炎剂、抗体或其抗体片段、生长因子、细胞因子、酶、蛋白质、肽、融合蛋白、合成分子、有机分子、碳水化合物等、脂质、激素、微粒体、其衍生物或变体及其任何组合。作为非限制性实例，用靶向抗原的car修饰的巨噬细胞能够分泌试剂比如细胞因子或抗体以辅助巨噬细胞功能。抗体，比如抗cd47/抗sirpαmab，也可以辅助巨噬细胞功能。在又另一个实例中，用靶向抗原(比如蛋白质聚集体中的蛋白质比如α-突触核蛋白或β-淀粉样蛋白)的car修饰的巨噬细胞被工程化以编码通过下调抑制基因(即sirpα)辅助巨噬细胞功能的sirna。另一个实例，car巨噬细胞被工程化以表达辅助巨噬细胞功能的显性失活(或以其他方式突变的)形式的受体或酶。
在一些实施方式中，巨噬细胞用多种基因修饰，其中至少一种基因包括car和至少一种其他基因包括增强car巨噬细胞功能的遗传元件。在一些实施方式中，巨噬细胞用多种基因修饰，其中至少一种基因包括car和至少一种其他基因辅助或重编程其他免疫细胞(比如t细胞)的功能。在一些实施方式中，巨噬细胞用多种基因修饰，其中至少一种基因包括car和至少一种其他基因包括增强治疗效力的遗传元件。可以通过各种遗传元件增强治疗效力，包括但不限于通过阻断检查点受体起作用的蛋白质、具有免疫刺激活性的蛋白质、具有免疫抑制/抗炎活性的蛋白质以及使蛋白质斑块不稳定的蛋白质。
进一步，在一些实施方式中，可以将修饰细胞施用至动物，优选地哺乳动物，甚至更优选地人，以治疗神经退行性疾病/失调、炎症性疾病/失调、心血管疾病/失调、纤维变性疾病、淀粉样变性病或本领域已知的与蛋白质错误折叠或蛋白质聚集相关的任何疾病/失调。在一些实施方式中，神经退行性疾病/失调包括tau蛋白病、α-突触核蛋白病、早老性痴呆、老年性痴呆、阿尔茨海默氏病、与第17位染色体相关的帕金森症(ftdp-17)、进行性核上性麻痹(psp)、皮克氏病、原发性进行性失语症、额颞叶痴呆症、皮层基底节痴呆症、帕金森氏病、伴有痴呆症的帕金森氏病、路易体痴呆症、唐氏综合征、多系统萎缩症、肌萎缩性脊髓侧索硬化症(als)、哈-斯二氏综合征、多聚谷氨酰胺病、三核苷酸重复病和朊病毒病。另外，在一些实施方式中，本发明的细胞可用于治疗任何病症，其中期望减少的或以其他方式抑制的免疫应答，特别是细胞介导的免疫应答以治疗或缓解疾病/失调。在一个方面中，本发明包括在受试者中治疗病症，比如神经退行性疾病/失调、炎症性疾病/失调、心血管疾病/失调、纤维变性疾病、淀粉样变性病或本领域已知的与蛋白质错误折叠和/或蛋白质聚集相关的任何疾病/失调，包括将治疗有效量的包括本文描述的细胞群的药物组合物施用至受试者。另外，在一些实施方式中，本发明的细胞可以在治疗之前作为预处理或调理(conditioning)来施用。
在一些实施方式中，提供的细胞还可以用于治疗受试者的组织中的炎症性疾病/失调，该炎症性疾病/失调包括蛋白质聚集体中的蛋白质。这种炎症性疾病/失调的实例包括但不限于纤维变性疾病。
在一些实施方式中，本发明的细胞可以以合适的临床前和临床实验和试验中确定的剂量和途径以及时间施用。细胞组合物可以以在这些范围内的剂量多次施用。如本领域技术人员所确定的，本发明细胞的施用可以与可用于治疗期望的疾病/失调或病症的其他方法组合。
根据各种实施方式，相对于接受治疗的受试者，待施用的本发明的细胞可以是自体的、同种异体的、异种的或通用的供体。
本发明的细胞的施用可以以本领域技术人员已知的任何方便的适合应用的方式进行。本发明的细胞可以通过雾化吸入、注射、吞咽、输液、植入或移植而施用至受试者。本文描述的组合物可经动脉、皮下、皮内、瘤内、结节内、髓内、肌内、通过静脉内(i.v.)注射、腹膜内或颅内施用至患者。在一些实施方式中，可以将本发明的细胞直接注射到受试者的炎症部位、受试者的局部疾病部位、淋巴结、器官、肿瘤等。
药物组合物
在一些实施方式中，本发明的药物组合物可以包括如本文描述的细胞与一种或多种药学上或生理学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂组合。这样的组合物可以包括缓冲液比如中性缓冲盐水、磷酸盐缓冲盐水等；碳水化合物，比如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露醇；蛋白质；多肽或氨基酸比如甘氨酸；抗氧化剂；螯合剂比如edta或谷胱甘肽；佐剂(例如，氢氧化铝)；和防腐剂。本发明的组合物优选地配制用于静脉内施用。
本发明的药物组合物可以以适合于待治疗(或预防)的疾病/失调的方式施用。施用的量和频率将由比如患者的病症以及患者疾病/失调的类型和严重程度等因素决定，但是可以通过临床试验确定合适的剂量。
当指示“免疫学有效量”、“抗免疫应答有效量”、“免疫应答抑制有效量”或“治疗量”时，可以由医师考虑患者(受试者)的年龄、体重、免疫应答和病症的个体差异来确定待施用的本发明的组合物的精确量。通常可以指出，包括本文描述的细胞的药物组合物可以以104至109个细胞/kg体重，优选地105至106个细胞/kg体重的剂量——包括那些范围内的所有整数值——施用。本文描述的细胞组合物也可以以这些剂量多次施用。可以通过使用免疫疗法中通常已知的输注技术来施用细胞(参见例如rosenberg等人，neweng.j.ofmed.319:1676,1988)。通过监测患者的疾病/失调的体征并相应地调整治疗，医学领域的技术人员可以容易地确定针对特定患者的最佳剂量和治疗方案。
在某些实施方式中，可能期望的是将单核细胞、巨噬细胞或树突细胞施用至受试者，并且接着随后抽血(或进行单采血液分离术)，根据本发明激活由此得到的单核细胞、巨噬细胞或树突细胞，并将这些激活的细胞再输注患者。此过程每几周可以执行多次。在某些实施方式中，可以从10ml至400ml的血液抽取物中激活细胞。在某些实施方式中，从20ml、30ml、40ml、50ml、60ml、70ml、80ml、90ml或100ml的血液抽取物激活细胞。不受理论的束缚，使用这种多次抽血/多次再输注的方案可以选出某些细胞群。
在本发明的某些实施方式中，使用本文所述的方法或将细胞扩展至治疗水平的本领域已知的其他方法修饰细胞，将其与许多相关治疗方式(例如，在此之前、同时或在此之后)联合施用至患者。在另外的实施方式中，可以在手术之前或之后施用细胞。
待施用至受试者的上述治疗的剂量将随所治疗的病症的确切性质和治疗受体而变化。可以根据本领域接受的实践来进行人施用剂量的缩放。对于成年患者，例如，campath抗体的剂量通常将在1至约100mg的范围内，通常每天施用，持续1至30天的时期。优选的每日剂量是每天1至10mg，但是在一些情况下可以使用高至40mg/天的较大剂量(在美国专利号6,120,766中描述)。
应当理解，可用于本发明的方法和组合物不限于实施例中列出的具体制剂。提出以下实施例以向本领域普通技术人员提供如何制造和使用本发明的细胞、扩展和培养方法以及治疗方法的完整的公开内容和描述，并且不意图限制本发明人视为其发明的范围。
除非另有说明，否则本发明的实践采用分子生物学(包括重组技术)、微生物学、细胞生物学、生物化学和免疫学的常规技术，它们在技术人员的能力范围内。此类技术在文献中充分地解释，比如“molecularcloning:alaboratorymanual”，第四版(sambrook，2012)；“oligonucleotidesynthesis”(gait，1984)；“cultureofanimalcells”(freshney，2010)；“methodsinenzymology”，“handbookofexperimentalimmunology”(weir，1997)；“genetransfervectorsformammaliancells”(miller和calos，1987)；“shortprotocolsinmolecularbiology”(ausubel，2002)；“polymerasechainreaction:principles,applicationsandtroubleshooting”，(babar，2011)；“currentprotocolsinimmunology”(coligan，2002)。这些技术适用于本发明的多核苷酸和多肽的产生，并且因此可以在进行和实施本发明时考虑。将在下列部分中讨论具体实施方式的特别有用的技术。
实验实施例
通过参考下列实验实施例进一步详细地描述本发明。除非另外规定，这些实施例仅出于说明目的提供，并且不意图是限制性的。因而，本发明决不应当解释为限制于下列实施例，而是应当解释为涵盖由于本文提供的教导而变得明显的任何和所有的变型。
在没有进一步描述的情况下，认为使用在先的描述和下列说明性实施例，本领域普通技术人员可以制造和利用本发明的化合物/细胞，并且实践要求保护的方法。因此，下列实施例具体地指出本发明的优选实施方式，并且不解释为以任何方式限制本公开内容的其余部分。
除非另有说明，否则以下实验中使用的材料和方法如下所描述：
细胞培养物：在5％co2中于37℃下在补充有10％胎牛血清和青霉素/链霉素的rpmi1640中培养细胞系。通过在培养基中用1ng/ml佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯培养细胞48小时，分化并诱导thp-1单核细胞aml细胞系。
原代人巨噬细胞：使用miltenyicd14microbeads(miltenyi，130-050-201)从正常供体单采血液分离术产品中纯化原代人单核细胞。在macsgmp细胞分化袋(miltenyi，170-076-400)中，在补充有5％人ab血清的x-vivo培养基或补充有10％胎牛血清，以及青霉素/链霉素、glutamax和10ng/ml重组人gm-csf或m-csf(peprotech，300-03)的rpmi1640中培养单核细胞持续7天。在第5-10天收获巨噬细胞，并且冷冻保存在fbs+10％dmso中，等待后续使用。
吞噬测定：在体外吞噬测定中使用之前，用1ng/ml佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯将wt或car巨噬细胞红色荧光(mrfp+)thp1亚系分化48小时。
定时显微镜：使用evosfl自动细胞成像系统或包括莱卡共聚焦激光扫描显微镜(leicatcssp8)的其他数字成像荧光显微镜对car介导的吞噬作用进行荧光定时视频显微镜分析。每1-2分钟捕获一次图像，持续6-24个小时。使用fiji成像软件和hcsstudio2.0细胞分析软件(thermofisher)进行图像分析。
慢病毒产生和转染：通过geneart(lifetechnologies)从头合成嵌合抗原受体构建体，并如前所述克隆到慢病毒载体中。如前所述，使用hek293t细胞产生浓缩的慢病毒。在一些情况下，将vpx和辅助质粒引入慢病毒包装过程中以增强慢病毒在髓样细胞中的转导效率。
dna电穿孔：在其他情况下，将car克隆到不同长度的质粒(包括最小长度的质粒)中，并通过电穿孔直接引入细胞中，其包括但不限于用lonzanucleofector进行核转染。
腺病毒产生和转染：按照标准分子生物学程序，产生并滴定编码gfp、car或在cmv启动子下无转基因的ad5f35嵌合腺病毒载体。以不同感染复数转导原代人巨噬细胞，并使用evosfl自动细胞成像系统对gfp表达和活力进行连续成像。使用his标记的抗原和抗his-apc二抗(r&dbiosystemsclonead1.1.10)通过表面car表达的facs分析评估car表达。
流式细胞术：在bdlsrfortessa上进行facs。用生物素化蛋白l(genscriptm00097)和链霉亲和素apc(biolegend，#405207)或his标记的抗原和抗his-apc二抗(r&dbiosystemsclonead1.1.10)检测表面car表达。所有流式结果均对活的(live/deadaquafixabledeadcellstain,lifetechnologiesl34957)单细胞门控。
rna电穿孔：使用标准分子生物学技术，在t7启动子的控制下将car构建体克隆到体外转录质粒中。carmrna使用mmessagemmachinet7ultra体外转录试剂盒(thermofisher)体外转录，使用rneasyrna纯化试剂盒(qiagen)纯化，并使用btxecm850电穿孔仪(btxharvardapparatus)电穿孔到人巨噬细胞中。使用facs分析在电穿孔后的不同时间点测定car表达。
抗淀粉样蛋白car巨噬细胞的产生：使用单克隆抗体neod001(称为构建体4001)开发了抗淀粉样蛋白car。使用含有mabneod001car构建体的慢病毒载体转导急性髓样白血病细胞系thp-1。通过在37℃下在体积2ml的培养基(补充有10％fbs、1％抗生素、1％l-谷氨酰胺、1％hepes的rpmi)中温育72小时，用携带4001car构建体的慢病毒以5:1(每1个细胞5个病毒颗粒)的感染复数(moi)转导100万thp-1mrfp+细胞。在温育72小时后，用培养基洗涤细胞并通过流式细胞术测试car的表达。使用生物素化的山羊抗小鼠抗体(特异性biotin-sp-affinipure山羊抗小鼠igg，f(ab')2片段；目录号115-065-072-jacksonimmunoresearch)检测thp1mrfp细胞表面上的car表达，随后是链霉亲和素apc(biolegend5μl/菌株)。
淀粉样蛋白原纤维的产生：淀粉样蛋白原纤维是通过对人细胞系amlc-1对细胞培养基中分泌的免疫球蛋白轻链进行热变性而获得的(arendtbk,blood.2008sep1；112(5):1931-41)。将800万-1000万个amlc-1细胞在直立的t75烧瓶中培养于40ml补充有10％fbs、1％青霉素/链霉素、1％l-谷氨酰胺和1ng/ml人il-6的imdm中。确定该细胞系的倍增时间为4天，因此每4天分裂细胞一次。从约500ml的细胞培养基中纯化分泌的轻链。在收获前，将细胞在无fbs(opti-mem)的培养基中生长4天。使用centriconplus-70旋转柱(millipore)浓缩500ml培养基至2ml的最终体积，分子量截留值为10kda。使用由akta蛋白纯化系统操作的sephadex7530/100gl柱(gehealthcare)，通过尺寸排阻色谱法获得游离轻链的纯化。使用1mm，ph＝7.2的tris盐缓冲液进行sephadex柱洗脱。色谱图显示在图2中。
使用amicon旋转柱(10kda分子截留值)将洗脱级分浓缩至0.5ml或更小的最终体积，并使用nanodrop分光光度计确定每种级分中的蛋白质浓度。使用sds-page检查洗脱级分的特性，在凝胶孔中上样来自每个级分的约20μg蛋白质(图3)。使用boltnovex4-12％bis-trisplus聚丙烯酰胺凝胶电泳(page)和mes运行缓冲液分离每个级分中的蛋白质。从sephadex柱洗脱的第二和第三级分中鉴定出游离轻链。
变性的免疫球蛋白轻链的原纤维的形成：为了获得变性的免疫球蛋白轻链的原纤维，将轻链级分在57.2℃下热变性4天(arendtbkblood.2008sep1；112(5):1931-41)。使用负染色，通过电子显微镜分析评估原纤维的形成(图4)。
变性轻链的荧光标记：体外测试分化的car+thp-1mrfp+细胞的吞噬功能需要用荧光染料标记变性的原纤维。使用微型蛋白标记试剂盒(目录号a30006，molecularprobes)用荧光染料af488标记100μg变性的轻链原纤维。使用nanodrop分光光度计检查荧光标记的强度。
实施例1：靶向血清淀粉样蛋白p的car基因工程化的巨噬细胞的产生
通过构建包含第1代car主链和商业上可获得的抗淀粉样蛋白p抗体的序列的质粒，抗体比如抗血清淀粉样蛋白p抗体克隆ep1018y(abcam目录号ab45151)、克隆14b4(abcam目录号ab27313)、克隆5.4a(millipore的目录号cbl304)或结合血清淀粉样蛋白p的任何商业上可获得的或专有的抗体或靶识别部分，产生具有包含识别血清淀粉样蛋白p(sap)的抗体的scfv的细胞外结构域的car构建体。还可以使用选择性靶向错误折叠的抗体轻链上的新表位的neod001scfv。另外，car的细胞外结构域可以包括识别sap上的表位的合成靶向部分，比如适配体、darpin、天然存在的或合成的sap受体、亲和体或对sap具有亲和力的其他工程化的蛋白质识别分子。
将car构建体转染或转导至原代人巨噬细胞或巨噬细胞细胞系比如thp-1中。通过流式细胞术评估car转录体在巨噬细胞中的表达，证明靶向结构域的细胞表面表达。
使用吞噬测定在体外证明荧光标记的淀粉样蛋白轻链或血清淀粉样蛋白p的靶向，并且通过比较对照和表达car的巨噬细胞之间的活性，通过错误折叠的sap的差异吞噬作用证明car-巨噬细胞和靶蛋白之间的靶向相互作用的特异性。在去除巨噬细胞后量化残留的淀粉样蛋白原纤维，以便模拟残留疾病。与4摄氏度相比，当在37摄氏度下进行测定时，通过归一化增加的摄取倍数来比较主动摄取和被动摄取。
实施例2：经由car基因工程化的巨噬细胞的吞噬作用消除或减少携带血清淀粉样蛋白p蛋白表位的靶标
为了证明在体内模型中靶蛋白或蛋白质聚集体的消除或减少，可以使用蛋白质异种移植模型，其中用直接化学缀合试剂盒(af488或vivotrack680)将sap缀合至荧光标记物，并通过手术植入nsgs小鼠的肝脏中。在移入期后，小鼠将接受仅含媒介物(磷酸盐缓冲盐水)、对照非工程化的巨噬细胞或针对sap的car巨噬细胞的静脉注射(每组n＝5)。每3天重复注射，持续5个周期。在治疗结束时，将对小鼠实施安乐死并收集肝脏组织。将使用ivisspectrum(perkinelmer)对整个肝进行整体荧光成像，并在治疗组之间比较信号强度。然后将通过免疫组织化学染色来量化肝脏sap负担。
可选地，可以证明体内模型中靶蛋白或蛋白质聚集体的消除或减少，其可以在转基因小鼠模型中比如表达人突变型甲状腺素蛋白(ttr)基因的转基因小鼠(在murakami等人，1992.amjpathol.1992aug；141(2):451–456中描述的)或其中观察到淀粉样蛋白沉积的另一种小鼠模型中。
在ttr模型中，在大约6个月大时开始可观察到淀粉样蛋白沉积，其逐渐增加，并最终在多个器官比如心脏、肝脏、脾脏、胃、肠道、甲状腺和/或皮肤中检测到。一旦建立淀粉样蛋白质沉积物并通过组织学分析或其他方法可检测到，可通过单尾静脉注射car巨噬细胞、对照car巨噬细胞或对照非工程化的巨噬细胞进行靶向血清淀粉样蛋白p的car巨噬细胞治疗。通过小鼠组织的免疫组织化学或其他能够测量小鼠器官中淀粉样蛋白质沉积物的量的方法，观察到淀粉样蛋白质沉积物的减少。
实施例3：靶向淀粉样蛋白β的car基因工程化的巨噬细胞的产生
使用含有识别淀粉样蛋白β的抗体的scfv，或构成淀粉样蛋白斑块的错误折叠的蛋白质的三级结构(glabe,2004.trendsbiochemsci.2004oct；29(10):542-7)，或识别形成淀粉样蛋白斑块的错误折叠的蛋白质的寡聚物特异性抗体(kayed等人，2003.science.apr18；300(5618):486-9)的细胞外结构域产生car构建体。通过构建包含第1代car主链和商业上可获得的抗淀粉样蛋白β抗体(比如rocklandantibodiesandassays的abcam或抗体编号600-401-253s的ab2539)或γ抗体(gammabody)(如在perchiacca等人，2012.pnas2012january,109(1)84-89中描述的)或结合β淀粉样蛋白前体蛋白质或所形成的淀粉样蛋白质聚集体上的表位的许多其他专有或定制合成的抗体或其他靶识别部分的序列的质粒，产生car。
将car构建体转染或转导至原代人巨噬细胞或巨噬细胞细胞系比如thp-1中，并通过流式细胞术评估car转录体在巨噬细胞中的表达，这证明了靶向结构域的细胞表面表达。
经由吞噬测定在体外证明淀粉样蛋白前体蛋白质的靶向，并且通过携带抗原的靶标与未携带抗原的靶标相比的差异吞噬作用证明car巨噬细胞和靶蛋白之间的靶向相互作用的特异性和选择性。与4摄氏度相比，当在37摄氏度下进行测定时，通过归一化增加的摄取倍数来比较主动摄取和被动摄取。通过建立具有活人神经元的培养室，并在有或没有抗原特异性巨噬细胞的情况下添加β淀粉样蛋白，来模拟从β淀粉样蛋白毒性拯救神经元。通过显微镜量化残留的活神经元。
实施例4：经由car基因工程化的巨噬细胞的吞噬作用消除或减少携带淀粉样蛋白β表位的靶标
为了证明在体内模型中靶蛋白或蛋白质聚集体的消除或减少，可以使用蛋白质异种移植模型，其中用直接化学缀合试剂盒(af488或vivotrack680)将β淀粉样蛋白缀合至荧光标记物，并通过外科手术植入nsgs小鼠的肝脏中。在移入期后，小鼠将接受仅含媒介物(磷酸盐缓冲盐水)、对照非工程化的巨噬细胞或针对β淀粉样蛋白的car巨噬细胞的静脉注射(每组n＝5)。每3天重复注射，持续5个周期。在治疗结束时，将对小鼠实施安乐死并收集肝脏组织。将使用ivisspectrum(perkinelmer)对整个肝进行整体荧光成像，并在治疗组之间比较信号强度。然后将通过免疫组织化学染色量化肝脏β淀粉样蛋白负担。
可选地，可以证明在体内模型中靶蛋白或蛋白质聚集体的消除或减少，其可以通过使用在小鼠器官中具有β淀粉样蛋白积累的转基因小鼠模型，比如在胰腺(kawarabayashi等人，1996.neurobiolaging17,215–222)、肠道(fukuchi等人，1996.amjpathol149,219–227)或骨骼肌(fukuchi等人，1998.amjpathol153,1687–1693)中积累的模型，或其他小鼠模型，比如在philipson等人，2010.febsj:277(6):1389–1409中评论的模型，或其中观察到β淀粉样蛋白质沉积物的积累的其他模型。一旦建立了β淀粉样蛋白质沉积物并通过组织学分析或其他方法可检测到，可以通过单尾静脉注射car巨噬细胞或对照car巨噬细胞或对照非工程化的巨噬细胞进行靶向β淀粉样蛋白的car巨噬细胞的治疗。通过小鼠组织的免疫组织化学或能够测量小鼠器官中β淀粉样蛋白质沉积物的量的其他方法，观察到β淀粉样蛋白沉积物的减少。
实施例5：靶向胶原蛋白或纤维变性胶原蛋白的car基因工程化的巨噬细胞的产生
通过构建包含第1代car主链和商业上可获得的抗胶原蛋白或抗纤维变性胶原蛋白抗体，或结合胶原蛋白、纤维变性胶原蛋白或纤维变性胶原蛋白聚集体上的表位的许多其他专有或定制合成的抗体或其他靶识别部分的序列的质粒，产生具有包含识别胶原蛋白或纤维变性胶原蛋白的抗体的scfv的细胞外结构域的car构建体。
将car构建体转染或转导至原代人巨噬细胞或巨噬细胞细胞系比如thp-1中，并通过流式细胞术评估car转录体在巨噬细胞中的表达，这证明了靶向结构域的细胞表面表达。
经由吞噬测定在体外证明了胶原蛋白或纤维变性胶原蛋白的靶向，并且通过比较car巨噬细胞与对照巨噬细胞的携带抗原的靶标的差异吞噬作用，证明car巨噬细胞与靶蛋白之间的靶向相互作用的特异性和选择性。
实施例6：经由car基因工程化的巨噬细胞的吞噬作用消除或减少携带胶原蛋白表位的靶标
纤维变性疾病或纤维变性的特征在于包括胶原蛋白的细胞外基质蛋白的病理性沉积。纤维变性发生在许多器官中，特别是在肺部(例如，特发性肺纤维变性(ipf))。在c57bl/6j小鼠中博来霉素攻击后建立了ipf模型(limjunyawong等人，2014.physiolrep.feb1；2(2):e00249)。在建立ipf之后，例如在博来霉素施用后1、3或6个月后，动物接受靶向胶原蛋白的car巨噬细胞的全身性施用。在博来霉素施用后30天或任何其他时间后，处死动物并收集肺进行免疫组织化学和通过羟脯氨酸测定法(sigma-aldrich,st.louis,mo)测量胶原蛋白含量。
可选地，为了证明在体内模型中靶蛋白或蛋白质聚集体的消除或减少，可以使用蛋白质异种移植模型，其中用直接化学缀合试剂盒(af488或vivotrack680)将胶原蛋白缀合至荧光标记物，并通过外科手术植入nsgs小鼠的肝脏。在移入期后，小鼠将接受仅含媒介物(磷酸盐缓冲盐水)、对照非工程化的巨噬细胞或针对胶原蛋白的car巨噬细胞的静脉注射(每组n＝5)。每3天重复注射，持续5个周期。在治疗结束时，将对小鼠实施安乐死并收集肝脏组织。将使用ivisspectrum(perkinelmer)对整个肝进行整体荧光成像，并在治疗组之间比较信号强度。然后将通过免疫组织化学染色量化肝脏胶原蛋白负担。
实施例7：靶向ldl的car基因工程化的巨噬细胞的产生
动脉粥样硬化疾病导致血管内皮的通透性增加。单核细胞被吸入内皮下空间，在那里它们分化成巨噬细胞，这可能有助于变成泡沫细胞的斑块的形成。同时，形成斑块保留越来越大量的ldl。通过构建携带抗ldl抗体比如ldl抗体克隆262-01(目录号sc-57895，santacruzbiotechnology)或结合ldl的任何其他商业上可获得的或专有抗体或靶识别部分的scfv的第一代car，将巨噬细胞工程化以靶向和吞噬ldl。
将car构建体转染到原代人巨噬细胞或巨噬细胞系比如thp-1中，并通过流式细胞术评估car转录体在巨噬细胞中的表达，这证明了靶向结构域的细胞表面表达。
通过吞噬测定在体外证明ldl的靶向，并且通过携带抗原的靶标与未携带抗原的靶标相比的差异吞噬作用，证明car-巨噬细胞与靶蛋白之间的靶向相互作用的特异性和选择性。
实施例8：经由car基因工程巨噬细胞的吞噬作用消除或减少携带ldl表位的靶标
动脉粥样硬化疾病在一种得到确认的小鼠动脉粥样硬化模型中概括，例如apoe敲除模型(plump等人，1992.cell71:343–353)、ldlr缺陷模型、其他动脉粥样硬化模型(veseli等人，2017.第816卷,2017年12月5日，第3-13页)或进行进一步修饰以实现本文描述的实验的模型。在建立动脉粥样硬化疾病后，动物通过尾静脉注射接受靶向ldl的car巨噬细胞，并监测一段时间。在处死动物后，收集降胸主动脉(da)和/或主动脉弓(aa)以及血液和主要器官，并通过包括ihc、rt-pcr和血液化学的方法分析动脉粥样硬化疾病的水平。
可选地，为证明在体内模型中靶蛋白或蛋白质聚集体的消除或减少，可以使用蛋白质异种移植模型，其中用直接化学缀合试剂盒(af488或vivotrack680)将ldl缀合至荧光标记物，并通过外科手术植入nsgs小鼠的肝脏中。在移入期后，小鼠将接受仅含媒介物(磷酸盐缓冲盐水)、对照非工程化的巨噬细胞或针对ldl的car巨噬细胞的静脉注射(每组n＝5)。每3天重复注射，持续5个周期。在治疗结束时，将对小鼠实施安乐死并收集肝脏组织。将使用ivisspectrum(perkinelmer)对整个肝进行整体荧光成像，并在治疗组之间比较信号强度。然后将通过免疫组织化学染色量化肝脏ldl负担。
实施例9：抗淀粉样蛋白car巨噬细胞的开发
通过将淀粉样蛋白特异性scfv的序列克隆到car主链中并转导细胞系衍生的巨噬细胞，开发了抗淀粉样蛋白car巨噬细胞。显示car表达的代表性流式细胞术图呈现在图1中。表达car的thp1mrfp+细胞的频率约为40％。将细胞分类并在培养物中扩展。为了将car+thp1细胞分化为巨噬细胞，将它们用1ug/mlpma和离子霉素处理48-72h；在该温育期结束时，细胞呈现出巨噬细胞样形态。
实施例10：在体外模型中抗淀粉样蛋白原代人car巨噬细胞对淀粉样蛋白原纤维的清除
为了检验car+thp-1mrfp+细胞特异性吞噬变性的淀粉样蛋白原纤维的假说，进行了流式细胞分析以检测在红色(mrfp)和绿色(af480)通道中均发荧光的car+thp-1mrfp+细胞。简而言之，将5x104个car+thp-1mrfp+细胞或未转导的thp-1mrfp+细胞在37℃下与af480标记的变性淀粉样蛋白原纤维、af480标记的变性免疫球蛋白蛋白或gfp标记的α-突触核蛋白纤维(作为阴性对照)温育4h。为了区分吞噬作用和纤维与细胞表面的附连，将一组重复的试管在4℃下平行温育(因为预期不会在4℃下发生吞噬作用)。结果表明，car+thp-1mrfp+细胞在4℃下没有吞噬淀粉样蛋白原纤维(mfiaf480car+thp-1细胞＝240；mfiaf480utdthp-1细胞＝134)，而在37℃下，与af480utdthp-1细胞的mfi值(mfi＝262)相比，af480car+thp-1细胞的mfi值加倍(mfi＝618)，这表明car+thp1细胞能够吞噬淀粉样蛋白纤维(图5)。此外，淀粉样蛋白轻链纤维的吞噬作用的特异性表现为缺乏car+thp-1mrfp+细胞吞噬gfp+α-突触核蛋白原纤维。此外，af480标记的未形成原纤维的变性免疫球蛋白分子表现出与细胞表面的附连，而不是吞噬作用，因为即使在4℃下温育时，car+thp-1mrfp+细胞也会变为af480阳性的。
其他实施方式
本文对变量的任何定义中的要素列表的叙述包括将该变量定义为任何单个要素或所列要素的组合(或子组合)。本文对实施方式的叙述包括该实施方式作为任何单个实施方式或与任何其他实施方式或其部分组合。
本文引用的每个专利、专利申请和出版物的公开内容由此通过引用以其整体并入本文。尽管已经参考具体实施方式公开了本发明，但是显而易见的是，本领域的其他技术人员可以设计本发明的其他实施方式和变型而不背离本发明的真实精神和范围。所附权利要求旨在被解释为包括所有这样的实施方式和等同变型。
- 还没有人留言评论。精彩留言会获得点赞！