寄生虫疫苗的制作方法

寄生虫疫苗
1.本申请要求2018年5月15日提交的澳大利亚专利申请号2018901691和2018年12月5日提交的澳大利亚专利申请号2018904620的优先权。这些文件的全部内容通过引用整体并入本文。
2.本文引用或参考的所有文献和在本文引用的文献中引用或参考的所有文献，以及本文或通过引用并入本文的任何文献中提及的任何产品的任何制造商的说明书、描述、产品规格和产品表均通过引用整体并入本文。
3.出于所有目的，序列表电子提交的全部内容通过引用整体并入本文。
4.本文所引用的专利保藏证明的全部内容通过引用整体并入本文。
发明领域
5.本公开内容提供了突变体寄生虫，特别是原生动物寄生虫，其中包含刚地弓形虫(toxoplasma gondii)(在本文中称为“弓形虫”)的海藻糖
‑6‑
磷酸合酶/6
‑
磷酸磷酸酶(tps/tpp)样基因或其同源物的突变，本发明还提供了包含其的疫苗。
6.发明背景
7.顶复体门(phylum apicomplexa)包含一组专性的细胞内寄生虫，它们通过在宿主细胞内的主动侵袭和复制而引起一系列疾病。像所有细胞内病原体一样，这些寄生虫广泛修饰其宿主细胞，以防止免疫清除，同时允许营养物质的获取用于生长。
8.刚地弓形虫(弓形虫)是最常见的人类病原体之一，感染人群中10
‑
80％的个体(fischer hg等(1997)eur j immunol.27：1539
‑
48；)。在人类中，风险在于未出生的人类婴儿和免疫功能低下的个体。孕妇可能已经感染并在不知不觉中感染胎儿。即使得到诊断和治疗，孩子可能天生患有永久性的大脑和眼睛损伤。怀孕期间的诊断充其量是不确定的，并且治疗是不确定性的和有风险的。因此，努力防止怀孕期间的感染很重要。
9.弓形虫是弓形虫病的病因，它是一种专性的细胞内原生动物寄生虫。除了感染人类，它实际上可以感染所有温血动物。在世界范围内已经发现近三分之一的人类已经暴露于该寄生虫。弓形虫是通过摄入被猫粪污染的土壤、水或蔬菜中存在的孢子化卵囊，或者通过摄入带有组织胞囊的生肉或未煮熟的肉而传播的。
10.在农场牲畜中，例如绵羊和山羊等物种，先天性感染很普遍并且可以导致流产和新生儿死亡(buxton(1998)vet res 29：289
‑
310)。生产供人类食用的肉而饲养的动物可能受到弓形虫的持续感染，其包含在肌肉和内脏的组织胞囊中并且可能成为对于人的重要感染源。
11.猫是弓形虫生命周期和疾病流行病学中非常重要的动物。幼猫第一次猎获并食用野生啮齿类和鸟类时往往会感染弓形虫。初次感染后，猫将在其粪便中排出数百万个卵囊，根据气候条件，这些卵囊在环境中可以生存12
‑
18个月，它们是放牧动物的重要感染源(tenter等(2000)int j parasitol 30：1217
‑
1258)。
12.本领域已知可以对动物进行接种以抗弓形虫病。但是，迄今为止，疫苗还没有完全成功，或者存在缺点。例如，猫(弓形虫的重要载体)的初次感染后通常在建立免疫力之前就
发生卵囊脱落。这种现象大大破坏了免疫的目的，因为猫粪中的感染性卵囊是该疾病的主要载体。此外，用于哺乳动物的初次感染的所有已知的生物体株系尽管对于建立免疫力都是有效的，但它们往往会在哺乳动物中持续存在很长一段时间，甚至可能持续一生，结果是哺乳动物处于慢性感染。这进而增加了这样的可能性，即如果这种哺乳动物在以后的生活中受到免疫抑制，则感染可能会重新激活，导致衰弱甚至致命的后果，此外，不确定用于人类食用的肉和内脏是否会被该株系感染。
13.目前，只有一种基于弓形虫的减毒活s48株的商业疫苗“toxovax”(intervet)被许可用于避免母羊的先天性感染(buxton d(1993)parasitol today 9：335
‑
337)。但是，这种疫苗价格昂贵，引起不良反应，并且保质期短(因为通常需要在生产后3周内施用)。另外，由于疫苗的减毒是通过重复的连续传代产生的，因此由于其生长缓慢而使其生产缓慢。另外，疫苗在遗传上是不确定的，因此减毒机理未知。此外，研究表明该疫苗可以回复到致病株，因此不适合人类使用(zhang nz等(2013)expert rev.vaccines 12(11)：1287
‑
1299)。疫苗不产生卵囊，因此免疫系统在生命周期的这一阶段不会看到抗原。该疫苗的另一个缺点是仅对动物具有部分保护作用，其虽然导致胞囊水平的降低，但不完全消失，因为只有大约60
‑
70％的母羊受到了保护而不流产(zhang nz等(2013)expert rev.vaccines 12(11)：1287
‑
1299)。
14.因此，在本领域中需要有效的疫苗，当被接种到动物中时，其提供足够和一致的免疫水平，但是不会持续并通过恢复毒性而在被免疫的动物中引起慢性感染。此外，在本领域中需要遗传上确定的并且可以安全地用于非人动物和人的疫苗。
15.发明概述
16.在导致本公开内容的工作中，发明人确定了ca
2+
依赖性蛋白激酶cdpk 2是支链淀粉代谢的关键调节剂。cdpk2缺陷型寄生虫中支链淀粉的合成增加和降解减少导致这种糖聚合物的过度积累(uboldi a等(2015)host cell and microbe 18：670
‑
681)。
17.发明人现在已经鉴定了弓形虫中的一种蛋白质，该蛋白质与细菌、真菌和植物的海藻糖生物合成途径的两种酶，即海藻糖
‑6‑
磷酸合酶(tps)和海藻糖/6
‑
磷酸磷酸酶(tpp)具有同源性。值得注意的是，哺乳动物细胞中不存在tps和tpp蛋白以及它们发挥功能的海藻糖生物合成途径。弓形虫tps/tpp样基因包含串联排列的海藻糖6
‑
磷酸合酶(tps)
‑
样和海藻糖6
‑
磷酸磷酸酶(tpp)
‑
样结构域，以及n末端支链淀粉结合cbm20结构域，从而能够与支链淀粉直接相互作用。特别地，发明人已经发现该蛋白质在弓形虫中的葡萄糖/支链淀粉代谢中具有调节作用。但是，与植物蛋白质相反，寄生虫中的tps/tpp样蛋白缺乏重要的底物结合残基，也未检测到来自tps结构域的t6p生物合成活性以及来自tpp结构域的海藻糖生产。
18.本公开内容基于以下发现：在含有tps/tpp样基因或其同源物的寄生虫中tps/tpp样基因的破坏改变了该寄生虫中的淀粉(例如支链淀粉)代谢。更特别地，发明人发现，与cdpk2基因的破坏相比，tps/tpp样基因的破坏导致弓形虫寄生虫的更大的减毒。此外，tps/tpp样基因突变体不能形成胞囊。
19.与现有技术的疫苗例如toxovax相比，本发明的疫苗提供了许多优点。这些优点包括：
20.(i)它们是遗传上确定的；
21.(ii)它们具有已知的减毒机制；和
22.(iii)它们产生不持续存在于宿主中的胞囊(缓殖子)，从而允许启动免疫应答。但是，由于胞囊不能在宿主体内持续存在，因此传播至人类的风险非常低甚至不存在。
23.通过改变寄生虫的生长培养基以使其含有葡萄糖，可以实现本文所述的突变体tps/tpp寄生虫的减毒。在无葡萄糖的培养基中，寄生虫正常生长。然而，在含葡萄糖的培养基的存在下，包含tps/tpp
‑
样蛋白破坏的寄生虫将在细胞质中大量积累支链淀粉，这不受控制地继续进行。对于ii型突变体刚地弓形虫寄生虫，支链淀粉积累持续不受控制地进行会导致死亡。这样的包含tps/tpp样基因失活突变的突变体在说明书和实施例中称为δtps/tpp突变体。发明人在本文中显示，当将δtps/tpp寄生虫给予小鼠时，它们在体内变得完全减毒。
24.因此，包含δtps/tpp寄生虫的疫苗特别有用。因为寄生虫一旦引入宿主中就被减毒并最终死亡，它们不能在被免疫的宿主中恢复毒性，而且不能在被免疫的宿主中形成持久的组织胞囊。这些特性使疫苗对人和动物用途具有吸引力。
25.另外，包含δtps/tpp寄生虫的疫苗对于猫的免疫特别有用，因为卵囊产生依赖于正常的淀粉代谢，因此有可能防止卵囊的脱落。
26.在第一方面，本公开内容提供了分离的突变体寄生虫，其中突变体当在含葡萄糖的培养基中生长时被减毒，但在无葡萄糖的(即，包含谷氨酰胺的)培养基中不被减毒。如本文所用，术语“分离的突变体寄生虫”还旨在指代此类突变体寄生虫的群体。在一个特定的实例中，突变体是活的。在一个实例中，当在含葡萄糖的培养基中生长时，突变体寄生虫不受控制地积累淀粉样支链淀粉储存物。在另一个实例中，寄生虫是原生动物寄生虫。在一个特定的实例中，寄生虫是刚地弓形虫(t.gondii)。
27.在一个实例中，寄生虫包含刚地弓形虫的海藻糖
‑6‑
磷酸合酶/6
‑
磷酸磷酸酶(tps/tpp)样基因或其同源物的失活突变。在一个实例中，突变体寄生虫是δtps/tpp寄生虫。在一个实例中，突变体寄生虫不是如uboldi a等，(2015)cell host&microbe 18,670
‑
681中所述的δcdpk2突变体。
28.在一个实例中，tps/tpp样基因是弓形虫基因组学资源(命名为“toxodb.org”)中的tggt1_297720或其同源物。在一个实例中，tps/tpp样基因包含根据seq id no：1的序列或由其组成(图1)。在一个实例中，序列是tps/tpp样基因的基因组序列。在一个实例中，序列是tps/tpp样基因的cdna序列，例如如seq id no：3所示。tps/tpp样基因还延伸至弓形虫的tps/tpp样基因的同源物，所述同源物存在于寄生虫，特别是原生动物寄生虫，更特别是球虫寄生虫中。在一些实例中，同源物与seq id no：1或其n
‑
末端200个核苷酸(seq id no：2)包含至少80％的同一性。
29.技术人员将理解，根据本公开内容，可以通过多种不同的方法使基因失活或突变。在一个实例中，突变导致tps/tpp样基因的失活，这是通过基因的靶向或非靶向(即随机)破坏来实现的。破坏可以发生在tps/tpp样基因的编码或非编码序列中。在另一个实例中，tps/tpp样基因功能的失活是由tps/tpp基因上游的一个或多个调节序列的破坏从而阻止了该基因的转录而引起的。在另一个实例中，破坏是tps/tpp样基因的编码序列中的移码突变。在一个实例中，tps样结构域或tpp样结构域被破坏或失活(部分地或全部地)。在另一个实例中，tps样结构域和tpp样结构域都被破坏或失活(部分地或全部地)。在另一个实例中，
tps/tpp样基因的失活是由基因敲低或基因敲除引起的。
30.在某些实例中，tps/tpp样基因的靶向破坏包括tps/tpp样基因中一个或多个连续核苷酸的插入或缺失。在其他实例中，插入或缺失引起tps/tpp样基因序列中的移码。在另一个实例中，插入或缺失导致终止密码子的形成，从而截短了所得蛋白质的翻译。更进一步，tps/tpp样基因的失活可能通过去除所有基因而发生(即无义突变)。
31.在一个实例中，tps/tpp样基因被失活或破坏，使得当在含葡萄糖的培养基中生长时，该寄生虫中发生不受控制的支链淀粉积累。
32.在一个实例中，突变体寄生虫在tps/tpp样基因例如根据seq id no：1或seq id no：3的tps/tpp样基因序列内包含一个或多个连续或非连续异源核苷酸的插入。在另一个实例中，突变体寄生虫包含tps/tpp样基因序列例如根据seq id no：1或seq id no：3的tps/tpp样基因序列内的一个或多个连续或非连续天然核苷酸的缺失。
33.例如，突变寄生虫可以在弓形虫的tps/tpp样基因或其同源物内包含1至1500个异源核苷酸的插入。在另一个实例中，突变体寄生虫包含1至1000个异源核苷酸，1至800个异源核苷酸，1至750个异源核苷酸，1至500个异源核苷酸，1至250个异源核苷酸，1至100个异源核苷酸，1至50个异源核苷酸，1至25个异源核苷酸，1至20个异源核苷酸，1至15个异源核苷酸，1至10个异源核苷酸或1至5个异源核苷酸的插入。突变体寄生虫可以包含至少三个，至少五个，至少十个，至少二十个，至少四十个，至少五十个，至少八十个，至少一百个和/或多达五百个异源核苷酸的插入。插入的核苷酸可以是连续的或非连续的。
34.在某些实例中，突变体寄生虫包含tps/tpp样基因序列内的天然核苷酸的缺失。在进一步的实例中，突变体寄生虫在弓形虫的天然tps/tpp样基因序列或其同源物内包含1至1000个连续核苷酸，1至800个连续核苷酸，1至750个连续核苷酸，1至500个连续核苷酸，1至250个连续核苷酸，1至100个连续核苷酸，1至50个连续核苷酸，1至25个连续核苷酸，1至20个连续核苷酸，1至15个连续核苷酸，1至10个连续核苷酸或1至5个连续核苷酸的缺失。突变体寄生虫可以包含至少三个，至少五个，至少十个，至少二十个，至少四十个，至少五十个，至少八十个，至少一百个和/或多达五百个天然核苷酸的缺失。
35.在另一个实例中，缺失的核苷酸是不连续的。
36.在另一个实例中，与相应的含有野生型tps/tpp的寄生虫相比，tps/tpp突变体寄生虫(δtps/tpp寄生虫)以快得多的速度积累支链淀粉储存物。
37.tps/tpp样基因可以在基因内的任何位置(例如，在tps/tpp样基因序列内的任何核苷酸位置)被破坏。更特别地，破坏可发生在seq id no：1，seq id no：2(对应于来自seq id no：1的n末端的前200个核苷酸)或seq id no：3所示的tps/tpp样基因序列内的任何核苷酸位置。在一个实例中，tps/tpp样基因的破坏可以在tps样结构域内发生。在一个实例中，tps/tpp样基因的破坏可以在tpp样结构域内发生。在一个实例中，tps/tpp样基因的破坏可以发生在支链淀粉结合结构域(也称为碳水化合物结合结构域20(即cbm20))内。
38.在某些实例中，tps/tpp样基因或其同源物在由seq id no：1或seq id no：2的1至99位的核苷酸残基限定的第一外显子序列内的位点处被破坏。在其他实例中，tps/tpp样基因在根据seq id no：1的tps/tpp样基因序列或其同源物的第二外显子序列内，第三外显子序列内，第四外显子序列内，第五外显子序列内，第六外显子序列内，第七外显子序列内，第八外显子序列内，第九外显子序列内，第十外显子序列内，第十一外显子序列内，第十二外
no：7)。
51.在另一个具体实例中，突变体包含seq id no：1的位置48至115的核苷酸残基的缺失。在另一个具体实例中，突变体包含序列gacagacttcggtgaacgagtcgcctgcgccgcttcgtg(seq id no：9)。
52.本公开内容还提供了由美国典型培养物保藏中心保藏并且名称为pta
‑
125166的刚地弓形虫突变体(在本文中也称为pru:tdtomato:tps/tpp)。
53.本公开内容还提供了由美国典型培养物保藏中心保藏并且名称为pta
‑
125165(本文也称为rh:dhxgprt:dtps/tpp cl
‑
23(seq id no：7))的刚地弓形虫突变体。
54.本公开内容还考虑了突变体寄生虫，其包含与本文所述的灭活或破坏的tps/tpp样基因组合的一个或多个另外的基因激活、失活或破坏，其中淀粉积累相对于野生型寄生虫得到增加。在一个实例中，所述另外的基因是cdpk2基因。uboldi a等(2015)cell host&microbe 18,670
‑
681)中描述了包含cdpk2基因失活(δcdpk2)的寄生虫的生成。因此，在一个实例中，本公开内容提供了突变体寄生虫，其包含tps/tpp样基因中的突变和cdpk2基因中的突变或由其组成。特别地，所述突变使得正常的淀粉代谢在突变体寄生虫中受损。在一个实例中，突变的组合导致以下一种或多种：i)支链淀粉颗粒的尺寸增加，ii)支链淀粉颗粒的数量增加，或iii)支链淀粉颗粒的更快积累。
55.在另一个实例中，突变体寄生虫包含tps/tpp样基因和修饰的己糖激酶(hxk)基因中的突变或由其组成。在一个实例中，己糖激酶是如本文所述经c
‑
末端修饰的。在一个实例中，突变体寄生虫包含具有以下序列advnagagypydvpdyaagagpragagypydvpdyaagagpgdvdiel(seq id no：20)的修饰的c末端。
56.在一个实例中，突变体寄生虫包含突变的tps/tpp样基因和加ha标签的hxk基因(称为δtps/tpp:hxk
‑
ha)或由其组成。
57.本公开内容还提供了由美国典型培养物保藏中心保藏并且名称为pta
‑
125164的刚地弓形虫突变体(在本文中也称为rh:δhxgprt:ku80:δtps/tpp:hxk
‑
ha cl
‑
1seq id no：9)。
58.本领域技术人员将熟悉可用于在tps/tpp样基因序列内引入核苷酸残基的靶向或非靶向(即随机)插入或缺失的方法。例如，可以使用簇状规则间隔的短回文重复(crispr)进行tps/tpp样基因的靶向破坏。如果要使用crispr，则可以设计与靶基因的约20bp区域相对应的原型
‑
间隔子序列以及包括gg二核苷酸并紧随待靶向的dna序列的约2
‑
6bp的原型
‑
间隔子相邻基序。crispr方法学是本领域已知的，并且例如在shen b等(2014)mbio 13；5(3)中进行了描述。在另一个实例中，tps/tpp样基因的破坏是由同源重组引起的。在又另一个实例中，tps/tpp样基因的破坏是由诱变引起的。在还另一个实例中，tps/tpp样基因的破坏是由基因敲除引起的。在又一个实例中，tps/tpp样基因的破坏是通过使用“基因打靶”策略引起的，如在例如michel cohen
‑
tannoudji和charles babinet(1998)molecular human reproduction vol 4(10)：929
‑
938中描述的。本领域已知的用于破坏或灭活基因的其他方法被认为在本公开内容的范围内。
59.在第二方面，本公开内容提供了疫苗，其包含根据本公开的第一方面的突变体寄生虫。在一个实例中，所述疫苗包含分离的突变体细胞内寄生虫，其中所述寄生虫当在含葡萄糖的培养基中生长时不受控制地积累淀粉样支链淀粉储存物。在另一个实例中，所述寄
生虫是原生动物寄生虫。在另一个实例中，所述疫苗包含具有海藻糖
‑
6磷酸合酶/6磷酸磷酸酶(tps/tpp)样基因的失活突变的寄生虫。
60.在一个实例中，所述寄生虫是弓形虫或本文描述的其他寄生虫。
61.在一个实例中，所述疫苗进一步包含药学上可接受的载体或赋形剂。
62.在另一个实例中，所述突变体寄生虫不能在免疫接种了所述疫苗的动物中持续存在。例如，所述突变体寄生虫不能在免疫接种的动物中保持存活超过2
‑
3天。
63.在一个实例中，在免疫接种所述疫苗的动物中防止或基本上减少了卵囊脱落。
64.在一个实例中，在施用给动物之前通过在含葡萄糖的培养基中生长而对突变体寄生虫进行体外减毒。这种减毒可以通过在含葡萄糖的培养基中培养所述突变体寄生虫一段合适的时间以允许在寄生虫中形成淀粉颗粒来实现。在一个实例中，培养期为约1
‑
7天，优选地约1
‑
2天。在另一个实例中，培养期为约24小时。
65.在第三方面，本公开内容提供了对动物进行免疫接种以抗寄生虫的方法，包括向所述动物施用根据第一方面的突变体寄生虫或根据第二方面的包含突变体寄生虫的疫苗。在一个实例中，寄生虫是原生动物寄生虫。在一个实例中，所述方法是对动物进行免疫接种以抗弓形虫病的方法。在另一个实例中，对动物进行免疫接种以抗弓形虫病的方法包括向所述动物施用根据第一方面的突变体弓形虫寄生虫或根据第二方面的包含突变体弓形虫寄生虫的疫苗。
66.在一个实例中，疫苗以有效量施用给动物。
67.根据这个方面，待免疫接种的动物可以是任何温血动物，并且优选地是易患弓形虫病的动物。温血动物也可以包括猫科成员(弓形虫的天然宿主)。
68.在另一个实例中，动物选自由人、牛、绵羊、山羊、鸟、猫、猪、新大陆猴、澳大利亚本土有袋动物、熊、鹿或浣熊组成的组。澳大利亚本土有袋动物的实例包括考拉、袋鼠、沙袋鼠、短尾小袋鼠、袋熊、袋鼬、袋獾、无尾负鼠、长鼻袋鼠和袋鼩。
69.在另一个实例中，人是未怀孕的女性。
70.在第四方面，本公开内容提供了对动物进行免疫接种以抗不伴随有卵囊脱落的寄生虫感染或病况的方法，包括向所述动物施用根据第一方面的突变体寄生虫或根据第二方面的疫苗。例如，所述寄生虫感染可以包括弓形虫引起的弓形虫病，所述寄生虫病况可以包括自然流产。
71.在一个实例中，本公开内容提供了对动物进行免疫接种以抗不伴随卵囊脱落的弓形虫病的方法，包括向所述动物施用根据第一方面的突变体弓形虫寄生虫或根据第二方面的包含突变体弓形虫寄生虫的疫苗。
72.在一个实例中，所述动物是猫，例如家猫。
73.在某些实例中，本公开内容的疫苗能够提供针对随后的弓形虫攻击的保护。
74.所述疫苗可以任何合适的形式施用给动物，包括肌肉内、皮下和口服。在一个特定的实例中，疫苗是经口服施用的。
75.在一个实例中，所述疫苗与药学上可接受的载体或赋形剂一起施用。在另一个实例中，所述药学上可接受的载体是盐水。
76.将寄生虫施用给动物的形式(即性阶段)可以不同。例如，所述疫苗可以包含速殖子和/或缓殖子形式的突变体寄生虫。在另一个实例中，所述疫苗可以包含卵囊形式的突变
体寄生虫。
77.施用给动物的疫苗剂量将取决于动物的大小和体重，由临床医生或兽医决定。在某些实例中，疫苗剂量包含至少约1,000
‑
2,000个寄生虫(例如速殖子)。在其他实例中，取决于动物，疫苗剂量可以包含至少约1,500、1,800、2,200、2,500、5,000、8,000或10,000或更多的寄生虫(例如速殖子)。
78.应当理解，以卵囊形式提供的疫苗将不需要在冷藏条件下(例如，在2
‑
8℃之间的温度)存储。因此，这有利于以方便和成本低的方式将疫苗运输到边远社区，并允许在不损害疫苗质量(即效力)的情况下运输疫苗。在某些实例中，疫苗剂量可以包含至少约20个卵囊。在其他实例中，疫苗包含至少约30、40、50、60、70、80、90、100个卵囊。在又另一个实例中，疫苗包含100至200个卵囊。在某些实例中，将卵囊与药学上可接受的稀释剂或赋形剂一起提供。
79.疫苗可以以单剂量或多剂量施用给动物。
80.在一个实例中，在配种或交配之前将疫苗施用给动物。在另一个实例中，在配种或交配之前至少四周将疫苗施用给动物。
81.在一些实例中，疫苗可以进一步包含佐剂。
82.在某些实例中，疫苗与使用说明书一起提供。使用说明书可能要求在施用给动物进行免疫之前对疫苗进行重构。例如，如果疫苗以卵囊形式提供，则可以将疫苗与合适的药学上可接受的稀释剂或赋形剂一起提供，其中在直接施用给动物之前将后者添加到卵囊中。
83.在某些实例中，卵囊可以在富含谷氨酰胺的培养基中培养足以将卵囊转化为速殖子的一段时间。在一个实例中，培养期为约3
‑
4天。在将速殖子添加到合适的药学上可接受的稀释剂或赋形剂中之后，可将其用于免疫动物。速殖子在免疫动物后自然会变得减毒，因为寄生虫将从免疫的宿主动物获得其葡萄糖源。
84.在替代的实例中，可以通过将培养基转移到包含葡萄糖或葡萄糖和谷氨酰胺的培养基中，在施用给动物之前在培养物中使培养的速殖子减毒。然后可以将速殖子培养一段时间，以使淀粉颗粒与寄生虫一起积累。在一个实例中，如上所述，该培养期为约1
‑
2天。寄生虫中淀粉颗粒的积累可以通过培养物样品中的显微镜检查或高碘酸
‑
席夫(pas)染色明显地确定。
85.在第五方面，本公开内容提供了根据第一方面的突变体寄生虫或根据第二方面的包含突变体寄生虫的疫苗在制备用于对动物进行免疫接种的药物中的用途。在一个实例中，所述药物用于对动物进行免疫接种以抗弓形虫病。
86.在一个具体实例中，本公开内容提供了根据第一方面的突变体弓形虫寄生虫或根据第二方面的包含突变体弓形虫寄生虫的疫苗在制备用于对动物进行免疫接种以抗弓形虫病的药物中的用途。
87.在第六方面，本公开内容提供了根据第一方面的突变体寄生虫或根据第二方面的包含突变体寄生虫的疫苗，用于或当用于对动物进行免疫接种时。在一个实例中，所述用途是用于对动物进行免疫接种以抗弓形虫病。
88.在第七方面，本公开内容提供了预防动物中弓形虫病的方法，该方法包括向所述动物施用根据第一方面的突变体弓形虫寄生虫或根据第二方面的包含突变体弓形虫寄生
虫的疫苗。
89.在第八方面，本公开内容提供了包含seq id no：10和seq id no：11所示的序列或由其组成的寡核苷酸引物用于破坏刚地弓形虫的tps/tpp样基因的方法。在一个特定的实例中，所述方法是crispr/cas9。
90.在第九方面，本公开内容提供了破坏刚地弓形虫的tps/tpp样基因的crispr/cas9方法，其中该方法包括寡核苷酸引物，其包含seq id no：10和seq id no：11所示的序列或由其组成。
91.在第十方面，本公开内容提供了寡核苷酸引物对，包括以下或由以下组成：
92.(i)seq id no：12和seq id no：13；
93.(ii)seq id no：14和seq id no：15；或
94.(iii)seq id no：16和seq id no：17。
95.在第十一方面，本公开内容提供了试剂盒，其中包括：包含缺乏功能性tps/tpp样基因的突变体卵囊的第一容器；包含药学上可接受的赋形剂或稀释剂的第二容器；用于合并容器的内容物和对动物进行免疫接种的递送装置和说明书。在一个实例中，所述容器是安瓿或小瓶。在某些实例中，所述安瓿瓶或小瓶包括可以用注射器刺穿的密封件。在另一个实例中，递送装置是用于将疫苗施用给动物的注射器。在另一个实例中，突变体卵囊是弓形虫卵囊。
附图说明
96.图1显示了来自刚地弓形虫的tps/tpp样基因的基因组序列。内含子突出显示。原型
‑
间隔子序列具有下划线，然后是被crispr靶向的agg pam序列。
97.图2显示了tps/tpp样基因的n端序列(前200个核苷酸)。指示了原型
‑
间隔子序列和pam序列。
98.图3显示了a)刚地弓形虫的野生型(wt)tps/tpp样基因的序列，指示了原型
‑
间隔序列(粗体和带下划线的文本)和pam基序(突出显示)的位置。b)具有单个“c”核苷酸插入的rh:δhxgprt:δtps/tpp克隆
‑
1的序列。c)具有源自crispr/cas9质粒的183bp插入(a+182bp)的rh:δhxgprt:δtps/tpp克隆
‑
2的序列。d)具有单个“t”碱基缺失的rh:δhxgprt:δtps/tpp克隆
‑
23的序列。e)具有大于1000bp的插入的pru:tdtomato:δtps/tpp cl
‑
2的序列。f)具有58bp缺失的rh:δhxgprt:δtps/tpp:己糖激酶
‑
ha cl
‑
1的序列，包括完整的原型间隔子序列和pam基序。
99.图4显示了刚地弓形虫己糖激酶(hxk)的基因组序列。内含子突出显示。
100.图5显示了在含葡萄糖的培养基中生长的δtps/tpp寄生虫积累支链淀粉，并且在体内显示降低的毒力。a)rh:δtps/tpp寄生虫积累大量的支链淀粉。通过高碘酸
‑
希夫荧光检测支链淀粉。比例尺＝5μm。b)噬菌斑测定法指示rh:δtps/tpp寄生虫不能在葡萄糖上生长。pas荧光显示与在无葡萄糖、含谷氨酰胺的培养基中生长时的无或低支链淀粉水平相比，在含葡萄糖的培养基中支链淀粉的积累。c)ii型pru:tdtomato:δtps/tpp寄生虫在含葡萄糖的培养基中过度积累支链淀粉，导致形态畸变。pru:tdtomato:δtps/tpp寄生虫在缺乏葡萄糖的培养基中生成，然后切换到含葡萄糖的培养基。通过ifa用抗gap45抗体检测到的gap45染色指示寄生虫外周。比例尺代表10μm。d)感染了野生型pru:tdtomato寄生虫的
c57bl/6小鼠随着时间损失显著的体重，并且在感染后10天达到损失峰值。相反，感染了pru:tdtomato:δtps/tpp寄生虫的小鼠没有损失体重。e)在感染后约10天，感染了野生型pru寄生虫的c57bl/6小鼠迅速死于感染。相反，在实验过程中，感染了pru:tdtomato:δtps/tpp寄生虫的小鼠保持健康。用10000个pru:tdtomato:δtps/tpp或wt寄生虫接种c57bl/6小鼠，并随时间监测其体重和存活的变化。
101.图6显示了a)细胞内rh:δtps/tpp速殖子超积累支链淀粉，b)当在含葡萄糖的培养基中培养时用pas染色进行检测。
102.图7显示了a)总支链淀粉库和b)提取、淀粉酶消化和gc/ms后测量分离的亲代rh和rh:δtps/tpp速殖子中的
13
c
‑
葡萄糖水平。
103.图8显示了通过lc/ms确定的亲代rh和rh:δtps/tpp速殖子中的极性代谢物水平。
104.图9显示了a)亲本rh和rh:δtgtps/tpp速殖子的葡萄糖摄入，使用
14
c
‑
葡萄糖。b)通过用
13
c
‑
葡萄糖标记寄生虫并通过用gc/ms追踪
13
c掺入葡萄糖
‑6‑
磷酸来评估葡萄糖
‑6‑
磷酸的细胞内库的周转动力学。
105.图10显示了支链淀粉颗粒在δtps/tpp:hxk
‑
ha寄生虫中的大量积累，导致缺乏存活的寄生虫。tghxk的加ha表位标签的形式在标准的含葡萄糖培养基中培养1天、4天和7天的rd::δtgtps/tpp寄生虫和感染的成纤维细胞中表达。在不同时间点拍摄感染的宿主细胞的免疫荧光图像，并用抗ha(tghxk)和gap45(内膜复合物)染色。
106.图11pas荧光显示当从无葡萄糖的培养基切换到含葡萄糖的培养基时，δtps/tpp:hxk
‑
ha寄生虫随时间积累大量的支链淀粉并最终死亡。
107.图12显示δcdpk2:hxk
‑
ha寄生虫的支链淀粉水平与δcdpk2寄生虫相当，并且可以在含葡萄糖的培养基中维持而不丧失活力。白色箭头指示支链淀粉颗粒，绿色染色指示hxk
‑
ha蛋白表达，如用抗ha抗体和alexafluor
‑
488二抗探测的ifa所检测到的。比例尺代表5μm。
108.图13通过对己糖激酶(δtps/tpp:hxk
‑
ha)寄生虫进行加双ha标签的c末端修饰导致催化活性的增加。使用偶联的g6pdh光谱测定法确定hxk的活性。
109.图14显示了加myc标签的tgtps/tpp在野生型rh寄生虫(上图)和在刚地弓形虫δcdpk2突变体(下图)中的定位。上图显示了tps/tpp在野生型寄生虫中的表达，而下图显示了，如存在的话，则tps/tpp定位在支链淀粉颗粒上，如cdpk2 ko寄生虫的情况一样，因此cbm20结构域是有功能的。感染的宿主细胞用抗myc(tgtps/tpp)和抗tom(线粒体)抗体进行标记，并用dic显现残留的抗体。
110.图15显示裂解了表达tgtps/tpp
‑
3myc的rh寄生虫并在直链淀粉柱上对细胞质提取物进行分级分离。加myc标签的蛋白很大程度上与结合的级分相关。
111.图16δtps/tpp寄生虫中的缓殖子胞囊发育不良。在进行ifa之前，用速殖子感染宿主细胞，并在存在缓殖子诱导培养基的情况下使其分化2天和7天。用抗srs9抗体检测缓殖子表面蛋白srs9，而通过pas染色检测支链淀粉。比例尺代表5μm。
112.图17用δtps/tpp弓形虫的免疫接种提供了针对随后的攻击的保护作用。用1x104野生型(pruδhx)弓形虫速殖子i.p.攻击首次用于实验的(naive)以及经过δtps/tpp免疫接种的动物。a)每天监测体重和b)生成kaplan
‑
meier存活曲线。当动物连续三天以上体重下降10％或一天以上体重下降15％时，将其淘汰。
113.序列表的说明
114.seq id no：1：显示来自刚地弓形虫的tps/tpp样基因的基因组序列。
115.seq id no：2：显示tps/tpp样基因的n末端序列(前200个核苷酸)。
116.seq id no：3：显示来自刚地弓形虫的tps/tpp样基因的cdna序列。
117.seq id no：4：来自刚地弓形虫的野生型tps/tpp
‑
样基因的靶向crispr的n
‑
末端部分的序列，包括20bp wt原型间隔子序列和pam基序。
118.seq id no：5：显示来自刚地弓形虫的突变的tps/tpp样基因的部分的序列，其在残基18处包含单个c插入(图3b)。
119.seq id no：6：显示来自刚地弓形虫的突变的tps/tpp样基因的部分的序列，其在残基15之后包含异源核苷酸的插入(图3c)。
120.seq id no：7：显示来自刚地弓形虫的突变的tps/tpp样基因的部分的序列，其含有单个t核苷酸(3d)的缺失。
121.seq id no：8：显示来自刚地弓形虫的突变的tps/tpp样基因的部分的序列，其在残基20之后包含大于1000个核苷酸的插入(图3e)。
122.seq id no：9：显示来自刚地弓形虫的突变的tps/tpp样基因的部分的序列，其具有58bp的缺失，包括完整的原间隔子序列和pam基序(图3f)。
123.seq id no：10：显示寡核苷酸引物的序列。
124.seq id no：11：显示寡核苷酸引物的序列。
125.seq id no：12：显示寡核苷酸引物的序列。
126.seq id no：13：显示寡核苷酸引物的序列。
127.seq id no：14：显示寡核苷酸引物的序列。
128.seq id no：15：显示寡核苷酸引物的序列。
129.seq id no：16：显示寡核苷酸引物的序列。
130.seq id no：17：显示寡核苷酸引物的序列。
131.seq id no：18：显示在seq id no：4内包含183bp插入序列的突变体的序列。
132.seq id no：19：显示突变体的序列，其包含破坏seq id no：8中的tps/tpp基因座的＞1kb插入序列(获得的部分序列)。
133.seq id no：20：显示加ha
‑
标签的己糖激酶修饰的c
‑
末端的序列。
134.seq id no：21：显示来自seq id no：9的58bp缺失序列。
135.seq id no：22：显示20bp的原型间隔子的序列。
136.seq id no：23：显示来自刚地弓形虫的己糖激酶基因的基因组序列。
137.seq id no：24：gblock no.1的序列。
138.seq id no：25：gblock no.2的序列。
139.seq id no：26：gblock no.3的序列。
140.seq id no：27：gblock no.4的序列。
141.seq id no：28：gblock no.5的序列。
142.seq id no：29：gblock no.6的序列。
143.seq id no：30：gblock no.7的序列。
144.seq id no：31：gblock no.8的序列。
145.seq id no：32：gblock no.9的序列。
146.seq id no：33：gblock no.10的序列。
147.seq id no：34：正向引物的序列。
148.seq id no：35：反向引物的序列。
149.seq id no：36：正向引物的序列。
150.seq id no：37：反向引物的序列。
151.seq id no：38：正向引物的序列。
152.seq id no：39：反向引物的序列。
153.seq id no：40：正向引物的序列。
154.seq id no：41：反向引物的序列。
155.seq id no：42：正向引物的序列。
156.seq id no：43：反向引物的序列。
157.seq id no：44：反向引物的序列。
158.seq id no：45：正向引物的序列。
159.seq id no：46：正向引物的序列。
160.seq id no：47：短接头的序列。
161.seq id no：48：长接头的序列。
162.seq id no：49：正向引物的序列。
163.seq id no：50：正向引物的序列。
164.seq id no：51：反向引物的序列。
165.seq id no：52：正向引物的序列。
166.seq id no：53：反向引物的序列。
167.seq id no：54：反向引物的序列。
168.seq id no：55：正向引物的序列。
169.seq id no：56：寡核苷酸序列。
170.seq id no：57：寡核苷酸序列。
171.seq id no：58：寡核苷酸序列。
172.seq id no：59：寡核苷酸序列。
173.seq id no：60：寡核苷酸序列。
174.seq id no：61：寡核苷酸序列。
175.seq id no：62：寡核苷酸序列。
176.seq id no：63：寡核苷酸序列。
177.详细描述
178.总述
179.在整个说明书中，除非另有明确说明或上下文另有要求，否则对单个步骤、物质组成、步骤组或物质组成组的提及应视为包含那些步骤、物质组成、步骤组或物质组成组中的一个和多个(即一个或多个)。
180.本领域技术人员将认识到，除了具体描述的内容以外，本公开内容还可以进行变化和修改。应当理解，本公开内容包括所有这样的变化和修改。本公开内容还单独地或共同
地包括在本说明书中提及或指示的所有步骤、特征、组合物和化合物，以及所述步骤或特征的任何和所有组合或者任何两个或更多个。
181.本公开内容不限于本文描述的具体实例的范围，这些具体实例仅旨在示例的目的。功能等效的产品、组合物和方法显然在本公开的范围内。
182.除非另有明确说明，否则本文中的公开内容的任何实例应作必要的变通而应用于本公开内容的任何其他实例。
183.除非另有明确定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语均应具有与本领域普通技术人员通常理解的相同含义(例如，在细胞培养、分子遗传学、免疫学、免疫组织化学、蛋白质化学和生物化学)。
184.除非另有说明，否则本公开内容中使用的重组蛋白、细胞培养和免疫学技术是本领域技术人员众所周知的标准程序。在诸如perbal(1984)，sambrook等(1989)，brown(1991)，glover和hames(1995和1996)和ausubel等(1988，包括至今所有的更新)，harlow和lane，(1988)，coligan等(包括至今所有的更新)和zola(1987)的整个文献中都描述和解释了这些技术。
185.在整个说明书中，词语“包括”或诸如“含有”或“包含”的变体将理解为暗示包括陈述的元素、整数或步骤，或者元素、整数或步骤的组，但不排除任何其他元素、整数或步骤，或者元素、整数或步骤的组。
186.如本文中所使用的，术语“衍生自”应认为指示可以从特定来源获得指定的整数，尽管不一定直接从该来源获得。
187.本发明采用本领域技术范围内的常规分子生物学、微生物学和重组dna技术。参见例如sambrook等“molecular cloning”a laboratory manual(1989)。
188.选择的定义
189.术语“和/或”，例如“x和/或y”应理解为表示“x和y”或者“x或y”，并且应理解为对这两种方式或任一含义提供明确的支持。
190.除非上下文另有指示，否则提及单数形式“一”、“一个”和“该”也应理解为暗示包括复数形式。
191.此外，在本文中使用的“和/或”应被视为具体公开两个指定特征或部件中的每个，其中有或没有另一个。因此，在本文中在诸如“a和/或b”的短语中使用的术语“和/或”旨在包括“a和b”、“a或b”、“a”(单独)和“b”(单独)。同样地，在诸如“a、b和/或c”的短语中使用的术语“和/或”旨在涵盖以下每个实施方案：a、b和c；a、b或c；a或c；a或b；b或c；a和c；a和b；b和c；a(单独)；b(单独)；和c(单独)。
192.术语“约”在本文中用来表示大约、大致、左右或在范围中。当术语“约”与数值范围结合使用时，它通过扩展上述数值上下的边界来修改该范围。通常，术语“约”在本文中用于指以高于或低于所述值10％范围内的方差(更高或更低)来修改数值。
[0193]“分离的”是指从其天然环境中取出的寄生虫。在一个特定的实例中，它是指突变体寄生虫，其基因型相对于天然寄生虫有所改变。
[0194]
如本文所用，术语“破坏”是指其天然序列已经通过在所述序列内插入或缺失核苷酸而被修饰的基因(例如，tps/tpp样基因)。插入或缺失可以涵盖靶序列内的单个核苷酸或多达数千个核苷酸。插入或缺失的核苷酸可以是连续的、部分连续的或不连续的。术语“破
坏”理解为涵盖在序列内特定核苷酸位置处引入的突变或引导在靶向突变的核苷酸的特定区域内发生的突变。术语“破坏”也包括的非靶向破坏理解为是指将随机引入的突变引入序列，这意味着突变是在给定序列内的随机位置(未预先确定)引入的。本文描述的源自crispr的突变在本领域中通常理解为是指靶向的突变。虽然无法预测crispr修复机制是否导致核苷酸的插入或缺失，但使用原型
‑
间隔子和pam基序将突变引导至序列内的特定位置(例如，本文所述的tps/tpp样基因)。
[0195]
本文所用术语“敲除”是指其中基因的一部分或全部被人造dna片段替代或破坏的过程，所述人造dna片段例如是来自弓形虫或另一生物或者来自用于转染的含cas9和rna指导的质粒的dna片段。
[0196]
如本文所用，术语“天然tps/tpp样基因”是指具有串联排列的海藻糖
‑6‑
磷酸合酶(tps)和海藻糖6
‑
磷酸磷酸酶(tpp)结构域以及n
‑
末端支链淀粉结合cbm20结构域的基因。所述基因是以天然存在于给定寄生物中的形式的基因。例如，弓形虫中的天然tps/tpp样基因序列可以衍生自弓形虫基因组资源(www.toxodb.org)中的toxodb基因id tggt1_297720(如图1所示)。
[0197]
本文所用的术语“失活突变”是指对给定基因的转录产生负面影响从而不能产生所得蛋白质的突变。失活突变可以通过不同的方式产生，例如基因序列内天然核苷酸的缺失或异源核苷酸的插入。，失活突变也可以由与天然序列相比导致基因序列的移码的插入或缺失引起。
[0198]
术语tps/tpp样基因的“其同源物”是指与称为toxodb基因id tggt1_297720的tps/tpp样基因在遗传上相关的基因序列(图1所示)。在本公开内容的上下文中，它指存在于弓形虫以外的其他寄生生物中的其他tps/tpp样基因，其中此类寄生虫也将能量存储为支链淀粉。此类同源物可以包含与刚地弓形虫的tps/tpp样基因至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少92％，至少95％，至少97％，至少98％，至少99％相同的序列。
[0199]
如本文所用，术语“球菌”是指属于顶复体纲(apicomplexan)的专性细胞内寄生虫。此类寄生虫必须在动物细胞内生活和繁殖。
[0200]
如本文所用，术语“组合物”是指包含至少一种治疗或生物活性剂并且适合于施用给受试者的任何组合物。这些制剂中的任何一种都可以通过本领域熟知的和公认的方法制备。参见例如，gennaro，a.r.，ed.,remington:the science and practice of pharmacy,20th edition,mack publishing co.,easton,pa.(2000)。
[0201]
本文所用的短语“药学上可接受的”是指在合理的医学判断范围内，适合于与人和动物的组织接触而没有过多毒性、刺激性、过敏应答和/或其他问题或并发症，与合理的获益/风险比相称的那些化合物、材料、组合物和/或剂型。
[0202]
本文使用的术语“动物”是指任何温血动物，包括非人动物(例如猫，绵羊)或灵长类动物(例如人或猴子)。
[0203]
如本文所用的术语“免疫接种”是指通过免疫在动物中诱导对传染性生物的免疫力的过程。通常，动物的免疫接种设计为通过刺激动物的免疫系统，提供针对同一传染性生物体(即免疫原)的进一步攻击的保护。
[0204]
术语“原型
‑
间隔子相邻基序(proto
‑
spacer adjacent motif，pam)”序列是指
crispr系统中紧随cas9核酸酶靶向的dna序列之后的2
‑
6个碱基对的dna序列。如果后面没有pam序列，则cas9将无法成功结合或切割靶dna序列。经典的pam序列是5'
‑
ngg
‑
3'，其中n是任何核碱基，后跟两个鸟嘌呤(g)核碱基。
[0205]
术语“不受控制”具有其一般含义。可以理解为是指以不受限制的方式发生的增长。
[0206]
本文所用的术语“弓形虫”应理解为是指刚地弓形虫，并且这些术语可以互换使用。
[0207]
刚地弓形虫(t.gondii)的生命周期
[0208]
弓形虫主要以对人类和动物具有感染性的三种形式存在：卵囊(含有子孢子)、速殖子和缓殖子。这三个阶段均对中间和最终宿主都具有传染性，这些宿主可能主要通过以下途径之一获得弓形虫感染：(a)水平地通过从环境中经口摄入感染性卵囊；(b)水平地通过经口摄入包含在生的或未煮熟的肉或中间宿主的初级下水(内脏)中的组织胞囊，或(c)垂直地通过速殖子的跨胎盘传播。另外，在几个宿主中，速殖子也可以在乳汁中从母亲传播给后代。
[0209]
卵囊被认为仅在确定的宿主，即猫科的成员中产生。卵囊在粪便中传播时，可以感染人和其他中间宿主(基本上是任何温血动物)。然后，它们发育成速殖子，通过反复的内生性而迅速繁殖。它们在细胞中迅速分裂，导致组织破坏并传播感染。最终，速殖子定位于肌肉组织和cns中，在那里它们转化为组织胞囊或缓殖子。这被认为是对宿主免疫反应的应答。
[0210]
组织胞囊(包含缓殖子)对神经和肌肉组织具有高度亲和力。它们主要位于中枢神经系统(cns)、眼睛以及骨骼和心肌中。但是，在较小程度上，它们也可以在内脏器官中发现，例如肺、肝和肾。组织胞囊是中间宿主内的最终生命周期阶段并立即具有感染性。在某些中间宿主物种中，它们可以在宿主的生命中持续存在。这种持久性的机制尚不清楚。然而，许多研究者认为组织胞囊周期性地破裂，缓殖子转变成重新侵入宿主细胞的速殖子，并再次转变成新的组织胞囊内的缓殖子(dubey jp等(1998)clin microbiol.rev 11：267
‑
99)。
[0211]
摄入受污染的肉中的胞囊导致缓殖子在进入新宿主后转变回速殖子。
[0212]
在新西兰报道描述了弓形虫生物体在流产的绵羊胎盘组织中和流产的绵阳胎儿体内，首次认识到弓形虫是家畜物种中的重要病原体(hartley等(1954)aust vet j 30：216
‑
218，hartley&marshall，(1957)nz vet j 5：119
‑
124)。1960年代后期，发现猫可以在其粪便中排出该寄生虫的一种新形的，其在环境中非常稳定，这使人们认识到猫是该寄生虫的最终宿主。
[0213]
实际上，动物的所有可食用部分都可以携带活的弓形虫。在一项研究中，从爱荷华州一家屠宰场的1,000头成年猪(母猪)的17％中分离出活的弓形虫。弓形虫感染在狩猎动物中也很普遍。在野生狩猎中，弓形虫感染在黑熊和白尾鹿中最普遍。在美国，约有80％的黑熊受到感染，而约60％的浣熊具有针对弓形虫的抗体。由于浣熊和黑熊会腐食获取其食物，因此这些动物中的感染是环境中弓形虫流行的良好指标。
[0214]
食用动物肉中的弓形虫组织胞囊数量非常低。据估计，每100克肉中可能只有1个组织胞囊。
[0215]
可以从诸如美国典型培养物保藏中心(atcc)的保藏处获得适用于本公开内容的弓形虫寄生虫。atcc包括弓形虫的多个保藏物，例如atcc号pra
‑
340、pra
‑
426、pra
‑
344、50950、50174、40050、50839、50940、50611、40615、50943、50942、50856、50851和50947。
[0216]
刚地弓形虫(t.gondii)的能量利用
[0217]
弓形虫速殖子必须从它们的宿主细胞中获取碳源和其他必需营养素。弓形虫位于被感染的宿主细胞中的独特的寄生虫液泡中，被膜包围，该膜认为可以自由渗透许多宿主代谢产物。
[0218]
为了获得其能量，速殖子利用从宿主细胞中获取的葡萄糖和谷氨酰胺(macrae ji等(2012)host cell microbe 12：682
‑
692)，并在宿主细胞流出后，速殖子积累γ
‑
氨基丁酸，这可能会提供具有短期能量储备以为运动和入侵供能的细胞外速殖子(macrae ji等(2012)host cell microbe 12：682
‑
692)。弓形虫速殖子还产生贮藏多糖支链淀粉，其含有由α(1
‑
6)
‑
连接的分支点修饰的α(1
‑
4)
‑
连接的葡萄糖残基的主链。除非受到胁迫，否则速殖子通常表达非常低水平的支链淀粉，相反，缓殖子和卵囊在细胞质中积累高水平的支链淀粉颗粒(coppin a等(2003)biochimie 85：353
‑
361)。据推测，支链淀粉颗粒在传播过程中可能是长期的能量储存，以保持低养分生态位中的寄生虫活力和/或在遇到有利条件时促进快速分化。然而，关于在不同的弓形虫生命细胞阶段如何调控支链淀粉积累和利用知之甚少。
[0219]
支链淀粉表征
[0220]
结构和气相色谱/质谱分析已确定，弓形虫中的颗粒是真正的支链淀粉，由具有低比例α(1
‑
6)支链的α(1
‑
4)
‑
连接的葡聚糖线性链组成。链具有19个葡萄糖分子的平均长度(guerardel y等(2005)microbes infect 7(1)：41
‑
8)。
[0221]
在弓形虫的所有阶段均发现有支链淀粉。但是，实验已经表明，休眠胞囊的缓殖子转变为新转化的速殖子与支链淀粉颗粒的消失有关(coppin a等(2003)biochimie 85：353
‑
361)。在弓形虫中，在组织胞囊形成期间，在缓殖子内合成了许多(平均：21.8，范围：7
‑
38)支链淀粉颗粒，平均大小为358nm(范围：192
‑
630nm)，并且在胞囊孔中存在特定的凝集素结合糖(von brand，1973)。当在富含葡萄糖的环境(例如大脑或肌肉细胞)中发育时，因为在此非活性阶段对营养物的需求减少，缓殖子形式会产生异常大量的支链淀粉(葡萄糖聚合物)。
[0222]
已经发现支链淀粉颗粒以相当大的尺寸范围存在。大的支链淀粉颗粒显示刚性的致密缠绕的线球结构以储存大量的葡萄糖分子，尺寸为0.4μm级。较大的支链淀粉的整齐缠绕，表面光滑的“线球”结构与较小颗粒的更不规则的形状和杆状颗粒组成形成鲜明对比(harris jr等，(2004)parasitology 128(pt 3):269
‑
82)。支链淀粉颗粒可以使用诸如碘染色、高碘酸席夫氏染色或电子显微镜等技术来鉴定。
[0223]
海藻糖
‑
6磷酸合酶/6
‑
磷酸磷酸酶(tps/tpp)样基因
[0224]
许多真菌和植物通过两种酶
‑‑
海藻糖磷酸合酶(tps)和海藻糖磷酸磷酸酶(tpp)的协同作用合成二糖
‑‑
海藻糖(thammahong a等，(2017)microbiol mol biol rev 15；81(2))。在细胞应激条件下，海藻糖合成通常会增加，这反映出这种糖作为短期能量储备和作为体内相容的溶质稳定蛋白的潜在作用。此外，海藻糖的组成性合成和降解(通过消耗atp的无效循环)可能在平衡某些真菌中通过较高(消耗atp)和较低(产生atp)糖酵解作用的通
量中起关键作用。有趣的是，所有刚地弓形虫株系的基因组都编码含有tps和tpp结构域两者的蛋白质(toxodb登录号tgme49_297720)。
[0225]
tps和tpp蛋白两者以及它们发挥功能的海藻糖生物合成途径在哺乳动物细胞中不存在。弓形虫同源物(在本文中称为tps/tpp样基因)包含串联排列的海藻糖6
‑
磷酸合酶(tps)样和海藻糖6
‑
磷酸磷酸酶(tpp)样结构域，以及n
‑
末端支链淀粉结合cbm20结构域，使得能够与支链淀粉直接相互作用。
[0226]
初步序列分析指示刚地弓形虫的tps结构域，tgtps/tpp与大肠杆菌(e.coli)、酿酒酵母(s.cerevisiae)和拟南芥(a.thaliana)的tps蛋白具有很强的同源性，包括对结合udp
‑
葡萄糖供体很重要的残基。但是，弓形虫tps结构域缺少几个重要的tps催化的残基，包括gly22、val366和lys267(对udp
‑
葡萄糖结合重要)以及arg9、arg300和tyr76(对葡萄糖
‑6‑
磷酸结合重要)，这增加了这种结构域可能没有t6p合酶活性的可能性。相似地，尽管c末端tgtpp样结构域似乎具有磷酸酶活性所需的所有保守基序，但tgtpp序列包含可以干扰活性的其他插入。与tgtps/tpp缺乏海藻糖磷酸合酶或海藻糖磷酸磷酸酶活性的可能性一致，使用gc/ms和lc/ms之一在速殖子的全细胞提取物中均未检测到海藻糖或海藻糖磷酸。
[0227]
在拟南芥中发现的11个旁系同源物中也存在tps样和tpp样结构域的串联排列(vandesteene l等，(2012)plant physiology 160：884
‑
896)，尽管仅显示其中三个具有t6p合酶活性(vandesteene等，(2012)和delorge i等，(2015)the biochemical journal 466：283
‑
290)，并且它们都没有显示具有t6p磷酸酶活性。
[0228]
除双结构域蛋白外，拟南芥还包含10种蛋白，这些蛋白包含具有酶促活性的t6p磷酸酶结构域，但完全缺乏tps样结构域(vogel g等，(1998)the plant journal：for cell and molecular biology 13：673
‑
683)。在酵母中，tps和tpp蛋白是分开的，但与另外两个辅助蛋白质形成复合物(bell w等，(1992)european journal of biochemistry 209：951
‑
959；bell w等，(1998)the journal of biological chemistry 273：33311
‑
33319；vuorio o.e等，(1993)european journal of biochemistry 216：849
‑
861)。重要的是，酿酒酵母酵母同源物tps1对于在葡萄糖上生长是必需的，并且该基因的破坏导致g6p的积累(eastmond p.j.和graham i.a.等，(2003)current opinion in plant biology 6：231
‑
235；hohmann s.等(1996)molecular biology 20：981
‑
991)。至少一些拟南芥旁系同源物也参与糖信号传导和植物发育(eastmond p.j.等，(2002)the plant journal：for cell and molecular biology 29：225
‑
235；gomez l.d.等，(2006)the plant journal:for cell and molecular biology 46：69
‑
84；gomez l.d.等，(2010)the plant journal：for cell and molecular biology64：1
‑
13；van dijken a.j.等，(2004)plant physiology 135：969
‑
977)。
[0229]
刚地弓形虫中tps/tpp样基因的序列被鉴定为toxodb基因id tggt1_297720，其序列如图1所示(seq id no：1)。toxodb基因资源在gajria b等，(2008)nuc acids res 36(database issue)：d553
‑
d556中描述。
[0230]
破坏tps/tpp样基因
[0231]
如本文所述，本公开内容涉及具有tps/tpp样基因的突变体寄生虫，所述tps/tpp样基因被破坏导致基因失活。寄生虫中tps/tpp样基因的失活可以通过本领域已知的许多不同方法来实现。本公开内容基于以下发现：当在含葡萄糖而不是无葡萄糖的培养基中生
长时，弓形虫中tps/tpp样基因的失活导致支链淀粉积累在突变体寄生虫中。
[0232]
可以使用常规用于产生基因敲除突变体的任何合适方法来产生本公开内容的突变体。例如，突变体可以通过单交换整合(例如，如fox和bzik(2002)nature 451(6874)：926
‑
9中所述)或使用双交换基因替代(kim k等，(1993)science nov 5；262(5135)：911
‑
4)获得。
[0233]
通常，突变体弓形虫的生成包括从弓形虫中分离出目的核酸分子(例如，如本文所述)；替换、突变、替代或缺失所述基因的全部或部分(例如一个或多个bp)以破坏该基因的编码或调控区；并将破坏的分子整合到弓形虫的基因组中。使用合适的药物可选择标志物，例如hxgprt、氯霉素乙酰转移酶、dhfr
‑
ts或腐草霉素，可以选择带有突变序列的突变体。
[0234]
在特定实施方案中，通过正负选择(例如，hxgprt)来选择可选择标志物。
[0235]
可以通过例如用编码可选择标志物的核酸分子取代编码序列，用编码外源蛋白质的核酸分子取代编码序列等等方式来实现tps/tpp样基因的全部或部分的破坏。如本领域技术人员已知的，随后的限制性内切核酸酶消化和southern印迹分析或突变体弓形虫基因组dna的测序可以用于确认破坏。
[0236]
尽管本发明的突变体可以由有毒的i型株系如rh(如本文所例示)产生，但是ii型株系(如本文所例举)以及iii型株系以及任何其他属于分化枝a、b、c、d、e或f的株系也可以使用。本发明的突变体可以使用成簇的规律间隔的短回文重复序列(crispr)生成，如所述(shen z等，(2014)dev cell sep 8；30(5)：625
‑
36；sidik s.m.等plos one2014jun 27；9(6)：e100450pmid：24971596)。简而言之，该技术由指导rna(grna)和dna核酸内切酶cas9(通常来自化脓性链球菌(streptococcus pyogenes))组成。grna(或原型间隔子序列)确定在何处发生插入或缺失(插入缺失)。一旦grna和cas9在细胞中表达，grna将指导cas9与靶序列结合并引入双链断裂。然后，细胞可以通过非同源末端连接(nhej)或同源定向修复(hdr)来修复断裂。nhej是弓形虫中最活跃的修复机制，经常导致靶序列附近的插入缺失。如果插入或缺失发生在开放阅读框内，这可能引入移码，导致过早的终止密码子，从而消除了基因功能。如果提供同源模板，则可以发生hdr重组，并且还导致基因的破坏或修饰。在目前的技术中(shen等2014和sidik等2014)，根据与pam'ngg'基序相邻且由20bp组成的序列来选择指导序列/原型间隔子。可以在5’末端添加“g”，以更好地启动转录。可以在任一dna链上，在整个基因中，包括启动子、终止子、编码序列或内含子或者基因的其他任何可能影响基因产物水平或保真度的部分上，选择原间隔子序列及其相邻的pam基序。
[0237]
如本文所述，作为非限制性实例，可以通过诱变用靶标tps/tpp原型
‑
间隔子序列(seq id no：22)取代质粒psag1
‑
cas9
‑
u6
‑
sguprt的uprt原型
‑
间隔子序列并将构建体转染到寄生虫中以启动crispr/cas9方案来生成突变体寄生虫。例如，可以使用荧光激活细胞分选术(facs)将寄生虫分选到96孔微孔板的孔中，然后培养足够长的时间以鉴定出当在含葡萄糖的培养基中生长时产生可见淀粉颗粒(支链淀粉)的克隆，从而实现突变体的筛选。一旦鉴定出突变体克隆，就可以将其维持在无葡萄糖、但含有谷氨酰胺的培养基中，以繁殖寄生虫，直到需要进行免疫接种的时间。也可以通过先在谷氨酰胺培养基中培养转染的细胞，通过有限稀释将其克隆出来，然后通过寻找当转移到含葡萄糖的培养基中时产生支链淀粉来鉴定作为突变体的克隆，从而分离出突变体。
[0238]
优选地，当在含葡萄糖的培养基中生长时，本发明的突变体寄生虫被减毒。如本领
域中常规的，术语“减毒的”是指天然株系的弱化和/或较弱的形式。期望地，本发明的减毒突变体能够刺激免疫应答并产生免疫力，但不引起疾病。可以使用本文实施例中所示的方法确定减毒。在一些实例中，相对于在相同培养基中生长的相应野生型寄生虫，减毒程度为至少50％，至少60％，至少70％，至少80％，至少90％，至少95％或大于95％。
[0239]
确定tps/tpp样基因失活
[0240]
可以通过检查突变体寄生虫在含葡萄糖和含谷氨酰胺培养基中的支链淀粉产生来评估tps/tpp样基因的失活。例如，可以通过本领域已知并且如本文所述的噬菌斑测定法来评估突变体寄生虫的生长。可以通过在包含葡萄糖或谷氨酰胺作为碳源的培养基中评估人包皮成纤维细胞汇合层上的通过裂解循环的生长能力来执行噬菌斑测定法。tps/tpp样基因的失活将通过速殖子自身中支链淀粉颗粒的积累而明显，这可以通过pas染色观察到。同一突变体寄生虫在含谷氨酰胺培养基上的生长应与野生型寄生虫相当，并且如果将这种突变体寄生虫被转移到含谷氨酰胺培养基上，则应导致寄生虫中支链淀粉颗粒的消失或减少。
[0241]
小鼠中的毒力测定法可以如本文所述执行。可以随时间测量用突变体寄生虫转染的小鼠的存活和体重。与将导致小鼠体重的损失和易感染性的野生型寄生虫相比，tps/tpp样基因被失活的突变体不会随时间显著影响小鼠体重。
[0242]
疫苗
[0243]
本公开内容涵盖包含本文所述的突变体寄生虫的疫苗。优选地，疫苗还包含药学上可接受的赋形剂或稀释剂。技术人员将知道要使用哪种合适的赋形剂或稀释剂，这取决于疫苗是用于人还是兽医用途。
[0244]
本文公开的突变体寄生虫的施用可以通过任何合适的方式进行，包括肠胃外注射(例如腹膜内、皮下或肌肉内注射)，经口或通过局部应用(通常在药物制剂中进行)至气道表面。可以通过鼻内施用(例如，通过使用将药物制剂鼻内沉积的滴管、拭子或吸入器)局部应用于气道表面。经口施用可以是可摄入的液体或固体制剂的形式。
[0245]
在一个实例中，药学上可接受的赋形剂或稀释剂是水性载体。可以使用多种水性载体，例如缓冲盐水等。示例性的载体包括水、盐水、林格氏溶液、葡萄糖溶液和5％人血清白蛋白。组合物可以包含近似生理条件所需的药学上可接受的载体，例如ph调节和缓冲剂，毒性调节剂等，例如乙酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙、乳酸钠等。也可以使用非水性媒介物，例如混合油和油酸乙酯。媒介物可以包含少量增强等渗性和化学稳定性的添加剂，例如缓冲剂和防腐剂。
[0246]
本发明的疫苗可以包含一种或多种兽医学可接受的载体。如本文所用，“兽医学可接受的载体”包括任何和所有溶剂、分散介质、包衣、佐剂、稳定剂、稀释剂、防腐剂、抗菌和抗真菌剂、等渗剂、吸附延迟剂等。稀释剂可以包括水、盐水、右旋糖、乙醇，甘油等。等渗剂可以包括氯化钠、右旋糖、甘露醇、山梨糖醇和乳糖等。稳定剂包括白蛋白等。佐剂包括但不限于ribi佐剂系统(ribi inc.)、明矾、氢氧化铝凝胶、胆固醇、水包油乳剂、油包水乳剂例如弗氏完全和不完全佐剂、嵌段共聚物(cytrx，atlanta ga.)、saf
‑
m(chiron,emeryville calif.)、佐剂、皂苷、quil a、qs
‑
21(cambridge biotech inc.，cambridge mass.)、gpi
‑
0100(galenica pharmaceuticals，inc.，birmingham,ala.)或其他皂苷馏分、单磷酰脂质a、阿夫立定脂质
‑
胺佐剂、来自大肠杆菌的不耐热肠毒素(重组或
其他形式)、霍乱毒素或胞壁酰二肽等。
[0247]
可以以单剂给药方案或多剂给药方案进行施用，其中主要治疗过程可以使用1
‑
10个分开的剂量，然后以维持和/或加强应答的后续时间间隔给予其他剂量，例如在1
‑
4个月给与第二剂，如果需要，在几个月后进行随后的给药。
[0248]
疫苗功效可能受许多因素影响，包括动物的健康状况、遗传构成、并发感染、年龄、营养状况、当前药物疗法和应激。因此，在一些实例中，可能有必要如上所述施用进一步的加强疫苗。
[0249]
施用的确切剂量可以由熟练的从业者根据与需要预防或治疗的动物有关的因素来确定。调整剂量和施用以提供足够水平的突变体寄生虫或含有其的疫苗或者维持预防或减轻弓形虫病体征或症状的所需效果。可以考虑的因素包括疾病状态的严重程度、受试者的总体健康状况、年龄、体重和动物的性别、饮食、施用的时间和频率、药物组合、反应敏感性和对疗法的耐受性/应答。
[0250]
在某些实例中，疫苗剂量包含至少约1,000
‑
2,000个寄生虫(例如速殖子)。在其他实例中，取决于动物，疫苗剂量可以包含至少约1,500、1,800、2,200、2,500、5,000、8,000或10,000或更多个寄生虫(例如速殖子)。
[0251]
在某些实例中，疫苗剂量可以包含至少约20个卵囊。在其他实例中，疫苗包含至少约30、40、50、60、70、80、90、100个卵囊。在另一个实例中，疫苗包含100至200个卵囊。
[0252]2[0253]
突变体刚地弓形虫(t.gondii)的用途
[0254]
在某些实例中，本公开内容的突变体弓形虫可以用作媒介物用于递送来自非弓形虫疾病因子的外源抗原(即并非弓形虫天然表达的抗原)。例如，可以利用crispr技术将tps/tpp样基因替换为编码需要免疫接种的抗原的外源基因。
[0255]
外源性抗原的具体实例包括破伤风类毒素(tetc)，疟疾抗原例如环子孢子蛋白(csp)和裂殖子表面蛋白
‑
1(msp
‑
1)，炭疽芽孢杆菌(bacillus anthracis)保护性抗原，鼠疫耶尔森氏菌(yersinia pestis)抗原，来自细菌病原体例如土拉弗朗西斯菌(francisella tularensis)、分枝杆菌属(mycobacteria)、军团菌属(legionella)、伯克霍尔德菌属(burkholderia)、布鲁氏菌属(brucella)和柯克斯体属(coxiella)的抗原；来自病毒的抗原，特别是诸如hiv的细胞内入侵者的抗原；其他类毒素，例如肉毒杆菌类毒素或epsilon毒素；肿瘤抗原；多药剂生物防御抗原；来自非生物威胁性传染原的抗原；鼠疫抗原(plague antigens)；以及所有这些的组合。
[0256]
在其他实例中，弓形虫的突变体可以用于表达想要在哺乳动物宿主细胞内表达的任何其他基因。这可能包括编码治疗性肽或蛋白质的基因，例如用于治疗疾病或病况的治疗性抗体(例如曲妥珠单抗)，蛋白质(例如干扰素、血液因子、胰岛素、促红细胞生成素和凝血因子)或酶(例如天冬酰胺酶、过氧化氢酶、脂肪酶和组织纤溶酶原激活剂)；以及用于筛选测定法以鉴定其抑制剂或激活剂(即效应子)的蛋白质、酶或肽。
[0257]
可以包括的其他非弓形虫疫苗抗原是钩端螺旋体属(leptospira)抗原、梭菌属(clostridial)抗原、狂犬病抗原、弯曲杆菌属(campylobacter)抗原和棒状杆菌属(corynebacterim)抗原。
[0258]
突变体弓形虫或包含其的疫苗可以用于诱导免疫应答和保护受试者免受弓形虫
和/或非弓形虫疾病感染的各种方法中。此类方法通常涉及向需要治疗的动物(例如，有暴露于传染病风险或有发展成癌症风险的动物)施用有效量的本发明的减毒突变体弓形虫或疫苗，从而生成免疫应答并保护动物免受弓形虫和/或非弓形虫疾病的感染。
[0259]
在本公开的上下文中使用的有效量是产生可检测的免疫应答(例如，th
‑
1应答、天然粒细胞、嗜中性粒细胞、巨噬细胞、gr1+巨噬细胞、b细胞或t细胞免疫应答)或抗体生产的量。根据一些实例，弓形虫突变体表达外源抗原，从而生成针对抗原所源自或与之相关的病原体或疾病的保护性免疫。然而，在其他实例中，仅本公开内容的弓形虫突变体足以生成针对弓形虫的免疫应答。有效量的本公开内容的弓形虫突变体预防或治疗弓形虫的体征或症状。可以根据本领域已知的任何合适方法通过监测t细胞或抗体应答来测量对施用的应答。
[0260]
在其他实例中，本文所述的突变体弓形虫寄生虫可以用于提供淀粉的工业来源，作为淀粉的植物衍生源的替代物。
[0261]
以下具体实施例应被解释为仅是示例说明性的，而不以任何方式限制本公开内容的其余部分。无需进一步阐述，据信本领域的技术人员可以根据本文的描述最大程度地利用本发明。本文引用的所有出版物均通过引用全文并入本文。在提到url或其他这样的标识符或地址的地方，应当理解这样的标识符可以改变并且互联网上的特定信息可以变化，但是可以通过搜索互联网来找到等同信息。对其的引用证明了此类信息的可用性和公开传播。
[0262]
本领域技术人员将认识到在不脱离本公开内容的广泛总体范围的情况下，可以对上述实施方案进行多种变化和/或修改。因此，本实施方案在所有方面都应被认为是示例性的而不是限制性的。
实施例
[0263]
材料和方法
[0264]
寄生虫培养
[0265]
将刚地弓形虫速殖子维持在d1培养基(dulbecco改良的eagle培养基[dmem]，补充有1％胎牛血清[invitrogen]和2mm glutamax[gibco])中的人包皮成纤维细胞(hffs)中，在10％co2的湿润气氛中于37℃。为了在无葡萄糖条件下生长，将寄生虫维持在补充有4mm谷氨酰胺和6mm glutamax(gibco)的无葡萄糖dmem中。在接种寄生虫之前，先将hff生长并维持在d10培养基(补充有10％小牛血清[thermo scientific]的dme)。
[0266]
dna克隆和转染
[0267]
根据制造商的说明，使用primestar hs或primestar max dna聚合酶(takara)执行dna扩增。限制酶来自new england biolabs(neb)。下表1中提供了寡核苷酸引物。
[0268]
表1寡核苷酸引物
[0269][0270][0271]
根据制造商的说明执行q5诱变(neb)。内部构建了一些质粒并可以根据要求提供这些质粒的详细信息。
[0272]
对于使用4d nucleofector系统(lonza)进行的电穿孔，将2x106个寄生虫悬浮在20μl有补充的p3溶液中，该溶液取决于实验而含有可变量的dna。使用f1
‑
115程序(t细胞，人未刺激的，he)在20μl nucleocuvette条(lonza)中进行转染。
[0273]
电穿孔后，将寄生虫立即转移到在完全培养基或无葡萄糖的培养基中的hff中。为了进行药物选择，通过添加氯霉素(20μm)，或麦考酚酸(20μg/ml)和黄嘌呤(50μg/ml)，或用5μm的5'
‑
fluo
‑
2'
‑
脱氧尿苷(fudr)(用于在不存在尿嘧啶磷酸核糖基转移酶[uprt]的情况下的负选择)选择重组寄生虫。
[0274]
使用crispr/cas9技术进行对海藻糖合酶/磷酸酶(tps/tpp)基因的基因组序列(toxodb基因id tggt1_297720；图1)的破坏(shen z等，(2014)dev cell sep 8；30(5)：625
‑
36；sidik s.m.等，plos one 2014 jun 27；9(6):e100450 pmid:24971596)。使用表1中的引物1和2，通过q5诱变用靶tps/tpp基因原型间隔子(cccgtctctggggaattggc)替换质粒psag1
‑
cas9
‑
u6
‑
sguprt的uprt原型
‑
间隔子(shen等，2014)。引物2还在原型间隔物的5'末端添加了“g”以更好地启动转录。将该构建体(10μg)转染到rh::hxgrpt寄生虫中(donald rg和roos ds(1998)mol biochem parisitol 15；91(2)：295
‑
305)。培养48小时后，将寄生虫以3个寄生虫/孔进行facs分选(基于高gfp表达)到96孔微孔板(corning)的孔中。使用表1中的筛选寡核苷酸3和4对产生可见淀粉颗粒的两个寄生虫克隆进行测序。一个克隆包含单个点突变(图3b；rh:δhxgprt:δtps/tpp cl
‑
1)，而另一个包含源自转染质粒的183个碱基对的插入，二者均导致移码突变(图3c；命名为rh：δhxgprt：δtps/tpp cl
‑
2)。
[0275]
此突变体包含以下序列：
[0276][0277]
下划线指示原型
‑
间隔子，pam基序用粗体显示。插入序列突出显示。
[0278]
为了应对δtps/tpp表型随着时间的推移可以在培养中恢复为野生型表型的事实，在无葡萄糖的培养基中也生成了δtps/tpp寄生虫。通过省略葡萄糖作为碳源，不存在严重的支链淀粉表型，但是可以通过随后向培养基中添加葡萄糖来诱导。为此，将已在补充有4mm谷氨酰胺和6mm glutamax(gibco)的无葡萄糖dmem中维持的rh:δhxgprt寄生虫用20μg psag1
‑
cas9
‑
u6
‑
sgtps/tpp转染。通过在补充有glutamax/谷氨酰胺的无葡萄糖的培养基中进行有限稀释来克隆出寄生虫。7天后，对当转移到含葡萄糖的d1培养基中时产生淀粉颗粒的rh:δhxgprt:δttps/tpp)的克隆进行测序，发现其含有导致基因破坏的单个碱基对缺失(图3；命名为rh:δhxgprt:δtps/tpp cl
‑
23)。
[0279]
为了破坏ii型pru:tdtomato寄生虫中的tps/tpp，将20μg的psag1
‑
cas9
‑
u6
‑
sgtps/tpp转染到寄生虫中，并立即以5个寄生虫/孔在含有d1培养基(缺乏葡萄糖，但含有6mm谷氨酰胺和4mm谷氨酰胺)中的hff的96孔板中克隆出。14天后，具有可见淀粉积累的单个克隆系进一步扩增并测序，指示存在大的>1kb的插入，破坏了tps/tpp基因座(图3e；pru:tdtomato:δtps/tpp cl
‑
2)。
[0280]
此突变体包含以下序列：
[0281][0282]
下划线指示原型
‑
间隔子，pam基序用粗体显示。插入序列突出显示。n指示无法从序列读取中确定的核苷酸碱基。
[0283]
带有加ha标签的己糖激酶的δtps/tpp突变体的产生
[0284]
为了生成在其c末端带有加双ha标签的己糖激酶的δtps/tpp寄生虫，分别使用具有序列5'
‑
ctcagatctactttcccgagaggaagagtg
‑
3(seq id no：14)和5'
‑
ttcctaggtcctgctccagcagcgtagtccgggacatcgtacgggtatcctgcaccagcgttcacatctgcgatcagagc
‑
3'(seq id no：15)的寡核苷酸5和6扩增弓形虫己糖激酶(hxk)基因(toxo db gene#tggt1_265450；图4)的3’区，并通过bgl ii和avr ii限制性位点插入到pgcm3(来自giel van dooren的馈赠)中。用kas i将pgch
‑
hxk(20μg)线性化，然后沉淀dna并转染到rh:δhxgprt:δku80寄生虫中。培养48小时后，用20μm氯霉素选择转染的寄生虫。对加ha标签的己糖激酶的dna测序揭示了以下修饰的c末端：advnagagypydvpdyaagagpragagypydvpdyaagagpgdvdiel(seq id no：20)(其中下划线突出显示了原始wt己糖激酶c末端，阴影突出显示了两个ha标签)。
[0285]
为了破坏rh:δhxgprt:δku80:hxk
‑
ha背景中的tps/tpp，将10μg的psag1
‑
cas9
‑
u6
‑
sgtps/tpp与100μg具有表1中序列5'
‑
ggtcttccccgtctctggggaattgactagctgagcaggtgaggctgcgtcgccgtcgc
‑
3'(seq id no：16)和5'
‑
gcgacggcgacgcagcctcacctgctcagctagtcaattccccagagacggggaagacc
‑
3'(seq id no：17)(设计为在tps/tpp阅读框中插入终止密码子)的退火的寡核苷酸7和8组合并电穿孔到rh:δhxgprt:δku80：hxk
‑
ha寄生虫中。
[0286]
为了获得活的寄生虫，转染和克隆程序必须在补充有谷氨酰胺/glutamax的无葡萄糖的d1培养基中进行。将转染的寄生虫以3个寄生虫/孔克隆到96孔板中，并对当转移到含有葡萄糖的d1培养基中时产生淀粉颗粒的克隆进行测序，发现其含有导致tps/tpp基因破坏的58bp的缺失(图3；rh:δhxgprt:δtps/tpp:hxk
‑
ha cl
‑
1)。缺失的序列如下所示：
[0287]
gtcgccgtcgtcgggtcttccccgtctctggggaattggcaggtgaggctgcgtcgcc(seq id no：21)。为了在rh:δhxgprt:δku80：hxk
‑
ha背景中生成δcdpk2寄生虫，将20ug先前使用的cdpk2基因敲除构建体(uboldi a等(2015)host cell and microbe 18：670
‑
681)用nhe i/clai消化以进行转染。通过有限稀释克隆寄生虫。
[0288]
噬菌斑测定法来确定无葡萄糖和无谷氨酰胺条件下δtps/tpp寄生虫的生长
[0289]
刮下寄生虫并通过27号针头以释放细胞内的寄生虫。通过低速离心(在beckman gs
‑
6kr离心机中以450rpm离心3分钟)沉淀碎片和完整细胞。随后以2000rpm离心5分钟以沉淀寄生虫。将寄生虫重悬于10ml缺少葡萄糖和谷氨酰胺的dmem培养基中，并像之前一样离心以沉淀寄生虫。对寄生虫进行计数，并以200个寄生虫/孔添加到装有在含5.55mm葡萄糖和4mm谷氨酰胺或者缺乏葡萄糖或谷氨酰胺的培养基中的融合hff单层的6孔板的孔中。7天后，通过除去培养基，用80％乙醇固定20分钟并用结晶紫染色剂(2％结晶紫(w/v)和0.16％草酸铵的20％乙醇溶液)对单层膜进行染色20分钟，以进行噬菌斑测定法。然后将单层用水洗涤以显示噬菌斑。
[0290]
高碘酸席夫(pas)染色
[0291]
将寄生虫添加到容纳在含5.55mm葡萄糖和4mm谷氨酰胺或者缺乏葡萄糖或谷氨酰胺的培养基中的融合hff单层的孔中。感染的单层在37℃和10％co2孵育4天，然后按如下进行pas染色：除去培养基，感染的单层用pbs洗涤一次，然后用pbs/4％甲醛(sigma)固定20分钟。除去甲醛固定剂并将固定的单层用pbs洗涤两次，然后将盖玻片置于80％乙醇中并使用标准方案执行pas染色。将pas染色的盖玻片安装到载玻片上并在配备coolsnap2 ccd检测器的ap deltavision elite显微镜(ge healthcare)上通过a594通道测量pas荧光，并用softworx软件(ge healthcare)捕获。使用nikon 90i upright/widefield显微镜(nikon)捕获pas染色的彩色图像。
[0292]
免疫荧光测定法
[0293]
用寄生虫感染生长在盖玻片上的hff，并用pbs中的4％多聚甲醛(pfa)(sigma
‑
aldrich)固定25分钟。固定的样品用pbs中的0.1％triton x
‑
100渗透10分钟(biorad)，用pbs中的3％(w/v)bsa(sigma
‑
aldrich)封闭1小时，并在4℃用一抗探测过夜，然后在室温与alexa fluor偶联的荧光二抗(invitrogen)放置1小时。当需要对核进行dapi染色时，使用0.2μg/ml(最终浓度)dapi。图像由配备coolsnap2 ccd检测器的ap deltavision elite显微镜(ge healthcare)拍摄，并由softworx软件(ge healthcare)捕获。使用image j软件查看图像，并使用image j、adobe photoshop和illustrator软件进行组装。
[0294]
用于免疫荧光测定法的抗体是大鼠抗ha(克隆3f10；roche)、兔抗gap45(来自con beckers,univ.north carolina的馈赠)和小鼠抗sag1(dg52)(来自john boothroyd,stanford university的馈赠)。
[0295]
用pru:tdtomato:δtps/tpp寄生虫对小鼠进行体内感染
[0296]
刮下pru:tdtomato(wt)和pru:tdtomato:δtps/tpp寄生虫并通过27号针头以释放细胞内寄生虫。低速离心(450rpm，3分钟)用于沉淀碎片和完整的细胞。随后以2000rpm离心5分钟以沉淀寄生虫。将寄生虫重悬于10ml pbs中并如上所述通过离心洗涤。将寄生虫沉淀重悬于pbs中，浓度为10000个寄生虫/100微升。用10000个寄生虫接种c57bl/6小鼠，并在数周内监测它们的体重和存活。
[0297]
己糖激酶活性测定法
[0298]
将来自t25培养物的新鲜排出的rh:wt和rh:hxk
‑
ha寄生虫低速旋转(在beckman gs
‑
6kr离心机中以350rpm离心5分钟)以沉淀细胞碎片。将上清液以2000rpm离心5分钟以沉淀寄生虫。寄生物沉淀物立即用于己糖激酶活性测定法，或储存在
‑
80℃用于后续阶段。根
据制造商的说明(abcam)执行己糖激酶测定法，并稍作修改，如下：将寄生虫用冰冷的pbs洗涤两次，然后重悬于200
‑
400μl冰冷的测定缓冲液中并上下吸移5
‑
10次以裂解细胞。将裂解物在4℃以13 0000rpm离心5分钟以沉淀不溶物。收集上清液并用于己糖激酶测定法。对于每个反应，将50μl裂解物与根据试剂盒说明制备的等体积反应混合物合并。然后随时间测量在450nm处的吸光度，并通过与nadh吸光度的标准曲线比较来确定己糖激酶活性，并将其标准化为通过bca方法(pierce)确定的裂解物中的蛋白质浓度。
[0299]
互补测定法
[0300]
为了用野生型tps/tpp或修饰的异源蛋白弥补δtps/tpp寄生虫，将wt tgtps/tpp和突变体cdna连接到载体phtu
‑
3xha(内部创建)。该载体将弥补的野生型tgtps/tpp和突变体变体置于微管蛋白上游区域的2760bp的控制下，并在蛋白质的c末端引入三重ha标签。该质粒允许用麦考酚酸进行选择，并含有来自uprt基因座的基因组dna区，以便在用5'
‑
氟
‑
2'
‑
脱氧尿苷进行选择后，将构建体稳定整合到该基因座中。为了产生用于用全长tgtps/tpp弥补δtps/tpp寄生虫的构建体，用寡核苷酸9和10扩增gblock 1(表2)，并用寡核苷酸11和12扩增gblock 2(见表3)。
[0301]
表2 gblock序列
[0302]
[0303]
[0304]
[0305]
[0306]
[0307]
[0308]
[0309]
[0310]
[0311]
[0312]
[0313]
[0314][0315]
用bgl ii/sac i(gblock 1)或sac i/nhe i(gblock2)消化扩增的gblock，并通过这些位点连接到phtu
‑
3ha。为了产生含有pfhad1蛋白的互补构建体，使用寡核苷酸13和14扩增密码子优化的gblock 3，用bgl ii和nhe i消化，并连接至phtu
‑
3ha。同样，要创建用sptpp1弥补的构建体，分别用寡核苷酸15和16、以及17和18分别扩增密码子优化的gblocks 4和5，用bgl ii/psi i(gblock 4)和psi i/nhe i(gblock 5)消化并连接至phtu
‑
3ha。为了产生仅包含tgtps结构域但缺乏tgtpp结构域的互补构建体，使用phtu
‑
tgtps/tpp
‑
3ha互补构建体作为dna模板，使用寡核苷酸9和19来扩增tps结构域。将tgtps结构域通过bgl ii和nhe i位点插入phtu
‑
3ha。还创建了包含与pfhad1或sptpp1结构域融合的tgtps结构域的构建体。对于tgtps
‑
pfhad1构建体，使用寡核苷酸14和20从gblock 3扩增pfhad1结构域，并用nhe i消化，而使用寡核苷酸21和寡核苷酸22或23扩增tgtps结构域(以创建不同的接头序列)并用bgl ii进行消化。如上所述，用寡核苷酸18和24从phtu
‑
sptpp1
‑
3ha模板dna扩增sptpp1，并用nhe i消化以与tgtps结构域融合。为了产生构建体以用sctps1弥补，用寡核苷酸25和26扩增密码子优化的gblock 6，用bgl ii和nhe i消化并通过这些位点连接到phtu
‑
3ha。为了产生构建体用于以融合至sctps1结构域的tgcbm20结构域进行弥补，用寡核苷酸27和寡核苷酸28或29扩增tgcbm20结构域(以在结构域之间产生刚性或柔性接头)并用bgl ii消化。使用寡核苷酸26和30扩增sctps1 gblock 6，并用nhe i消化。这两个产物通过这些位点连接到phtu
‑
3ha。为了创建tgtps/tpp的弥补构建体(complementation construct)，该构建体中缺失的底物结合残基被重新引入(因此推测其能够产生反应产物t6p)，使用寡核苷酸9和31扩增gblock 7，使用寡核苷酸12和32扩增gblock 8。用bgl ii/mlu i(gblock 7)和mlu i/nhe i(gblock 8)消化gblock，并通过bgl ii和nhe i位点连接至phtu
‑
3ha。为了创建失去了结合支链淀粉能力的弥补构建体，使用寡核苷酸9和10扩增gblock 9(在3个重要的淀粉结合残基中包含突变)，用bgl ii/sac i消化并连接到sac i/nhei
‑
消化的gblock 2和bgl ii/nhe i消化的phtu
‑
3ha。为了创建构建体用于弥补rh:δku80:δhxgprt:hxk
‑
ha:δtps/tpp寄生虫，将bgl ii/sac i
‑
消化的gblock 1和saci/nhe i
‑
消化的gblock 2连接到bgl ii/avr ii
‑
消化的phtu
‑
3myc(内部创建)。
[0316]
为了用三重myc表位标签对tgtps/tpp的c末端加标签，使用寡核苷酸33和34扩增基因的3'区域，并通过bgl ii和avr ii限制性位点插入pgcm3。用sfo i将构建体线性化用于转染到rh:δku80:dhfr、rh:δku80:δhxgprt:hxk
‑
ha和rh:δku80:dhfr:δcdpk2寄生虫中，并用氯霉素进行药物选择。为了制备可以被麦考酚酸/黄嘌呤选择的加myc标签的构建体，将tps/tpp片段用spe i从上述pgcm3
‑
tps/tpp
‑
3myc构建体中切割下来，并连接到用spe i和nhe i消化的phtu
‑
3ha载体主链上。用aar ii消化得到的phtu
‑
tgtps/tpp
‑
3xmyc构建体，将10μg转染到rh:δku80:δhxgprt：hxk
‑
ha寄生虫中，产生rh:δku80:δhxgprt:hxk
–
ha:tps/tpp
‑
3myc品系。
[0317]
表3寡核苷酸
[0318]
[0319][0320]
胞囊测定法
[0321]
将已经在无葡萄糖的d1培养基中维持的pru:tdtomato:wt和pru:tdtomato:δtps/tpp寄生虫以每5个宿主细胞1个寄生虫的m.o.i.添加到6孔平板(corning)中盖玻片上的人包皮成纤维细胞(hff)的单层中。通过以1400rpm离心3分钟，将寄生虫旋转到hff上，并
在10％co2的潮湿气氛中于37℃孵育4小时，使其发生附着和侵入。除去无葡萄糖的d1培养基，并替换为缓殖子诱导培养基(rpmi
‑
hepes，ph 8.1；5％fbs)，每隔一天更换一次。如sugi t等，(2017)mbio 8，e01289
‑
17中所述执行修饰的ifa组合抗体染色和pas染色。
[0322]
δtps/tpp免疫
[0323]
从组织培养物中制备δtps/tpp速殖子，并重悬于1x104/200ul的pbs中。用1x104个速殖子腹膜内(i.p)感染6x野生型c57bl/6并在3周内积极监测。
[0324]
野生型寄生虫的攻击
[0325]
pru:tdtomato:δhx株系(ii型)弓形虫株从以1x104/200ul pbs重悬于pbs中的组织培养物中收获。然后六只首次用于实验的和6只经δtps/tpp免疫的动物i.p.注射1x104个pru:tdtomato:δhx株系，每天监测体重和感染迹象。
[0326]
实施例1刚地弓形虫(tg)tps/tpp
‑
样基因的破坏导致支链淀粉在弓形虫速殖子内的大量积累。
[0327]
为了研究tps/tpp样蛋白的功能，发明人在高毒性i型(rh)速殖子和毒性较低的胞囊形成prugniaud(ii型)株系中创建了基因破坏。通过pcr和测序证实了在rh和表达tdtomato的p株系中tgtps/tpp的遗传消融。
[0328]
基因破坏后，残留体内和速殖子自身内可见大量支链淀粉颗粒，如通过高碘酸希夫(pas)染色所检测的(图5a和c)。
[0329]
然后，发明人通过对汇合的人包皮成纤维细胞执行噬菌斑测定法，评估了通过裂解循环的生长能力。令人惊讶的是，当在标准高葡萄糖培养基中培养宿主细胞时，成纤维细胞中rh:δtgtps/tpp速殖子的生长被严重减弱(图5b)。相反，当宿主细胞在含有谷氨酰胺作为替代碳源的无葡萄糖培养基中培养时，突变体的生长会部分恢复(图5b)。有趣的是，向含葡萄糖的培养基中添加谷氨酰胺不能挽救生长，表明在没有tps/tpp样基因的情况下，葡萄糖本身而不是过量的碳源具有毒性。
[0330]
实施例2tps/tpp的破坏导致体内毒力的降低。
[0331]
为了研究动物模型中的急性感染是否需要tps/tpp样基因，将c57bl/6小鼠感染亲代pru:tdtomato和pru:δtps/tpp寄生虫(参见突变体图3e)，并追踪随着时间的推移它们的存活和体重变化。感染了亲代寄生虫的小鼠在10天后体重损失了10％，必须将其扑杀(图5d)。相比之下，感染了pru:δtps/tpp寄生虫的小鼠几乎没有体重损失，随后体重恢复到感染前水平(图5d)。随着时间的流逝，感染了野生型pru寄生虫的小鼠体重显著损失，并且在感染后10天达到损失峰值(图5d)。在大约这个时间，小鼠迅速死于感染(图5e)。
[0332]
显微镜检查脑组织表明这些小鼠中没有胞囊。因此，tgtps/tpp对于受感染组织中急性期速殖子和慢性缓殖子的生长都是必不可少的。结果还表明，两个阶段通常在体内都暴露于高葡萄糖浓度。
[0333]
实施例3：tgtps/tpp的丧失与中央碳代谢的缺陷有关
[0334]
刚地弓形虫速殖子通过多种途径代谢葡萄糖，包括糖酵解和戊糖磷酸途径，还将过量的葡萄糖引导到主要的储存碳水化合物
‑‑
支链淀粉的合成中(uboldi ad等，(2015)cell host microbe 18，670
‑
681)。野生型rh速殖子通常具有非常低水平的支链淀粉，如胞内寄生虫阶段的希夫高碘酸盐染色所示，表明这些寄生虫摄入的大部分葡萄糖都用于糖酵解。相反，rh：δtgtps/tpp速殖子在细胞质和残留体(与发育中的速殖子的前端连续并通常
包含外来代谢物的膜网络)内均积累了大量高碘酸盐
‑
希夫阳性颗粒(图6a)。当将感染的成纤维细胞培养在含葡萄糖的培养基中时发生支链淀粉颗粒的过度积累，而在含谷氨酰胺作为主要碳源而没有葡萄糖的培养基中时不会如此(图6b)。生化分析证实，与野生型寄生虫相比，rh:δtgtps/tpp速殖子积累高100倍水平的支链淀粉(图7a)。当用
13
c
‑
葡萄糖标记细胞内rh速殖子时，与支链淀粉相关的葡萄糖被有效标记，指示该多糖在葡萄糖充足条件下有组成性合成和周转(图7b)。rh:δtgtps/tpp寄生虫中
13
c
‑
葡萄糖掺入支链淀粉的测量指示突变品系中进入支链淀粉合成的葡萄糖通量有5倍增加(图7b)。因此，tgtps/tpp似乎可以调节葡萄糖摄取和/或进入碳水化合物代谢的不同途径的下游通量。
[0335]
rh亲本和rh:δtgtps/tpp速殖子的代谢物谱指示tgtps/tpp的丧失与寄生虫中心碳代谢的整体变化有关。具体而言，对极性代谢物的lc/ms分析(导致检测到2657m/z特征)揭示了突变体在上游糖酵解和戊糖磷酸途径中的中间体水平升高(图8)。糖酵解所供料的途径包括脱氧
‑
木酮糖磷酸途径(doxp)中的中间体在敲除寄生虫中也升高(图8)。相反，tca循环中大多数氨基酸和中间体的水平在很大程度上不受tgtps/tpp丧失的影响(图8)。因此，tgtps/tpp的丧失似乎导致葡萄糖利用和通向与上游糖酵解有关的通路的通量总体增加。
[0336]
接下来，发明人测量了细胞外rh亲本和rh:δtgtps/tpp突变体速殖子中葡萄糖摄取的速率，以研究tgtps/tpp是否可以调节质膜葡萄糖转运蛋白的活性。令人惊讶的是，与亲本品系相比，tgtps/tpp缺陷型速殖子寄生虫表现出相似或略低的
14
c
‑
葡萄糖摄取速率(图9a)。为了确定在没有tgtps/tpp的情况下葡萄糖分解代谢的下游步骤是否得到增强，亲代rh和rh:δtgtps/tpp速殖子用
13
c
‑
葡萄糖进行代谢标记，并通过gc/ms确定
13
c掺入己糖磷酸和其他糖酵解中间体的动力学。令人惊讶的是，在rh:δtgtps/tpp突变体中，葡萄糖
‑6‑
磷酸(图9b)和代谢连接的己糖
‑
磷酸的合成速率大大提高，表明tgtps/tpp可能负面调节葡萄糖的磷酸化。
[0337]
寄生虫提取物的lc
‑
ms/ms蛋白质组学分析指示，与wt寄生虫相比，tps/tpp敲除寄生虫中己糖激酶的表达没有改变，并且翻译后修饰也没有检测到。此外，在富含葡萄糖的培养基中用
13
c
‑
谷氨酰胺对细胞外寄生虫进行互补代谢标记揭示了亲代rh和rh:δtgtps/tpp速殖子两者中的己糖磷酸的标记极少，指示突变体速殖子中糖磷酸酯的水平升高不是由于糖原异生通量增加。
[0338]
实施例4tgtps/tpp的破坏与己糖激酶的破坏相组合导致突变体寄生虫的更大减毒
[0339]
为了进一步评估己糖激酶活性的表达增加是否直接导致了严重的支链淀粉表型和rh:δtgtps/tpp突变体的活力丧失，在该突变体中过表达刚地弓形虫己糖激酶(tghexk)的加ha表位标签形式。突变体中己糖激酶的过表达与寄生虫增殖的急剧减少，感染一天内充满支链淀粉颗粒的非常大的残留体的形成和该残留体的进一步扩大以及第7天寄生虫完整性的普遍丧失有关(图10)。
[0340]
大量的支链淀粉颗粒的积累一直没有减弱，形成了形态畸变，直到寄生虫死亡(图11)。这种缺陷比在带有未加标签的野生型己糖激酶的δtps/tpp寄生虫所见更为严重(图11)，表明新修饰的c末端(包含两个ha标签)是δtps/tpp表型的严重性增加的原因。
[0341]
而且，这种严重的表型对δtps/tpp:hxk
‑
ha寄生虫具有特异性，相反，δcdpk2:
hxk
‑
ha寄生虫仅表现出对δcdpk2寄生虫典型的淀粉积累水平(图12)。
[0342]
通过对c末端加ha
‑
标签提高了己糖激酶的催化活性(图13)，表明加ha
‑
标签的己糖激酶对δtps tpp表型的增强是由于其催化活性的提高。
[0343]
这些发现表明tgtps/tpp通常负调节己糖激酶活性，并且在不存在tgtps/tpp的情况下，由高活性己糖激酶合成的过量的葡萄糖
‑6‑
磷酸被转移到支链淀粉合成中，导致支链淀粉颗粒的病理性积累。
[0344]
实施例5tgtps/tpp的cbm20和tpp结构域对活性很重要
[0345]
tgtps/tpp包含n末端碳水化合物结合模块(cbm20)，预计其与支链淀粉结合，并在细胞裂解和细胞溶质提取物通过直链淀粉柱后保留在直链淀粉柱上(图15)，表明它在体内可能被募集到支链淀粉颗粒上。实际上，当在野生型rh寄生虫中表达tgtps/tpp的加myc标签形式时，该表位与分布在整个细胞质中的小点相关(图14)。令人惊讶的是，当在rh:δcdpk2寄生虫中表达时，tgtps/tpp
‑
myc蛋白在很大程度上转移到了残留体内，该寄生虫在残留体内超积累支链淀粉颗粒(图14)，支持了tgtps/tpp与颗粒的共定位。有趣的是，δcdpk2敲除品系中tgtps/tpp
‑
myc的表达揭示了与符合线粒体定位的周质网相关的第二群体的加标签蛋白质(图14)。通过用针对线粒体标志物的抗体tom40共标记寄生虫来确认这种定位(图14)。这些数据表明tgtps/tpp靶向胞质溶胶中的支链淀粉颗粒和线粒体外膜两者。
[0346]
最后，为了确定tgtps/tpp的哪些结构域参与调节己糖激酶活性和支链淀粉积累，将rh:δtgtps/tpp突变体用融合到ha表位的突变或截短的tgtps/tpp蛋白进行弥补(图未显示)。将编码每种构建体的基因随机整合到染色体位点中，并通过免疫荧光显微镜检查(蛋白质的定位和支链淀粉沉淀物在扩大的残留体内的存在)，western印迹和gc/ms分析海藻糖代谢物来检查群体。敲除品系用表达全长tgtps/tpp的构建体互补后完全恢复了残留体的正常形态(未显示)。用全长tgtps/tpp蛋白进行互补(其中支链淀粉结合所需的cbm20结合域中的关键残基被突变)(tgtps/tpp
‑
cbm
mut
)也可以恢复残留体表型，但仅在观察到高水平表达的细胞中观察到。通过直链淀粉色谱法证实了该构建体中cbm功能的丧失。因此，将tgtps/tpp靶向支链淀粉颗粒有可能促进功能但并非必不可少。重要的是，缺少c末端磷酸酶结构域的截短的tgtps/tpp蛋白的表达无法补充弥补突变体并阻止支链淀粉积累和残留体肿胀，表明该结构域对功能至关重要。为了研究其他密切相关的磷酸酶结构域是否可以替代tgtps/tpp的tpp结构域，敲除品系进一步用融合蛋白进行了弥补，其中tgtps/tpp的tpp结构域被粟酒裂殖酵母海藻糖特异性磷酸酶tpp1或混杂的恶性疟原虫(plasmodium falciparum)糖磷酸酶had1替代。这些嵌合蛋白质均不能弥补δtps/tpp寄生虫的支链淀粉表型。同样，用酿酒酵母tps1(sctps1)本身和作为cbm20融合体对rh:δtgtps/tpp突变体的弥补也未能弥补突变体表型。有趣的是，通过全细胞裂解物的gc/ms分析确定，表达sctps1合成的海藻糖6
‑
磷酸的rh:δtgtps/tpp突变体品系证实了这些异源蛋白是有活性的，而单独的海藻糖
‑6‑
磷酸的合成不足以满足tgtps/tpp的调节活性。最后，具有恢复的推定的底物结合残基的tgtps/tpp突变形式的表达显示了tgtps/tpp样定位模式，但未能弥补δtps/tpp表型。
[0347]
实施例6在δtps/tpp寄生虫中缓殖子胞囊发育不良
[0348]
缓殖子分化诱导后两天，δtps/tpp寄生虫中可见大的支链淀粉颗粒，而在野生型
(wt)寄生虫中不存在。此外，与wt寄生虫相比，δtps/tpp寄生虫的缓殖子表面标志物srs9的强度更低。缓殖子诱导7天后，支链淀粉过多积累明显地破坏了δtps/tpp胞囊形态。不能通过用srs9染色来辨别单个寄生虫，srs9在胞囊状结构外围周围呈环状图案出现。相反，wt寄生虫在胞囊内各个缓殖子的外围周围表达高水平的srs9。7天后，在wt胞囊中也可见到作为缓殖子分化特征的小支链淀粉颗粒。使用定量pcr监测小鼠脑中的弓形虫胞囊负载。完全不存在tps/tpp敲除(δtps/tpp)或低于可检测的水平，表明该突变体无法作为缓殖子存活。
[0349]
实施例7tps的免疫攻击
[0350]
发明人想要确定用δtps/tpp株系(专利保藏号atcc pta
‑
125166，对应于pru:tdtomato:dtps/tpp cl
‑
2(seq id no：8))的感染是否可以防止随后的野生型寄生虫攻击，从而显示该株系作为活监督疫苗的用途。为此，发明人首先以1x104个δtps/tpp对首次用于实验的c57bl/6小鼠进行感染，并等待5周。然后，他们用1x104个野生型(pru:tdtomato:δhx)速殖子i.p.感染免疫的和首次用于实验的动物两者，每天监测体重和疾病迹象。正如预期的那样，首次用于实验的动物经历了典型的感染过程，大约从第5天开始体重下降，并在第9至12天死于感染(图17a)。
[0351]
但是，用δtps/tpp免疫接种的动物没有下降任何体重，并且100％的动物在攻击中存活了下来(图17b)。这表明δtps/tpp免疫接种可以完全保护动物免于弓形虫野生菌株的攻击。
[0352]
备注
[0353]
发明人在此表明多结构域蛋白tgtps/tpp在调节刚地弓形虫中心碳代谢中已经发展出新的调节功能，这些功能对于这些寄生虫的急性和慢性阶段的细胞内生长和存活是必不可少的。虽然该蛋白质的tps和tpp结构域似乎都缺乏可检测的催化活性，但它们保留了己糖磷酸/糖核苷酸结合所需的许多残基，并可能充当细胞内糖磷酸传感器。在存在高浓度葡萄糖的情况下(如同在培养的宿主细胞和在感染组织中一样)，tgtps/tpp可能会感受到高的细胞内葡萄糖
‑6‑
磷酸水平，并对己糖激酶的活性和葡萄糖
‑6‑
磷酸进入中央碳代谢的关键途径产生负调节作用。尽管我们无法使用下拉或体内交联测定法检测tgtps/tpp与己糖激酶之间的直接相互作用，但这些蛋白质可能在支链淀粉颗粒上或线粒体外膜上相互关联。tgtps蛋白结构域是否能够像在某些真菌和植物中已推测的那样可以感知其他代谢物还尚待研究。这些发现增加了越来越多的证据，表明刚地弓形虫高度依赖转录后/翻译机制来调节中心碳代谢。该策略可以使这些寄生虫对不同细胞类型或组织生态位内碳源的可利用性迅速做出应答，和/或将其生长速度调整为主要的免疫反应。
[0354]
保藏说明
[0355]
刚地弓形虫突变体pru:tdtomato:tps/tpp(25个小瓶)于2018年9月14日被美国典型培养物保藏中心(atcc)10801university boulevard，manassas，va接收，并分配了专利保藏号为pta
‑
125166。
[0356]
刚地弓形虫突变体rh:hxgprt:ku80:tps/tpp:hk2ha(25个小瓶)于2018年9月14日被美国典型培养物保藏中心10801university boulevard，manassas，va接收，并分配了专利保藏号pta
‑
125164。
[0357]
刚地弓形体突变体rh:hxgprt:tps/tpp(25个小瓶)于2018年9月14日被美国典型
培养物保藏中心10801university boulevard，manassas，va接收，并分配了专利保藏号pta
‑
125165。
[0358]
这些保藏物将根据布达佩斯条约的要求提供。但是，应当理解提供保藏物并不构成实施本发明的许可，损害政府授予的专利权。此外，将根据关于微生物保藏的布达佩斯条约的规定对相关的培养保藏物进行存储并向公众开放，即，将对它们进行储存，必要的维护以使其保持存活和不受污染至最近一次要求提供保藏物样本的请求后至少五年，并且无论如何，自保藏之日起至少30(三十)年，或者公开该培养物的可能授权的任何专利的有效期加上最后一次要求获得该保藏物的样本后五年。如果保藏人由于保藏的条件而无法应要求提供样品，则保藏人承认有责任更换保藏物。