合生元组合物的制作方法

本发明涉及一种合生元制剂，其包含至少一种益生菌菌株和选自谷氨酰胺、谷氨酸或其盐、共轭谷氨酰胺或长度为2-10个氨基酸单元的寡肽的至少一种氨基酸，所述氨基酸单元是天然氨基酸，并且至少一个氨基酸单元是谷氨酰胺或谷氨酸单元。胃肠道微生物群调节健康，因此已成为改善人和动物健康的干预靶标。针对微生物群的策略包括应用益生元、益生菌和有时甚至是粪便移植物，目的是改变微生物群的组成和活性。益生菌是活的微生物，当以足够的量施用时，其给宿主带来健康益处[1]。最普遍研究和可商购获得的益生菌主要是来自乳杆菌属(lactobacillus)和双歧杆菌属(bifidobacterium)的微生物。另外，还使用其他几种微生物，例如丙酸杆菌属(propionibacterium)、链球菌属(streptococcus)、芽孢杆菌属(bacillus)、肠球菌属(enterococcus)、大肠杆菌(escherichiacoli)和酵母。同一属和种的不同细菌菌株可能对宿主产生不同的作用。按照定义，益生菌通过其在人体中的活性对宿主产生益处，提出的作用方式包括宿主微生物群的正常化、病原体的抑制、与免疫系统的相互作用以及它们自身的代谢活性。更具体地说，对微生物群组成的有利作用可包括属于梭菌属iv群(也称为柔嫩梭菌(clostridiumleptum)群)和梭菌属xiva群(也称为拟球梭菌(clostridiumcoccoides)群)的分类群(这两个群均属于严格极端厌氧微生物群)的增加，和梭菌属xi群分类群的减少。例如，污泥梭菌(clostridiumsoredelli)群属于xi簇，并引起肺炎、心内膜炎、关节炎、腹膜炎和肌坏死。梭菌属xiva簇包括属于梭菌属(clostridium)、真细菌属(eubacterium)、鲁米诺球菌属(ruminococus)、coporococcus、多尔氏菌属(dorea)、毛螺菌属(lachnospira)、罗氏菌属(roseburia)和丁酸弧菌属(butyrivibrio)的种。梭菌属iv簇由梭菌属、真细菌属、鲁米诺球菌属和厌氧丝菌属(anaerofilum)组成[2]。梭菌属xi簇具有诸如艰难梭菌(clostridiumdifficile)的致病性物种。梭菌属xiva和iv簇占肠道微生物群(其是防御机制和抵抗感染的必要角色)中细菌总数的很大一部分(10-40％)[3]。微生物群的功能通过产生以下物质来描述：例如有机酸、二乙酰、短链脂肪酸、生物表面活性剂、气体、改性胆汁酸、植物化学物质和抗菌物质(例如细菌素和过氧化氢)。有利的短链脂肪酸(scfa)特别是乙酸酯和正丁酸酯。例如，乙酸酯通过抑制肠病原改善健康。在饮食中添加一些食物成分可能促进有益细菌。所谓的益生元定义为选择性发酵的成分，其导致胃肠道微生物群的组成和/或活性发生特定变化，从而为宿主健康带来益处。益生元通常在胃肠道运输过程中充当包裹基质，进一步释放肠道中的微生物并随后用作可发酵的基质[4]。大多数益生元是来自植物来源的复杂碳水化合物。益生元和益生菌可以组合起来以支持后者的存活和代谢活性，并且所得产品属于合生元类别。合生元是指以协同形式(因此是合生元)组合益生菌和益生元的食物成分或膳食补充剂[5]。术语益生元的最新定义是：“被宿主微生物选择性地利用从而赋予健康益处的基质”[6]，因此不仅指某些碳水化合物，而且还指例如氨基酸和多肽。食物补充剂是营养物质或具有营养或生理作用的其他物质的集中来源，其目的是补充正常饮食(www.efsa.europa.eu/en/topics/topic/food-supplements)。例如，对于l-谷氨酰胺描述了口服补充剂改变超重的人中群肠道微生物群的组成，降低厚壁菌(firmicutes)与拟杆菌(bacteriodetes)的比率(这也在减肥程序中被观察到)[7]。对微生物群活性的有利作用可能是乙酸酯和正丁酸酯的产量增加，以及支链短链脂肪酸(例如异丁酸酯和异戊酸酯)的产量降低。正丁酸酯可以作为所谓的结肠燃料引入到脂质生物合成和肠激素的生产中。此外，丁酸是具有抗炎和抗肿瘤特性的结肠环境的生理成分[8]，并且它支持人体的许多其他功能以防止非传染性疾病的形成[9、10]。丁酸酯和戊酸酯的同工型的减少表明肠中减少的蛋白质发酵，和有害发酵产物的减少。尽管一些益生菌在研究中显示出有前景的结果，但仍缺乏强有力的科学证据来支持大多数健康状况下益生菌的特定用途。到目前为止，美国食物药品监督管理局(fda)和欧洲食物安全局(efsa)尚未批准用于预防或治疗健康问题的任何益生菌。几种益生菌策略没有成功，因为微生物通常在胃肠道中显示出较差的存活和定植。限制因素包括胃中的低ph值，以及胆汁和消化酶的存在、低氧含量以及肠中其他微生物的存在。此外，不仅菌株的生存能力而且其代谢活性的维持对于益生菌功能也很重要[11]。益生菌治疗可能对几种情况下的微生态失调(其与许多疾病有关)和肠道驻留的有益和致病微生物的调节的缺乏没有足够的影响。此外，缺少一些有益微生物用作补充剂的可用性(例如普氏栖粪杆菌(faecalibacteriumprausnitzii)等)。诸如粪便微生物群移植(fmt)(也称为细菌疗法)的方法很复杂，并且存在意外的不良后果的风险。尽管经常提出肠道病原体的减少属于益生元的有益作用，但这尚未得到最终证明。像其他不可消化的碳水化合物一样，益生元通过肠道细菌发酵，并且产生的scfa以其促进健康的特性而闻名。实际上，scfa生产受食物摄入和肠道微生物群组成的影响。这些分子参与塑造肠道环境和结肠生理，因为它们是宿主细胞和肠道微生物群的能量来源，并参与不同的宿主信号传导机制[12]。乙酸酯、丙酸酯和丁酸酯是肠道中丰富的scfa。可以通过合成奇数脂肪酸将丙酸酯掺入糖异生。scfa的形成的前体是乳酸酯。因此，益生元策略主要包括可发酵的寡糖、二糖、单糖和多元醇(fodmap)，并且旨在增加这些代谢产物的产生以及有益微生物的丰度。但是，这些碳水化合物经常引起不想要的副作用，例如腹泻、便秘和肠胃气胀。低fodmap饮食有效减轻肠易激综合症患者的这些症状[13]。因此，需要靶向胃肠道微生物群以诱导其组成和活性的有利变化以实现对宿主健康的有益作用的策略。这种概念应特别关注对梭菌的作用，因为它们属于肠道稳态维持的主要参与者[14]。厚壁菌门的这些杆状细菌为革兰氏阳性，并且占肠道微生物群中细菌总数的实质部分。他们在生命的第一个月期间开始在母乳喂养的婴儿的肠道中定殖，并聚居在肠道粘膜中的特定区域中与肠道细胞密切相关。该位置允许它们作为关键因子通过与其他驻留微生物群体相互作用并通过提供特定和必要的功能参与调节肠道中在整个生命周期中的生理、代谢和免疫过程。之前已经描述了各种益生菌菌株及其作为饲料和食物添加剂的用途(仅示例性参考wo2017/207371a1和wo2017/207372a1)。但是，对于已知的益生菌菌株，以前没有在关于特定细菌菌株及其分布的这样的细节上描述对肠道微生物群组成的作用。因此，本发明的目的是提供益生菌菌株的新组合，其通过诱导胃肠道微生物群组成(特别是与梭菌相关的)的有利变化并促进胃肠道中有利的scfa例如乙酸酯和正丁酸酯的产生而对胃肠道微生物群具有积极作用。因此，本发明的主题是一种合生元制剂，其包含枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)、地衣芽孢杆菌(bacilluslicheniformis)、解淀粉芽孢杆菌(bacillusamyloliquefaciens)和短小芽孢杆菌(bacilluspumilus)的至少一种益生菌菌株和选自谷氨酰胺、谷氨酸或其盐、共轭谷氨酰胺或长度为2-10个氨基酸单元的寡肽的至少一种氨基酸，所述氨基酸单元是天然氨基酸，并且至少一个氨基酸单元是谷氨酰胺或谷氨酸单元。这种含有细菌菌株和谷氨酰胺或谷氨酰胺衍生物的新型合生元制剂促进产生正丁酸酯的分类群，并提高肠道中正丁酸酯的水平。发现芽孢杆菌属的细菌特别适合于这种作用。因此，在本发明的优选配置中，益生菌菌株包括芽孢杆菌属的细菌菌株。特别地，来自枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌的细菌菌株有效地增加梭菌属xiva群成员的比例，并同时减少肠道中的梭菌属xi群分类群。这种作用伴随着增加的乳酸酯、乙酸酯和正丁酸酯，但同时减少的异丁酸酯和异戊酸酯水平。令人惊讶地，发现l-谷氨酰胺和谷氨酸及其衍生物强烈诱导梭菌属xiva群并抑制梭菌属xi群分类群。就像枯草芽孢杆菌的作用一样，这种微生物群作用与乙酸酯和正丁酸酯的增加以及异丁酸酯和异戊酸酯的减少有关。乙酸酯和正丁酸酯水平的增加可以由某些梭菌使用的谷氨酸发酵途径来解释[15]。此外，枯草芽孢杆菌菌株与谷氨酰胺或其衍生物的组合具有协同作用，并且与单个组分相比对梭菌簇和短链脂肪酸的产生具有更强的作用。芽孢杆菌属菌株作为益生菌和/或合生元食物补充剂的使用具有可能应用耐热和耐酸孢子的附加优点，这对于例如非孢子形成的乳酸菌是不可能的。与抗生素相比，益生菌的一大优势在于，它们不会随意破坏细菌，也不会导致具有抗生素抗性的致病菌菌株。通常，它们能够通过产生具有特定功效的抗微生物物质选择性地与致病细菌竞争，并且理想地能够同时增强有益肠道微生物群的生长和生存力。此外，它们优选地能够刺激被治疗的动物或人中的全身免疫应答。在优选的实施方案中，益生菌株选自以下之一：枯草芽孢杆菌dsm32315(其详细描述于wo2017/207372a1中)、枯草芽孢杆菌dsm32540和解淀粉芽孢杆菌cect5940、枯草芽孢杆菌dsm32592、短小芽孢杆菌dsm32539、地衣芽孢杆菌dsm32314(其详细描述于wo2017/207371a1中)。根据本发明，氨基酸或其衍生物选自谷氨酰胺、谷氨酸或其盐、共轭谷氨酰胺或长度为2-10个氨基酸单元的寡肽，所述氨基酸单元是天然氨基酸，并且至少一种氨基酸单元是谷氨酰胺或谷氨酸单元。谷氨酰胺的积极作用从文献中是已知的，例如，已经显示，使用谷氨酰胺的口服补充降低用诱导坏死性小肠结肠炎的甲氨蝶呤剂量处理的豚鼠的死亡率[16]。此外，在术后麻醉犬的后肢平衡研究中已显示，输注的丙氨酰谷氨酰胺的氨基酸几乎与从丙氨酸和谷氨酰胺的混合物中提取一样好地从骨骼肌中提取出来[17]。在本发明的上下文中，“氨基酸”应理解为包含氨基官能团(-nh2)和羧酸官能团(-cooh)以及对相应氨基酸特定的侧链的分子。在本发明的上下文中，包括α-氨基酸和β-氨基酸。本发明优选的氨基酸是α-氨基酸，特别是如下的20种“天然氨基酸”：在本发明的上下文中，表述“天然氨基酸”应理解为包括以上列出的20种氨基酸的l形式和d形式。然而，l型是优选的。在一个实施方案中，术语“氨基酸”还包括那些氨基酸的类似物或衍生物。根据本发明，“游离氨基酸”应理解为具有游离形式的其氨基和其(α-)羧基官能团的氨基酸，即不与其他分子共价结合，例如不形成肽键的氨基酸。游离氨基酸也可以作为盐或以水合物形式存在。当将氨基酸称为寡肽的一部分或在寡肽中时，应将其理解为是指根据已知的生物化学机制和肽生物合成衍生自相应氨基酸的相应寡肽结构的该部分。根据本发明，“寡肽”应理解为是由2至20个氨基酸组成的肽化合物。本发明更优选的寡肽是由2-10个氨基酸、2-6个氨基酸、2-5个氨基酸、2-4个氨基酸或2-3个氨基酸组成的寡肽。根据本发明的最优选的寡肽是二肽。较小肽的偏好性与早期文献一致，该文献显示在幼小动物中的研究提示在早期生长过程中，二肽转运比游离氨基酸转运具有更大的定量意义[18、19]。此外，在人体肠道灌注研究中，在饥饿2周后，二肽和三肽的摄取被抑制的程度小于游离氨基酸的摄取[20]。“肽”应理解为是包含通过肽键(r1-co-nh-r2)彼此共价偶联的至少两个氨基酸的分子。在本发明的替代实施方案中，寡肽还包含丙氨酸或甘氨酸。在另一个替代实施方案中，寡肽是选自甘氨酸-谷氨酰胺、甘氨酸-谷氨酸、丙氨酸-谷氨酰胺、丙氨酸-谷氨酸及其乙酰化形式的二肽。根据本发明的优选实施方案，二肽丙氨酸-谷氨酰胺(ala-gln)是特别优选的。根据本发明，益生菌菌株和氨基酸或寡肽的总量为制剂的总重量的至少40重量％，优选至少50重量％，更优选至少60重量％，最优选至少70重量％。当制剂还包含根据本发明的肠溶衣时，特别优选的是将合生元组合物直接递送至个体的结肠。肠溶衣组合物可包含以下一种或多种：丙烯酸甲酯-甲基丙烯酸共聚物、乙酸邻苯二甲酸纤维素(cap)、乙酸琥珀酸纤维素、邻苯二甲酸羟丙基甲基纤维素、乙酸琥珀酸羟丙基甲基纤维素(乙酸琥珀酸羟丙甲纤维素)、聚乙酸乙烯邻苯二甲酸酯(polyvinylacetatephthalate，pvap)、甲基丙烯酸甲酯-甲基丙烯酸共聚物、虫胶、乙酸偏苯三酸纤维素、藻酸钠、玉米蛋白。作为肠溶衣，优选使用由10至30重量％的甲基丙烯酸甲酯、50至70重量％的丙烯酸甲酯和5至15重量％的甲基丙烯酸聚合的聚合物。所公开的聚合物分散体可优选包含15至50重量％的由20至30重量％的甲基丙烯酸甲酯、60至70重量％的丙烯酸甲酯和8至12重量％的甲基丙烯酸聚合的聚合物。最优选地，聚合物由25重量％的甲基丙烯酸甲酯、65重量％的丙烯酸甲酯和10重量％的甲基丙烯酸聚合。由25重量％的甲基丙烯酸甲酯、65重量％的丙烯酸甲酯和10重量％的甲基丙烯酸聚合的聚合物的30重量％的水分散体对应于商业产品biotic。单体的百分比总计为100％。以2–30mg/cm2、优选5–20mg/cm2的量施加功能性聚合物。本发明的一个主题是根据本发明的制剂用作饲料或食物补充剂的用途。本发明的另一主题还是本发明的制剂用作饲料或食物产品中的合生元成分的用途。根据本发明，术语“合生元”应指包含益生元和益生菌组分的组合物。此外，本发明涉及术语“益生元”的更新定义，意指被微生物选择性地利用并赋予健康益处的基质，并且其还应包括氨基酸和肽。因此，根据本发明的合生元组合物是包含益生菌菌株和作为益生元的氨基酸或寡肽的组合物。根据本发明的优选食物是乳制品，特别是酸奶、奶酪、牛奶、黄油和夸克干酪。本发明的菌株(特别是在本发明的组合物中)的细胞可以作为孢子(其是休眠的)、作为营养细胞(其正在生长)、作为过渡状态细胞(其从生长阶段过渡至孢子形成阶段)或作为至少两种特别是所有这些类型的细胞的组合存在。在一个优选的实施方案中，本发明的组合物主要或仅包含孢子。本发明的另一个主题是一种饲料或食物组合物，其包含根据本发明的制剂和至少一种其他饲料或食物成分，优选选自蛋白质、碳水化合物、脂肪、其他益生菌、益生元、酶、维生素、免疫调节剂、代乳品、矿物质、氨基酸、抗球虫药、酸基产品、药物及其组合。根据本发明的饲料或食物组合物还包括丸剂、胶囊剂、片剂或液体形式的膳食补充剂。本发明的组合物，特别是饲料、食物和药物组合物，优选包含本发明的菌株，并以约1×103至约2×1012cfu/g饲料/食物或ml水的比率，特别是以约1×103或约1×104或约1×105或约1×106或约1×107或约1×108或约1×109或约1×1010或约1×1011或约1×1012cfu/g饲料/食物或ml水的比率，优选以约1×104至约1×1010cfu/g饲料/食物或ml水的量，更优选以约1×104至1×107cfu/g饲料/食物或ml水的量施用至动物或人。相应地，在本发明的饲料或食物组合物中本发明的制剂的优选量优选为0.1重量％至10重量％，更优选为0.2重量％至5重量％，特别是0.3重量％至3重量％。本发明的另一主题是药物组合物，其包含根据本发明的制剂和药学上可接受的载体。当将本发明的制剂施用于动物或人时，优选改善动物或人的健康状况，特别是肠道健康、心血管健康、健康体重管理或免疫健康。因此，本发明的另一个主题是根据本发明的组合物，其用于预防或治疗腹泻、便秘、肠易激综合征、克罗恩氏病、溃疡性结肠炎、结直肠癌、肠癌、心血管疾病、动脉硬化、脂肪肝病、高脂血症、高胆固醇血症、肥胖、多脂症、2型糖尿病、代谢综合征、慢性炎性疾病和过敏性疾病。根据本发明的有利配置是用于通过以下一项或多项改善动物或人的肠道健康状况的组合物：-增加肠道微生物群中梭菌属xiva群的细菌的总量，-减少肠道微生物群中梭菌属xi群的细菌的总量，-增加短链脂肪酸，优选正丁酸酯、丙酸酯、乙酸酯和乳酸酯的产生，以及-抑制支链短链脂肪酸，优选异丁酸酯和异戊酸酯的形成。本发明的另一个主题是一种胶囊，其包含选自枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短小芽孢杆菌的至少一种益生菌菌株和选自甘氨酸-谷氨酰胺、甘氨酸-谷氨酸、丙氨酸-谷氨酰胺、丙氨酸-谷氨酸及其乙酰化形式的至少一种二肽。在一个优选的实施方案中，益生菌菌株是枯草芽孢杆菌，优选枯草芽孢杆菌dsm32315、枯草芽孢杆菌dsm32540、枯草芽孢杆菌dsm32592。胶囊优选包含1×108至2×1010cfu的益生菌菌株和50mg至800mg的二肽。当益生菌菌株和二肽的量为胶囊填充物的总重量的至少40重量％，优选至少50重量％，更优选至少60重量％，最优选至少70重量％时，也是优选的。胶囊还可以包含另外的维生素或矿物质。维生素优选选自维生素a(作为全反式视黄醇、全反式视黄酯以及全反式β-胡萝卜素和其他维生素a原类胡萝卜素)、维生素b1(硫胺素)、维生素b2(核黄素)、维生素b3(烟酸)、维生素b5(泛酸)、维生素b6(吡哆醇)、维生素b7(生物素)、维生素b9(叶酸或叶酸酯)、维生素b12(钴胺素)、维生素c(抗坏血酸)、维生素d(钙化醇)、维生素e(生育酚和生育三烯酚)和维生素k(醌)。矿物质优选选自硫、铁、氯、钙、铬、钴、铜、锌、镁、锰、钼、碘和硒。胶囊可还包含一种或多种益生元成分，优选地选自菊粉、低聚果糖(fos)、低聚半乳糖(gos)、淀粉、果胶、β-葡聚糖和低聚木糖。胶囊还可包含一种或多种植物提取物，其中植物优选选自西兰花、橄榄果、石榴、黑醋栗、蓝莓、越桔、沙棘、卡姆果、波森莓、姜黄、姜、大蒜、葡萄籽、阿萨伊浆果、野樱梅、枸杞果、辣根、齿叶乳香树、螺旋藻、人参、大麻二酚、玫瑰果、普洱茶、煎茶、紫锥菊和绿茶叶。在优选的配置中，胶囊包含肠溶衣，其中所述肠溶衣包括以下一种或多种：丙烯酸甲酯-甲基丙烯酸共聚物、乙酸邻苯二甲酸纤维素(cap)、乙酸琥珀酸纤维素、邻苯二甲酸羟丙基甲基纤维素、乙酸琥珀酸羟丙基甲基纤维素(乙酸琥珀酸羟丙甲纤维素)、聚乙酸乙烯邻苯二甲酸酯(pvap)、甲基丙烯酸甲酯-甲基丙烯酸共聚物、虫胶、乙酸偏苯三酸纤维素、藻酸钠、玉米蛋白。工作实施例实施例1：枯草芽孢杆菌dsm32315、枯草芽孢杆菌dsm32540、地衣芽孢杆菌dsm32314和解淀粉芽孢杆菌cect5940菌株能够在人结肠微生物群中持续存在肠筛选模型为了确定益生菌菌株枯草芽孢杆菌dsm32315、枯草芽孢杆菌dsm32540、地衣芽孢杆菌dsm32314和解淀粉芽孢杆菌cect5940对成人结肠微生物群的作用，使用了肠道筛选模型(i-screen，tno，thenetherlands)。因此，i-screen模型接种了标准的人成人粪便微生物群材料，该材料由来自6名健康成人志愿者(白种人，欧洲人的生活方式和营养)的合并的粪便捐赠物组成。将粪便材料混合并在补料分批发酵罐中生长40小时，以产生标准化的微生物群，如前所述[21]。这些标准的成人肠道微生物群集合在-80℃下保存在12％甘油中。在改良的标准回肠外流培养基(siem)中体外培养肠道微生物群，该培养基的组成由[22]描述，并进行了如下改良：0.047g/l果胶，0.047g/l木聚糖，0.047g/l阿拉伯半乳聚糖，0.047g/l支链淀粉，0.392g/l淀粉，24.0g/l酪蛋白，24.0bacto蛋白胨，0.4牛胆粉(ox-bile)和0.2g/l半胱氨酸。所有成分均由trititiummicrobiology(veldhoven,thenetherlands)提供。将培养基的ph调节至5.8。对于i-screen发酵，将预培养的标准化粪便接种物在1350μl改良的siem中稀释50倍。所有实验均一式三份进行。将枯草芽孢杆菌(dsm32315)、枯草芽孢杆菌dsm32540、地衣芽孢杆菌dsm32314和解淀粉芽孢杆菌cect5940菌株分别在50mllbkelly培养基[23]中预培养约16h。在有氧条件下于37℃在摇瓶中进行孵育。孵育后，通过600nm处的光密度测量来确定细菌密度。在1ml缓冲溶液(0.1mmmesph6)中制备1×1010个细胞/ml的最终储备液。将每种菌株的悬浮液分别引入i-screen至约109个细胞/ml的最终水平i-screen孵育是在以下气体条件下进行的：0.2％o2、0.2％co2、10％h2、89.6％n2。dna分离如ladirat等人(2013)所述并进行了一些小的修改，进行用于16srrna编码基因的测序的dna提取。将大约100μl的培养材料添加到96孔板的孔中，每孔含300μl裂解缓冲液(magminidna分离试剂盒，lgcltd,uk)、500μl锆珠(0.1mm；biospecproducts,bartlesville,ok,usa)和500μl的用tris-hcl饱和的苯酚(ph8.0；carlrothgmbh,germany)。将96孔板放置在mini-beadbeater-96(biospecproducts,bartlesville,ok,usa)中以2100次振荡/分钟持续2分钟。随后根据制造商的建议使用agowamagminidna分离试剂盒纯化dna。提取的dna在最终体积为60μl的缓冲液中洗脱。v416srrna基因测序通过v4高变区的16srrna基因扩增子测序来分析微生物群组成。这是通过一系列步骤实现的：使用对细菌16srrna基因具有特异性的引物，通过定量聚合酶链反应(qpcr)确定i-screendna样品中细菌dna的量：正向引物：cgaaagcgtggggagcaaa；反向引物：gttcgtactccccaggcgg；探针：6fam-attagataccctggtagtcca-mgb。随后，如[24](2013)所述，使用f515/r806引物[25]，通过扩增500pgdna生成个体样品的16srrna基因的v4高变区的pcr扩增子。引物包含illumina衔接子和独特的8-nt样品索引序列密钥[24]。包含了模拟对照以用于技术质量控制。使用dsdna910试剂盒在片段分析仪(advancedanalytical)上对每个样品的扩增的dna的量进行定量。扩增子文库以等摩尔量合并，并使用凝胶提取试剂盒(qiagen)从1.2％琼脂糖凝胶中纯化。使用quant-ittmdsdna测定试剂盒(thermofisherscientific)对文库进行定量。在illuminamiseq平台(illumina,eindhoven,thenetherlands)上进行扩增子的配对末端测序。根据mothurmiseqsop[24]，用mothurv.1.36.1[26]处理序列数据。在合并读数对之前，使用btrim[27]以5nt的滑动窗口大小和25的平均质量得分修剪低质量区域。合并后，根据长度过滤序列，但不允许歧义碱基。将独特的序列与细菌的silvaseed参考比对释放102(可在http://www.mothur.org/wiki/silva_reference_files获得)进行比对；使用具有参数“optimize＝start-end，criteria＝90”的screen.seqs除去太短的序列。使用uchime[28]以从头模式鉴定每个样品的嵌合序列，并将其除去。接下来，除去在整个数据集中出现少于10次的序列。使用核糖体数据库计划(rdp)朴素贝叶斯分类器以60％的置信度阈值和1000次迭代[29]以及rdp训练集v.9(trainset9_032012)的mothur格式化形式将分类学名称分配给所有序列。使用最小熵分解(med)算法对序列进行分组，该算法以敏感方式将16srrna基因扩增子聚类[30]。为了过滤噪声，将“minimumsubstantiveabundance”过滤器设置为200。i-screen中的人结肠微生物群还补充有每个益生菌菌株的活的营养芽孢杆菌属的几个种的细胞。基于16srrna编码基因的v4高变区的miseq测序，可以看到对与个体菌株相关的微生物群组成的特定作用。基于序列读数的数量，在i-screen实验开始时细菌的丰度很高(约109cfu/ml)，因此在t＝0h时，枯草芽孢杆菌dsm32315约占总细菌群体的91％(图1c)，在t＝0h时，枯草芽孢杆菌dsm32540约占总细菌群体的87％(图1e)，在t＝0h时，地衣芽孢杆菌dsm32314约占总细菌群体的94％(图1g)，以及在t＝0h时，解淀粉芽孢杆菌cect5940约占总细菌群体的88％(图1i)。没有添加芽孢杆菌属的几个种的菌株的对照在时间点0小时(图1a)和孵育24小时后(图1b)显示。孵育24小时后，粪便微生物群能够以芽孢杆菌的相对存在为代价来恢复。似乎在24小时孵育后，dsm32315细胞在i-screen中以41％的水平持续存在(图1d)，在24小时孵育后，dsm32540细胞在i-screen中以19％的水平持续存在(图1f)，在孵育24小时后，dsm32314细胞在i-screen中以4％的水平持续存在(图1h)，以及孵育24小时后，cect5940细胞在i-screen中以7％的水平持续存在(图1j)。图1显示的饼图显示了基于16srrna编码区基因的v4高变区的miseq测序的i-screen发酵样品的属的水平。用阴影部分表示检测到的属及其相对丰度。a)在没有任何添加的情况下孵育0小时，b)在没有任何添加的情况下孵育24小时之后，c)在添加营养枯草芽孢杆菌dsm32315细胞之后0小时，d)在添加营养枯草芽孢杆菌dsm32315细胞之后24小时，e)在添加营养枯草芽孢杆菌dsm32540细胞之后0小时，f)在添加营养枯草芽孢杆菌dsm32540细胞之后24小时，g)在添加营养枯草芽孢杆菌dsm32314细胞之后0小时，h)在添加营养枯草芽孢杆菌dsm32314细胞之后24小时，i)在添加营养解淀粉芽孢杆菌cect5940细胞之后0小时，j)添加营养解淀粉芽孢杆菌cect5940细胞之后24小时。实施例2：益生菌菌株枯草芽孢杆菌dsm32315、枯草芽孢杆菌dsm32540、地衣芽孢杆菌dsm32314和解淀粉芽孢杆菌cect5940产生显著水平的乳酸酯。在开始时的siem中，检测到较低水平的乳酸，约为0.04mg/ml，其在存在微生物群的情况下完全消失，在24小时后具有<0.02mg/ml的乳酸酯含量(图2)。24小时后，芽孢杆菌属菌株在没有结肠群落的siem中产生显著水平的乳酸酯。dsm32315的细胞产生0.35mg/ml，dsm32540的细胞产生0.31mg/ml，dsm32314的细胞产生0.19mg/ml，并且cect5940的细胞产生0.11mg/ml。与人肠道微生物群孵育24小时后，在dsm32315或dsm32540细胞存在的情况下，乳酸酯的量仍显著增加至0.12mg/ml，并且在dsm32314存在的情况下增加至0.15g/ml。因此，这些益生菌菌株引起人肠道微生物群的显著的乳酸酯形成。这可以解释为有益的作用，因为乳酸酯可以转化为促进健康的scfa。图2显示了在siem中孵育24小时后，在siem中以及在存在分别含有枯草芽孢杆菌dsm32315、枯草芽孢杆菌dsm32540、地衣芽孢杆菌dsm32314和解淀粉芽孢杆菌cect5940的结肠微生物群的情况下，测量的乳酸酯浓度(mg/ml)。乳酸酯的极限检测为0.02mg/ml。实施例3：益生菌菌株枯草芽孢杆菌dsm32315、地衣芽孢杆菌dsm32314和解淀粉芽孢杆菌cect5940分别支持人微生物群落的乙酸酯的产生。芽孢杆菌属菌株dsm32315、dsm32314和cect5940导致肠道微生物群的乙酸酯产量显著增加。图3显示，在没有添加益生菌菌株的情况下暴露24小时后，i-screen中的乙酸酯平均水平约为44mm，而siem中的乙酸酯水平仅为3.4mm，几乎无法检测到。孵育24小时后，在菌株dsm32315、dsm32314和cect5940的存在下，分别观察到乙酸酯浓度增加了10.4mm、43.7mm和3.3mm(图3)。所有数据的p值均低于0.05，这意味着它们是统计学上显著的。因此，益生菌菌株dsm32315、dsm32314和cect5940支持乙酸酯的生产，这对人肠道具有有益的作用。图3显示了在siem中孵育24小时后，在siem中以及在存在分别含有枯草芽孢杆菌dsm32315、地衣芽孢杆菌dsm32314和解淀粉芽孢杆菌cect5940的结肠微生物群的情况下，测量的乙酸酯浓度(mm)。实施例4：益生菌菌株枯草芽孢杆菌dsm32315、枯草芽孢杆菌dsm32540、地衣芽孢杆菌dsm32314和解淀粉芽孢杆菌cect5940分别支持人微生物群的丙酸酯的产生。芽孢杆菌菌株dsm32315、dsm32540，dsm32314和cect5940在siem中不产生丙酸酯，但它们显著(p值<0.05)加速人微生物群的丙酸酯产生(图4)。与对照相比，菌株显著支持肠道微生物群的丙酸酯产生。图4显示，在没有添加益生菌菌株的情况下暴露24小时后，i-screen中的平均丙酸酯水平约为11.5mm，而siem中的丙酸酯水平仅为2.7mm，几乎无法检测到。在营养枯草芽孢杆菌dsm32315细胞的存在下，24小时后丙酸酯的量比对照高15.1mm。在营养枯草芽孢杆菌dsm32540的存在下，丙酸酯的量高12.2mm。在dsm32314的存在下，量高13.4mm，并且在cect5940的存在下，丙酸酯的量高7.1mm。丙酸酯对人肠道的健康状况是有益的，因为它可以掺入糖异生中。图4显示了在siem中孵育24小时后，在siem中以及在存在分别含有枯草芽孢杆菌dsm32315、枯草芽孢杆菌dsm32540、地衣芽孢杆菌dsm32314和解淀粉芽孢杆菌cect5940的结肠微生物群的情况下，测量的丙酸酯浓度(mm)。实施例5：益生菌菌株枯草芽孢杆菌dsm32315、地衣芽孢杆菌dsm32314和解淀粉芽孢杆菌cect5940分别支持人微生物群组成中正丁酸酯的产生。益生菌菌株枯草芽孢杆菌dsm32315、地衣芽孢杆菌dsm32314和解淀粉芽孢杆菌cect5940在siem中暴露24小时后未产生可检测水平的正丁酸酯，但它们对人微生物群的正丁酸酯产生水平具有显著的积极影响(p值<0.05)(图5)。图5显示，在不添加益生菌菌株的情况下暴露24小时后，i-screen中的正丁酸酯平均水平约为5.4mm，而在siem中几乎无法检测到丙酸酯(0.3mm)。在营养枯草芽孢杆菌dsm32315细胞的存在下，24小时后正丁酸酯的量比对照高2.0mm。在dsm32314的营养细胞的存在下，正丁酸酯的量高1.0mm，在cect5940的营养细胞的存在下，正丁酸酯的量高4.8mm。更高的正丁酸酯量的产生对于脂质生物合成(例如产生肠道激素)可能是有益的。图5显示了在siem中孵育24小时后，在siem中以及在存在分别含有枯草芽孢杆菌dsm32315、地衣芽孢杆菌dsm32314和解淀粉芽孢杆菌cect5940的结肠微生物群的情况下，测量的正丁酸酯浓度(mm)。实施例6：枯草芽孢杆菌dsm32315和dsm32540菌株分别减少人微生物群组成中的异丁酸酯和异戊酸酯形成。图6显示在未添加益生菌菌株的情况下暴露24小时后i-screen中的异丁酸酯平均水平约为0.73mm，并且异戊酸酯平均水平约为2.2mm，而siem中的异丁酸酯无法检测到并且异戊酸酯的含量为0.24mm。特别地，菌株dsm32315和dsm32540显著减少(p值<0.05)人肠道微生物群的异丁酸酯和异戊酸酯产生。孵育24小时后，与对照相比，在dsm32315的细胞的存在下异丁酸酯含量低0.5mm，和在dsm32540的细胞的存在下异丁酸酯含量低0.4mm。当将芽孢杆菌菌株dsm32315和dsm32540添加到人微生物群中时，它们还对异戊酸酯产生的水平具有负面影响。与对照相比，i-screen中的浓度分别显著(p值<0.05)降低了0.7mm和0.8mm。在i-screen中在肠道微生物群中引入芽孢杆菌属菌株dsm32315后，该细胞支持正丁酸酯的产生并抑制异丁酸酯和异戊酸酯的形成。这可能表明肠道中减缓的蛋白质发酵过程，其也表明有害副产物的减少的产生。图6显示了在siem中孵育24小时后，在存在分别含有枯草芽孢杆菌dsm32315和枯草芽孢杆菌dsm32540的结肠微生物群的情况下，测量的异丁酸酯和异戊酸酯浓度(mm)。实施例7：枯草芽孢杆菌dsm32315、枯草芽孢杆菌dsm32540、地衣芽孢杆菌dsm32314和解淀粉芽孢杆菌cect5940的存在分别减少梭菌属xi簇的丰度。菌株dsm32315、dsm32314和cect5940分别增加梭菌属xiva簇的丰度。当在起始时间点0h时与对照(图1)和在24h后与微生物群的发育相比，菌株dsm32315、dsm32540、dsm32314和cect5940的存在将梭菌属xi簇从总微生物群落的6％降低至低于3％的值(图7)。在存在益生菌细胞的情况下，24小时后，梭菌属xiva簇从对照中的5％增加到总群落的至少8％。i-screen孵育在以下气体条件下进行：0.2％o2、0.2％co2、10％h2、89.6％n2。因此，在这些益生菌菌株的存在下，人微生物群组成转变至更健康的群落。图7显示的条形图显示了基于16srrna编码区基因的v4高变区的miseq测序的i-screen发酵样品的属的水平。阴影条表示检测到的梭菌属xi和梭菌属xiva及其相对丰度。实施例8：谷氨酰胺或其衍生物的添加显著改变人微生物群落含有谷氨酰胺或谷氨酸的二肽的存在通过转变为消除的梭菌属xi群和增加的梭菌属xiva群而影响微生物群落(图8)。添加单个氨基酸至浓度为3.5mm，并添加二肽至浓度为7mm。如实施例1中所述，在以下气体条件下进行i-screen暴露：0％o2、0.2％co2、10％h2、90％n2。此外，ala-gln和gly-glu几乎完全减少了梭菌属xi群，这与对肠道健康的强大有益作用有关。作为对照，测试了不含任何谷氨酰胺或谷氨酸的二肽gly-tyr，以及单个氨基酸谷氨酰胺(gln)和谷氨酸(glu)，它们对微生物群落没有积极影响。图8显示的柱状图显示了基于16srrna编码区基因的v4高变区的miseq测序的i-screen发酵样品的属的水平。阴影条表示检测到的梭菌属xi和梭菌属xiva及其相对丰度。实施例9：枯草芽孢杆菌(dsm32315)、地衣芽孢杆菌(dsm32314)或解淀粉芽孢杆菌(cect5940)与谷氨酰胺或其衍生物的组合添加显示出与单一组分相比对改变微生物群落及其短链酸产生的协同作用。通过实施例7中所述的方法，详细分析了不同益生菌菌株与几种含谷氨酰胺和谷氨酸的肽组合在一起的作用。作为对照，分析了单独的谷氨酰胺(gln)、谷氨酸(glu)和非glu/非gln二肽甘氨酸-酪氨酸(gly-tyr)以及与益生菌菌株的组合的作用。添加单个氨基酸至浓度为3.5mm，添加二肽至浓度为7mm。孵育24小时后分析微生物群组成。观察到几种组合对微生物群落组成的协同积极作用，如通过与单独添加氨基酸或二肽和益生菌细胞相比，梭菌属xiva群的百分比的更多增加和梭菌属xi群的更多减少所揭示的。对于枯草芽孢杆菌(dsm32315)与ala-gln、gly-glu和gly-gln的组合，对于地衣芽孢杆菌(dsm32314)与ala-gln、gly-glu和gly-gln的组合和解淀粉芽孢杆菌(cect5940)与ala-gln、gln、gly-glu和gly-gln的组合，观察到了这种协同作用(表1)。因此，在与含有谷氨酰胺或谷氨酸的二肽组合的这些益生菌菌株的存在下，人微生物群组成转变至更健康的群落。表1：在siem中人微生物群与添加的氨基酸、二肽和/或益生菌细胞(枯草芽孢杆菌dsm32315、地衣芽孢杆菌dsm32314或解淀粉芽孢杆菌cect5940)一起孵育24小时后，检测到的梭菌属xi(梭菌属_xi)、梭菌属xiva(梭菌属_xiva)以及其他微生物和它们的相对丰富度。实施例10：枯草芽孢杆菌(dsm32315)、地衣芽孢杆菌(dsm32314)或解淀粉芽孢杆菌(cect5940)与谷氨酰胺或含谷氨酰胺或谷氨酸的二肽的组合添加显示出对微生物群落的正丁酸酯产生的协同作用。如实施例1和5中所述，对于枯草芽孢杆菌(dsm32315)菌株分析了不同益生菌菌株与谷氨酰胺或含有含谷氨酰胺或谷氨酸的二肽的肽的组合对微生物群落的正丁酸酯产生的作用。添加单个氨基酸至3.5mm的浓度和添加二肽至7mm的浓度。孵育24小时后分析正丁酸酯含量。对于枯草芽孢杆菌(dsm32315)与gln、gly-gln、ala-gln、glu或gly-glu的组合，观察到了对正丁酸酯浓度的协同积极作用(图9)。这显示与谷氨酰胺或谷氨酸或含谷氨酰胺的肽组合的该益生菌菌株对微生物群落的有益正丁酸酯产生具有加速作用。作为阴性对照，测试了不含任何谷氨酰胺或谷氨酸的二肽gly-tyr，它对正丁酸酯产生没有积极作用。图9显示了在siem中与人微生物群一起孵育24小时后，在具有和不具有枯草芽孢杆菌dsm32315细胞的组合的情况下在分别含有不同氨基酸或二肽的结肠微生物群的存在下，测量的正丁酸酯浓度(mm)。实施例11：地衣芽孢杆菌(dsm32314)或解淀粉芽孢杆菌(cect5940)细胞与谷氨酰胺、含谷氨酰胺或谷氨酸的二肽的组合添加显示了对微生物群落的正丁酸酯产生的协同作用。如实施例1、5和10中所述，对于地衣芽孢杆菌(dsm32314)和解淀粉芽孢杆菌(cect5940)菌株分析了不同益生菌菌株与谷氨酰胺或含有含谷氨酰胺或谷氨酸的二肽的肽的组合对微生物群落的正丁酸酯产生的作用。添加单个氨基酸至3.5mm的浓度和添加二肽至7mm的浓度。孵育24小时后分析正丁酸酯含量。对于地衣芽孢杆菌(dsm32314)与gly-gln、ala-gln和gly-glu的组合，观察到了对正丁酸酯浓度的协同积极作用(图10)。对于解淀粉芽孢杆菌(cect5940)与gln和gly-gln的组合也如此。这显示与谷氨酰胺或谷氨酸或含谷氨酰胺的肽组合的该益生菌菌株对微生物群落的有益正丁酸酯产生具有加速作用。作为阴性对照，测试了不含任何谷氨酰胺或谷氨酸的二肽gly-tyr，它对正丁酸酯产生没有积极作用。图10显示了在siem中与人微生物群一起孵育24小时后，在具有和不具有地衣芽孢杆菌(dsm32314)或解淀粉芽孢杆菌(cect5940)细胞的组合的情况下在分别含有不同氨基酸或二肽的结肠微生物群的存在下，测量的正丁酸酯浓度(mm)。实施例12：包含枯草芽孢杆菌和二肽作为益生元的胶囊将以下成分填充入hpmc胶囊(尺码3)中。表2：用于填充入hpmc胶囊的制剂复方胶囊i胶囊ii胶囊iii枯草芽孢杆菌b2166mg(2×109cfu)10mg(1×108cfu)300mg(2×1010cfu)二肽ala-gln400mg50mg800mg维生素b120.0125mg0.0125mg0.0125mg维生素b60.7mg0.7mg0.7mg锌5mg5mg5mg生物素25mg25mg25mg胶囊还可包含选自菊粉、低聚果糖(fos)、低聚半乳糖(gos)、淀粉、果胶、β-葡聚糖和低聚木糖的其他益生元成分。胶囊还可包含一种或多种植物提取物，其选自西兰花、橄榄果、石榴、黑醋栗、蓝莓、越桔、沙棘、卡姆果、波森莓、姜黄、姜、大蒜、葡萄籽、阿萨伊浆果、野樱梅、枸杞果、辣根、齿叶乳香树、螺旋藻、人参、大麻二酚、玫瑰果、普洱茶、煎茶、紫锥菊和绿茶叶。胶囊可包含选自以下的其他维生素：维生素a、维生素b1(硫胺素)、维生素b2(核黄素)、维生素b3(烟酸)、维生素b5(泛酸)、维生素b9(叶酸或叶酸酯)、维生素c(抗坏血酸)、维生素d(钙化醇)、维生素e(生育酚和生育三烯酚)和维生素k(醌)；或选自硫、铁、氯、钙、铬、钴、铜、镁、锰、钼、碘和硒的其他矿物质。实施例13：包含枯草芽孢杆菌和二肽作为益生元以及肠溶衣的胶囊如实施例12中制备的胶囊用肠溶衣组合物包衣。表3：包衣组合物参考文献1.hillc,guarnerf,reidg,gibsongr,merensteindj,potb,morellil,cananirb,flinthj,salminensetal:expertconsensusdocument.theinternationalscientificassociationforprobioticsandprebioticsconsensusstatementonthescopeandappropriateuseofthetermprobiotic.natrevgastroenterolhepatol2014,11(8):506-514.2.collinsmd,lawsonpa,willemsa,cordobajj,fernandez-garayzabalj,garciap,caij,hippeh,farrowja:thephylogenyofthegenusclostridium:proposaloffivenewgeneraandelevennewspeciescombinations.intjsystbacteriol1994,44(4):812-826.3.holdgl,prydese,russellvj,furriee,flinthj:assessmentofmicrobialdiversityinhumancolonicsamplesby16srdnasequenceanalysis.femsmicrobiolecol2002,39(1):33-39.4.kohjh,choish,parksw,choinj,kimy,kimsh:synbioticimpactoftagatoseonviabilityoflactobacillusrhamnosusstrainggmediatedbythephosphotransferasesystem(pts).foodmicrobiol2013,36(1):7-13.5.pandeykr,naiksr,vakilbv:probiotics,prebioticsandsynbiotics-areview.jfoodscitechnol2015,52(12):7577-7587.6.gibsongr,hutkinsr,sandersme,prescottsl,reimerra,salminensj,scottk,stantonc,swansonks,canipdetal:expertconsensusdocument:theinternationalscientificassociationforprobioticsandprebiotics(isapp)consensusstatementonthedefinitionandscopeofprebiotics.natrevgastroenterolhepatol2017,14(8):491-502.7.desouzaaz,zambomaz,abboudky,reissk,tannihaof,guadagninid,saadmj,pradapo:oralsupplementationwithl-glutaminealtersgutmicrobiotaofobeseandoverweightadults:apilotstudy.nutrition2015,31(6):884-889.8.celascog,morol,aielloc,manganok,milasia,quattrocchic,rdim:calciumbutyrate:anti-inflammatoryeffectonexperimentalcolitisinratsandantitumorproperties.biomedrep2014,2(4):559-563.9.rivierea,selakm,lantind,leroyf,devuystl:bifidobacteriaandbutyrate-producingcolonbacteria:importanceandstrategiesfortheirstimulationinthehumangut.frontmicrobiol2016,7:979.10.vitalm,karcha,pieperdh:colonicbutyrate-producingcommunitiesinhumans:anoverviewusingomicsdata.msystems2017,2(6).11.gueimondem,sanchezb:enhancingprobioticstabilityinindustrialprocesses.microbecolhealthdis2012,23.12.rios-coviand,ruas-madiedop,margollesa,gueimondem,delosreyes-gavilancg,salazarn:intestinalshortchainfattyacidsandtheirlinkwithdietandhumanhealth.frontmicrobiol2016,7:185.13.halmost,subai:[physiologicalpatternsofintestinalmicrobiota.theroleofdysbacteriosisinobesity,insulinresistance,diabetesandmetabolicsyndrome].orvhetil2016,157(1):13-22.14.lopetusolr,chowdhrys,pizarrott:opposingfunctionsofclassicandnovelil-1familymembersinguthealthanddisease.frontimmunol2013,4:181.15.schlegelh:allgemeinemikrobiologie.georgthiemeverlag1992.16.foxad,kripkesa,depaulaj,bermanjm,settlerg,rombeaujl:effectofaglutamine-supplementedenteraldietonmethotrexate-inducedenterocolitis.jpenjparenterenteralnutr1988,12(4):325-331.17.rothe,karnerj,ollenschlagerg,karnerj,simmela,furstp,funovicsj:alanylglutaminereducesmusclelossofalanineandglutamineinpost-operativeanaesthetizeddogs.clinsci(lond)1988,75(6):641-648.18.guandalinis,rubinoa:developmentofdipeptidetransportintheintestinalmucosaofrabbits.pediatrres1982,16(2):99-103.19.millerpm,burstond,bruetonmj,matthewsdm:kineticsofuptakeofl-leucineandglycylsarcosineintonormalandproteinmalnourishedyoungratjejunum.pediatrres1984,18(6):504-508.20.vazquezja,morseel,adibisa:effectofstarvationonaminoacidandpeptidetransportandpeptidehydrolysisinhumans.amjphysiol1985,249(5pt1):g563-566.21.ladiratse,scholsha,nautaa,schotermanmh,keijserbj,montijnrc,gruppenh,schurenfh:high-throughputanalysisoftheimpactofantibioticsonthehumanintestinalmicrobiotacomposition.jmicrobiolmethods2013,92(3):387-397.22.minekusm,smeets-peetersm,bernaliera,marol-bonnins,havenaarr,marteaup,alricm,fontyg,huisin'tveldjh:acomputer-controlledsystemtosimulateconditionsofthelargeintestinewithperistalticmixing,waterabsorptionandabsorptionoffermentationproducts.applmicrobiolbiotechnol1999,53(1):108-114.23.scholzr,molohonkj,nachtigallj,vaterj,markleyal,sussmuthrd,mitchellda,borrissr:plantazolicin,anovelmicrocinb17/streptolysins-likenaturalproductfrombacillusamyloliquefaciensfzb42.jbacteriol2011,193(1):215-224.24.kozichjj,westcottsl,baxternt,highlandersk,schlosspd:developmentofadual-indexsequencingstrategyandcurationpipelineforanalyzingampliconsequencedataonthemiseqilluminasequencingplatform.applenvironmicrobiol2013,79(17):5112-5120.25.caporasojg,laubercl,costelloek,berg-lyonsd,gonzaleza,stombaughj,knightsd,gajerp,ravelj,fierernetal:movingpicturesofthehumanmicrobiome.genomebiol2011,12(5):r50.26.schlosspd,westcottsl,ryabint,halljr,hartmannm,hollistereb,lesniewskira,oakleybb,parksdh,robinsoncjetal:introducingmothur:open-source,platform-independent,community-supportedsoftwarefordescribingandcomparingmicrobialcommunities.applenvironmicrobiol2009,75(23):7537-7541.27.kongy:btrim:afast,lightweightadapterandqualitytrimmingprogramfornext-generationsequencingtechnologies.genomics2011,98(2):152-153.28.edgarrc,haasbj,clementejc,quincec,knightr:uchimeimprovessensitivityandspeedofchimeradetection.bioinformatics2011,27(16):2194-2200.29.wangq,garritygm,tiedjejm,colejr:naivebayesianclassifierforrapidassignmentofrrnasequencesintothenewbacterialtaxonomy.applenvironmicrobiol2007,73(16):5261-5267.30.erenam,maignienl,sulwj,murphylg,grimsl,morrisonhg,soginml:oligotyping:differentiatingbetweencloselyrelatedmicrobialtaxausing16srrnagenedata.methodsecolevol2013,4(12).序列表<110>赢创运营有限公司<120>合生元组合物<130>file:201800108<210>1<211>19<212>dna,正向引物<213>细菌16srrna基因<400>1cgaaagcgtggggagcaaa<210>2<211>19<212>dna,反向引物<213>细菌16srrna基因<400>2gttcgtactccccaggcgg<210>3<211>21<212>dna,pcr探针<213>细菌16srrna基因<400>3attagataccctggtagtcca2018001081当前第1页12