单特异性和多特异性抗-TMEFF2抗体及其用途的制作方法

单特异性和多特异性抗
‑
tmeff2抗体及其用途
1.序列表
2.本申请包含已经以ascii格式电子递交的序列表，并且据此全文以引用方式并入。所述ascii副本创建于2019年1月31日，命名为jbi5160wopct1_sl.txt，并且大小为144,156字节。
技术领域
3.本文提供的公开内容涉及单特异性和多特异性抗
‑
tmeff2抗体，以及制备和使用所述抗体的方法。


背景技术：

4.前列腺癌是全世界男性第二大常见癌症，并且是引起癌症相关死亡的第六大主要原因。在全球范围内，每年有大约1,100,000例新病例和300,000例死亡病例，占所有癌症死亡病例的4％。据估计，每6名男性中就有1名将在其一生中被诊断患有该疾病。前列腺癌风险与年龄密切相关：约四分之三的病例出现在65岁以上男性中，在年龄为70
‑
74岁的男性中病例数量最多。根据尸检数据估计，大约一半的五十多岁男性和80％的80岁男性具有前列腺癌的组织学依据。在早期阶段，5年存活率接近100％。然而，当癌症已经转移时，5年存活率降至28％，并且仍然需要对晚期前列腺癌进行有效治疗。
5.雄激素阻断疗法通常导致疾病保持稳定或消退(在80％的患者中)。目前针对前列腺癌的治疗包括外科手术、放射疗法和激素疗法。通常，将癌症疫苗sipuleucel
‑
t、放射性药物剂(诸如，氯化镭223)、辅助激素疗法(诸如，阿比特龙或恩杂鲁胺)和/或化学疗法(多西他赛和卡巴他赛)依次添加到激素疗法中。虽然这些治疗中的每一种治疗可致使癌症生长延缓几个月并减轻疾病所产生的症状，但转移性前列腺癌的进展最终发展。尽管通过激素疗法降低睾酮水平，但前列腺癌也生长时，治疗选择是有限的。
6.因此，需要开发另外的治疗剂来治疗前列腺癌。


技术实现要素：

7.本发明提供了一种分离的抗
‑
tmeff2抗体或其抗原结合片段，该抗体或其抗原结合片段结合至tmeff2的seq id no:110的膜近侧区。
8.本发明还提供了一种分离的抗
‑
tmeff2抗体或其抗原结合片段，该抗体或其抗原结合片段结合至tmeff2的膜近侧区，其中该抗体或其抗原结合片段与参考抗体竞争结合至tmeff2的膜近侧区，该参考抗体包含seq id no:25的重链可变区(vh)和seq id no:28的轻链可变区(vl)、seq id no:26的vh和seq id no:29的vl、seq id no:27的vh和seq id no:30的vl、seq id no:26的vh和seq id no:31的vl、seq id no:87的vh和seq id no:88的vl、或seq id no:89的vh和seq id no:90的vl。
9.本发明还提供了一种分离的抗tmeff2抗体或其抗原结合片段，该抗体或其抗原结合片段结合至tmeff2的膜近侧区，其中该抗体或其抗原结合片段在残基hgkcehsinmqepsc
(seq id no:57)或dagytgqhcekkdysvl(seq id no:58)内结合至tmeff2的膜近侧区。
10.本发明还提供了一种分离的抗
‑
tmeff2抗体，该抗体具有如本文所述的某些重链和轻链互补决定区序列。
11.本发明还提供了一种分离的抗
‑
tmeff2抗体，该抗体具有如本文所述的某些重链可变区和轻链可变区序列。
12.本发明还提供了一种分离的抗
‑
tmeff2抗体，该抗体具有如本文所述的某些重链和轻链序列。
13.本发明还提供了一种分离的抗
‑
tmeff2抗体或其抗原结合片段，该抗体或其抗原结合片段包含：
14.分别为seq id no:10、12、15、18、20和22的hcdr1、hcdr2、hcdr3、lcdr1、lcdr2和lcdr3；
15.seq id no:25的vh和seq id no:28的vl；和/或
16.seq id no:32的hc和seq id no:35的lc。
17.本发明还提供了一种分离的抗
‑
tmeff2抗体或其抗原结合片段，该抗体或其抗原结合片段包含：
18.分别为seq id no:11、13、16、19、21和23的hcdr1、hcdr2、hcdr3、lcdr1、lcdr2和lcdr3；
19.seq id no:26的vh和seq id no:29的vl；和/或
20.seq id no:33的hc和seq id no:36的lc。
21.本发明还提供了一种分离的抗
‑
tmeff2抗体或其抗原结合片段，该抗体或其抗原结合片段包含：
22.分别为seq id no:10、14、17、18、20和24的hcdr1、hcdr2、hcdr3、lcdr1、lcdr2和lcdr3；
23.seq id no:27的vh和seq id no:30的vl；和/或
24.seq id no:34的hc和seq id no:37的lc。
25.本发明还提供了一种分离的抗
‑
tmeff2抗体或其抗原结合片段，该抗体或其抗原结合片段包含：
26.分别为seq id no:11、13、16、18、20和22的hcdr1、hcdr2、hcdr3、lcdr1、lcdr2和lcdr3；
27.seq id no:26的vh和seq id no:31的vl；和/或
28.seq id no:33的hc和seq id no:38的lc。
29.本发明还提供了一种分离的抗
‑
tmeff2抗体或其抗原结合片段，该抗体或其抗原结合片段包含：
30.分别为seq id no:10、12、15、18、20和86的hcdr1、hcdr2、hcdr3、lcdr1、lcdr2和lcdr3；
31.seq id no:87的vh和seq id no:88的vl；和/或
32.seq id no:91的hc和seq id no:92的lc。
33.本发明还提供了一种分离的抗
‑
tmeff2抗体或其抗原结合片段，该抗体或其抗原结合片段包含：
34.分别为seq id no:10、12、15、18、20和86的hcdr1、hcdr2、hcdr3、lcdr1、lcdr2和lcdr3；
35.seq id no:89的vh和seq id no:90的vl；和/或
36.seq id no:93的hc和seq id no:94的lc。
37.本发明还提供了一种药物组合物，该药物组合物包含本发明的抗
‑
tmeff2抗体或其抗原结合片段和药学上可接受的载体。
38.本发明还提供了一种分离的多核苷酸，该分离的多核苷酸编码本发明的抗
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tmeff2抗体或其抗原结合片段，编码seq id no:25、26、27、87或89的抗
‑
tmeff2抗体vh和/或seq id no:28、29、30、31、88或90的vl，或包含seq id no:39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、95、96、97、98、99、100、101或102的多核苷酸序列。
39.本发明还提供了包含本发明的多核苷酸的载体。
40.本发明还提供一种包含本发明的载体的宿主细胞。
41.本发明还提供了一种制备本发明的抗
‑
tmeff2抗体或其抗原结合片段的方法，该方法包括在表达该抗体或抗原结合片段的条件下培养本发明的宿主细胞，并且回收由宿主细胞产生的抗体或其抗原结合片段。
42.本发明还提供了一种治疗对其有需要的受试者的tmeff2阳性癌症的方法，该方法包括向受试者施用治疗有效量的本发明的分离的抗
‑
tmeff2抗体或其抗原结合片段或本发明的药物组合物以治疗tmeff2阳性癌症。
43.本发明还提供了一种抗独特型抗体，该抗独特型抗体结合至本发明的抗
‑
tmeff2抗体。
44.本发明还提供了一种试剂盒，该试剂盒包含本发明的抗
‑
tmeff2抗体或其抗原结合片段。
45.本发明还提供了一种分离的双特异性抗
‑
tmeff2/抗
‑
cd3抗体或其抗原结合片段，该抗体或其抗原结合片段包含结合tmeff2的第一结构域和结合cd3的第二结构域。
46.本发明还提供了一种分离的双特异性抗
‑
tmeff2/抗
‑
cd3抗体或其抗原结合片段，该抗体或其抗原结合片段包含结合tmeff2的第一结构域和结合cd3的第二结构域，其中抗体结合至tmeff2的seq id no:110的膜近侧区。
47.本发明还提供了一种分离的双特异性抗
‑
tmeff2/抗
‑
cd3抗体或其抗原结合片段，其中该抗体与参考抗体竞争结合至tmeff2的膜近侧区，该参考抗体包含seq id no:25的重链可变区(vh)和seq id no:28的轻链可变区(vl)、seq id no:26的vh和seq id no:29的vl、seq id no:27的vh和seq id no:30的vl、seq id no:26的vh和seq id no:31的vl、seq id no:87的vh和seq id no:88的vl、或seq id no:89的vh和seq id no:90的vl。
48.本发明还提供了一种分离的双特异性抗
‑
tmeff2/抗
‑
cd3抗体或其抗原结合片段，其中该抗体结合tmeff2上的seq id no:57或seq id no:58的表位。
49.本发明还提供了一种分离的双特异性抗
‑
tmeff2/抗
‑
cd3抗体或其抗原结合片段，该抗体或其抗原结合片段包含结合tmeff2的第一结构域和结合cd3的第二结构域，其中
50.第一结构域包含分别为seq id no:10、12、15、18、20和22的hcdr1、hcdr2、hcdr3、lcdr1、lcdr2和lcdr3，并且第二结构域包含分别为seq id no:60、61、62、63、64和65的hcdr1、hcdr2、hcdr3、lcdr1、lcdr2和lcdr3；
no:77的lc2。
64.本发明还提供了一种分离的双特异性抗
‑
tmeff2/抗
‑
cd3抗体或其抗原结合片段，该抗体或其抗原结合片段包含结合tmeff2的第一结构域和结合cd3的第二结构域，其中
65.第一结构域包含分别为seq id no:10、14、17、18、20和24的hcdr1、hcdr2、hcdr3、lcdr1、lcdr2和lcdr3，并且第二结构域包含分别为seq id no:68、69、70、71、72和73的hcdr1、hcdr2、hcdr3、lcdr1、lcdr2和lcdr3；
66.第一结构域包含seq id no:27的vh和seq id no:30的vl，并且第二结构域包含seq id no:74的vh和seq id no:75的vl；并且/或者双特异性抗
‑
tmeff2/抗
‑
cd3抗体或其抗原结合片段包含seq id no:34的hc1、seq id no:37的lc1、seq id no:78的hc2和seq id no:79的lc2。
67.本发明还提供了一种分离的双特异性抗
‑
tmeff2/抗
‑
cd3抗体或其抗原结合片段，该抗体或其抗原结合片段包含结合tmeff2的第一结构域和结合cd3的第二结构域，其中
68.第一结构域包含分别为seq id no:11、13、16、18、20和22的hcdr1、hcdr2、hcdr3、lcdr1、lcdr2和lcdr3，并且第二结构域包含分别为seq id no:60、61、62、63、64和65的hcdr1、hcdr2、hcdr3、lcdr1、lcdr2和lcdr3；
69.第一结构域包含seq id no:26的vh和seq id no:31的vl，并且第二结构域包含seq id no:66的vh和seq id no:67的vl；并且/或者双特异性抗
‑
tmeff2/抗
‑
cd3抗体或其抗原结合片段包含seq id no:33的hc1、seq id no:38的lc1、seq id no:76的hc2和seq id no:77的lc2。
70.本发明还提供了一种分离的双特异性抗
‑
tmeff2/抗
‑
cd3抗体或其抗原结合片段，该抗体或其抗原结合片段包含结合tmeff2的第一结构域和结合cd3的第二结构域，其中
71.第一结构域包含分别为seq id no:11、13、16、18、20和22的hcdr1、hcdr2、hcdr3、lcdr1、lcdr2和lcdr3，并且第二结构域包含分别为seq id no:68、69、70、71、72和73的hcdr1、hcdr2、hcdr3、lcdr1、lcdr2和lcdr3；
72.第一结构域包含seq id no:26的vh和seq id no:31的vl，并且第二结构域包含seq id no:74的vh和seq id no:75的vl；并且/或者双特异性抗
‑
tmeff2/抗
‑
cd3抗体或其抗原结合片段包含seq id no:33的hc1、seq id no:38的lc1、seq id no:78的hc2和seq id no:79的lc2。
73.本发明还提供了一种分离的双特异性抗
‑
tmeff2/抗
‑
cd3抗体或其抗原结合片段，该抗体或其抗原结合片段包含结合tmeff2的第一结构域和结合cd3的第二结构域，其中
74.第一结构域包含分别为seq id no:10、12、15、18、20和86的hcdr1、hcdr2、hcdr3、lcdr1、lcdr2和lcdr3，并且第二结构域包含分别为seq id no:60、61、62、63、64和65的hcdr1、hcdr2、hcdr3、lcdr1、lcdr2和lcdr3；
75.第一结构域包含seq id no:87的vh和seq id no:88的vl，并且第二结构域包含seq id no:66的vh和seq id no:67的vl；并且/或者双特异性抗
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tmeff2/抗
‑
cd3抗体或其抗原结合片段包含seq id no:91的hc1、seq id no:92的lc1、seq id no:76的hc2和seq id no:77的lc2。
76.本发明还提供了一种分离的双特异性抗
‑
tmeff2/抗
‑
cd3抗体或其抗原结合片段，该抗体或其抗原结合片段包含结合tmeff2的第一结构域和结合cd3的第二结构域，其中
77.第一结构域包含分别为seq id no:10、12、15、18、20和86的hcdr1、hcdr2、hcdr3、lcdr1、lcdr2和lcdr3，并且第二结构域包含分别为seq id no:68、69、70、71、72和73的hcdr1、hcdr2、hcdr3、lcdr1、lcdr2和lcdr3；
78.第一结构域包含seq id no:87的vh和seq id no:88的vl，并且第二结构域包含seq id no:74的vh和seq id no:75的vl；并且/或者双特异性抗
‑
tmeff2/抗
‑
cd3抗体或其抗原结合片段包含seq id no:91的hc1、seq id no:92的lc1、seq id no:78的hc2和seq id no:79的lc2。
79.本发明还提供了一种分离的双特异性抗
‑
tmeff2/抗
‑
cd3抗体或其抗原结合片段，该抗体或其抗原结合片段包含结合tmeff2的第一结构域和结合cd3的第二结构域，其中
80.第一结构域包含分别为seq id no:10、12、15、18、20和86的hcdr1、hcdr2、hcdr3、lcdr1、lcdr2和lcdr3，并且第二结构域包含分别为seq id no:60、61、62、63、64和65的hcdr1、hcdr2、hcdr3、lcdr1、lcdr2和lcdr3；
81.第一结构域包含seq id no:89的vh和seq id no:90的vl，并且第二结构域包含seq id no:66的vh和seq id no:67的vl；并且/或者双特异性抗
‑
tmeff2/抗
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cd3抗体或其抗原结合片段包含seq id no:93的hc1、seq id no:94的lc1、seq id no:76的hc2和seq id no:77的lc2。
82.本发明还提供了一种分离的双特异性抗
‑
tmeff2/抗
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cd3抗体或其抗原结合片段，该抗体或其抗原结合片段包含结合tmeff2的第一结构域和结合cd3的第二结构域，其中
83.第一结构域包含分别为seq id no:10、12、15、18、20和86的hcdr1、hcdr2、hcdr3、lcdr1、lcdr2和lcdr3，并且第二结构域包含分别为seq id no:68、69、70、71、72和73的hcdr1、hcdr2、hcdr3、lcdr1、lcdr2和lcdr3；
84.第一结构域包含seq id no:89的vh和seq id no:90的vl，并且第二结构域包含seq id no:74的vh和seq id no:75的vl；并且/或者双特异性抗
‑
tmeff2/抗
‑
cd3抗体或其抗原结合片段包含seq id no:93的hc1、seq id no:94的lc1、seq id no:78的hc2和seq id no:79的lc2。
85.本发明还提供了一种药物组合物，该药物组合物包含本发明的双特异性抗
‑
tmeff2/抗
‑
cd3抗体或其抗原结合片段和药学上可接受的载体。
86.本发明还提供了一种多核苷酸，该多核苷酸编码本发明的双特异性抗
‑
tmeff2/抗
‑
cd3抗体或其抗原结合片段。
87.本发明还提供了一种制备双特异性抗
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tmeff2/抗
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cd3抗体的方法，该方法包括在表达该抗体的条件下培养本发明的宿主细胞，以及回收并纯化由该宿主细胞产生的双特异性抗
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tmeff2/抗
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cd3抗体或其抗原结合片段。
88.本发明还提供了一种制备双特异性抗
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tmeff2/抗
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cd3抗体或其抗原结合片段的方法，该方法包括：
89.将具有两条相同hc1和两条相同lc1的单特异性二价tmeff2抗体与具有两条相同hc2和两条相同lc2的单特异性二价cd3抗体以约1:1摩尔比的混合物混合；
90.将还原剂引入该混合物中；
91.将该混合物温育约九十分钟至约六小时；
92.除去还原剂；以及
93.纯化包含hc1、lc1、hc2和lc2的双特异性抗
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tmeff2/抗cd3
‑
抗体或其抗原结合片段。
94.本发明还提供了一种治疗对其有需要的受试者的tmeff2阳性癌症的方法，该方法包括向受试者施用治疗有效量的本发明的双特异性抗
‑
tmeff2/抗cd3
‑
抗体或其抗原结合片段或本发明的药物组合物以治疗tmeff2阳性癌症。
95.本发明还提供了一种抗独特型抗体，该抗独特型抗体结合至本发明的双特异性抗
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tmeff2/抗
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cd3抗体或其抗原结合片段。
96.本发明还提供了一种试剂盒，该试剂盒包含本发明的双特异性抗
‑
tmeff2/抗
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cd3抗体。
附图说明
97.图1示出了选定抗
‑
tmeff2抗体重链可变区(vh)的比对。vh区在每行开始时由它们的seq id no:标识。
98.图2示出了选定抗
‑
tmeff2抗体轻链可变区(vl)的比对。vh区在每行开始时由它们的seq id no:标识。
99.图3示出了通过选定双特异性抗
‑
tmeff2/抗
‑
cd3抗体所致的如通过半胱天冬酶3/7活性增大测量的随时间推移lncap细胞的杀伤。
100.图4示出了在雄性ngs小鼠的离体lncap前列腺癌模型中通过选定双特异性抗
‑
tmeff2/抗
‑
cd3抗体所致肿瘤移植后平均肿瘤体积随时间推移的减小。
101.图5a示出了在雄性ngs小鼠的离体lncap前列腺癌模型中用0.5mg/kg tmcb93处理的每只小鼠的平均肿瘤体积的减小。
102.图5b示出了在雄性ngs小鼠的离体lncap前列腺癌模型中用0.5mg/kg tmcb132处理的每只小鼠的平均肿瘤体积的减小。
103.图6示出了tmeb762xcd3b376在t细胞人源化nsg小鼠中的已建立lncap异种移植物中的功效。
104.图7示出了响应于tmcb132的施用，lncap前列腺癌细胞中的t细胞活化。
105.图8示出了tmcb132的t细胞介导的细胞毒性。
106.图9示出了tmcb132在t细胞人源化小鼠中的抗肿瘤功效。
具体实施方式
107.本说明书中所引用的所有出版物，包括但不限于专利和专利申请均以引用方式并入本文，如同在本文中完整给出。
108.应当了解，本文所用的术语只是为了描述具体实施方案的目的，并非旨在进行限制。除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语的含义与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的含义相同。
109.虽然与本文所述的那些方法和材料相似或等效的任意方法和材料都可以用于检验本发明的实践中，然而本文中描述示例性材料和方法。在描述和要求保护本发明时，将使用以下术语。
110.如本说明书和所附权利要求中所用，除非内容另有明确说明，否则单数形式“一
个”、“一种”和“所述”包括复数指代。因此，例如，对“一个细胞”的提及包括两个或更多个细胞的组合等等。
111.除非上下文另有明确要求，否则在整个说明书和权利要求书中，应将词语“包括”、“包含”等理解为包含性含义，而不是排他性或穷举性含义；也就是说，为“包括但不限于”的含义。
[0112]“特异性结合”、“特异性地结合”或“结合”是指抗体以比针对其他抗原更高的亲和力结合至抗原或抗原内的表位。通常，抗体以约1
×
10
‑8m或更小(例如约1
×
10
‑9m或更小、约1
×
10
‑
10
m或更小、约1
×
10
‑
11
m或更小、或者约1
×
10
‑
12
m或更小)的平衡解离常数(k
d
)结合至抗原或抗原内的表位，通常该k
d
为该抗体结合至非特异性抗原(如bsa、酪蛋白)的k
d
的至少百分之一。可使用本文所述的方案来测量解离常数。然而，结合至抗原或抗原内的表位的抗体可能对其他相关的抗原具有交叉反应性，例如，对来自其他物种(同源)(诸如人或猴，例如食蟹猕猴(macaca fascicularis)(cynomolgus，cyno)、黑猩猩(pan troglodytes)(chimpanzee，chimp)的相同抗原具有交叉反应性。单特异性抗体结合一个抗原或一个表位，而双特异性抗体结合两个不同的抗原或两个不同的表位。
[0113]“抗体”广义上是指并包括免疫球蛋白分子，具体包括单克隆抗体(包括鼠科动物单克隆抗体、人单克隆抗体、人源化单克隆抗体和嵌合单克隆抗体)，抗原结合片段，多特异性抗体(诸如双特异性抗体、三特异性抗体、四特异性抗体等)，二聚、四聚或多聚抗体，单链抗体、结构域抗体，以及包含具有所需特异性的抗原结合位点的免疫球蛋白分子的任何其他经修饰构型。“全长抗体”包含由二硫键互连的两条重链(hc)与两条轻链(lc)以及它们的多聚体(例如igm)。每条重链由重链可变区(vh)和重链恒定区(由结构域ch1、铰链、ch2和ch3构成)构成。每条轻链由轻链可变区(vl)和轻链恒定区(cl)构成。vh区和vl区可进一步细分为超变区，该超变区称为互补决定区(cdr)并间插有框架区(fr)。各个vh和vl由三个cdr和四个fr片段构成，并按以下顺序从氨基端至羧基端排列：fr1、cdr1、fr2、cdr2、fr3、cdr3和fr4。
[0114]“互补决定区(cdr)”是结合抗原的抗体区域。cdr可使用各种描绘来定义，诸如kabat(wu等人，(1970)j exp med 132:211
‑
50)(kabat等人，“sequences of proteins of immunological interest”，第5版，public health service,national institutes of health,bethesda,md.,1991)、chothia(chothia等人，(1987)jmol biol 196:901
‑
17)、imgt(lefranc等人，(2003)dev comp immunol27:55
‑
77)和abm(martin和thornton，(1996)jbmol biol 263:800
‑
15)。描述了各种描绘和可变区编号之间的对应关系(参见例如lefranc等人，(2003)dev comp immunol 27:55
‑
77；honegger和pluckthun，(2001)jmol biol 309:657
‑
70；国际免疫遗传学(imgt)数据库；网络资源，www.imgt.org)。可用程序(诸如ucl business plc的abysis)可用于描绘cdr。除非说明书中另有明确地说明，否则如本文所用，术语“cdr”、“hcdr1”、“hcdr2”、“hcdr3”、“lcdr1”、“lcdr2”和“lcdr3”包括由任何上述方法(kabat、chothia、imgt或abm)定义的cdr。
[0115]
免疫球蛋白可根据重链恒定域氨基酸序列被指定为五种主要种类，即iga、igd、ige、igg和igm。iga和igg进一步亚分类为同种型iga1、iga2、igg1、igg2、igg3和igg4。基于其恒定结构域的氨基酸序列，可将任何脊椎物种的抗体轻链指定为两种完全不同的类型即κ和λ中的一种。
[0116]“抗原结合片段”是指免疫球蛋白分子的结合抗原的部分。抗原结合片段可以是合成的、可通过酶促方法获得的或遗传工程的多肽，并且包括vh、vl、vh和vl、fab、f(ab')2、fd和fv片段、由一个vh结构域或一个vl结构域组成的结构域抗体(dab)、鲨鱼可变ignar结构域、骆驼化vh结构域、由模拟抗体的cdr的氨基酸残基组成的最小识别单元(诸如fr3
‑
cdr3
‑
fr4部分、hcdr1、hcdr2和/或hcdr3、以及lcdr1、lcdr2和/或lcdr3)。vh和vl域可经由合成接头连接在一起以形成各种类型的单链抗体设计，其中在vh和vl域由单独的单链抗体构建体表达的情况下，vh/vl域可在分子内或分子间配对，以形成单价抗原结合位点，诸如单链fv(scfv)或双价抗体；例如在国际专利公布wo1998/44001、wo1988/01649、wo1994/13804和wo1992/01047中所述。
[0117]“单克隆抗体”是指从抗体分子的基本上同质群体中获得的抗体，即，除了可能熟知的改变(诸如从抗体重链移除c末端赖氨酸)或翻译后修饰(诸如氨基酸异构化或脱酰胺、甲硫氨酸氧化或天冬酰胺或谷氨酰胺脱酰胺)之外，构成群体的各个抗体是相同的。单克隆抗体通常结合一个抗原表位。双特异性单克隆抗体结合两个不同的抗原表位。单克隆抗体可在抗体群内具有异质糖基化。单克隆抗体可以是单特异性的或多特异性的，诸如双特异性单价的、二价的或多价的。
[0118]“分离的”是指已经与分子产生于其中的系统(诸如重组细胞)中的其他组分基本上分离和/或从其中纯化出来的分子(诸如合成的多核苷酸或蛋白质，诸如抗体)的同质群体，以及已经受至少一个纯化或分离步骤的蛋白质。“分离的抗体”是指基本上不含其他细胞材料和/或化学物质的抗体，并且涵盖分离至更高纯度，诸如80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％纯度的抗体。
[0119]“人源化抗体”是指其中至少一个cdr来源于非人物种并且至少一个框架来源于人免疫球蛋白序列的抗体。人源化抗体在框架中可包含置换，使得该框架可能不是表达的人免疫球蛋白或人免疫球蛋白种系基因序列的精确拷贝。
[0120]“人抗体”是指当施用于人受试者时被优化以具有最小限度的免疫应答的抗体。人抗体的可变区来源于人免疫球蛋白序列。如果人抗体包含恒定区或恒定区的一部分，则该恒定区也来源于人免疫球蛋白序列。如果人抗体的可变区来源于使用人种系免疫球蛋白或重排免疫球蛋白基因的系统，则人抗体包含“来源于”人起源序列的重链可变区和轻链可变区。此类示例性系统为在噬菌体上展示的人免疫球蛋白基因文库，以及转基因非人动物，诸如携带人免疫球蛋白基因座的小鼠或大鼠。由于用于获得人抗体和人免疫球蛋白基因座的系统之间的差异，体细胞突变的引入，或有意将取代引入框架或cdr中，或这两者，因此“人抗体”与在人中表达的免疫球蛋白相比通常包含氨基酸差异。通常，“人抗体”的氨基酸序列与由人种系免疫球蛋白基因或重排免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列具有至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。在一些情况下，“人抗体”可包含由人框架序列分析得到的共有框架序列(例如knappik等人，(2000)j mol biol 296:57
‑
86中所述)；或结合到展示在噬菌体上的人免疫球蛋白基因文库中的合成hcdr3(例如shi等人，(2010)j mol biol 397:385
‑
96和国际专利公开wo2009/085462中所述)。
[0121]“人抗体”的定义中不包括至少一个cdr来源于非人物种的抗体。
[0122]“重组体”是指当将来自不同来源的片段连接以产生重组dna、抗体或蛋白质时，通过重组手段制备、表达、形成或分离的dna、抗体和其他蛋白质。
[0123]“表位”是指抗原的与抗体特异性结合的部分。表位通常由部分诸如氨基酸或多糖侧链的化学活性(诸如，极性、非极性或疏水性)表面基团组成，并且可具有特定三维结构特征以及特定电荷特征。表位可由形成构象空间单元的连续和/或不连续氨基酸构成。对于不连续表位，来自抗原的线性序列的不同部分的氨基酸因蛋白质分子的折叠而在三维空间上靠近。
[0124]“双特异性”是指特异性结合两个不同抗原或同一抗原内的两个不同表位的抗体。双特异性抗体可能对其他相关的抗原具有交叉反应性，例如，对来自其他物种(同源)(诸如人或猴，例如猕猴(macaca cynomolgus)或黑猩猩)的相同抗原具有交叉反应性，或者可结合两个或更多个不同抗原之间所共享的表位。
[0125]“多特异性”是指特异性结合两个或更多个不同抗原或同一抗原内的两个或更多个不同表位的抗体。多特异性抗体可能对其他相关的抗原具有交叉反应性，例如，对来自其他物种(同源)(诸如人或猴，例如猕猴或黑猩猩)的相同抗原具有交叉反应性，或者可结合两个或更多个不同抗原之间所共享的表位。
[0126]“变体”是指因一处或多处修饰(例如，一个或多个置换、插入或缺失)而不同于参考多肽或参考多核苷酸的多肽或多核苷酸。
[0127]“载体”是指能够在生物系统内复制或可在这类系统之间移动的多核苷酸。载体多核苷酸通常含有元件诸如复制起点、聚腺苷酸化信号或选择标记物，其功能是促进这些多核苷酸在生物系统，例如细胞、病毒、动物、植物、以及利用能够复制载体的生物组分的重组生物系统中的复制或保持。载体多核苷酸可为单链或双链dna或rna分子或这些分子的杂合分子。
[0128]“表达载体”是指可用于在生物系统或再造生物系统中以指导由存在于表达载体中的多核苷酸序列所编码的多肽进行翻译的载体。
[0129]“多核苷酸”是指包含磷酸糖类主链共价连接的核苷酸链或其他等同共价化学物的合成分子。cdna是示例性合成多核苷酸。
[0130]“多肽”或“蛋白质”是指包含由肽键连接以形成多肽的至少两个氨基酸残基的分子。少于50个氨基酸的小多肽可以称作“肽”。
[0131]“tmeff2”是指具有egf样和两个卵泡抑素样结构域2的人跨膜蛋白质，也称为tomoregulin 2。全长人tmeff2的氨基酸序列示出在seq id no:1中。tmeff2的胞外域示出在seq id no:2中并横跨全长tmeff2的残基40
‑
374。tmeff2胞外域携带三个不同的亚结构域：kazal样1(残基85
‑
137)、kazal样2(残基176
‑
229)和egf结构域(残基261
‑
301)。tmeff2 egf结构域示出于seq id no:3中。tmeff2“膜近侧区”是指seq id no:110的tmeff2区，其涵盖egf结构域和n
‑
c末端接头区(例如seq id no:1的全长人tmeff2的残基230
‑
320)。除非明确指明来自非人物种，否则本文对蛋白质、多肽和蛋白质片段的所有提及均旨在指相应蛋白质、多肽或蛋白质片段的人型式。因此，除非指明来自非人物种，例如“小鼠tmeff2”或“猴tmeff2”等，否则“tmeff2”意指人tmeff2。
[0132]
seq id no:1(全长人tmeff2)
[0133]
mvlwesprqcsswtlcegfcwllllpvmllivarpvklaafptslsdcqtptgwncsgyd
[0134]
drendlflcdtntckfdgeclrigdtvtcvcqfkcnndyvpvcgsngesyqnecylrqaa
[0135]
ckqqseilvvsegscatdagsgsgdgvhegsgetsqketstcdicqfgaecdedaedvwc
[0136]
vcnidcsqtnfnplcasdgksydnacqikeascqkqekievmslgrcqdntttttksedg
[0137]
hyartdyaenankleesarehhipcpehyngfcmhgkcehsinmqepscrcdagytgqhc
[0138]
ekkdysvlyvvpgpvrfqyvliaavigtiqiavicvvvlcitrkcprsnrihrqkqntgh
[0139]
yssdnttrastrli
[0140]
seq id no:2(人tmeff2的胞外域)
[0141]
fptslsdcqtptgwncsgyddrendlflcdtntckfdgeclrigdtvtcvcqfkcnndyv
[0142]
pvcgsngesyqnecylrqaackqqseilvvsegscatdagsgsgdgvhegsgetsqkets
[0143]
tcdicqfgaecdedaedvwcvcnidcsqtnfnplcasdgksydnacqikeascqkqekie
[0144]
vmslgrcqdntttttksedghyartdyaenankleesarehhipcpehyngfcm
[0145]
hgkcehsinmqepscrcdagytgqhcekkdysvlyvvpgpvrfqyvliaavigtiqiavicvvvlcitrkcprsnrihrqkqntghyssdnttrastrli
[0146]
tmeff2 egf结构域seq id no:3
[0147]
hhipcpehyngfcmhgkcehsinmqepscrcdagytgqhce
[0148]
tmeff2膜近侧区seq id no:110
[0149]
ntttttksedghyartdyaenankleesarehhipcpehyngfcmhgkcehsinmqepscrcdagytgqhcekkdysvlyvvpgpvrfqyv
[0150]“cd3”是指作为多分子t细胞受体(tcr)复合物的一部分在t细胞上表达并且由同源二聚体或异源二聚体组成的抗原，该同源二聚体或异源二聚体由两条或四条受体链：cd3ε、cd3δ、cd3ζ和cd3γ的缔合形成。人cd3ε包含seq id no:4的氨基酸序列。除非明确指明来自非人物种，否则本文对蛋白质、多肽和蛋白质片段的所有提及均旨在指相应蛋白质、多肽或蛋白质片段的人型式。因此，除非指明来自非人物种，例如“小鼠cd3”或“猴cd3”等，否则“cd3”意指人cd3。
[0151]
seq id no:4(人cd3ε)
[0152]
mqsgthwrvlglcllsvgvwgqdgneemggitqtpykvsisgttviltcpqypgseilwq
[0153]
hndkniggdeddknigsdedhlslkefseleqsgyyvcyprgskpedanfylylrarvce
[0154]
ncmemdvmsvativivdicitggllllvyywsknrkakakpvtrgagaggrqrgqnkerp
[0155]
ppvpnpdyepirkgqrdlysglnqrri
[0156]
seq id no:5(人cd3ε胞外域)
[0157]
dgneemggitqtpykvsisgttviltcpqypgseilwqhndkniggdeddknigsdedhl
[0158]
slkefseleqsgyyvcyprgskpedanfylylrarvcencmemd
[0159]“双特异性抗
‑
tmeff2/抗
‑
cd3抗体”、tmeff2/cd3抗体、tmeff2xcd3抗体等是指结合tmeff2和cd3的抗体。
[0160]“与
……
组合”意指将两种或更多种治疗剂以混合物一起、作为单一药剂同时或作为单一药剂以任何顺序依次施用给受治疗者。
[0161]“tmeff2阳性癌症”是指表现出可测量水平的tmeff2蛋白质的癌症组织或癌症细胞。tmeff2蛋白质的水平可使用熟知的测定法，使用例如elisa、免疫荧光法、流式细胞术或放射性免疫测定法，在活细胞或裂解细胞上测量。
[0162]“样本”是指从受试者分离的类似流体、细胞、或组织的采集物，以及存在于受试者体内的流体、细胞或组织。示例性样本为生物流体，诸如血液，血清和浆膜液，血浆，淋巴液，尿液，唾液，囊液，泪液，排泄物，痰，分泌组织和器官的粘膜分泌物，阴道分泌物，腹水诸如与非实体肿瘤相关联的那些，胸膜、心包、腹膜、腹腔和其他体腔的流体，由支气管灌洗液收集的流体，与受试者或生物来源接触的液体溶液例如细胞和器官培养基(包括细胞或器官条件培养基)、灌洗液等，组织活检样本，细针穿剌或手术切除的肿瘤组织。
[0163]“癌细胞”或“肿瘤细胞”是指在体内、离体或组织培养物中的癌性、癌前或转化的细胞，其具有自发或诱导的表型变化。这些变化未必涉及新遗传物质的摄取。虽然转化可由感染转化病毒以及结合新基因组核酸、或摄取外源核酸而发生，但是还可自发地发生或在暴露于致癌物之后发生，从而使内源基因突变。转化/癌症示例为合适的动物宿主(诸如裸小鼠等)中体外、体内和离体的形态变化、细胞永生、异常生长控制、病灶形成、增殖、恶性肿瘤、肿瘤特异性标记物水平调节、侵入、肿瘤生长(freshney,culture of animal cells:a manual of basic technique(第3版，1994))。
[0164]“约”是指处于如本领域的普通技术人员所确定的特定值的可接受误差范围之内，其将部分取决于所述值是如何测量或测定的，即所述测量系统的限制。在特定测定、结果或实施方案的上下文中，除非实施例或说明书其他地方内另有明确说明，否则“约”意指在根据本领域惯例的一个标准偏差之内、或多至5％的范围(无论哪个更大)。
[0165]“受试者”包括任何人或非人动物。“非人动物”包括所有的脊椎动物，例如哺乳动物和非哺乳动物，诸如非人灵长类动物、绵羊、狗、猫、马、牛、鸡、两栖动物、爬行动物等。除非另外指出，否则术语“患者”或“受试者”可互换使用。
[0166]“治疗”是指治疗性治疗以及预防性或防御性措施两者，其中目标是防止或减缓(减轻)不期望的生理变化或障碍。有益或期望的临床结果包括症状的减轻、疾病程度的减弱、疾病的稳定(即，未恶化)状态、疾病进展的延迟或减慢、疾病状态的改善或缓和，以及缓解(不论是部分缓解还是完全缓解)，不论是可检测的还是不可检测的。“治疗”也可意指与受检者未接受治疗时的预期生存期相比延长生存期。需要治疗的个体包括已患有病症或障碍的个体以及易患病症或障碍的个体或者要预防病症或障碍的个体。
[0167]“治疗有效量”是指在所需剂量和时间段有效实现期望的治疗结果的量。治疗有效量可根据以下因素变化：诸如个体的疾病状态、年龄、性别和体重，以及治疗剂或治疗剂组合在个体中引发期望的应答的能力。有效的治疗剂或治疗剂的组合的示例性指标包括例如改善患者的健康。
[0168]
除非另有明确说明，否则在整个说明书中，抗体恒定区中的氨基酸残基根据eu索引编号，如kabat等人，“sequences of proteins of immunological interest”，第5版public health service,national institutes of health,bethesda,md.(1991)中有所描述。
[0169]
本文使用如表1中所示的常规单字母和三字母氨基酸代码。
[0170]
表1.
[0171]
氨基酸三字母代码单字母代码丙氨酸alaa精氨酸argr
天冬酰胺asnn天冬氨酸aspd半胱氨酸cysc谷氨酸glne谷氨酰胺gluq甘氨酸glyg组氨酸hish异亮氨酸ilei亮氨酸leul赖氨酸lysk甲硫氨酸metm苯丙氨酸phef脯氨酸prop丝氨酸sers苏氨酸thrt色氨酸trpw酪氨酸tyry缬氨酸valv
[0172]
物质的组成
[0173]
本发明提供了抗
‑
tmeff2抗体或其抗原结合片段、包含本发明的抗
‑
tmeff2抗体的抗原结合片段的多特异性抗体、以及双特异性抗
‑
tmeff2/抗
‑
cd3抗体或其抗原结合片段。本发明提供了多肽和编码本发明抗体的多核苷酸或其互补核酸、载体、宿主细胞及其制备和使用方法。
[0174]
抗tmeff2抗体
[0175]
相对于其他正常组织，前列腺组织和前列腺腺癌中显著富含tmeff2表达。膜tmeff2在整个疾病进展中保留，用作抗肿瘤治疗剂的可能靶标。已知tmeff2被蛋白酶切割，产生可溶性形式的抗原。在本发明中，产生针对tmeff2的膜近侧区的抗体，以最大程度提高抗体与膜tmeff2的结合，并最大程度减小所得抗体结合可溶性tmeff2形式的可能性。
[0176]
本发明提供了一种分离的抗
‑
tmeff2抗体或其抗原结合片段，该抗体或其抗原结合片段结合至tmeff2的seq id no:110的膜近侧区。结合tmeff2的膜近侧区的本发明的抗tmeff2抗体不被细胞内化。虽然不希望受任何特定理论的束缚，但可以预期，与内化抗
‑
tmeff2抗体相比，非内化抗
‑
tmeff2抗体具有由于缺乏内化和tmeff2的降解引起的由抗体效应子功能介导的改善的致癌效应。
[0177]“结合至膜近侧区”意指90％的使用氢/氘交换(h/d交换)鉴别的抗体表位残基位于tmeff2的膜近侧区内。表位残基是通过h/d交换具有至少5％氘代水平差异的由测试抗体保护的那些。示例性此类抗体为如本文所述的tmeb675、tmeb570、tmeb674、tmeb565、tmeb762和tmeb757。
[0178]
在一些实施方案中，分离的抗
‑
tmeff2抗体或其抗原结合片段在残基hgkcehsinmqepsc(seq id no:57)或dagytgqhcekkdysvl(seq id no:58)内结合至tmeff2
的膜近侧区。在残基hgkcehsinmqepsc(seq id no:57)内结合的示例性抗
‑
tmeff2抗体是tmeb570。在残基dagytgqhcekkdysvl(seq id no:58)内结合的示例性抗
‑
tmeff2抗体是tmeb675。tmeb675变体tmeb762和tmeb757也预期在残基dagytgqhcekkdysvl(seq id no:58)内结合tmeff2的膜近侧区。
[0179]
在h/d交换测定法中，将通过重组表达的tmeff2 ecd在存在或不存在抗体情况下于氘化水中温育预定时间，从而导致氘在不受抗体保护的可交换氢原子处引入，之后使蛋白酶消化蛋白质并使用lc
‑
ms分析肽片段。h/d交换测定法可使用已知的方案执行。示例性方案描述于实施例5中。
[0180]
本发明还提供了一种分离的抗
‑
tmeff2抗体或其抗原结合片段，其中该抗体或其抗原结合片段与参考抗体竞争结合至tmeff2的膜近侧区，该参考抗体包含seq id no:25的重链可变区(vh)和seq id no:28的轻链可变区(vl)、seq id no:26的vh和seq id no:29的vl、seq id no:27的vh和seq id no:30的vl、seq id no:26的vh和seq id no:31的vl、seq id no:87的vh和seq id no:88的vl、或seq id no:89的vh和seq id no:90的vl。
[0181]
测试抗体与参考抗体竞争结合至tmeff2的膜近侧区可使用熟知的方法在体外进行测定。例如，可通过elisa评估在存在未标记的参考抗体情况下msd sulfo
‑
tag
tm nhs
‑
酯标记的测试抗体与tmeff2膜近侧区的结合，或者可使用bioacore分析或流式细胞术来展示竞争。当测试抗体抑制参考抗体与tmeff2的膜近侧区的结合达到85％或更大，例如90％或更大、或95％或更大的程度时，测试抗体与参考抗体竞争结合至tmeff2。
[0182]
本发明还提供了一种分离的抗
‑
tmeff2抗体或其抗原结合片段，该抗体或其抗原结合片段包含下列的重链互补决定区1(hcdr1)、hcdr2、hcdr3、轻链互补决定区1(lcdr1)、lcdr2和lcdr3：
[0183]
分别为seq id no:10、12、15、18、20和22；
[0184]
分别为seq id no:11、13、16、19、21和23；
[0185]
分别为seq id no:10、14、17、18、20和24；
[0186]
分别为seq id no:11、13、16、18、20和22；或者
[0187]
分别为seq id no:10、12、15、18、20和86。
[0188]
在一些实施方案中，本发明的分离的抗
‑
tmeff2抗体或其抗原结合片段以约0.4
×
10
‑9m或更小的平衡解离常数(k
d
)结合至tmeff2的膜近侧区，其中k
d
使用表面等离振子共振在ph 4.5
‑
5.0的乙酸盐缓冲液中于室温下进行测量。
[0189]
在一些实施方案中，分离的抗
‑
tmeff2抗体或其抗原结合片段以介于约0.1
×
10
‑
10
m和约0.4
×
10
‑9m之间的k
d
结合至tmeff2的膜近侧区。
[0190]
抗体对tmeff2的膜近侧区的亲和力可使用任何合适的方法通过实验确定。一种示例性方法采用本领域技术人员已知的proteon xpr36、biacore 3000或kinexa仪器、elisa或竞争结合测定法。如果在不同的条件(例如，同渗容摩、ph)下测量，则测量的抗体对tmeff2的亲和力可变化。因此，亲和力和其他结合参数(例如，k
d
、k
on
和k
off
)的测量通常用标准化条件和标准化缓冲液(诸如本文所述的缓冲液)进行。本领域技术人员将理解，使用例如biacore 3000或proteon进行亲和力测量的内部误差(测量为标准偏差，sd)通常可在典型检出限内的测量值的5％
‑
33％内。因此，当提及k
d
值时，术语“约”反映测定中的典型标准偏差。例如，1
×
10
‑9m的k
d
的典型sd为至多+0.33
×
10
‑9m。
[0191]
本发明还提供了一种分离的抗
‑
tmeff2抗体或其抗原结合片段，该抗体或其抗原结合片段结合至tmeff2的膜近侧区，并包含来源于vh3_3
‑
23(seq id no:53)或vh1_1
‑
69(seq id no:54)的重链可变区(vh)框架。
[0192]
本发明还提供了一种分离的抗
‑
tmeff2抗体或其抗原结合片段，该抗体或其抗原结合片段结合至tmeff2的膜近侧区，并包含来源于vki_l11(seq id no:55)或vkiiii_a27(seq id no:56)的轻链可变区(vl)框架。
[0193]
本发明还提供了一种分离的抗
‑
tmeff2抗体或其抗原结合片段，该抗体或其抗原结合片段结合至tmeff2的膜近侧区，并包含分别来源于seq id no:53的vh3_3
‑
23和seq id no:55的vki_l11的vh框架和vl框架。
[0194]
本发明还提供了一种分离的抗
‑
tmeff2抗体或其抗原结合片段，该抗体或其抗原结合片段结合至tmeff2的膜近侧区，并包含分别来源于seq id no:54的vh1_1
‑
69和seq id no:56的vkiii_a27的vh框架和vl框架。
[0195]
本发明还提供了一种分离的抗
‑
tmeff2抗体或其抗原结合片段，该抗体或其抗原结合片段结合至tmeff2的膜近侧区，并包含分别来源于seq id no:54的vh1_1
‑
69和seq id no:55的vki_l11的vh框架和vl框架。
[0196]
包含“来源于”特定框架或种系序列的重链或轻链可变区的抗体是指从使用人种系免疫球蛋白基因的系统获得的抗体，诸如从转基因小鼠、大鼠或鸡或如本文讨论的噬菌体展示文库获得的抗体。由于例如天然存在的体细胞突变或有意取代，含有来源于种系序列的特定框架的抗体与其来源于的序列相比可含有氨基酸差异。
[0197]
本发明还提供了一种分离的抗
‑
tmeff2抗体或其抗原结合片段，该抗体或其抗原结合片段包含分别为seq id no:10、12、15、18、20和22的hcdr1、hcdr2、hcdr3、lcdr1、lcdr2和lcdr3。
[0198]
在一些实施方案中，该分离的抗
‑
tmeff2抗体或其抗原结合片段包含seq id no:25的vh和seq id no:28的vl。
[0199]
在一些实施方案中，vh由seq id no:39的多核苷酸编码，并且vl由seq id no:42的多核苷酸编码。
[0200]
在一些实施方案中，该分离的抗
‑
tmeff2抗体或其抗原结合片段包含seq id no:32的hc和seq id no:35的lc。
[0201]
在一些实施方案中，hc由seq id no:46的多核苷酸编码，并且vl由seq id no:49的多核苷酸编码。
[0202]
本发明还提供了一种分离的抗
‑
tmeff2抗体或其抗原结合片段，该抗体或其抗原结合片段包含分别为seq id no:11、13、16、19、21和23的hcdr1、hcdr2、hcdr3、lcdr1、lcdr2和lcdr3。
[0203]
在一些实施方案中，该分离的抗
‑
tmeff2抗体或其抗原结合片段包含seq id no:26的vh和seq id no:29的vl。
[0204]
在一些实施方案中，vh由seq id no:40的多核苷酸编码，并且vl由seq id no:43的多核苷酸编码。
[0205]
在一些实施方案中，该分离的抗
‑
tmeff2抗体或其抗原结合片段包含seq id no:33的hc和seq id no:36的lc。
[0206]
在一些实施方案中，hc由seq id no:47的多核苷酸编码，并且lc由seq id no:50的多核苷酸编码。
[0207]
本发明还提供了一种分离的抗
‑
tmeff2抗体或其抗原结合片段，该抗体或其抗原结合片段包含分别为seq id no:10、14、17、18、20和24的hcdr1、hcdr2、hcdr3、lcdr1、lcdr2和lcdr3。
[0208]
在一些实施方案中，该分离的抗
‑
tmeff2抗体或其抗原结合片段包含seq id no:27的vh和seq id no:30的vl。
[0209]
在一些实施方案中，vh由seq id no:41的多核苷酸编码，并且vl由seq id no:44的多核苷酸编码。
[0210]
在一些实施方案中，该分离的抗
‑
tmeff2抗体或其抗原结合片段包含seq id no:34的hc和seq id no:37的lc。
[0211]
在一些实施方案中，hc由seq id no:48的多核苷酸编码，并且lc由seq id no:51的多核苷酸编码。
[0212]
本发明还提供了一种分离的抗
‑
tmeff2抗体或其抗原结合片段，该抗体或其抗原结合片段包含分别为seq id no:11、13、16、18、20和22的hcdr1、hcdr2、hcdr3、lcdr1、lcdr2和lcdr3。
[0213]
在一些实施方案中，该分离的抗
‑
tmeff2抗体或其抗原结合片段包含seq id no:26的vh和seq id no:31的vl。
[0214]
在一些实施方案中，vh由seq id no:40的多核苷酸编码，并且vl由seq id no:45的多核苷酸编码。
[0215]
在一些实施方案中，该分离的抗
‑
tmeff2抗体或其抗原结合片段包含seq id no:33的hc和seq id no:38的lc。
[0216]
在一些实施方案中，hc由seq id no:47的多核苷酸编码，并且lc由seq id no:52的多核苷酸编码。
[0217]
本发明还提供了一种分离的抗
‑
tmeff2抗体或其抗原结合片段，该抗体或其抗原结合片段包含分别为seq id no:10、12、15、18、20和86的hcdr1、hcdr2、hcdr3、lcdr1、lcdr2和lcdr3。
[0218]
在一些实施方案中，该分离的抗
‑
tmeff2抗体或其抗原结合片段包含seq id no:87的vh和seq id no:88的vl。
[0219]
在一些实施方案中，vh由seq id no:95的多核苷酸编码，并且vl由seq id no:96的多核苷酸编码。
[0220]
在一些实施方案中，该分离的抗
‑
tmeff2抗体或其抗原结合片段包含seq id no:91的hc和seq id no:92的lc。
[0221]
在一些实施方案中，hc由seq id no:97的多核苷酸编码，并且lc由seq id no:98的多核苷酸编码。
[0222]
本发明还提供了一种分离的抗
‑
tmeff2抗体或其抗原结合片段，该抗体或其抗原结合片段包含分别为seq id no:10、12、15、18、20和86的hcdr1、hcdr2、hcdr3、lcdr1、lcdr2和lcdr3。
[0223]
在一些实施方案中，该分离的抗
‑
tmeff2抗体或其抗原结合片段包含seq id no:
89的vh和seq id no:90的vl。
[0224]
在一些实施方案中，vh由seq id no:99的多核苷酸编码，并且vl由seq id no:100的多核苷酸编码。
[0225]
在一些实施方案中，该分离的抗
‑
tmeff2抗体或其抗原结合片段包含seq id no:93的hc和seq id no:94的lc。
[0226]
在一些实施方案中，hc由seq id no:101的多核苷酸编码，并且lc由seq id no:102的多核苷酸编码。
[0227]
在一些实施方案中，该分离的抗
‑
tmeff2抗体或其抗原结合片段是多特异性抗体。
[0228]
在一些实施方案中，该分离的抗
‑
tmeff2抗体或其抗原结合片段是双特异性抗体。
[0229]
在一些实施方案中，该分离的抗
‑
tmeff2双特异性抗体或其抗原结合片段结合t细胞抗原。
[0230]
在一些实施方案中，该分离的抗
‑
tmeff2双特异性抗体或其抗原结合片段结合cd3。
[0231]
在一些实施方案中，该分离的抗
‑
tmeff2双特异性抗体或其抗原结合片段结合cd3ε。
[0232]
本发明的示例性抗
‑
tmeff2抗体的vh、vl、hcdr、lcdr、hc和lc序列示于表5
‑
12中。
[0233]
尽管实施例中所示的实施方案包括成对的可变结构域，一个来自重链并且一个来自轻链，但本领域技术人员将认识到另选实施方案可包括单一重链可变结构域或单一轻链可变结构域。单个可变结构域可用于筛选能够形成能够与tmeff2结合的二结构域特异性抗原结合片段的可变结构域。可以通过噬菌体展示筛选方法，使用例如国际专利公开wo1992/01047中所公开的分级双组合方法来完成筛选。在该方法中，使用含有vh或vl链克隆的单个菌落来感染编码另一条链(vl或vh)的克隆的完整文库，并且使用已知方法和本文所述的那些方法根据噬菌体展示技术选择所得的双链特异性抗原结合结构域。因此，使用国际专利公开wo1992/01047中公开的方法，单独的vh和vl多肽链可用于鉴别另外的抗
‑
tmeff2抗体。
[0234]
同源抗体
[0235]
包含表9所示的vh或vl氨基酸序列的本发明抗tmeff2抗体或其抗原结合片段的变体在本发明的范围之内。例如，变体可在vh和/或vl中包含一、二、三、四、五、六、七、八、九、十、十一、十二、十三、十四或十五个氨基酸置换，只要同源抗体在与亲本抗体相比时保持或具有改善的功能特性(诸如与tmeff2的结合相当或改善的稳定性)即可。在一些实施方案中，对本发明的vh或vl氨基酸序列的序列同一性可为约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。
[0236]
在一些实施方案中，本发明的同源抗
‑
tmeff2抗体或其抗原结合片段以约0.4
×
10
‑9m或更小的平衡解离常数(k
d
)结合至tmeff2的膜近侧区，其中k
d
使用表面等离振子共振在ph 4.5
‑
5.0的乙酸盐缓冲液中于室温下进行测量。
[0237]
在一些实施方案中，本发明的同源抗
‑
tmeff2抗体或其抗原结合片段以介于约0.1
×
10
‑
10
m和约0.4
×
10
‑9m之间的k
d
结合至tmeff2的膜近侧区。
[0238]
本发明还提供了一种分离的抗
‑
tmeff2抗体或其抗原结合片段，该抗体或其抗原结合片段包含seq id no:25的vh和seq id no:28的vl，其中vh、vl、或vh和vl两者任选地包含一、二、三、四、五、六、七、八、九、十、十一、十二、十三、十四或十五个氨基酸置换。任选地，
任何置换不在cdr之内。
[0239]
本发明还提供了一种分离的抗
‑
tmeff2抗体或其抗原结合片段，该抗体或其抗原结合片段包含seq id no:26的vh和seq id no:29的vl，其中vh、vl、或vh和vl两者任选地包含一、二、三、四、五、六、七、八、九、十、十一、十二、十三、十四或十五个氨基酸置换。任选地，任何置换不在cdr之内。
[0240]
本发明还提供了一种分离的抗
‑
tmeff2抗体或其抗原结合片段，该抗体或其抗原结合片段包含seq id no:27的vh和seq id no:30的vl，其中vh、vl、或vh和vl两者任选地包含一、二、三、四、五、六、七、八、九、十、十一、十二、十三、十四或十五个氨基酸置换。任选地，任何置换不在cdr之内。
[0241]
本发明还提供了一种分离的抗
‑
tmeff2抗体或其抗原结合片段，该抗体或其抗原结合片段包含seq id no:26的vh和seq id no:31的vl，其中vh、vl、或vh和vl两者任选地包含一、二、三、四、五、六、七、八、九、十、十一、十二、十三、十四或十五个氨基酸置换。任选地，任何置换不在cdr之内。
[0242]
本发明还提供了一种分离的抗
‑
tmeff2抗体或其抗原结合片段，该抗体或其抗原结合片段包含seq id no:87的vh和seq id no:88的vl，其中vh、vl、或vh和vl两者任选地包含一、二、三、四、五、六、七、八、九、十、十一、十二、十三、十四或十五个氨基酸置换。任选地，任何置换不在cdr之内。
[0243]
本发明还提供了一种分离的抗
‑
tmeff2抗体或其抗原结合片段，该抗体或其抗原结合片段包含seq id no:89的vh和seq id no:90的vl，其中vh、vl、或vh和vl两者任选地包含一、二、三、四、五、六、七、八、九、十、十一、十二、十三、十四或十五个氨基酸置换。任选地，任何置换不在cdr之内。
[0244]
本发明还提供了一种分离的抗
‑
tmeff2抗体或其抗原结合片段，该抗体或其抗原结合片段包含的vh与seq id no:25、26、27、87或89的vh具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％氨基酸序列同一性。任选地，seq id no的序列的任何变化不在cdr之内。
[0245]
本发明还提供了一种分离的抗
‑
tmeff2抗体或其抗原结合片段，该抗体或其抗原结合片段包含的vl与seq id no:28、29、30、31、88或90的vl具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％氨基酸序列同一性。任选地，seq id no的序列的任何变化不在cdr之内。
[0246]
抗
‑
tmeff2抗体的vh结构域的氨基酸序列的比对示于图1中，并且选定抗
‑
tmeff2抗体的vl结构域的氨基酸序列的比对示于图2中。vh链和vl链在每行开始时由它们的seq id no:标识。vh和/或vl中可能的置换位点是各抗体之间不同的残基位置。例如，在seq id no:25、27、87和89(基于seq id no 25进行编号)的vh中可在残基位置14、20、54、56、59、76、82、84、93、107处进行置换。类似地，在seq id no:28、30、88和90的vl中可在残基位置1、95和107处进行置换。可进行的示例性置换是保守氨基酸置换，或用每种抗tmeff2抗体中对应残基位置中存在的氨基酸残基进行的置换。
[0247]
两个序列之间的百分比同一性是序列所共有的相同位置数目的函数(即，同一性％＝相同位置的数目/位置总数
×
100)，考虑到空位的数目和每个空位的长度，需要引入这些参数用于两个序列的最佳比对。
[0248]
两个氨基酸序列之间的百分比同一性可以采用e.meyers和w.miller(comput appl biosci 4:11
‑
17(1988))的算法(该算法已经并入align程序(版本2.0)中)，使用pam120加权残基表、空位长度罚分12和空位罚分4来确定。此外，两个氨基酸序列之间的百分比同一性可以使用needleman和wunsch(jmol biol 48:444
‑
453(1970))的算法(该算法已并入gcg软件包(可在www.gcg.com获得)的gap程序中)，使用blossum 62矩阵或pam250矩阵、以及16、14、12、10、8、6、或4的缺口权重和1、2、3、4、5、或6的长度权重来确定。
[0249]
具有保守修饰的抗体
[0250]
本发明还提供了一种分离的抗
‑
tmeff2抗体或其抗原结合片段，该抗体或其抗原结合片段包含含有hcdr1、hcdr2和hcdr3序列的vh以及含有lcdr1、lcdr2和lcdr3序列的vl。其中cdr序列中的一个或多个序列包含基于本文所述抗体(例如，表5
‑
12中所示的抗体)或其保守修饰的特定氨基酸序列，并且其中抗体保留亲本抗体的期望功能特性。
[0251]
在一些实施方案中，具有保守修饰的抗
‑
tmeff2抗体或其抗原结合片段以约0.4
×
10
‑9m或更小的平衡解离常数(k
d
)结合至tmeff2的膜近侧区，其中k
d
使用表面等离振子共振在ph 4.5
‑
5.0的乙酸盐缓冲液中于室温下进行测量。
[0252]
在一些实施方案中，具有保守修饰的抗
‑
tmeff2抗体或其抗原结合片段以介于约0.1
×
10
‑
10
m和约0.4
×
10
‑9m之间的k
d
结合至tmeff2的膜近侧区。
[0253]
本发明还提供了一种分离的抗
‑
tmeff2抗体或其抗原结合片段，该抗体或其抗原结合片段包含分别为seq id no:10、12、15、18、20和22的hcdr1、hcdr2、hcdr3、lcdr1、lcdr2和lcdr3以及它们的保守修饰。
[0254]
本发明还提供了一种分离的抗
‑
tmeff2抗体或其抗原结合片段，该抗体或其抗原结合片段包含分别为seq id no:11、13、16、19、21和23的hcdr1、hcdr2、hcdr3、lcdr1、lcdr2和lcdr3以及它们的保守修饰。
[0255]
本发明还提供了一种分离的抗
‑
tmeff2抗体或其抗原结合片段，该抗体或其抗原结合片段包含分别为seq id no:10、14、17、18、20和24的hcdr1、hcdr2、hcdr3、lcdr1、lcdr2和lcdr3以及它们的保守修饰。
[0256]
本发明还提供了一种分离的抗
‑
tmeff2抗体或其抗原结合片段，该抗体或其抗原结合片段包含分别为seq id no:11、13、16、18、20和22的hcdr1、hcdr2、hcdr3、lcdr1、lcdr2和lcdr3以及它们的保守修饰。
[0257]
本发明还提供了一种分离的抗
‑
tmeff2抗体或其抗原结合片段，该抗体或其抗原结合片段包含分别为seq id no:10、12、15、18、20和86的hcdr1、hcdr2、hcdr3、lcdr1、lcdr2和lcdr3以及它们的保守修饰。
[0258]
本发明还提供了一种分离的抗
‑
tmeff2抗体或其抗原结合片段，该抗体或其抗原结合片段包含seq id no:25的vh和seq id no:28的vl以及它们的保守修饰。
[0259]
本发明还提供了一种分离的抗
‑
tmeff2抗体或其抗原结合片段，该抗体或其抗原结合片段包含seq id no:26的vh和seq id no:29的vl以及它们的保守修饰。
[0260]
本发明还提供了一种分离的抗
‑
tmeff2抗体或其抗原结合片段，该抗体或其抗原结合片段包含seq id no:27的vh和seq id no:30的vl以及它们的保守修饰。
[0261]
本发明还提供了一种分离的抗
‑
tmeff2抗体或其抗原结合片段，该抗体或其抗原结合片段包含seq id no:26的vh和seq id no:31的vl以及它们的保守修饰。
[0262]
本发明还提供了一种分离的抗
‑
tmeff2抗体或其抗原结合片段，该抗体或其抗原结合片段包含seq id no:87的vh和seq id no:88的vl以及它们的保守修饰。
[0263]
本发明还提供了一种分离的抗
‑
tmeff2抗体或其抗原结合片段，该抗体或其抗原结合片段包含seq id no:89的vh和seq id no:90的vl以及它们的保守修饰。
[0264]“保守修饰”是指不会显著影响或改变含有氨基酸修饰的抗体的结合特征的氨基酸修饰。保守修饰包括氨基酸置换、添加和缺失。“保守氨基酸置换”是其中氨基酸被具有相似侧链的氨基酸残基替换的置换。具有相似侧链的氨基酸残基家族是明确定义的，包括具有如下侧链的氨基酸：酸性侧链(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、非极性侧链(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、不带电极性侧链(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、色氨酸)、芳族侧链(例如，苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸、酪氨酸)、脂族侧链(例如，甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、丝氨酸、苏氨酸)、酰胺(例如，天冬酰胺、谷氨酰胺)、β
‑
分支侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)以及含硫侧链(半胱氨酸、甲硫氨酸)。此外，多肽中的任何天然残基还可用丙氨酸来置换，如先前对于丙氨酸扫描诱变所述(maclennan等人，(1988)acta physiol scand suppl 643:55
‑
67；sasaki等人，(1988)adv biophys 35:1
‑
24)。对本发明的抗体的氨基酸取代可通过已知的方法进行，例如通过pcr诱变(美国专利4,683,195)进行。另选地，可例如使用随机(nnk)或非随机密码子(例如dvk密码子，其编码11个氨基酸(ala、cys、asp、glu、gly、lys、asn、arg、ser、tyr、trp))来产生变体文库。可使用本文所述的测定法来测试所得抗体变体的特征。
[0265]
免疫缀合物
[0266]“免疫缀合物”是指缀合至一个或多个异源分子的本发明抗体。
[0267]
本发明还提供了一种免疫缀合物，该免疫缀合物包含缀合至异源分子的本发明的分离抗体或其抗原结合片段。
[0268]
在一些实施方案中，异源蛋白为可检测标签。
[0269]
缀合至可检测标签的本发明的分离抗体或其抗原结合片段可用于评估tmeff2在多种样本上的表达。可检测标签包括当缀合至本发明的分离抗体或其抗原结合片段时使得本发明的分离抗体或其抗原结合片段可通过光谱、光化学、生物化学、免疫化学或化学手段检测的组合物。
[0270]
示例性的可检测标签包括放射性同位素、磁珠、金属珠、胶体粒子、荧光染料、电子高密度试剂、酶(例如，如elisa中常用的)、生物素、地高辛、半抗原、发光分子、化学发光分子、荧光染料、荧光团、荧光淬灭剂、有色分子、放射性同位素、闪烁体、抗生物素蛋白、链霉抗生物素蛋白、蛋白质a、蛋白质g、抗体或其片段、多组氨酸、ni
2+
、flag标签、myc标签、重金属、酶、碱性磷酸酶、过氧化物酶、荧光素酶、电子供体/受体、吖啶酯和比色底物。
[0271]
可检测标签可自发地发出信号，例如当可检测标签为放射性同位素时。在其他情况下，可检测标签在受到外场刺激后发出信号。
[0272]
示例性放射性同位素可为发出γ的、发出auger的、发出β的、发出α的或发出正电子的放射性同位素。示例性放射性同位素包括3h、
11
c、
13
c、
15
n、
18
f、
19
f、
55
co、
57
co、
60
co、
61
cu、
62
cu、
64
cu、
67
cu、
68
ga、
72
as、
75
br、
86
y、
89
zr、
90
sr、
94m
tc、
99m
tc、
115
in、
123
1、
124
1、
125
i、
131
1、
211
at、
212
bi、
213
bi、
223
ra、
226
ra、
225
ac和
227
ac。
[0273]
示例性金属原子为原子序数大于20的金属，诸如钙原子、钪原子、钛原子、钒原子、铬原子、锰原子、铁原子、钴原子、镍原子、铜原子、锌原子、镓原子、锗原子、砷原子、硒原子、溴原子、氪原子、铷原子、锶原子、钇原子、锆原子、铌原子、钼原子、锝原子、钌原子、铑原子、钯原子、银原子、镉原子、铟原子、锡原子、锑原子、碲原子、碘原子、氙原子、铯原子、钡原子、镧原子、铪原子、钽原子、钨原子、铼原子、锇原子、铱原子、铂原子、金原子、汞原子、铊原子、铅原子、铋原子、钫原子、镭原子、锕原子、铈原子、镨原子、钕原子、钷原子、钐原子、铕原子、钆原子、铽原子、镝原子、钬原子、铒原子、铥原子、镱原子、镥原子、钍原子、镤原子、铀原子、镎原子、钚原子、镅原子、锔原子、锫原子、锎原子、锿原子、镄原子、钔原子、锘原子或铹原子。
[0274]
合适的染料包括任何可商购染料，诸如例如5(6)
‑
羧基荧光素、irdye 680rd马来酰亚胺或irdye 800cw、钌多吡啶染料等。
[0275]
合适的荧光团为异硫氰酸荧光素(fitc)、氨基硫脲荧光素、罗丹明、德克萨斯红、cydyes(例如cy3、cy5、cy5.5)、alexa fluors(例如alexa488、alexa555、alexa594；alexa647)、近红外(nir)(700
‑
900nm)荧光染料、以及碳菁和氨基苯乙烯基染料。
[0276]
缀合至可检测标签的本发明的分离抗体或其抗原结合片段可用作成像剂。
[0277]
可使用已知的方法将本发明的分离抗体或其抗原结合片段缀合至可检测标签。
[0278]
在一些实施方案中，可检测标签与螯合剂复合。
[0279]
在一些实施方案中，可检测标签经由接头缀合至本发明的抗体或其抗原结合片段。
[0280]
可使用已知方法将可检测标签直接或间接地连接至本发明的抗体或其抗原结合片段。合适的接头是本领域中已知的，并且包括例如辅基、非酚类接头(苯甲酸n
‑
琥珀酰亚胺酯的衍生物；十二硼酸盐)、大环螯合剂和无环螯合剂两者的螯合部分，诸如1,4,7,10
‑
四氮杂环十二烷
‑
1,4,7,10
‑
四乙酸(dota)的衍生物、二亚乙基三胺五乙酸(dtpa)的衍生物、s
‑2‑
(4
‑
异硫氰酸基苄基)
‑
1,4,7
‑
三氮杂环壬烷
‑
1,4,7
‑
三乙酸(nota)的衍生物和1,4,8,11
‑
四氮杂环十二烷
‑
1,4,8,11
‑
四乙酸(teta)的衍生物、n
‑
琥珀酰亚胺基
‑3‑
(2
‑
吡啶基二硫醇)丙酸酯(spdp)、亚氨基噻吩(it)、亚胺酸酯的双官能衍生物(诸如己二亚胺酸二甲酯hcl)、活性酯(诸如双琥珀酰亚胺辛二酸酯)、醛(诸如戊二醛)、双叠氮基化合物(诸如双(对叠氮基苯甲酰基)己二胺)、双重氮衍生物(诸如双
‑
(对重氮苯甲酰基)
‑
乙二胺)、二异氰酸酯(诸如甲苯2,6
‑
二异氰酸酯)和双活性氟化合物(诸如1,5
‑
二氟
‑
2,4
‑
二硝基苯)以及其他螯合部分。合适的肽接头是公知的。
[0281]
双特异性抗
‑
tmeff2/抗
‑
cd3抗体
[0282]
本发明还提供了一种分离的双特异性抗
‑
tmeff2/抗
‑
cd3抗体或其抗原结合片段，该抗体或其抗原结合片段包含结合tmeff2的第一结构域和结合cd3的第二结构域。
[0283]
本发明还提供了一种分离的双特异性抗
‑
tmeff2/抗
‑
cd3抗体或其抗原结合片段，该抗体或其抗原结合片段包含结合tmeff2的第一结构域和结合cd3的第二结构域，其中抗体结合至tmeff2的膜近侧区。虽然不希望受任何具体理论的束缚，但结合至tmeff2的膜近侧区的双特异性抗体可更有效地介导t
‑
细胞介导的肿瘤细胞杀伤。
[0284]
本发明还提供了一种分离的双特异性抗
‑
tmeff2/抗
‑
cd3抗体或其抗原结合片段，该抗体或其抗原结合片段包含结合tmeff2的第一结构域和结合cd3的第二结构域，其中该
抗体与参考抗体竞争结合至tmeff2的膜近侧区，该参考抗体包含seq id no:25的重链可变区(vh)和seq id no:28的轻链可变区(vl)、seq id no:26的vh和seq id no:29的vl、seq id no:27的vh和seq id no:30的vl、seq id no:26的vh和seq id no:31的vl、seq id no:87的vh和seq id no:88的vl、或seq id no:89的vh和seq id no:90的vl。
[0285]
在一些实施方案中，该分离的双特异性抗
‑
tmeff2/抗
‑
cd3抗体或其抗原结合片段以约0.4
×
10
‑9m或更小的解离常数(k
d
)结合tmeff2的膜近侧区，其中k
d
使用表面等离振子共振在ph 4.5
‑
5.0的乙酸盐缓冲液中于室温下进行测量。
[0286]
在一些实施方案中，该分离的双特异性抗
‑
tmeff2/抗
‑
cd3抗体或其抗原结合片段以介于约0.1
×
10
‑
10
m和约0.4
×
10
‑9m之间的k
d
结合tmeff2的膜近侧区。
[0287]
本发明还提供了一种分离的双特异性抗
‑
tmeff2/抗
‑
cd3抗体或其抗原结合片段，其中第一结构域包含下列的hcdr1、hcdr2、hcdr3、lcdr1、lcdr2和lcdr3：分别为seq id no:10、12、15、18、20和22；分别为seq id no:11、13、16、19、21和23；分别为seq id no:10、14、17、18、20和24；
[0288]
分别为seq id no:11、13、16、18、20和22；或者
[0289]
分别为seq id no:10、12、15、18、20和86。
[0290]
本发明还提供了一种分离的双特异性抗
‑
tmeff2/抗
‑
cd3抗体或其抗原结合片段，其中第二结构域包含下列的hcdr1、hcdr2、hcdr3、lcdr1、lcdr2和lcdr3：
[0291]
分别为seq id no:60、61、62、63、64和65；或者
[0292]
分别为seq id no:68、69、70、71、72和73。
[0293]
本发明还提供了一种分离的双特异性抗
‑
tmeff2/抗
‑
cd3抗体或其抗原结合片段，其中第一结构域包含
[0294]
seq id no:25的vh和seq id no:28的vl；
[0295]
seq id no:26的vh和seq id no:29的vl；
[0296]
seq id no:27的vh和seq id no:30的vl；
[0297]
seq id no:26的vh和seq id no:31的vl；
[0298]
seq id no:87的vh和seq id no:88的vl；或
[0299]
seq id no:89的vh和seq id no:90的vl。
[0300]
本发明还提供了一种分离的双特异性抗
‑
tmeff2/抗
‑
cd3抗体或其抗原结合片段，其中第二结构域包含
[0301]
seq id no:66的vh和seq id no:67的vl；或
[0302]
seq id no:74的vh和seq id no:75的vl。
[0303]
在一些实施方案中，第二结构域包含seq id no:59的vh和seq id no:111的vl。
[0304]
本发明还提供了一种分离的双特异性抗
‑
tmeff2/抗
‑
cd3抗体或其抗原结合片段，该抗体或其抗原结合片段包含结合tmeff2的第一结构域和结合cd3的第二结构域，其中
[0305]
第一结构域包含分别为seq id no:10、12、15、18、20和22的hcdr1、hcdr2、hcdr3、lcdr1、lcdr2和lcdr3，并且第二结构域包含分别为seq id no:60、61、62、63、64和65的hcdr1、hcdr2、hcdr3、lcdr1、lcdr2和lcdr3；
[0306]
第一结构域包含seq id no:25的vh和seq id no:28的vl，并且第二结构域包含seq id no:66的vh和seq id no:67的vl；并且/或者双特异性抗
‑
tmeff2/抗
‑
cd3抗体或其
抗原结合片段包含seq id no:32的第一重链(hc1)、seq id no:35的第一轻链(lc1)、seq id no:76的第二重链(hc2)和seq id no:77的第二轻链(lc2)。
[0307]
本发明还提供了一种分离的双特异性抗
‑
tmeff2/抗
‑
cd3抗体或其抗原结合片段，该抗体或其抗原结合片段包含结合tmeff2的第一结构域和结合cd3的第二结构域，其中
[0308]
第一结构域包含分别为seq id no:10、12、15、18、20和22的hcdr1、hcdr2、hcdr3、lcdr1、lcdr2和lcdr3，并且第二结构域包含分别为seq id no:68、69、70、71、72和73的hcdr1、hcdr2、hcdr3、lcdr1、lcdr2和lcdr3；
[0309]
第一结构域包含seq id no:25的vh和seq id no:28的vl，并且第二结构域包含seq id no:74的vh和seq id no:75的vl；并且/或者双特异性抗
‑
tmeff2/抗
‑
cd3抗体或其抗原结合片段包含seq id no:32的hc1、seq id no:35的lc1、seq id no:78的hc2和seq id no:79的lc2。
[0310]
本发明还提供了一种分离的双特异性抗
‑
tmeff2/抗
‑
cd3抗体或其抗原结合片段，该抗体或其抗原结合片段包含结合tmeff2的第一结构域和结合cd3的第二结构域，其中
[0311]
第一结构域包含分别为seq id no:11、13、16、19、21和23的hcdr1、hcdr2、hcdr3、lcdr1、lcdr2和lcdr3，并且第二结构域包含分别为seq id no:60、61、62、63、64和65的hcdr1、hcdr2、hcdr3、lcdr1、lcdr2和lcdr3；
[0312]
第一结构域包含seq id no:26的vh和seq id no:29的vl，并且第二结构域包含seq id no:66的vh和seq id no:67的vl；并且/或者双特异性抗
‑
tmeff2/抗
‑
cd3抗体或其抗原结合片段包含seq id no:33的hc1、seq id no:36的lc1、seq id no:76的hc2和seq id no:77的lc2。
[0313]
本发明还提供了一种分离的双特异性抗
‑
tmeff2/抗
‑
cd3抗体或其抗原结合片段，该抗体或其抗原结合片段包含结合tmeff2的第一结构域和结合cd3的第二结构域，其中
[0314]
第一结构域包含分别为seq id no:11、13、16、19、21和23的hcdr1、hcdr2、hcdr3、lcdr1、lcdr2和lcdr3，并且第二结构域包含分别为seq id no:68、69、70、71、72和73的hcdr1、hcdr2、hcdr3、lcdr1、lcdr2和lcdr3；
[0315]
第一结构域包含seq id no:26的vh和seq id no:29的vl，并且第二结构域包含seq id no:74的vh和seq id no:75的vl；并且/或者双特异性抗
‑
tmeff2/抗
‑
cd3抗体或其抗原结合片段包含seq id no:33的hc1、seq id no:36的lc1、seq id no:78的hc2和seq id no:79的lc2。
[0316]
本发明还提供了一种分离的双特异性抗
‑
tmeff2/抗
‑
cd3抗体或其抗原结合片段，该抗体或其抗原结合片段包含结合tmeff2的第一结构域和结合cd3的第二结构域，其中
[0317]
第一结构域包含分别为seq id no:10、14、17、18、20和24的hcdr1、hcdr2、hcdr3、lcdr1、lcdr2和lcdr3，并且第二结构域包含分别为seq id no:60、61、62、63、64和65的hcdr1、hcdr2、hcdr3、lcdr1、lcdr2和lcdr3；
[0318]
第一结构域包含seq id no:27的vh和seq id no:30的vl，并且第二结构域包含seq id no:66的vh和seq id no:67的vl；并且/或者双特异性抗
‑
tmeff2/抗
‑
cd3抗体或其抗原结合片段包含seq id no:34的hc1、seq id no:37的lc1、seq id no:76的hc2和seq id no:77的lc2。
[0319]
本发明还提供了一种分离的双特异性抗
‑
tmeff2/抗
‑
cd3抗体或其抗原结合片段，
该抗体或其抗原结合片段包含结合tmeff2的第一结构域和结合cd3的第二结构域，其中
[0320]
第一结构域包含分别为seq id no:10、14、17、18、20和24的hcdr1、hcdr2、hcdr3、lcdr1、lcdr2和lcdr3，并且第二结构域包含分别为seq id no:68、69、70、71、72和73的hcdr1、hcdr2、hcdr3、lcdr1、lcdr2和lcdr3；
[0321]
第一结构域包含seq id no:27的vh和seq id no:30的vl，并且第二结构域包含seq id no:74的vh和seq id no:75的vl；并且/或者双特异性抗
‑
tmeff2/抗
‑
cd3抗体或其抗原结合片段包含seq id no:34的hc1、seq id no:37的lc1、seq id no:78的hc2和seq id no:79的lc2。
[0322]
本发明还提供了一种分离的双特异性抗
‑
tmeff2/抗
‑
cd3抗体或其抗原结合片段，该抗体或其抗原结合片段包含结合tmeff2的第一结构域和结合cd3的第二结构域，其中
[0323]
第一结构域包含分别为seq id no:11、13、16、18、20和22的hcdr1、hcdr2、hcdr3、lcdr1、lcdr2和lcdr3，并且第二结构域包含分别为seq id no:60、61、62、63、64和65的hcdr1、hcdr2、hcdr3、lcdr1、lcdr2和lcdr3；
[0324]
第一结构域包含seq id no:26的vh和seq id no:31的vl，并且第二结构域包含seq id no:66的vh和seq id no:67的vl；并且/或者双特异性抗
‑
tmeff2/抗
‑
cd3抗体或其抗原结合片段包含seq id no:33的hc1、seq id no:38的lc1、seq id no:76的hc2和seq id no:77的lc2。
[0325]
本发明还提供了一种分离的双特异性抗
‑
tmeff2/抗
‑
cd3抗体或其抗原结合片段，该抗体或其抗原结合片段包含结合tmeff2的第一结构域和结合cd3的第二结构域，其中
[0326]
第一结构域包含分别为seq id no:11、13、16、18、20和22的hcdr1、hcdr2、hcdr3、lcdr1、lcdr2和lcdr3，并且第二结构域包含分别为seq id no:68、69、70、71、72和73的hcdr1、hcdr2、hcdr3、lcdr1、lcdr2和lcdr3；
[0327]
第一结构域包含seq id no:26的vh和seq id no:31的vl，并且第二结构域包含seq id no:74的vh和seq id no:75的vl；并且/或者双特异性抗
‑
tmeff2/抗
‑
cd3抗体或其抗原结合片段包含seq id no:33的hc1、seq id no:38的lc1、seq id no:78的hc2和seq id no:79的lc2。
[0328]
本发明还提供了一种分离的双特异性抗
‑
tmeff2/抗
‑
cd3抗体或其抗原结合片段，该抗体或其抗原结合片段包含结合tmeff2的第一结构域和结合cd3的第二结构域，其中
[0329]
第一结构域包含分别为seq id no:10、12、15、18、20和86的hcdr1、hcdr2、hcdr3、lcdr1、lcdr2和lcdr3，并且第二结构域包含分别为seq id no:60、61、62、63、64和65的hcdr1、hcdr2、hcdr3、lcdr1、lcdr2和lcdr3；
[0330]
第一结构域包含seq id no:87的vh和seq id no:88的vl，并且第二结构域包含seq id no:66的vh和seq id no:67的vl；并且/或者双特异性抗
‑
tmeff2/抗
‑
cd3抗体或其抗原结合片段包含seq id no:91的第一重链(hc1)、seq id no:92的第一轻链(lc1)、seq id no:76的第二重链(hc2)和seq id no:77的第二轻链(lc2)。
[0331]
本发明还提供了一种分离的双特异性抗
‑
tmeff2/抗
‑
cd3抗体或其抗原结合片段，该抗体或其抗原结合片段包含结合tmeff2的第一结构域和结合cd3的第二结构域，其中
[0332]
第一结构域包含分别为seq id no:10、12、15、18、20和86的hcdr1、hcdr2、hcdr3、lcdr1、lcdr2和lcdr3，并且第二结构域包含分别为seq id no:68、69、70、71、72和73的
hcdr1、hcdr2、hcdr3、lcdr1、lcdr2和lcdr3；
[0333]
第一结构域包含seq id no:87的vh和seq id no:88的vl，并且第二结构域包含seq id no:74的vh和seq id no:75的vl；并且/或者双特异性抗
‑
tmeff2/抗
‑
cd3抗体或其抗原结合片段包含seq id no:91的hc1、seq id no:92的lc1、seq id no:78的hc2和seq id no:79的lc2。
[0334]
本发明还提供了一种分离的双特异性抗
‑
tmeff2/抗
‑
cd3抗体或其抗原结合片段，该抗体或其抗原结合片段包含结合tmeff2的第一结构域和结合cd3的第二结构域，其中
[0335]
第一结构域包含分别为seq id no:10、12、15、18、20和86的hcdr1、hcdr2、hcdr3、lcdr1、lcdr2和lcdr3，并且第二结构域包含分别为seq id no:60、61、62、63、64和65的hcdr1、hcdr2、hcdr3、lcdr1、lcdr2和lcdr3；
[0336]
第一结构域包含seq id no:89的vh和seq id no:90的vl，并且第二结构域包含seq id no:66的vh和seq id no:67的vl；并且/或者双特异性抗
‑
tmeff2/抗
‑
cd3抗体或其抗原结合片段包含seq id no:93的第一重链(hc1)、seq id no:94的第一轻链(lc1)、seq id no:76的第二重链(hc2)和seq id no:77的第二轻链(lc2)。
[0337]
本发明还提供了一种分离的双特异性抗
‑
tmeff2/抗
‑
cd3抗体或其抗原结合片段，该抗体或其抗原结合片段包含结合tmeff2的第一结构域和结合cd3的第二结构域，其中
[0338]
第一结构域包含分别为seq id no:10、12、15、18、20和86的hcdr1、hcdr2、hcdr3、lcdr1、lcdr2和lcdr3，并且第二结构域包含分别为seq id no:68、69、70、71、72和73的hcdr1、hcdr2、hcdr3、lcdr1、lcdr2和lcdr3；
[0339]
第一结构域包含seq id no:89的vh和seq id no:90的vl，并且第二结构域包含seq id no:74的vh和seq id no:75的vl；并且/或者双特异性抗
‑
tmeff2/抗
‑
cd3抗体或其抗原结合片段包含seq id no:93的hc1、seq id no:94的lc1、seq id no:78的hc2和seq id no:79的lc2。
[0340]
工程化和修饰抗体
[0341]
本发明的抗体或其抗原结合片段可被进一步工程化以产生在与亲本抗体进行比较时具有相似或改变的特性的修饰抗体。在本发明的抗体中可将vh、vl、vh和vl、恒定区、重链框架、轻链框架、或六个cdr中的任一个或全部工程化。
[0342]
本发明的抗体可通过cdr接枝进行工程化。可将本发明抗体的一个或多个cdr序列接枝到不同的框架序列。cdr接枝可使用已知方法和本文所述的方法进行。
[0343]
可使用的框架序列可获自包括种系抗体基因序列的公共dna数据库或公开参考文献。例如，人重链和轻链可变结构域基因的种系dna和编码的蛋白质序列可见于,the international immunogenetics informationwww.imgt.org。可用于替换本发明抗体的现有框架序列的框架序列可以是在vh或vl的整个长度上或在fr1、fr2、fr3和fr4的长度上与亲本可变结构域显示出最高百分比(％)同一性的那些。此外，合适的框架可基于vh和vl cdr1以及cdr2长度或相同的lcdr1、lcdr2、lcdr3、hcdr1和hcdr2规范结构来进一步选择。合适的框架可使用已知的方法进行选择，例如美国专利8,748,356所述的人框架改型或美国专利7,709,226的超人源化。
[0344]
亲本和工程化抗体的框架序列可例如通过回复突变进行进一步修饰，以恢复和/
或改善所生成抗体与抗原的结合，如例如美国专利6,180,370中所述。亲本或工程化抗体的框架序列可通过使框架区内(或另选地，一个或多个cdr区内)的一个或多个残基突变来进行进一步修饰，以除去t细胞表位，从而降低抗体的潜在免疫原性。该方法也被称为“脱免疫”，并且在美国专利公开us20070014796中进一步详述。
[0345]
本发明抗体的cdr残基可突变以调节抗体对tmeff2和/或cd3的亲和力。
[0346]
本发明抗体的cdr残基可突变以最大程度降低翻译后修饰的风险。可将用于脱氨基(ns)、酸催化水解(dp)、异构化(ds)或氧化(w)的推定基序的氨基酸残基替换为任何天然存在的氨基酸以诱变这些基序，并且可使用本文所述的方法测试所得抗体的功能和稳定性。
[0347]
经修饰以改善稳定性、选择性、交叉反应性、亲和力、免疫原性或其他所需生物学或生物物理学特性的本发明的抗体在本发明的范围之内。抗体的稳定性受许多因素影响，包括(1)影响其内在稳定性的单独域的核心堆叠，(2)对hc和lc配对具有影响的蛋白质/蛋白质界面相互作用，(3)极性和带电残基的包埋，(4)极性和带电残基的h键网络；以及(5)其它分子内力和分子间力中的表面电荷和极性残基分布(worn等人，(2001)j mol biol 305:989
‑
1010)。潜在的结构不稳定残基可根据该抗体的晶体结构或在某些情况下通过分子建模来鉴定，并且所述残基对于抗体稳定性的影响可通过生成并评估在所鉴定残基中携带突变的变体来测试。一种增加抗体稳定性的方法是升高由差示扫描量热法(dsc)测量的热转变中间点(t
m
)。一般而言，蛋白质t
m
与其稳定性相关，与其对在溶液中的解折叠和变性以及对取决于蛋白质解折叠趋向的降解过程的敏感性负相关(remmele等人，(2000)biopharm 13:36
‑
46)。大量的研究已经发现了通过dsc以热稳定性而测量的制剂物理稳定性的级别与通过其它方法测量的物理稳定性之间的相关性(gupta等人，(2003)aaps pharmsci 5e8；zhang等人，(2004)j pharm sci 93:3076
‑
89；maa等人,(1996)int j pharm 140:155
‑
68；bedu
‑
addo等人，(2004)pharm res 21:1353
‑
61；remmele等人,(1997)pharm res 15:200
‑
8)。制剂研究提示，fab t
m
对相应mab的长期物理稳定性有影响。
[0348]
可通过在血流中内源性循环羧肽酶从注射的抗体中移除c
‑
末端赖氨酸(ctl)(cai等人，(2011)biotechnol bioeng 108:404
‑
412)。在制备期间，可通过控制细胞外zn
2+
、edta或edta
–
fe
3+
的浓度，将ctl移除控制到小于最大水平，如美国专利公开us20140273092中有所描述。抗体中的ctl含量可使用已知方法测定。
[0349]
可使本发明的抗体发生fc置换，以调节抗体效应子功能和/或药代动力学特性。在传统免疫功能中，抗体
‑
抗原复合物与免疫系统的细胞的相互作用产生多种反应，范围从效应子功能例如抗体依赖的细胞毒性、肥大细胞脱颗粒和噬菌作用，到免疫调节信号例如调节淋巴细胞增殖与抗体分泌。所有这些相互作用是通过抗体的fc结构域或者免疫复合物与细胞上特异细胞表面受体结合而引起的。由抗体和免疫复合物触发的细胞应答的多样性是如下fc受体的异质性造成的：fcγri(cd64)、fcγriia(cd32a)和fcγriii(cd16)是活化fcγ受体(即免疫系统增强)，而fcγriib(cd32b)是抑制fcγ受体(即免疫系统抑制)。结合fcrn受体调节了抗体半衰期。
[0350]
在一些实施方案中，本发明的抗
‑
tmeff2抗体或双特异性抗
‑
tmeff2/抗
‑
cd3抗体在fc区中包含至少一个置换。
[0351]
在一些实施方案中，本发明的抗
‑
tmeff2抗体或双特异性抗
‑
tmeff2/抗
‑
cd3抗体
在fc区中包含一、二、三、四、五、六、七、八、九、十、十一、十二、十三、十四或十五个置换。
[0352]
fc位置可被置换以调节抗体半衰期。可用于增长抗体半衰期的示例性单独或组合置换为置换m428l/n434s、m252y/s254t/t256e、t250q/m428l、n434a和t307a/e380a/n434a。可用于减小抗体半衰期的示例性单独或组合置换为置换h435a、p257i/n434h、d376v/n434h、m252y/s254t/t256e/h433k/n434f、t308p/n434a和h435r。
[0353]
在一些实施方案中，本发明的抗
‑
tmeff2抗体或双特异性抗
‑
tmeff2/抗
‑
cd3抗体在fc区中包含至少一个选自下列的置换：m428l/n434s、m252y/s254t/t256e、t250q/m428l、n434a、t307a/e380a/n434a、h435a、p257i/n434h、d376v/n434h、m252y/s254t/t256e/h433k/n434f、t308p/n434a和h435r。
[0354]
在一些实施方案中，本发明的抗
‑
tmeff2抗体或双特异性抗
‑
tmeff2/抗
‑
cd3抗体在fc区中包含至少一个置换，该置换降低抗体与活化fcγ受体(fcγr)的结合并且/或者降低fc效应子功能，诸如c1q结合、补体依赖性细胞毒性(cdc)、抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(adcc)或吞噬作用(adcp)。
[0355]
降低抗体与活化fcγr的结合并且随后降低效应子功能的fc位置为以下置换：igg1上的l234a/l235a、igg2上的v234a/g237a/p238s/h268a/v309l/a330s/p331s、igg4上的f234a/l235a、igg4上的s228p/f234a/l235a、所有ig同种型上的n297a、igg2上的v234a/g237a、igg1上的k214t/e233p/l234v/l235a/g236
‑
缺失/a327g/p331a/d365e/l358m、igg2上的h268q/v309l/a330s/p331s、igg1上的s267e/l328f、igg1上的l234f/l235e/d265a、igg1上的l234a/l235a/g237a/p238s/h268a/a330s/p331s、igg4上的s228p/f234a/l235a/g237a/p238s、以及igg4上的s228p/f234a/l235a/g236
‑
缺失/g237a/p238s。
[0356]
公知的s228p置换可在igg4抗体中进行，以增强igg4稳定性。
[0357]
在一些实施方案中，本发明的抗tmeff2抗体或双特异性抗
‑
tmeff2/抗
‑
cd3抗体包含s228p置换，其中残基根据eu索引进行编号。
[0358]
在一些实施方案中，本发明的抗
‑
tmeff2抗体或双特异性抗
‑
tmeff2/抗
‑
cd3抗体包含f234a、l235a或f234a/l235a置换，其中残基根据eu索引进行编号。
[0359]
在一些实施方案中，本发明的抗
‑
tmeff2抗体或双特异性抗
‑
tmeff2/抗
‑
cd3抗体包含s228p、f234a和l235a置换，其中残基根据eu索引进行编号。
[0360]
产生同源抗体、具有保守修饰的抗体、以及工程化和修饰抗体的方法
[0361]
在相比于亲本抗体时氨基酸序列有改变的本发明抗体可使用标准克隆和表达技术产生。例如，可进行定点诱变或pcr介导的诱变以引入突变，并可使用公知的方法和本文实施例中所述的方法评估对抗体结合或其他感兴趣的特性的影响。
[0362]
抗体同种型和同种异型
[0363]
本发明的抗
‑
tmeff2抗体或双特异性抗
‑
tmeff2/抗
‑
cd3抗体可以是igg1、igg2、igg3或igg4同种型。
[0364]
在一些实施方案中，本发明的抗
‑
tmeff2抗体或双特异性抗
‑
tmeff2/抗
‑
cd3抗体为igg1同种型。
[0365]
在一些实施方案中，本发明的抗
‑
tmeff2抗体或双特异性抗
‑
tmeff2/抗
‑
cd3抗体为igg2同种型。
[0366]
在一些实施方案中，本发明的抗
‑
tmeff2抗体或双特异性抗
‑
tmeff2/抗
‑
cd3抗体
no:26的vh和seq id no:31的vl的本发明的抗
‑
tmeff2抗体。
[0383]
本发明还提供了一种抗独特型抗体，该抗独特型抗体特异性结合至包含seq id no:87的vh和seq id no:88的vl的本发明的抗
‑
tmeff2抗体。
[0384]
本发明还提供了一种抗独特型抗体，该抗独特型抗体特异性结合至包含seq id no:89的vh和seq id no:90的vl的本发明的抗
‑
tmeff2抗体。
[0385]
抗独特型(id)抗体是识别抗体的抗原决定簇(例如互补位或cdr)的抗体。id抗体可为抗原封闭性或非封闭性的。抗原封闭性id可用于检测样本中的游离抗体(例如本文所述的本发明的抗
‑
tmeff2抗体)。非封闭性id可用于检测样本中的总抗体(游离，部分结合于抗原，或完全结合于抗原的抗体)。id抗体可通过用抗体对正在制备抗id的动物免疫来制备。
[0386]
抗id抗体还可以用作免疫原以在另一动物中诱导免疫应答，从而产生所谓的抗
‑
抗id抗体。抗
‑
抗id可在表位上与诱导抗id的原始mab相同。因此，通过使用针对单克隆抗体的独特型决定簇的抗体，可以识别出表达相同特异性抗体的其它克隆。抗id抗体可通过任何合适的技术改变(从而产生抗id抗体变体)和/或衍生，例如本文别处所述的那些。
[0387]
本发明的单特异性抗体的产生
[0388]
在一些实施方案中，抗
‑
tmeff2抗体为人。
[0389]
在一些实施方案中，抗
‑
tmeff2抗体为人源化的。
[0390]
本发明的单特异性抗体可使用各种技术产生。例如，可使用kohler和milstein,nature 256:495,1975所述的杂交瘤方法来产生单克隆抗体。在杂交瘤方法中，用人、黑猩猩或猕猴tmeff2或tmeff2的片段诸如tmeff2的膜近侧结构域来免疫小鼠或其他宿主动物(诸如仓鼠、大鼠或猴)，之后使用标准方法将来自免疫动物的脾细胞与骨髓瘤细胞融合以形成杂交瘤细胞(goding,monoclonal antibodies:principles and practice，第59
‑
103页(academic press,1986))。筛选出由单个永生化杂交瘤细胞产生的菌落，用以制备具有所需特性(诸如结合特异性、交叉反应性或缺乏结合特异性、缺乏交叉反应性，以及抗原的亲和力)的抗体。
[0391]
可使用各种宿主动物来产生本发明的抗
‑
tmeff2抗体。例如，可使用balb/c小鼠来产生小鼠抗人tmeff2抗体。可使用各种技术来人源化由balb/c小鼠和其它非人动物制备的抗体，从而产生更类似人的序列。
[0392]
包括选择人受体框架的示例性人源化技术是已知的，并且包括cdr接枝(美国专利5,225,539)、sdr接枝(美国专利6,818,749)、表面重塑(padlan,(1991)mol immunol 28:489
‑
499)、特异性决定残基表面重塑(美国专利公开2010/0261620)、人框架改型(美国专利8,748,356)或超人源化(美国专利7,709,226)。在这些方法中，亲本抗体的cdr被转移到人框架上，该人框架可基于其与亲本框架的总体同源性，基于cdr长度的相似性、或规范结构同一性、或它们的组合进行选择。
[0393]
可通过如下过程进一步优化人源化抗体以改善其对所需抗原的选择性或亲和力：通过采用诸如国际专利公布wo1090/007861和wo1992/22653中所述的技术，引入修改的框架支持残基来保持结合亲和力(回复突变)，或者通过在任何cdr处引入变体例如来改善抗体的亲和力。
[0394]
基因组中携带人免疫球蛋白(ig)基因座的转基因动物(诸如小鼠、大鼠或鸡)可用
于生成抗目标蛋白质的人抗体，这在例如美国专利6,150,584；国际专利公开wo99/45962；国际专利公开wo2002/066630、wo2002/43478、wo2002/043478和wo1990/04036；lonberg等人(1994)nature 368:856
‑
9；green等人(1994)nature genet.7:13
‑
21；green&jakobovits(1998)exp.med.188:483
‑
95；lonberg和huszar(1995)int rev immunol 13:65
‑
93；bruggemann等人，(1991)eur j immunol 21:1323
‑
1326；fishwild等人，(1996)nat biotechnol 14:845
‑
851；mendez等人，(1997)nat genet 15:146
‑
156；green(1999)j immunol methods 231:11
‑
23；yang等人，(1999)cancer res 59:1236
‑
1243；br
ü
ggemann和taussig(1997)curr opin biotechnol 8:455
‑
458中有所描述。可破坏此类动物中的内源性免疫球蛋白基因座或使该基因座缺失，并且可使用转染色体或微小基因，通过同源或非同源重组将至少一种完整或部分的人免疫球蛋白基因座插入动物的基因组中。公司诸如regeneron(www.regeneron.com)、harbour antibodies(www.harbourantibodies.com)、open monoclonal technology,inc.(omt)(www.omtinc.net)、kymab(www.kymab.com)、trianni(www.trianni.com)和ablexis(www.ablexis.com)可参与以使用如上所述的技术提供针对选定抗原的人抗体。
[0395]
人抗体可选自噬菌体展示文库，其中噬菌体被工程化以表达人免疫球蛋白或其部分，诸如fab、单链抗体(scfv)或者未配对或配对抗体可变区(knappik等人，(2000)j mol biol 296:57
‑
86；krebs等人，(2001)j immunol meth 254:67
‑
84；vaughan等人，(1996)nature biotechnology 14:309
‑
314；sheets等人，(1998)pitas(usa)95:6157
‑
6162；hoogenboom和winter(1991)j mol biol 227:381；marks等人，(1991)j mol biol 222:581)。可例如用噬菌体pix外壳蛋白从将抗体重链和轻链可变区表达为融合蛋白的噬菌体展示文库中分离出本发明的抗体，如shi等人，(2010)j mol biol 397:385
‑
96和国际专利公开wo09/085462中所述。可从文库中筛选结合到人和/或cyno tmeff2或cd3的噬菌体，并可进一步表征所获得的阳性克隆，从克隆裂解物中分离fab，并将其表达为全长igg。用于分离人抗体的此类噬菌体展示方法描述于例如：美国专利5,223,409、5,403,484、5,571,698、5,427,908、5,580,717、5,969,108、6,172,197、5,885,793；6,521,404；6,544,731；6,555,313；6,582,915和6,593,081。
[0396]
免疫源性抗原的制备以及单克隆抗体的产生可用任何合适的技术诸如重组蛋白产生来进行。免疫原性抗原可以纯化蛋白质或蛋白质混合物(包括全细胞或细胞提取物或组织提取物)的形式施用于动物，或抗原可在动物体内由编码所述抗原或其部分的核酸从头形成。
[0397]
本发明的双特异性抗
‑
tmeff2/抗
‑
cd3抗体的产生
[0398]
本发明的双特异性抗
‑
tmeff2/抗
‑
cd3抗体可通过将本文分离的tmeff2结合vh/vl结构域与任何cd3结合vh/vl结构域组合而产生，包括本文所述的那些和公共可用的那些。可使用的示例性cd3结合vh/vl结构域是如本文所述的抗体cd3b219和cd3b376的那些。可使用的示例性tmeff2结合vh/vl结构域是抗体tmeb675、tmeb570、tmeb674、tmeb565、tmeb762和tmeb757的那些。可测试所产生的双特异性抗
‑
tmeff2/抗
‑
cd3抗体与tmeff2和cd3的结合以及它们所需的功能特征，诸如t
‑
细胞介导的表达tmeff2的细胞(例如lncap)的杀伤。
[0399]
本发明的双特异性抗体可例如使用两个单特异性二价抗体之间的fab臂交换(或半分子交换)通过下列方式产生：在每个半分子中的重链ch3交界处引入置换以促成两个在
体外无细胞环境中或使用共表达而具有不同特异性的抗体半分子的异源二聚体形成。fab臂交换反应是二硫键异构化反应和ch3域解离
‑
缔合的结果。亲本单特异性抗体的铰链区中的重链二硫键被还原。亲本单特异性抗体之一的所得游离半胱氨酸与第二亲本单特异性抗体分子的半胱氨酸残基形成重链间二硫键，同时亲本抗体的ch3域通过解离
‑
缔合而释放和重新形成。可将fab臂的ch3域改造成促成异源二聚化而非同源二聚化。所得产物是具有两个fab臂或半分子的双特异性抗体，这两个fab臂或半分子各自结合不同的表位，即tmeff2上的表位和cd3上的表位。例如，本发明的双特异性抗体可使用国际专利公开wo2011/131746中描述的技术产生。在igg1抗体的情况中，可使用一条重链中的突变f405l和另一条重链中的k409r。对于igg2抗体，可使用具有f405l和r409k置换的野生型igg2和igg2抗体。对于igg4抗体，可使用具有f405l和r409k置换的野生型igg4和igg4抗体。为了产生双特异性抗体，将第一单特异性二价抗体和第二单特异性二价抗体工程化以在fc区中具有前述突变，在足以允许铰链区中的半胱氨酸发生二硫键异构化的还原条件下将抗体一起温育；从而通过fab臂交换产生双特异性抗体。温育条件最理想地可恢复到非还原条件。可使用的示例性还原剂为2
‑
巯基乙胺(2
‑
mea)、二硫苏糖醇(dtt)、二硫赤藓糖醇(dte)、谷胱甘肽、三(2
‑
羧乙基)膦(tcep)、l
‑
半胱氨酸和β
‑
巯基乙醇。例如，可使用如下条件：在至少25mm 2
‑
mea的存在下或至少0.5mm二硫苏糖醇的存在下，在5
‑
8的ph例如ph7.0或ph7.4，至少20℃的温度下，温育至少90分钟。
[0400]
在一些实施方案中，双特异性抗
‑
tmeff2/抗
‑
cd3抗体是igg1同种型，并且当与seq id no:84的野生型igg1进行比较时，在第一重链(hc1)中包含f405l置换并且在第二重链(hc2)中包含k409r置换。
[0401]
在一些实施方案中，双特异性抗
‑
tmeff2/抗
‑
cd3抗体是igg4同种型，并且当与seq id no:85的野生型igg4进行比较时，在hc2中包含f405l/r409k置换。
[0402]
在一些实施方案中，双特异性抗
‑
tmeff2/抗
‑
cd3抗体是igg4同种型，并且在与seq id no:85的野生型igg4进行比较时，在hc1中包含s228p、f234a和l235a置换并且在hc2中包含s228p、f234a、l235a、f405l和r409k置换。
[0403]
seq id no:84野生型igg1
[0404]
astkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqss
[0405]
glyslssvvtvpssslgtqtyicnvnhkpsntkvdkkvepkscdkthtcppcpapellgg
[0406]
psvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqyn
[0407]
styrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsrde
[0408]
ltknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrw
[0409]
qqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk
[0410]
seq id no:85野生型igg4
[0411]
astkgpsvfplapcsrstsestaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqss
[0412]
glyslssvvtvpssslgtktytcnvdhkpsntkvdkrveskygppcpscpapeflggpsv
[0413]
flfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvsqedpevqfnwyvdgvevhnaktkpreeqfnsty
[0414]
rvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkglpssiektiskakgqprepqvytlppsqeemtk
[0415]
nqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflysrltvdksrwqeg
[0416]
nvfscsvmhealhnhytqkslslslgk
[0417]
seq id no 103:igg1 f405l
[0418]
astkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqss
[0419]
glyslssvvtvpssslgtqtyicnvnhkpsntkvdkkvepkscdkthtcppcpapellgg
[0420]
psvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqyn
[0421]
styrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsrde
[0422]
ltknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfllyskltvdksrw
[0423]
qqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk
[0424]
seq id no:109:igg1 k409r
[0425]
astkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqss
[0426]
glyslssvvtvpssslgtqtyicnvnhkpsntkvdkkvepkscdkthtcppcpapellgg
[0427]
psvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqyn
[0428]
styrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsrde
[0429]
ltknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflysrltvdksrw
[0430]
qqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk
[0431]
seq id no:104 igg4 f405l/r409k
[0432]
astkgpsvfplapcsrstsestaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqss
[0433]
glyslssvvtvpssslgtktytcnvdhkpsntkvdkrveskygppcpscpapeflggpsv
[0434]
flfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvsqedpevqfnwyvdgvevhnaktkpreeqfnsty
[0435]
rvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkglpssiektiskakgqprepqvytlppsqeemtk
[0436]
nqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfllyskltvdksrwqeg
[0437]
nvfscsvmhealhnhytqkslslslgk
[0438]
双特异性抗体也可使用诸如钮扣(genentech)、crossmabs(roche)和静电匹配(chugai,amgen,novonordisk,oncomed)、luz
‑
y(genentech)、strand exchange工程化domain body(seedbody)(emd serono)和biclonic(merus)之类的设计产生。
[0439]
在“钮扣”策略(参见，例如国际公开wo 2006/028936)中，在人igg中形成ch3结构域的交界的选定氨基酸可在影响ch3结构域相互作用的位置处突变，从而促进异源二聚体形成。将具有小侧链(扣)的氨基酸引入特异性地结合第一抗原的抗体的重链中，并将具有大侧链(钮)的氨基酸引入特异性地结合第二抗原的抗体的重链中。在两种抗体共表达后，由于具有“扣”的重链与具有“钮”的重链的优先相互作用而形成异源二聚体。形成钮和扣的示例性ch3取代对(表示为第一重链的第一ch3域中的修饰位置/第二重链的第二ch3域中的修饰位置)是：t366y/f405a、t366w/f405w、f405w/y407a、t394w/y407t、t394s/y407a、t366w/t394s、f405w/t394s和t366w/t366s_l368a_y407v。
[0440]
除利用“钮扣”策略促进fab壁交换之外，crossmab技术还利用一个半臂中的ch1/cl结构域更换，以确保所得的双特异性抗体正确的轻链配对(参见例如美国专利8,242,247)。
[0441]
可使用其他交换策略如下产生本发明的全长双特异性抗体：在双特异性抗体的一个或两个臂中，在重链与轻链之间或重链之内交换可变结构域或恒定结构域、或这两种结构域。这些交换包括例如vh
‑
ch1与vl
‑
cl、vh与vl、ch3与cl以及ch3与ch1，如在国际专利公布wo2009/080254、wo2009/080251、wo2009/018386和wo2009/080252中有所描述。
[0442]
还可使用其他策略，诸如通过在一个ch3表面置换带正电荷的残基并在第二ch3表面置换带负电荷的残基使用静电相互作用促进重链异源二聚化，如美国专利公开us2010/0015133；美国专利公布us2009/0182127；美国专利公布us2010/028637或美国专利公布us2011/0123532中所述。在其他策略中，可通过下面的置换(表示为第一重链的第一ch3结构域中的修饰位置/第二重链的第二ch3结构域中的修饰位置)促进异源二聚化：l351y_f405a_y407v/t394w、t366i_k392m_t394w/f405a_y407v、t366l_k392m_t394w/f405a_y407v、l351y_y407a/t366a_k409f、l351y_y407a/t366v_k409f、y407a/t366a_k409f或t350v_l351y_f405a_y407v/t350v_t366l_k392l_t394w，如美国专利公开us2012/0149876或美国专利公布us2013/0195849中所述。
[0443]
seedbody技术可用于产生本发明的双特异性抗体。seedbodies在其恒定域中具有所选择的经iga残基取代的igg残基，以促进异源二聚化，如在美国专利us20070287170中有所描述。
[0444]
通常使用标准方法以dna水平到分子水平(诸如抗体的恒定域)上进行突变。
[0445]
多核苷酸、载体和宿主细胞
[0446]
本发明还提供了分离的多核苷酸，该分离的多核苷酸编码本发明的抗
‑
tmeff2抗体或其抗原结合片段。本发明还提供了分离的多核苷酸，该分离的多核苷酸编码本发明的双特异性抗
‑
tmeff2/抗
‑
cd3抗体或其抗原结合片段。能够编码本文提供的可变域区段的分离多核苷酸可包括在相同或不同的载体上以产生抗体或抗原结合片段。多核苷酸可为互补脱氧核酸(cdna)，并且可经密码子优化以在合适的宿主中表达。密码子优化是公知的技术。
[0447]
在一些实施方案中，本文所述的多核苷酸(及其编码的肽)包含前导序列。可采用本领域已知的任何前导序列。前导序列可包含限制性位点或翻译起始位点。
[0448]
本发明还提供了一种分离的多核苷酸，该分离的多核苷酸编码本发明抗体的vh、本发明抗体的vl、本发明抗体的重链或本发明抗体的轻链。
[0449]
本发明还提供了一种编码seq id no:25、26、27、87或89的vh的分离的多核苷酸。
[0450]
本发明还提供了一种编码seq id no:28、29、30、31、88或90的vl的分离的多核苷酸。
[0451]
本发明还提供了一种编码本发明的抗
‑
tmeff2/抗
‑
cd3抗体的hc1、lc1、hc2或lc2的分离的多核苷酸。
[0452]
本发明还提供了一种编码seq id no:32、33、34、91或93的hc1的分离的多核苷酸。
[0453]
本发明还提供了一种编码seq id no:35、36、37、38、92或94的lc1的分离的多核苷酸。
[0454]
本发明还提供了一种编码seq id no:76或78的hc2的分离的多核苷酸。
[0455]
本发明还提供了一种编码seq id no:77或79的lc2的分离的多核苷酸。
[0456]
本发明还提供了一种包含seq id no:39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、95、96、97、98、99、100、101或102的多核苷酸序列的分离的多核苷酸。
[0457]
本发明还提供了一种包含seq id no:105、106、80、81、107、108、82和83的多核苷酸序列的分离的多核苷酸。
[0458]
可将编码本发明抗体的vh或vl或其抗原结合片段的多核苷酸序列，或本发明抗体的重链和轻链可操作地连接至允许核苷酸序列在预期宿主细胞中表达的一个或多个调控
元件，诸如启动子或增强子。多核苷酸可为cdna。
[0459]
本发明还提供了包含本发明的多核苷酸的载体。此类载体可以是质粒载体、病毒载体、用于杆状病毒表达的载体、基于转座子的载体或任何其它适于通过任何手段将本发明的合成多核苷酸引入给定生物体或遗传背景的载体。例如，将可任选地与恒定区连接的编码本发明抗体的轻链可变区和/或重链可变区的多核苷酸插入表达载体中。轻链和/或重链可被克隆在相同或不同的表达载体中。可将编码免疫球蛋白链的dna片段可操作地连接到确保免疫球蛋白多肽表达的一个或多个表达载体中的对照序列。对此类对照序列包括信号序列、启动子(例如，天然相关联的或异源的启动子)、增强子元件和转录终止子序列进行选择，以使其与选择用于表达抗体的宿主细胞相容。载体被结合到适当的宿主后，将宿主保持在适于蛋白质的高水平表达的条件下，该蛋白质由结合的多核苷酸编码。
[0460]
本说明书范围内的重组表达载体包括合成的或cdna衍生的核酸片段，这些片段编码可操作地连接至合适的调控元件的至少一种重组蛋白质诸如抗体的vh、vl、hc或lc。此类调节元件可包含转录启动子、编码合适的mrna核糖体结合位点的序列以及控制转录和翻译的终止的序列。表达载体，特别是哺乳动物表达载体还可包含一个或多个非转录元件，诸如复制起点、连接到待表达的基因的合适启动子和增强子、其它5'或3'侧翼非转录序列、5'或3'非翻译序列(诸如必需的核糖体结合位点)、聚腺苷酸化位点、剪接供体和受体位点或转录终止序列。也可并入赋予在宿主中复制能力的复制起点。
[0461]
用于转化脊椎动物细胞的表达载体中的转录和翻译控制序列可由病毒源提供。示例性载体可如okayama和berg，3mol.cell.biol.280(1983)。
[0462]
在一些实施方案中，将抗体编码序列或抗原结合片段编码序列置于强效组成型启动子(诸如用于以下基因的启动子：次黄嘌呤磷酸核糖基转移酶(hprt)、腺苷脱氨酶、丙酮酸激酶、β
‑
肌动蛋白、人肌球蛋白、人血红蛋白、人肌肉肌酸等)的控制下。此外，许多病毒启动子在真核细胞中组成性地发挥功能，并适合与所述实施方案一起使用。这类病毒启动子包括但不限于细胞巨化病毒(cmv)立即早期启动子、sv40的早期和晚期启动子、小鼠乳腺肿瘤病毒(mmtv)启动子、马罗尼白血病病毒的长末端重复序列(ltr)、人免疫缺陷病毒(hiv)、eb病毒(ebv)、劳氏肉瘤病毒(rsv)和其它逆转录病毒，以及单纯疱疹病毒的胸苷激酶启动子。在一个实施方案中，将抗tmeff2抗体或其抗原结合片段编码序列置于诱导型启动子(诸如，金属硫蛋白启动子、四环素诱导型启动子、多西环素诱导型启动子、含有一种或多种干扰素刺激的反应元件(isre)(诸如蛋白激酶r 2',5'
‑
寡腺苷酸合成酶、mx基因、adar1等)的启动子)的控制下。
[0463]
本文所述的载体可含有一个或多个内部核糖体进入位点(ires)。ires序列包含在融合载体中可能有利于增强一些蛋白质的表达。在一些实施方案中，载体系统将包括一个或多个聚腺苷酸化位点(例如，sv40)，这些位点可在任何上述核酸序列的上游或下游。载体组分可连续地连接，或以提供用于表达基因产物的最佳间距的方式(即通过在orf之间引入“间隔区”核苷酸)排列，或以另一种方式定位。调控元件诸如ires基序也可被布置成提供用于表达的最佳间距。
[0464]
载体可包含本领域熟知的选择标记。选择标记包括阳性和阴性选择标记，例如，抗生素抗性基因(例如，新霉素抗性基因、潮霉素抗性基因、卡那霉素抗性基因、四环素抗性基因、青霉素抗性基因)、谷氨酰胺合酶基因、hsv
‑
tk、用于更昔洛韦选择的hsv
‑
tk衍生物或用
于6
‑
甲基嘌呤选择的细菌嘌呤核苷磷酸化酶基因(gadi等人，7gene ther.1738
‑
1743(2000))。编码选择标记或克隆位点的核酸序列可在编码感兴趣的多肽或克隆位点的核酸序列的上游或下游。
[0465]
可使用的示例性载体为细菌：pbs、phagescript、psix174、pbluescript sk、pbs ks、pnh8a、pnh16a、pnh18a、pnh46a(stratagene,la jolla,calif.,usa)；ptrc99a、pkk223
‑
3、pkk233
‑
3、pdr540和prit5(pharmacia,uppsala,sweden)。真核：pwlneo、psv2cat、pog44、pxr1、psg(stratagene)、psvk3、pbpv、pmsg和psvl(pharmacia)、pee6.4(lonza)和pee12.4(lonza)。
[0466]
在一些实施方案中，载体包含编码seq id no:25的vh和/或seq id no:28的vl的多核苷酸。
[0467]
在一些实施方案中，抗体包含seq id no:39的多核苷酸和/或seq id no:42的多核苷酸。
[0468]
在一些实施方案中，载体包含编码seq id no:26的vh和/或seq id no:29的vl的多核苷酸。
[0469]
在一些实施方案中，抗体包含seq id no:40的多核苷酸和/或seq id no:43的多核苷酸。
[0470]
在一些实施方案中，载体包含编码seq id no:27的vh和/或seq id no:30的vl的多核苷酸。
[0471]
在一些实施方案中，抗体包含seq id no:41的多核苷酸和/或seq id no:44的多核苷酸。
[0472]
在一些实施方案中，载体包含编码seq id no:26的vh和/或seq id no:31的vl的多核苷酸。
[0473]
在一些实施方案中，抗体包含seq id no:40的多核苷酸和/或seq id no:45的多核苷酸。
[0474]
在一些实施方案中，载体包含编码seq id no:87的vh和/或seq id no:88的vl的多核苷酸。
[0475]
在一些实施方案中，抗体包含seq id no:95的多核苷酸和/或seq id no:96的多核苷酸。
[0476]
在一些实施方案中，载体包含编码seq id no:89的vh和/或seq id no:90的vl的多核苷酸。
[0477]
在一些实施方案中，抗体包含seq id no:99的多核苷酸和/或seq id no:100的多核苷酸。
[0478]
在一些实施方案中，载体包含编码seq id no:66的vh和/或seq id no:67的vl的多核苷酸。
[0479]
在一些实施方案中，抗体包含seq id no:105的多核苷酸和/或seq id no:106的多核苷酸。
[0480]
在一些实施方案中，载体包含编码seq id no:74的vh和/或seq id no:75的vl的多核苷酸。
[0481]
在一些实施方案中，抗体包含seq id no:107的多核苷酸和/或seq id no:108的
多核苷酸。
[0482]
在一些实施方案中，载体包含编码seq id no:32的hc和/或seq id no:35的lc的多核苷酸。
[0483]
在一些实施方案中，抗体包含seq id no:46的多核苷酸和/或seq id no:49的多核苷酸。
[0484]
在一些实施方案中，载体包含编码seq id no:33的hc和/或seq id no:36的lc的多核苷酸。
[0485]
在一些实施方案中，抗体包含seq id no:47的多核苷酸和/或seq id no:50的多核苷酸。
[0486]
在一些实施方案中，载体包含编码seq id no:34的hc和/或seq id no:37的lc的多核苷酸。
[0487]
在一些实施方案中，抗体包含seq id no:48的多核苷酸和/或seq id no:51的多核苷酸。
[0488]
在一些实施方案中，载体包含编码seq id no:33的hc和/或seq id no:38的lc的多核苷酸。
[0489]
在一些实施方案中，抗体包含seq id no:47的多核苷酸和/或seq id no:52的多核苷酸。
[0490]
在一些实施方案中，载体包含编码seq id no:91的vh和/或seq id no:92的vl的多核苷酸。
[0491]
在一些实施方案中，抗体包含seq id no:97的多核苷酸和/或seq id no:98的多核苷酸。
[0492]
在一些实施方案中，载体包含编码seq id no:93的vh和/或seq id no:94的vl的多核苷酸。
[0493]
在一些实施方案中，抗体包含seq id no:101的多核苷酸和/或seq id no:102的多核苷酸。
[0494]
在一些实施方案中，载体包含编码seq id no:76的hc和/或seq id no:77的lc的多核苷酸。
[0495]
在一些实施方案中，抗体包含seq id no:80的多核苷酸和/或seq id no:81的多核苷酸。
[0496]
在一些实施方案中，载体包含编码seq id no:78的hc和/或seq id no:79的lc的多核苷酸。
[0497]
在一些实施方案中，抗体包含seq id no:82的多核苷酸和/或seq id no:83的多核苷酸。
[0498]
本文所述的载体可用于用编码所述抗体或抗原结合片段的基因转化各种细胞。例如，该载体可用于生成抗
‑
tmeff2抗体或产生抗原结合片段的细胞。因此，本发明还提供了一种包含本发明的一个或多个载体的宿主细胞。
[0499]
用于将外来基因引入细胞中的技术是已知的，并且可用于构建本发明的重组细胞。
[0500]“宿主细胞”是指已引入载体的细胞。应该理解，术语宿主细胞不仅旨在指特定的
主体细胞，还指此类细胞的子代，并且也指特定主体细胞所产生的稳定细胞系。因为由于突变或者由于环境影响，在后代中可发生某些修饰，因此此类子代可与母体细胞不同，但仍包括在本文所用的术语“宿主细胞”的范围内。
[0501]
此类宿主细胞可以是真核细胞、原核细胞、植物细胞或古菌细胞。原核宿主细胞的示例是大肠杆菌(escherichia coli)、杆菌属(bacilli)诸如枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)和其它肠杆菌科(enterobacteriaceae)诸如沙门氏菌(salmonella)、沙雷氏菌(serratia)以及各种假单胞菌属(pseudomonas)物种。其他微生物诸如酵母也可用于表达。酵母属(saccharomyces)(例如，酿酒酵母(s.cerevisiae))和毕赤酵母是合适的酵母宿主细胞的示例。示例性真核细胞可以是哺乳动物、昆虫、禽类或其它动物来源。哺乳动物真核细胞包括无限增殖化细胞系，诸如杂交瘤或骨髓瘤细胞系，诸如sp2/0(美国典型培养物保藏中心(atcc),manassas,va,crl
‑
1581)、ns0(欧洲细胞培养物保藏中心(ecacc),salisbury,wiltshire,uk,ecacc no.85110503)、fo(atcc crl
‑
1646)和ag653(atcc crl
‑
1580)鼠细胞系。一种示例性人骨髓瘤细胞系是u266(attc crl
‑
tib
‑
196)。其它可用的细胞系包括衍生自中国仓鼠卵巢(cho)细胞的那些细胞系，诸如chok1sv(lonza biologics,walkersville,md)、chok2sv(lonza)、cho
‑
k1(atcc crl
‑
61)或dg44。
[0502]
可选择或筛选用本文所述的表达载体转化的细胞用于本文所述的抗体或抗原结合片段的重组表达。扩增和筛选重组阳性细胞，筛选表现出所需表型(诸如高水平表达、增强的生长特性或例如由于蛋白质修饰或改变的翻译后修饰产生具有所需生化特征的蛋白质的能力)的亚克隆。这些表型可能是由于给定亚克隆的固有性质或由于突变造成的。突变可通过使用化学品、uv波长光、辐射、病毒、插入诱变剂、dna错配修复的抑制或这些方法的组合来影响。
[0503]
本发明还提供了一种制备本发明的抗体的方法，该方法包括在表达该抗体的条件下培养本发明的宿主细胞，并且回收由宿主细胞产生的抗体。制备抗体并将其纯化的方法是本领域所熟知的。一旦被合成(以化学方式或重组方式)后，全部抗体、其二聚体、单个轻链和/或重链、或者其它抗体片段诸如vh和/或vi，可以根据标准程序进行纯化，包括硫酸铵沉淀、亲和色谱柱、柱层析法、高效液相色谱(hplc)纯化、凝胶电泳等等(参见generally scopes,protein purification(springer
‑
verlag,n.y.,(1982))。受试者抗体可以基本上是纯净的，例如，至少约80％至85％纯净、至少约85％至90％纯净、至少约90％至95％纯净、或者至少约98％至99％纯净，或者更加纯净，例如，不含污染物，诸如细胞碎片、除受试者抗体之外的大分子等。
[0504]
可使用标准分子生物方法将本发明的多核苷酸序列结合到载体中。使用熟知的方法完成宿主细胞转化、培养、抗体表达和纯化。
[0505]
本发明还提供了一种制备本发明的抗
‑
tmeff2抗体的方法，该方法包括：
[0506]
将编码抗体的vh的第一多核苷酸和编码抗体的vl的第二多核苷酸引入表达载体中；
[0507]
用表达载体转化宿主细胞；
[0508]
在使vl和vh表达并形成抗体的条件下，将宿主细胞在培养基中进行培养；以及
[0509]
从宿主细胞或培养基中回收抗体。
[0510]
药物组合物/施用
[0511]
本发明还提供一种包含本发明的抗体以及药学上可接受的载体的药物组合物。就治疗性用途而言，可将本发明的抗体制备为药物组合物，该药物组合物含有有效量的抗体作为药学可接受的载体中的活性成分。“载体”是指本发明抗体与之一起施用的稀释剂、佐剂、赋形剂或媒介物。此类媒介物可以是液体，诸如水和油，包括来源于石油、动物、植物的油或合成的那些油，诸如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。例如，可使用0.4％盐水和0.3％甘氨酸。这些溶液是无菌的，并且通常不含颗粒物。它们可通过常规的公知灭菌技术(例如过滤)进行灭菌。组合物可根据需要含有药学可接受的辅助物质，以接近生理条件，例如ph调节剂和缓冲剂、稳定剂、增稠剂、润滑剂和着色剂等。在此类药物制剂中本发明的抗体的浓度可从按重量计小于约0.5％，通常到至少约1％到多达15％或20％改变，且可根据所选择的施用方式，主要基于所需剂量、流体体积、粘度等进行选择。包含其他人蛋白(例如，人血清白蛋白)在内的合适的溶媒和配制物在例如《雷明顿：药学科学与实践(remington:the science and practice of pharmacy)》，第21版，troy,d.b.编辑，lipincott williams和wilkins，宾夕法尼亚州费城(philadelphia,pa)2006，第5部分，药物制造(pharmaceutical manufacturing)，第691
‑
1092页(特别参见第958
‑
989页)中有所描述。
[0512]
本发明的抗体的施用模式可为任何合适的途径，诸如肠胃外施用，例如真皮内、肌肉内、腹膜内、静脉内或皮下、粘膜(口腔、鼻内、阴道内、直肠)或如本领域公知的技术人员了解的其他方式。
[0513]
还可预防性地施用本发明的抗体，以便降低患上疾病诸如癌症的风险。
[0514]
因此，本发明的用于肌内注射的药物组合物可制备成含有1ml无菌缓冲水，以及约1ng/kg至约100mg/kg，例如约50ng/kg至约30mg/kg或更优选约5mg/kg至约25mg/kg的本发明的抗体。
[0515]
使用抗
‑
tmeff2抗体和双特异性抗
‑
tmeff2/抗
‑
cd3抗体的方法
[0516]
本发明还提供了一种治疗对其有需要的受试者的tmeff2阳性癌症的方法，该方法包括向受试者施用治疗有效量的双特异性抗
‑
tmeff2/抗
‑
cd3抗体或其抗原结合片段以治疗tmeff2阳性癌症。
[0517]
本发明还提供了一种治疗对其有需要的受试者的tmeff2阳性癌症的方法，该方法包括向受试者施用治疗有效量的抗
‑
tmeff2抗体或其抗原结合片段以治疗tmeff2阳性癌症。
[0518]
多种基因与罹患前列腺癌有关。参与前列腺癌的罹患和进展并因此成为新型抗前列腺癌疗法的理想靶标的蛋白质之一是具有egf样结构域和两个卵泡抑素样结构域(tmeff2)的跨膜蛋白质。tmeff2是由两个卵泡抑素样(fs)结构域、egf样结构域、跨膜(tm)结构域和短胞质尾区组成的i型跨膜蛋白质。在两个器官中检测到tmeff2蛋白质的最高表达：大脑和前列腺(liang等人2000；horie等人2000)。tmeff2的表达升高也存在于前列腺癌细胞系和临床样本中(glynne
‑
jones等人2001；gery等人2002；afar等人2004)，这表明tmeff2在前列腺癌进展中起重要作用。tmeff2基因的表达处于雄激素受体的控制下。大量雄激素依赖性癌症患者表现出高水平的tmeff2 mrna。
[0519]
因此，抗
‑
tmeff2抗体可能成为用于诊断、预后或治疗前列腺癌的重要工具。
[0520]“癌症”旨在包括所有类型的癌性生长或致癌过程、转移性组织或恶性转化的细
胞、组织、或器官，而不考虑组织病理学类型或侵入阶段。示例性tmeff阳性癌症包括前列腺癌。
[0521]
在一些实施方案中，前列腺癌是腺癌。
[0522]
在一些实施方案中，前列腺癌是转移性前列腺癌。在一些实施方案中，前列腺癌已转移到直肠、淋巴结或骨、或它们的任何组合。
[0523]
在一些实施方案中，前列腺癌是复发性或难治性前列腺癌。
[0524]
在一些实施方案中，前列腺癌是去势抵抗性前列腺癌。
[0525]
在一些实施方案中，前列腺癌对雄激素阻断疗法敏感。
[0526]
在一些实施方案中，前列腺癌对雄激素阻断疗法不敏感。
[0527]
本发明还提供了一种分离的双特异性抗
‑
tmeff2/抗
‑
cd3抗体或其抗原结合片段用于治疗。
[0528]
本发明还提供了一种分离的双特异性抗
‑
tmeff2/抗
‑
cd3抗体或其抗原结合片段用于治疗tmeff2阳性癌症。
[0529]
本发明还提供了一种分离的双特异性抗
‑
tmeff2/抗
‑
cd3抗体或其抗原结合片段用于治疗tmeff2前列腺癌。
[0530]
本发明还提供了一种分离的双特异性抗
‑
tmeff2/抗
‑
cd3抗体或其抗原结合片段用于制造用于治疗tmeff2阳性癌症的药物。
[0531]
本发明还提供了一种分离的双特异性抗
‑
tmeff2/抗
‑
cd3抗体或其抗原结合片段用于治疗tmeff2阳性癌症诸如前列腺癌，其中双特异性抗
‑
tmeff2/抗
‑
cd3抗体包含结合tmeff2的第一结构域和结合cd3的第二结构域，其中
[0532]
第一结构域包含分别为seq id no:10、12、15、18、20和22的hcdr1、hcdr2、hcdr3、lcdr1、lcdr2和lcdr3，并且第二结构域包含分别为seq id no:60、61、62、63、64和65的hcdr1、hcdr2、hcdr3、lcdr1、lcdr2和lcdr3；
[0533]
第一结构域包含seq id no:25的vh和seq id no:28的vl，并且第二结构域包含seq id no:66的vh和seq id no:67的vl；并且/或者双特异性抗
‑
tmeff2/抗
‑
cd3抗体或其抗原结合片段包含seq id no:32的第一重链(hc1)、seq id no:35的第一轻链(lc1)、seq id no:76的第二重链(hc2)和seq id no:77的第二轻链(lc2)。
[0534]
本发明还提供了一种分离的双特异性抗
‑
tmeff2/抗
‑
cd3抗体或其抗原结合片段用于治疗tmeff2阳性癌症诸如前列腺癌，其中双特异性抗
‑
tmeff2/抗
‑
cd3抗体包含结合tmeff2的第一结构域和结合cd3的第二结构域，其中
[0535]
第一结构域包含分别为seq id no:10、12、15、18、20和22的hcdr1、hcdr2、hcdr3、lcdr1、lcdr2和lcdr3，并且第二结构域包含分别为seq id no:68、69、70、71、72和73的hcdr1、hcdr2、hcdr3、lcdr1、lcdr2和lcdr3；
[0536]
第一结构域包含seq id no:25的vh和seq id no:28的vl，并且第二结构域包含seq id no:74的vh和seq id no:75的vl；并且/或者双特异性抗
‑
tmeff2/抗
‑
cd3抗体或其抗原结合片段包含seq id no:32的hc1、seq id no:35的lc1、seq id no:78的hc2和seq id no:79的lc2。
[0537]
本发明还提供了一种分离的双特异性抗
‑
tmeff2/抗
‑
cd3抗体或其抗原结合片段用于治疗tmeff2阳性癌症诸如前列腺癌，其中双特异性抗
‑
tmeff2/抗
‑
cd3抗体包含结合
tmeff2的第一结构域和结合cd3的第二结构域，其中
[0538]
第一结构域包含分别为seq id no:11、13、16、19、21和23的hcdr1、hcdr2、hcdr3、lcdr1、lcdr2和lcdr3，并且第二结构域包含分别为seq id no:60、61、62、63、64和65的hcdr1、hcdr2、hcdr3、lcdr1、lcdr2和lcdr3；
[0539]
第一结构域包含seq id no:26的vh和seq id no:29的vl，并且第二结构域包含seq id no:66的vh和seq id no:67的vl；并且/或者双特异性抗
‑
tmeff2/抗
‑
cd3抗体或其抗原结合片段包含seq id no:33的hc1、seq id no:36的lc1、seq id no:76的hc2和seq id no:77的lc2。
[0540]
本发明还提供了一种分离的双特异性抗
‑
tmeff2/抗
‑
cd3抗体或其抗原结合片段用于治疗tmeff2阳性癌症诸如前列腺癌，其中双特异性抗
‑
tmeff2/抗
‑
cd3抗体包含结合tmeff2的第一结构域和结合cd3的第二结构域，其中
[0541]
第一结构域包含分别为seq id no:11、13、16、19、21和23的hcdr1、hcdr2、hcdr3、lcdr1、lcdr2和lcdr3，并且第二结构域包含分别为seq id no:68、69、70、71、72和73的hcdr1、hcdr2、hcdr3、lcdr1、lcdr2和lcdr3；
[0542]
第一结构域包含seq id no:26的vh和seq id no:29的vl，并且第二结构域包含seq id no:74的vh和seq id no:75的vl；并且/或者双特异性抗
‑
tmeff2/抗
‑
cd3抗体或其抗原结合片段包含seq id no:33的hc1、seq id no:36的lc1、seq id no:78的hc2和seq id no:79的lc2。
[0543]
本发明还提供了一种分离的双特异性抗
‑
tmeff2/抗
‑
cd3抗体或其抗原结合片段用于治疗tmeff2阳性癌症诸如前列腺癌，其中双特异性抗
‑
tmeff2/抗
‑
cd3抗体包含结合tmeff2的第一结构域和结合cd3的第二结构域，其中
[0544]
第一结构域包含分别为seq id no:10、14、17、18、20和24的hcdr1、hcdr2、hcdr3、lcdr1、lcdr2和lcdr3，并且第二结构域包含分别为seq id no:60、61、62、63、64和65的hcdr1、hcdr2、hcdr3、lcdr1、lcdr2和lcdr3；
[0545]
第一结构域包含seq id no:27的vh和seq id no:30的vl，并且第二结构域包含seq id no:66的vh和seq id no:67的vl；并且/或者双特异性抗
‑
tmeff2/抗
‑
cd3抗体或其抗原结合片段包含seq id no:34的hc1、seq id no:37的lc1、seq id no:76的hc2和seq id no:77的lc2。
[0546]
本发明还提供了一种分离的双特异性抗
‑
tmeff2/抗
‑
cd3抗体或其抗原结合片段用于治疗tmeff2阳性癌症诸如前列腺癌，其中双特异性抗
‑
tmeff2/抗
‑
cd3抗体包含结合tmeff2的第一结构域和结合cd3的第二结构域，其中
[0547]
第一结构域包含分别为seq id no:10、14、17、18、20和24的hcdr1、hcdr2、hcdr3、lcdr1、lcdr2和lcdr3，并且第二结构域包含分别为seq id no:68、69、70、71、72和73的hcdr1、hcdr2、hcdr3、lcdr1、lcdr2和lcdr3；
[0548]
第一结构域包含seq id no:27的vh和seq id no:30的vl，并且第二结构域包含seq id no:74的vh和seq id no:75的vl；并且/或者双特异性抗
‑
tmeff2/抗
‑
cd3抗体或其抗原结合片段包含seq id no:34的hc1、seq id no:37的lc1、seq id no:78的hc2和seq id no:79的lc2。
[0549]
本发明还提供了一种分离的双特异性抗
‑
tmeff2/抗
‑
cd3抗体或其抗原结合片段
用于治疗tmeff2阳性癌症诸如前列腺癌，其中双特异性抗
‑
tmeff2/抗
‑
cd3抗体包含结合tmeff2的第一结构域和结合cd3的第二结构域，其中
[0550]
第一结构域包含分别为seq id no:11、13、16、18、20和22的hcdr1、hcdr2、hcdr3、lcdr1、lcdr2和lcdr3，并且第二结构域包含分别为seq id no:60、61、62、63、64和65的hcdr1、hcdr2、hcdr3、lcdr1、lcdr2和lcdr3；
[0551]
第一结构域包含seq id no:26的vh和seq id no:31的vl，并且第二结构域包含seq id no:66的vh和seq id no:67的vl；并且/或者双特异性抗
‑
tmeff2/抗
‑
cd3抗体或其抗原结合片段包含seq id no:33的hc1、seq id no:38的lc1、seq id no:76的hc2和seq id no:77的lc2。
[0552]
本发明还提供了一种分离的双特异性抗
‑
tmeff2/抗
‑
cd3抗体或其抗原结合片段用于治疗tmeff2阳性癌症诸如前列腺癌，其中双特异性抗
‑
tmeff2/抗
‑
cd3抗体包含结合tmeff2的第一结构域和结合cd3的第二结构域，其中
[0553]
第一结构域包含分别为seq id no:11、13、16、18、20和22的hcdr1、hcdr2、hcdr3、lcdr1、lcdr2和lcdr3，并且第二结构域包含分别为seq id no:68、69、70、71、72和73的hcdr1、hcdr2、hcdr3、lcdr1、lcdr2和lcdr3；
[0554]
第一结构域包含seq id no:26的vh和seq id no:31的vl，并且第二结构域包含seq id no:74的vh和seq id no:75的vl；并且/或者双特异性抗
‑
tmeff2/抗
‑
cd3抗体或其抗原结合片段包含seq id no:33的hc1、seq id no:38的lc1、seq id no:78的hc2和seq id no:79的lc2。
[0555]
本发明还提供了一种分离的双特异性抗
‑
tmeff2/抗
‑
cd3抗体或其抗原结合片段用于治疗tmeff2阳性癌症诸如前列腺癌，其中双特异性抗
‑
tmeff2/抗
‑
cd3抗体包含结合tmeff2的第一结构域和结合cd3的第二结构域，其中
[0556]
第一结构域包含分别为seq id no:10、12、15、18、20和86的hcdr1、hcdr2、hcdr3、lcdr1、lcdr2和lcdr3，并且第二结构域包含分别为seq id no:60、61、62、63、64和65的hcdr1、hcdr2、hcdr3、lcdr1、lcdr2和lcdr3；
[0557]
第一结构域包含seq id no:87的vh和seq id no:88的vl，并且第二结构域包含seq id no:66的vh和seq id no:67的vl；并且/或者双特异性抗
‑
tmeff2/抗
‑
cd3抗体或其抗原结合片段包含seq id no:91的hc1、seq id no:92的lc1、seq id no:76的hc2和seq id no:77的lc2。
[0558]
本发明还提供了一种分离的双特异性抗
‑
tmeff2/抗
‑
cd3抗体或其抗原结合片段用于治疗tmeff2阳性癌症诸如前列腺癌，其中双特异性抗
‑
tmeff2/抗
‑
cd3抗体包含结合tmeff2的第一结构域和结合cd3的第二结构域，其中
[0559]
第一结构域包含分别为seq id no:10、12、15、18、20和86的hcdr1、hcdr2、hcdr3、lcdr1、lcdr2和lcdr3，并且第二结构域包含分别为seq id no:68、69、70、71、72和73的hcdr1、hcdr2、hcdr3、lcdr1、lcdr2和lcdr3；
[0560]
第一结构域包含seq id no:87的vh和seq id no:88的vl，并且第二结构域包含seq id no:74的vh和seq id no:75的vl；并且/或者双特异性抗
‑
tmeff2/抗
‑
cd3抗体或其抗原结合片段包含seq id no:91的hc1、seq id no:92的lc1、seq id no:78的hc2和seq id no:79的lc2。
[0561]
本发明还提供了一种分离的双特异性抗
‑
tmeff2/抗
‑
cd3抗体或其抗原结合片段用于治疗tmeff2阳性癌症诸如前列腺癌，其中双特异性抗
‑
tmeff2/抗
‑
cd3抗体包含结合tmeff2的第一结构域和结合cd3的第二结构域，其中
[0562]
第一结构域包含分别为seq id no:10、12、15、18、20和86的hcdr1、hcdr2、hcdr3、lcdr1、lcdr2和lcdr3，并且第二结构域包含分别为seq id no:60、61、62、63、64和65的hcdr1、hcdr2、hcdr3、lcdr1、lcdr2和lcdr3；
[0563]
第一结构域包含seq id no:89的vh和seq id no:90的vl，并且第二结构域包含seq id no:66的vh和seq id no:67的vl；并且/或者双特异性抗
‑
tmeff2/抗
‑
cd3抗体或其抗原结合片段包含seq id no:93的hc1、seq id no:94的lc1、seq id no:76的hc2和seq id no:77的lc2。
[0564]
本发明还提供了一种分离的双特异性抗
‑
tmeff2/抗
‑
cd3抗体或其抗原结合片段用于治疗tmeff2阳性癌症诸如前列腺癌，其中双特异性抗
‑
tmeff2/抗
‑
cd3抗体包含结合tmeff2的第一结构域和结合cd3的第二结构域，其中
[0565]
第一结构域包含分别为seq id no:10、12、15、18、20和86的hcdr1、hcdr2、hcdr3、lcdr1、lcdr2和lcdr3，并且第二结构域包含分别为seq id no:68、69、70、71、72和73的hcdr1、hcdr2、hcdr3、lcdr1、lcdr2和lcdr3；
[0566]
第一结构域包含seq id no:89的vh和seq id no:90的vl，并且第二结构域包含seq id no:74的vh和seq id no:75的vl；并且/或者双特异性抗
‑
tmeff2/抗
‑
cd3抗体或其抗原结合片段包含seq id no:93的hc1、seq id no:94的lc1、seq id no:78的hc2和seq id no:79的lc2。
[0567]
本发明的抗体可与第二治疗剂组合施用。
[0568]
在一些实施方案中，第二治疗剂为外科手术、化学疗法、雄激素阻断疗法或放射疗法、或它们的任何组合。
[0569]
试剂盒
[0570]
本发明还提供了一种试剂盒，该试剂盒包含本发明的抗
‑
tmeff2抗体或双特异性抗
‑
tmeff2/抗
‑
cd3抗体。试剂盒可用于治疗用途并用作诊断试剂盒。试剂盒可用于检测样品中tmeff2、cd3、或tmeff2和cd3的存在。
[0571]
在一些实施方案中，试剂盒包含本发明的抗体和用于检测该抗体的试剂。试剂盒可包含一个或多个其它元件，包含：使用说明；其它试剂，例如标记、治疗剂、或者可用于使抗体与标记或治疗剂螯合或以其它方式偶联的试剂、或辐射防护组合物；用于准备施用抗体的装置或其它材料；药学上可接受的载体；以及向受试者施用的装置或其它材料。
[0572]
在一些实施方案中，试剂盒包含容器装本发明的抗体和试剂盒的使用说明。
[0573]
在一些实施方案中，试剂盒中的抗体被标记。
[0574]
本发明还提供了一种包含抗
‑
tmeff2抗体的试剂盒，该抗
‑
tmeff2抗体包含seq id no:25的vh和seq id no:28的vl。
[0575]
本发明还提供了一种包含抗
‑
tmeff2抗体的试剂盒，该抗
‑
tmeff2抗体包含seq id no:26的vh和seq id no:29的vl。
[0576]
本发明还提供了一种包含抗
‑
tmeff2抗体的试剂盒，该抗
‑
tmeff2抗体包含seq id no:27的vh和seq id no:30的vl。
[0577]
本发明还提供了一种包含抗
‑
tmeff2抗体的试剂盒，该抗
‑
tmeff2抗体包含seq id no:26的vh和seq id no:31的vl。
[0578]
本发明还提供了一种包含抗
‑
tmeff2抗体的试剂盒，该抗
‑
tmeff2抗体包含seq id no:87的vh和seq id no:88的vl。
[0579]
本发明还提供了一种包含抗
‑
tmeff2抗体的试剂盒，该抗
‑
tmeff2抗体包含seq id no:89的vh和seq id no:90的vl。
[0580]
本发明还提供了一种包含双特异性抗
‑
tmeff2/抗
‑
cd3抗体的试剂盒，该抗体包含结合tmeff2的第一结构域和结合cd3的第二结构域，其中第一结构域包含seq id no:25的vh和seq id no:28的vl，并且第二结构域包含seq id no:66的vh和seq id no:67的vl。
[0581]
本发明还提供了一种包含双特异性抗
‑
tmeff2/抗
‑
cd3抗体的试剂盒，该抗体包含结合tmeff2的第一结构域和结合cd3的第二结构域，其中第一结构域包含seq id no:25的vh和seq id no:28的vl，并且第二结构域包含seq id no:74的vh和seq id no:75的vl。
[0582]
本发明还提供了一种包含双特异性抗
‑
tmeff2/抗
‑
cd3抗体的试剂盒，该抗体包含结合tmeff2的第一结构域和结合cd3的第二结构域，其中第一结构域包含seq id no:26的vh和seq id no:29的vl，并且第二结构域包含seq id no:66的vh和seq id no:67的vl。
[0583]
本发明还提供了一种包含双特异性抗
‑
tmeff2/抗
‑
cd3抗体的试剂盒，该抗体包含结合tmeff2的第一结构域和结合cd3的第二结构域，其中第一结构域包含seq id no:26的vh和seq id no:29的vl，并且第二结构域包含seq id no:74的vh和seq id no:75的vl。
[0584]
本发明还提供了一种包含双特异性抗
‑
tmeff2/抗
‑
cd3抗体的试剂盒，该抗体包含结合tmeff2的第一结构域和结合cd3的第二结构域，其中第一结构域包含seq id no:27的vh和seq id no:30的vl，并且第二结构域包含seq id no:66的vh和seq id no:67的vl。
[0585]
本发明还提供了一种包含双特异性抗
‑
tmeff2/抗
‑
cd3抗体的试剂盒，该抗体包含结合tmeff2的第一结构域和结合cd3的第二结构域，其中第一结构域包含seq id no:27的vh和seq id no:30的vl，并且第二结构域包含seq id no:74的vh和seq id no:75的vl。
[0586]
本发明还提供了一种包含双特异性抗
‑
tmeff2/抗
‑
cd3抗体的试剂盒，该抗体包含结合tmeff2的第一结构域和结合cd3的第二结构域，其中第一结构域包含seq id no:26的vh和seq id no:31的vl，并且第二结构域包含seq id no:66的vh和seq id no:67的vl。
[0587]
本发明还提供了一种包含双特异性抗
‑
tmeff2/抗
‑
cd3抗体的试剂盒，该抗体包含结合tmeff2的第一结构域和结合cd3的第二结构域，其中第一结构域包含seq id no:26的vh和seq id no:31的vl，并且第二结构域包含seq id no:74的vh和seq id no:75的vl。
[0588]
本发明还提供了一种包含双特异性抗
‑
tmeff2/抗
‑
cd3抗体的试剂盒，该抗体包含结合tmeff2的第一结构域和结合cd3的第二结构域，其中第一结构域包含seq id no:87的vh和seq id no:88的vl，并且第二结构域包含seq id no:66的vh和seq id no:67的vl。
[0589]
本发明还提供了一种包含双特异性抗
‑
tmeff2/抗
‑
cd3抗体的试剂盒，该抗体包含结合tmeff2的第一结构域和结合cd3的第二结构域，其中第一结构域包含seq id no:87的vh和seq id no:88的vl，并且第二结构域包含seq id no:74的vh和seq id no:75的vl。
[0590]
本发明还提供了一种包含双特异性抗
‑
tmeff2/抗
‑
cd3抗体的试剂盒，该抗体包含结合tmeff2的第一结构域和结合cd3的第二结构域，其中第一结构域包含seq id no:89的vh和seq id no:90的vl，并且第二结构域包含seq id no:66的vh和seq id no:67的vl。
[0591]
本发明还提供了一种包含双特异性抗
‑
tmeff2/抗
‑
cd3抗体的试剂盒，该抗体包含结合tmeff2的第一结构域和结合cd3的第二结构域，其中第一结构域包含seq id no:89的vh和seq id no:90的vl，并且第二结构域包含seq id no:74的vh和seq id no:75的vl。
[0592]
检测tmeff2或cd3的方法
[0593]
本发明还提供了一种检测样本中tmeff2的方法，该方法包括获得样本，使样本与本发明的抗
‑
tmeff2抗体接触，以及检测与样本中的tmeff2结合的抗体。
[0594]
本发明还提供了一种检测样本中的tmeff2和cd3的方法，该方法包括：获得样本；使样本与本发明的包含结合tmeff2的第一结构域和结合cd3的第二结构域的双特异性抗
‑
tmeff2/抗
‑
cd3抗体接触；以及检测与样本中的tmeff2和cd3结合的抗体。
[0595]
在一些实施方案中，样本可来源于尿液、血液、血清、血浆、唾液、腹水、循环细胞、循环肿瘤细胞、非组织缔合的细胞(即游离细胞)、组织(例如手术切除的肿瘤组织、活体组织切片，包括细针抽吸组织)、组织学制备物等。
[0596]
本文所述的与tmeff2或tmeff2和cd3结合的本发明抗体可使用已知方法检测。示例性方法包括使用荧光或化学发光标记、或放射标记物直接标记抗体，或者使易于检测的部分(诸如生物素、酶或表位标签)连接到本发明的抗体上。示例性的标记和部分为钌、111in
‑
dota、111in
‑
二亚乙基三胺五乙酸(dtpa)、辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶和β
‑
半乳糖苷酶、聚组氨酸(his标签)、吖啶染料、花青染料、荧光酮染料、噁嗪染料、菲啶染料、罗丹明染料和染料。
[0597]
本发明的抗体可用于多种测定中以检测样本中的tmeff2或tmeff2和cd3。示例性的测定为蛋白质印迹分析、放射性免疫测定、表面等离振子共振、免疫沉淀、平衡透析、免疫扩散、电化学发光(ecl)免疫测定、免疫组织化学、荧光激活细胞分选(facs)或elisa测定。
[0598]
本发明现将结合以下具体的、非限制性实施例进行描述。
[0599]
实施例1：抗原生成
[0600]
人胞外结构域(ecd)tmeff2基于uniprot登录号q9uik5序列产生。ecd构建体被设计成在c
‑
末端处具有6x his
‑
标签和avi
‑
标签序列(构建体tmew1；seq id no:6)。将含有fs2和egf结构域的构建体(氨基酸151
‑
320)设计为具有6x his
‑
标签和avi
‑
标签序列的人血清白蛋白(hsa)融合体(构建体tmew7；seq id no:7)。将含有tmeff2膜近侧结构域(残基230
‑
320)的构建体设计成具有6xhis标签(构建体tmew19；seq id no:8)或融合在具有his标签的大鼠igg1 fc(构建体tmew20；seq id no:9)上。tmeff2的残基230
‑
320含有横跨tmeff2的残基261
‑
301的egf结构域。根据制造商方案，使用expifectamine将人tmeff2 ecd表达构建体瞬时转染到hek293衍生细胞expi293(gibco/thermo fisher scientific)中。在收获之前，在定轨振荡器上将细胞用8％co2在37℃下温育5天。通过离心移除表达的细胞，并且使用固定化金属亲和色谱法，使用ni sepharose 6fast flow树脂(ge healthcare)，之后使用superdex 200制备型尺寸排阻色谱法(sec)(ge healthcare)在ph 7.2的dubelcco磷酸盐缓冲液(1x dpbs)中从培养基纯化具有his标签的可溶性tmeff2蛋白质。所生成的抗原的氨基酸序列在表3中示出。
[0601]
表3.
[0602][0603][0604]
实施例2.抗
‑
tmeff2抗体的生成
[0605]
使用表达人免疫球蛋白基因座的转基因大鼠来生成抗体含有嵌合人/大鼠igh基因座(包含22个人v
h
，全部的人d和j
h
片段以天然构型连接至大鼠c
h
基因座)连同完整人igl基因座(连接至jκ
‑
cκ的12个vκ和连接至jλ
‑
cλ的16个vλ)。(参见例如，osborn等人，2013年，j immunol，第190卷，第4期，第1481
‑
1490页)。因此，大鼠表现出大鼠免疫球蛋白的表达降低，并且响应于免疫，引入的人重链和轻链转基因经历类别转换和体细胞突变以产生具有完全人可变区的高亲和力嵌合人/大鼠igg单克隆抗体。wo14/093908中描述了的制备和用途以及由这些大鼠携带的基因组修饰。
[0606]
用人tmeff2构建体fs2
‑
egf
‑
tev
‑
hsa(c34s)
‑
his
‑
avitag(tmew7，seq id no:7)免疫omnirats，并用构建体sptmeff2(230
‑
320)g3s
‑
大鼠igg1fc(tmew20，seq id no:9)增强。在89天免疫方案后，从大鼠收获淋巴结并用于生成杂交瘤，并且通过elisa和/或sparcl(空间接近分析物试剂捕集发光)筛选杂交瘤上清液与人tmeff2
‑
fl
‑
ecd
‑
his
‑
avi标签(tmew1)蛋白质的结合。选择若干种上清液用于二次elisa和sparcl筛选，筛选与tmeff ecd、fs2
‑
egf、或仅egf结构域tmeff2的结合。基于筛选结果，对若干杂交瘤克隆进行测序、表达和功能表征。
[0607]
从噬菌体展示文库生成抗体
[0608]
使用标准方法从两组从头pix噬菌体展示文库中选择tmeff2结合fab，如shi等人，j mol biol 397:385
‑
96,2010和wo2009/085462中所述。简而言之，通过使人支架多样化来生成两组文库(称为v3.0和v5.0)，其中种系vh基因ighv1
‑
69*01、ighv3
‑
23*01和ighv5
‑
51*01经由h3环与人ighj
‑
4微小基因重新组合(ighj
‑
6微小基因也用于v5.0)，并且人种系vlκ基因o12(igkv1
‑
39*01)、l6(igkv3
‑
11*01)、a27(igkv3
‑
20*01)和b3(igkv4
‑
1*01)与igkj
‑
1微小基因重新组合以组装完整的vh和vl结构域。选择在围绕h1、h2、l1、l2和l3环的重链和轻链可变区中的位置用于多样化，这些位置经常与蛋白质和肽抗原接触。在选定位置处的序列多样性限于在各个ighv或iglv基因的ighv或iglv种系基因家族中的每个位置处出现的残基。通过针于v3.0文库使用长度为7
‑
14个氨基酸的短至中等大小的合成环以及针于v5.0文库使用长度为6
‑
19个氨基酸的合成环而在h3环处产生多样性。设计在h3处的氨基酸分布，以模仿在人抗体中观察到的氨基酸变异。根据它们的人vh和vl种系基因起源，命名用于生成文库的支架。对于v3.0和v5.0两组，将三个重链文库中的每一个文库与四条种系轻链或四个种系轻链文库组合，以产生用于选择实验的每组文库的12种独特vh:vl组合。
[0609]
v区克隆
[0610]
按照制造商方案，使用rneasy 96试剂盒(qiagen)纯化来自噬菌体的杂交瘤细胞裂解物的总rna。使用drop sense定量所得的rna，并将其保存在
‑
80℃下或用于通过rt
‑
pcr(invitrogen)使用invitrogen superscript iii第一链合成系统的cdna合成。使用分别退火至重链、k链和λ链恒定区的基因特异性引物进行第一链cdna合成。将由最多3μg纯化rna、基因特异性引物、dntp混合物、反应缓冲液、25mm mgcl2、dtt、rnaseout
tm
(40u/μl，invitrogen)和superscript
tm iii rt(200u/μl，invitrogen目录号18080
‑
051)组成的rt
‑
pcr反应混合物在50℃下温育50分钟并在85℃下温育5分钟。将所得单链cdna保存在
‑
20℃下，或直接用于pcr扩增。使用platinum pfx聚合酶(invitrogen)进行pcr反应。使用优化的pcr条件，通过分别退火至重链、k链和λ链的前导序列和恒定区的正向引物和反向引物扩增
v区片段。对所得的pcr片段进行测序，对所回收v区的氨基酸序列进行密码子优化并将其克隆到基于punder的表达载体中，该表达载体携带具有s228p、f234a和l235a突变的igg4恒定区(igg4paa同种型)。
[0611]
expi293小规模转染和纯化
[0612]
克隆从免疫运动或噬菌体展示中鉴别的选定抗体并将其表示为igg1paa，并且经由2ml小规模纯化。将expi293
tm
细胞(thermofisher scientific)以1.25
×
105‑
2.25
×
105个活细胞/ml密度接种在expi293
tm
表达培养基中，并在37℃下、7％co2中在125ml
‑
2l摇瓶中培养。当密度达到对数生长期时，将细胞以3
×
106‑5×
106个活细胞/ml进行传代培养，存活率为98％
‑
99％。
[0613]
在转染当天，测定活细胞密度和存活率百分比。按照制造商的转染方案(thermofisher公开号man0007814)，以3
×
106个活细胞/ml的密度使细胞转染。在转染后第6天通过在纯化前以850
×
g离心15分钟来收获培养物。使用mab select sure树脂(ge healthcare)从澄清的上清液中纯化抗体，并透析到pbs中。使用dropsense仪器(trinean)，通过对滤液进行a280测量来确定蛋白质浓度。
[0614]
实施例3.抗
‑
tmeff2抗体的表征
[0615]
抗
‑
tmeff2抗体以高亲和力结合tmeff2
[0616]
使用proteon(tmeb674、tmeb675、tmeb 565和tmeb570)或biacore spr(tmeb762和tmeb757)评估选定igg4paa抗
‑
tmeff2抗体与tmeff2 ecd(tmew1：tmeff2
‑
fl ecd
‑
his
‑
avi标签)和/或膜近侧区(tmew19：sptmeff2(230
‑
320)g3s
‑
h6)的结合。结合选定抗体的动力学参数示于表4中。经发现，抗
‑
tmeff2抗体以皮摩尔亲和力结合tmeff2 ecd和tmeff2膜近侧区两者。
[0617]
表4.
[0618][0619]
proteon spr
[0620]
通过proteon spr(bio
‑
rad)测量抗
‑
tmeff2 mab与ecd和人tmeff2的膜近侧区的结合。将纯化的mab(在pbst中稀释至1μg/ml的最终浓度)用作测定中的配体，并且通过fc捕集固定至山羊抗人(gah)igg fc。对于gah igg fc的氨基偶联，在注射前立即混合edc(40mm)和nhs(10mm)的1:1混合物以活化芯片表面并沿竖直取向注射。然后使醋酸盐缓冲液(ph 5.0)中的gah
‑
fc(以30μg/ml)抗体以30μl/min的流速沿竖直取向在表面上流动300秒。
随后通过沿相同取向注射1m乙醇胺(ph 8.5)使表面中任何剩余的反应性羧基基团失活。抗体以1μg/ml的浓度用于固定。抗体沿水平方向在表面上流动。将人tmeff2 ecd或膜近侧区以5个浓度(100
‑
600nm范围内的最高浓度)的3倍稀释系列作为分析物沿竖直取向流入，以结合至所捕集的分子。缓冲液样品也沿竖直方向注入第6个通道中以监测基线信号的任何漂移。分别在3分钟和30(或15)分钟内以100μl/min的流速监测所有浓度的缔合相和解离相。使用0.8％磷酸的18秒脉冲将结合表面再生用于下一个相互作用循环以除去结合的抗原。通过从响应数据中减去两组参考数据来处理原始数据：1)点间信号以校正抗原与空芯片表面之间的非特异性相互作用；2)空通道信号(其中仅pbst在芯片上流动)以校正非特异性基线漂移。
[0621]
biacore 8k spr
[0622]
通过biacore 8k spr测量抗
‑
tmeff2 mab与人tmeff2 ecd的结合。测定的形式是使用高密度抗人fc表面捕集mab，然后使用单循环动力学方法注射人tmeff2浓度滴定。将山羊抗人fc igg(jackson immunoresearch，目录号109
‑
005
‑
098)经由氨基偶联在10mm醋酸盐缓冲液(ph 4.5)中以30μg/ml直接固定在流动池1和2上，在hbsp(ge)缓冲液中以30μl/min的流速直接固定在cm5传感器芯片(ge)上。将mab在流通池2上以0.5μg/ml(约200
‑
300ru)捕集在抗人fc igg表面上。然后将运行缓冲液更改为hbsp+100μg/ml bsa。使用单循环动力学方法，从低浓度至高浓度注射浓度为30nm的tmeff2 ecd的3倍稀释系列。在最后一次或最高浓度注射后30分钟时监测解离速率，然后使用0.8％磷酸(bio
‑
rad)将表面再生。还完成了捕集相同mab并使用相同样本运行条件的缓冲液空白运行。通过从响应数据中减去两组参考数据来处理原始数据：1)从样本流通池2中减去参考流通池1，以及2)从实验运行中减去缓冲液空白运行。将每种mab在所有浓度下的处理数据全局拟合到1:1简单langmuir结合模型中，以提取动力学(kon，koff)和亲和力(kd)常数的估计值。
[0623]
抗
‑
tmeff2抗体的热稳定性
[0624]
通过dsc(差示扫描量热法)发现，tmeb675示出低于通常的热稳定性特征，其中解折叠开始时tm＝52℃并且第一热转变(tm1)为60.4℃。对tmeb675的序列(参见实施例4)的更详细的检查显示，在重链和轻链的框架区内存在体细胞超突变(shm)。通过dsc亚克隆、表达、纯化和分析多个重新工程化的变体。所得的mab tmeb762和tmefb757示出期望的热稳定性特征(分别tm1＝69.4℃和tm1＝69.7℃)。与tmeb675相比，tmeb762在重链中具有以下氨基酸修饰：r14p、p20l和h81q，而tmefb757在重链中具有以下氨基酸修饰：r14p和p20l。与tmeb675相比，tmeb762在轻链中具有以下氨基酸修饰：a1d和a91p，而tmefb757在轻链中具有a91p修饰。残基根据kabat进行编号。tmeb675、tmeb762与tmeff2 ecd结合的动力学参数示于表4中。
[0625]
实施例4.抗
‑
tmeff2抗体的结构表征
[0626]
使用标准技术获得抗体的cdna序列和氨基酸翻译。在多肽序列测定中，一些编码可变区或全长抗体的抗体cdna用标准方法进行密码子优化以大规模表达。
[0627]
表5示出了选定抗
‑
tmeff2抗体的hcdr1和hcdr2氨基酸序列。
[0628]
表6示出了选定抗
‑
tmeff2抗体的hcdr3氨基酸序列。
[0629]
表7示出了选定抗
‑
tmeff2抗体的lcdr1和lcdr2氨基酸序列。
[0630]
表8示出了选定抗
‑
tmeff2抗体的lcdr3氨基酸序列。
[0631]
表9示出了选定抗
‑
tmeff2抗体的vh和vl氨基酸序列。
[0632]
表10示出了选定抗
‑
tmeff2抗体的重链和轻链的seq id no:。
[0633]
表11示出了选定抗
‑
tmeff2抗体的重链氨基酸序列。
[0634]
表12示出了选定抗
‑
tmeff2抗体的轻链氨基酸序列。
[0635]
表13示出了编码各种抗
‑
tmeff2抗体链的多核苷酸的seq id no:。
[0636]
表5.
[0637][0638]
表6.
[0639][0640]
表7.
[0641][0642]
表8.
[0643]
mablcdr3氨基酸lcdr3 seq id no:tmeb675lqdynyalt22tmeb570qqyghspit23tmeb674lqdynyslt24tmeb565lqdynyalt22tmeb762lqdynyplt86tmeb757lqdynyplt86
[0644]
表9.
[0645]
[0646][0647]
表10.
[0648][0649]
表11.
[0650]
[0651][0652]
表12.
[0653][0654]
表13.
[0655][0656]
seq id no:39(tmeb675 vh cdna)
[0657]
gaggtgcagctgctggaaagcggcggaggcctggtgcagagaggaggaagcctgagacccagctgtgccgccagcggcttcaccttcagcagctacagcatgagctgggtcaggcaggcccctggcaaaggactggagtgggtgagcgtgattagcggcagcggcggcttcaccgattacgccgacagcgtgaagggcaggttcaccatcagcagggacaatagcaagaacaccctgtacctgcacatgaacagcctgagggccgaggacaccgccgtgtactactgcgccaggatgcccctgaacagccctcacgactactggggccagggaaccctggtgaccgtgtccagc
[0658]
seq id no:40(tmeb570、tmeb565 vh cdna)
[0659]
caggtgcagctggtgcagagcggcgcggaagtgaaaaaaccgggcagcagcgtgaaagtgagctgcaaagcgagcggcggcaccttcagctcctattacattagctgggtgcgccaggcgccgggccagggcctggaatggatgggtggcattatcccaatcagtgggcgtgctaattatgcgcagaaatttcagggccgcgtgaccattaccgctgatgaaagcaccagcaccgcgtatatggaactgagcagcctgcgcagcgaagataccgcggtgtattattgcgcgcgcgacggctacagtagtggacgtagcacaacatacgcatttgactattggggccagggcaccctggtgaccgtgtcgagt
[0660]
seq id no:41(tmeb674 vh cdna)
[0661]
gaagtgcagctgctggagagcggaggaggactggtgcagcctcctggcggaagcctgagactgagctgcgccgctagcggcttcaccttcagcagctacagcatgagctgggtgagacaggctcctggcaagggcctggagtgggtgagcgtgatcagcggcggaggcagctttaccagctacgccgacagcgtgaagggcaggttcaccatcagcagggacaacagcaacaacaccctgtacctgcagatgagcagcctgagggccgaggacaccgccttctactactgcgccaggatgcccctgaacagcccccatgactgctggggacagggcaccctggtgaccgtgagcagc
[0662]
seq id no:42(tmeb675 vl cdna)
[0663]
gccatccagatgacccagagccctagcagcctgagcgctagcgtgggcgacagggtgaccatcacctgcagggccagccagggcatcagaaacgacctgggctggtaccagcagaagcccggcaaggcccccaagctgctgatctacgccgccagcagcctgcagagcggagtgcctagcaggttcagcggaagcggcagcggcaccgacttcaccctgaccatcagcagcctgcagcccgaggacttcgccacctactactgcctgcaggactacaactacgccctgacattcggcggcggcaccaaggtggagatcaag
[0664]
seq id no:43(tmeb570 vl cdna)
[0665]
gaaattgtgctgacccagagcccgggcaccctgagcctgagcccgggcgaacgcgcgaccctgagctgccgcgcgagccagagcgtttccacatactacctggcgtggtatcagcagaaaccgggccaggcgccgcgcctgctgatttacggtgcctcctatcgcgcgaccggcattccggatcgctttagcggcagcggttccggcaccgattttaccctgaccattagccgcctggaaccggaagattttgcggtgtattattgccagcagtacggtcacagcccgattacttttggccagggcaccaaagtggaaatcaaa
[0666]
seq id no:44(tmeb674 vl cdna)
[0667]
gccatccagatgacccagagccctagcagcctgagcgctagcgtgggcgacagggtgaccatcacctgcagggccagccagggcatcaggaacgacctgggctggtaccagcagaagcccggcaaggcccccaagctgctgatctacgccgccagcagcctgcagagcggagtgcctagcaggttcagcggcagcggaagcggcaccgacttcaccctgaccatctccagcctgcagcccgaggacttcgccacctactactgcctgcaggactacaactacagcctgaccttcggcggcggcaccaaggtggagatcagg
[0668]
seq id no:45(tmeb565 vl cdna)
[0669]
gaaattgtgctgacccagagcccgggcaccctgagcctgagcccgggcgaacgcgcgaccctgagctgccgcgcgagccagagcgttgccacctattatcttgcgtggtatcagcagaaaccgggccaggcgccgcgcctgctgatttacggtgcatcctcccgtgcgaccggcattccggatcgctttagcggcagcggttccggcaccgattttaccctgaccattagccgcctggaaccggaagattttgcggtgtattattgccagcagtacggctataacccaattacctttggccagggcaccaaagtggaaatcaaa
[0670]
seq id no:46(tmeb675 hc cdna)
[0671]
gaggtgcagctgctggaaagcggcggaggcctggtgcagagaggaggaagcctgagacccagctgtgccgccagcggcttcaccttcagcagctacagcatgagctgggtcaggcaggcccctggcaaaggactggagtgggtgagcgtgattagcggcagcggcggcttcaccgattacgccgacagcgtgaagggcaggttcaccatcagcagggacaata
gcaagaacaccctgtacctgcacatgaacagcctgagggccgaggacaccgccgtgtactactgcgccaggatgcccctgaacagccctcacgactactggggccagggaaccctggtgaccgtgtccagcgcttccaccaagggcccatccgtcttccccctggcgccctgctccaggagcacctccgagagcacagccgccctgggctgcctggtcaaggactacttccccgaaccggtgacggtgtcgtggaactcaggcgccctgaccagcggcgtgcacaccttcccggctgtcctacagtcctcaggactctactccctcagcagcgtggtgaccgtgccctccagcagcttgggcacgaaaacctacacctgcaacgtagatcacaagcccagcaacaccaaggtggacaagagagttgagtccaaatatggtcccccatgcccaccatgcccagcacctgaggccgccgggggaccatcagtcttcctgttccccccaaaacccaaggacactctcatgatctcccggacccctgaggtcacgtgcgtggtggtggacgtgagccaggaagaccccgaggtccagttcaactggtacgtggatggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagttcaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaacggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaaggcctcccgtcctccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagagccacaggtgtacaccctgcccccatcccaggaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctaccccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaggctaaccgtggacaagagcaggtggcaggaggggaatgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacacagaagagcctctccctgtctctgggtaaa
[0672]
seq id no:47(tmeb570、tmeb565 hc cdna)
[0673]
caggtgcagctggtgcagagcggcgcggaagtgaaaaaaccgggcagcagcgtgaaagtgagctgcaaagcgagcggcggcaccttcagctcctattacattagctgggtgcgccaggcgccgggccagggcctggaatggatgggtggcattatcccaatcagtgggcgtgctaattatgcgcagaaatttcagggccgcgtgaccattaccgctgatgaaagcaccagcaccgcgtatatggaactgagcagcctgcgcagcgaagataccgcggtgtattattgcgcgcgcgacggctacagtagtggacgtagcacaacatacgcatttgactattggggccagggcaccctggtgaccgtgtcgagtgcttccaccaagggcccatccgtcttccccctggcgccctgctccaggagcacctccgagagcacagccgccctgggctgcctggtcaaggactacttccccgaaccggtgacggtgtcgtggaactcaggcgccctgaccagcggcgtgcacaccttcccggctgtcctacagtcctcaggactctactccctcagcagcgtggtgaccgtgccctccagcagcttgggcacgaaaacctacacctgcaacgtagatcacaagcccagcaacaccaaggtggacaagagagttgagtccaaatatggtcccccatgcccaccatgcccagcacctgaggccgccgggggaccatcagtcttcctgttccccccaaaacccaaggacactctcatgatctcccggacccctgaggtcacgtgcgtggtggtggacgtgagccaggaagaccccgaggtccagttcaactggtacgtggatggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagttcaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaacggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaaggcctcccgtcctccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagagccacaggtgtacaccctgcccccatcccaggaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctaccccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaggctaaccgtggacaagagcaggtggcaggaggggaatgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacacagaagagcctctccctgtctctgggtaaa
[0674]
seq id no:48(tmeb674 hc cdna)
[0675]
gaagtgcagctgctggagagcggaggaggactggtgcagcctcctggcggaagcctgagactgagctgcgccgctagcggcttcaccttcagcagctacagcatgagctgggtgagacaggctcctggcaagggcctggagtgggtgagcgtgatcagcggcggaggcagctttaccagctacgccgacagcgtgaagggcaggttcaccatcagcagggacaacagcaacaacaccctgtacctgcagatgagcagcctgagggccgaggacaccgccttctactactgcgccaggatg
cccctgaacagcccccatgactgctggggacagggcaccctggtgaccgtgagcagcgcttccaccaagggcccatccgtcttccccctggcgccctgctccaggagcacctccgagagcacagccgccctgggctgcctggtcaaggactacttccccgaaccggtgacggtgtcgtggaactcaggcgccctgaccagcggcgtgcacaccttcccggctgtcctacagtcctcaggactctactccctcagcagcgtggtgaccgtgccctccagcagcttgggcacgaaaacctacacctgcaacgtagatcacaagcccagcaacaccaaggtggacaagagagttgagtccaaatatggtcccccatgcccaccatgcccagcacctgaggccgccgggggaccatcagtcttcctgttccccccaaaacccaaggacactctcatgatctcccggacccctgaggtcacgtgcgtggtggtggacgtgagccaggaagaccccgaggtccagttcaactggtacgtggatggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagttcaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaacggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaaggcctcccgtcctccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagagccacaggtgtacaccctgcccccatcccaggaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctaccccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaggctaaccgtggacaagagcaggtggcaggaggggaatgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacacagaagagcctctccctgtctctgggtaaa
[0676]
seq id no:49(tmeb675 lc cdna)
[0677]
gccatccagatgacccagagccctagcagcctgagcgctagcgtgggcgacagggtgaccatcacctgcagggccagccagggcatcagaaacgacctgggctggtaccagcagaagcccggcaaggcccccaagctgctgatctacgccgccagcagcctgcagagcggagtgcctagcaggttcagcggaagcggcagcggcaccgacttcaccctgaccatcagcagcctgcagcccgaggacttcgccacctactactgcctgcaggactacaactacgccctgacattcggcggcggcaccaaggtggagatcaagcgtacggtggctgcaccatctgtcttcatcttcccgccatctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctatcccagagaggccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactcccaggagagtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgagcaaagcagactacgagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtcacaaagagcttcaacaggggagagtgt
[0678]
seq id no:50(tmeb570 lc cdna)
[0679]
gaaattgtgctgacccagagcccgggcaccctgagcctgagcccgggcgaacgcgcgaccctgagctgccgcgcgagccagagcgtttccacatactacctggcgtggtatcagcagaaaccgggccaggcgccgcgcctgctgatttacggtgcctcctatcgcgcgaccggcattccggatcgctttagcggcagcggttccggcaccgattttaccctgaccattagccgcctggaaccggaagattttgcggtgtattattgccagcagtacggtcacagcccgattacttttggccagggcaccaaagtggaaatcaaacgtacggtggctgcaccatctgtcttcatcttcccgccatctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctatcccagagaggccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactcccaggagagtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgagcaaagcagactacgagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtcacaaagagcttcaacaggggagagtgt
[0680]
seq id no:51(tmeb674 lc cdna)
[0681]
gccatccagatgacccagagccctagcagcctgagcgctagcgtgggcgacagggtgaccatcacctgcagggccagccagggcatcaggaacgacctgggctggtaccagcagaagcccggcaaggcccccaagctgctgatctacgccgccagcagcctgcagagcggagtgcctagcaggttcagcggcagcggaagcggcaccgacttcaccctgaccatctccagcctgcagcccgaggacttcgccacctactactgcctgcaggactacaactacagcctgaccttcggcggc
ggcaccaaggtggagatcaggcgtacggtggctgcaccatctgtcttcatcttcccgccatctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctatcccagagaggccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactcccaggagagtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgagcaaagcagactacgagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtcacaaagagcttcaacaggggagagtgt
[0682]
seq id no:52(tmeb565 lc cdna)
[0683]
gaaattgtgctgacccagagcccgggcaccctgagcctgagcccgggcgaacgcgcgaccctgagctgccgcgcgagccagagcgttgccacctattatcttgcgtggtatcagcagaaaccgggccaggcgccgcgcctgctgatttacggtgcatcctcccgtgcgaccggcattccggatcgctttagcggcagcggttccggcaccgattttaccctgaccattagccgcctggaaccggaagattttgcggtgtattattgccagcagtacggctataacccaattacctttggccagggcaccaaagtggaaatcaaacgtacggtggctgcaccatctgtcttcatcttcccgccatctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctatcccagagaggccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactcccaggagagtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgagcaaagcagactacgagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtcacaaagagcttcaacaggggagagtgt
[0684]
seq id no:95(tmeb762 vh cdna)
[0685]
gaggtgcagctgctggaaagcggcggaggcctggtgcagcccggaggaagcctgagactcagctgtgccgccagcggcttcaccttcagcagctacagcatgagctgggtcaggcaggcccctggcaaaggactggagtgggtgagcgtgattagcggcagcggcggcttcaccgattacgccgacagcgtgaagggcaggttcaccatcagcagggacaatagcaagaacaccctgtacctgcagatgaacagcctgagggccgaggacaccgccgtgtactactgcgccaggatgcccctgaacagccctcacgactactggggccagggaaccctggtgaccgtgtccagc
[0686]
seq id no:96(tmeb762 vl cdna)
[0687]
gacatccagatgacccagagccctagcagcctgagcgctagcgtgggcgacagggtgaccatcacctgcagggccagccagggcatcagaaacgacctgggctggtaccagcagaagcccggcaaggcccccaagctgctgatctacgccgccagcagcctgcagagcggagtgcctagcaggttcagcggaagcggcagcggcaccgacttcaccctgaccatcagcagcctgcagcccgaggacttcgccacctactactgcctgcaggactacaactaccccctgacattcggcggcggcaccaaggtggagatcaag
[0688]
seq id no:97(tmeb762 hc cdna)
[0689]
gaggtgcagctgctggaaagcggcggaggcctggtgcagcccggaggaagcctgagactcagctgtgccgccagcggcttcaccttcagcagctacagcatgagctgggtcaggcaggcccctggcaaaggactggagtgggtgagcgtgattagcggcagcggcggcttcaccgattacgccgacagcgtgaagggcaggttcaccatcagcagggacaatagcaagaacaccctgtacctgcagatgaacagcctgagggccgaggacaccgccgtgtactactgcgccaggatgcccctgaacagccctcacgactactggggccagggaaccctggtgaccgtgtccagcgcttccaccaagggcccatccgtcttccccctggcgccctgctccaggagcacctccgagagcacagccgccctgggctgcctggtcaaggactacttccccgaaccggtgacggtgtcgtggaactcaggcgccctgaccagcggcgtgcacaccttcccggctgtcctacagtcctcaggactctactccctcagcagcgtggtgaccgtgccctccagcagcttgggcacgaaaacctacacttgcaacgtagatcacaagcccagcaacaccaaggtggacaagagagttgagtccaaatatggtcccccatgcccaccatgcccagcacctgaggccgccgggggaccatcagtcttcctgttccccccaaaacccaaggacactctcatgatctcccggacccctgaggtcacgtgcgtggtggtggacgtgagccaggaagaccccgaggtccagttcaactggtacgtggatggcgt
ggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagttcaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaacggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaaggcctcccgtcctccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagagccacaggtgtacaccctgcccccatcccaggaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctaccccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaggctaaccgtggacaagagcagatggcaggaggggaatgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacacagaagagcctctccctgtctctgggtaaa
[0690]
seq id no:98(tmeb762 lc cdna)
[0691]
gacatccagatgacccagagccctagcagcctgagcgctagcgtgggcgacagggtgaccatcacctgcagggccagccagggcatcagaaacgacctgggctggtaccagcagaagcccggcaaggcccccaagctgctgatctacgccgccagcagcctgcagagcggagtgcctagcaggttcagcggaagcggcagcggcaccgacttcaccctgaccatcagcagcctgcagcccgaggacttcgccacctactactgcctgcaggactacaactaccccctgacattcggcggcggcaccaaggtggagatcaagcgtacggtggctgcaccatctgtcttcatcttcccgccatctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctatcccagagaggccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactcccaggagagtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgagcaaagcagactacgagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtcacaaagagcttcaacaggggagagtgttag
[0692]
seq id no:99(tmeb757 vh cdna)gaggtgcagctgctggaaagcggcggaggcctggtgcagcccggaggaagcctgagactcagctgtgccgccagcggcttcaccttcagcagctacagcatgagctgggtcaggcaggcccctggcaaaggactggagtgggtgagcgtgattagcggcagcggcggcttcaccgattacgccgacagcgtgaagggcaggttcaccatcagcagggacaatagcaagaacaccctgtacctgcacatgaacagcctgagggccgaggacaccgccgtgtactactgcgccaggatgcccctgaacagccctcacgactactggggccagggaaccctggtgaccgtgtccagc
[0693]
seq id no:100(tmeb757 vl cdna)
[0694]
gccatccagatgacccagagccctagcagcctgagcgctagcgtgggcgacagggtgaccatcacctgcagggccagccagggcatcagaaacgacctgggctggtaccagcagaagcccggcaaggcccccaagctgctgatctacgccgccagcagcctgcagagcggagtgcctagcaggttcagcggaagcggcagcggcaccgacttcaccctgaccatcagcagcctgcagcccgaggacttcgccacctactactgcctgcaggactacaactaccccctgacattcggcggcggcaccaaggtggagatcaag
[0695]
seq id no:101(tmeb757 hc cdna)
[0696]
gaggtgcagctgctggaaagcggcggaggcctggtgcagcccggaggaagcctgagactcagctgtgccgccagcggcttcaccttcagcagctacagcatgagctgggtcaggcaggcccctggcaaaggactggagtgggtgagcgtgattagcggcagcggcggcttcaccgattacgccgacagcgtgaagggcaggttcaccatcagcagggacaatagcaagaacaccctgtacctgcacatgaacagcctgagggccgaggacaccgccgtgtactactgcgccaggatgcccctgaacagccctcacgactactggggccagggaaccctggtgaccgtgtccagcgcttccaccaagggcccatccgtcttccccctggcgccctgctccaggagcacctccgagagcacagccgccctgggctgcctggtcaaggactacttccccgaaccggtgacggtgtcgtggaactcaggcgccctgaccagcggcgtgcacaccttcccggctgtcctacagtcctcaggactctactccctcagcagcgtggtgaccgtgccctccagcagcttgggcacgaaaacctacacttgcaacgtagatcacaagcccagcaacaccaaggtggacaagagagttgagtccaaatatggtcccccatgcccaccatgcccag
tdftltisslqpedfatyyc lqdynyp
[0708]
seq id no:56(vkiii_a27框架)
[0709]
eivltqspgtlslspgeratlscrasqsvsssylawyqqkpgqaprlliygassratgipdrfsgsgsgtdftltisrlepedfavyycqqygssp
[0710]
实施例5.抗
‑
tmeff2抗体的表位作图
[0711]
使用h/d交换进行tmeb570和tmeb675的表位作图。在这些测定法中使用tmew1(seq id no:6)作为tmeff2的来源。
[0712]
通过添加130μl的4m盐酸胍、0.85m tcep缓冲液(终ph为2.5)并将混合物在10℃下温育3分钟，来使130μl对照缓冲液(50mm磷酸盐、100mm氯化钠，ph为7.4)中的10μg tmew1变性。然后使用内部填充的胃蛋白酶/蛋白酶xiii(w/w，1:1)柱(2.1mm
×
30mm)使混合物经受柱上胃蛋白酶/蛋白酶xiii消化。使用uplc
‑
ms系统分析所得的肽，该系统由waters acquity uplc偶联到q exactivetm混合四极
‑
轨道阱质谱仪(thermo)构成。在50mm
×
1mm c8柱上，梯度洗脱16.5分钟，从2％至34％的溶剂b(0.2％甲酸乙腈溶液)中分离肽。溶剂a为0.2％甲酸水溶液。注射阀和胃蛋白酶/蛋白酶xiii柱及其相关的连接管位于保持在10℃下的冷却箱内部。第二个切换阀、c8柱及其相关的不锈钢连接管位于另一保持在
‑
6℃下的冷却循环箱内部。通过采用mascot，针对tmew1序列搜索ms/ms数据进行肽鉴定。前体和产物离子的质量容差分别为7ppm和0.02da。
[0713]
将10μl的tmew1(5μg)、或10μl的tmew1和tmeb570或tmeb675混合物(5μg:15μg)与120μl的氧化氘标记缓冲液(50mm磷酸钠、100mm氯化钠，ph为7.4)一起在10℃下温育0秒、30秒、360秒、3600秒或14400秒。每个时间点的氢/氘(h/d)交换重复进行两次。通过添加130μl的4m盐酸胍、0.85m的tcep缓冲液(终ph为2.5)来淬灭氢/氘交换。随后，使淬灭的样本经受如上文所述的柱上胃蛋白酶/蛋白酶xiii消化和lc
‑
ms分析。质谱仅以ms模式记录。
[0714]
使用hdx workbench软件处理原始ms数据，以分析h/d交换ms数据(pascal等人，j.am.soc.mass spectrom.2012,23(9),1512
‑
1521)。用氘化肽与其天然形式(t0)之间的平均质量差值来计算氘水平。约97％
‑
99％的蛋白质可映射到特定肽。随着肽交换时间的推移，氘积聚曲线的斜率显示出显著差异。
[0715]
tmeb570表位：tmew1显示出在残基235
‑
249(残基根据seq id no:2进行编号)处氘吸收适当地降低，例如膜近侧区内的残基hgkcehsinmqepsc(seq id no:57)在与tmeb570结合时不发生h/d交换。
[0716]
tmeb675表位：tmew1显示出在残基252
‑
268(残基根据seq id no:2进行编号)处氘吸收适当地降低，例如膜近侧区内的残基dagytgqhcekkdysvl(seq id no:58)在与tmeb675结合时不发生h/d交换。
[0717]
因此，tmeb570 tmeff2表位残基涵盖hgkcehsinmqepsc(seq id no:57)，并且tmeb675表位残基涵盖dagytgqhcekkdysvl(seq id no:58)。两种抗体均结合膜近侧区内的tmeff2。
[0718]
实施例6.抗
‑
cd3抗体的生成
[0719]
抗
‑
cd3抗体cd3b219已在us9850310中有所描述。
[0720]
通过使omnirat(omt
tm
)免疫来生成另外的抗
‑
cd3抗体。筛选所获得的杂交瘤上清液与人和猕猴cd3
+ t淋巴细胞的结合，将克隆分离并测序，并且在一些情况下进一步工程
化。将抗
‑
cd3抗体克隆为各种同种型，包括具有s228p、f234a和l235a突变的效应子沉默igg4，或克隆为具有l234a、l235a、g237a、p238s、h268a、a330s和p331s突变的igg1。所生成的两种抗
‑
cd3抗体被命名为cd3b376和cd3b450。
[0721]
与抗原特异性靶臂杂交后，通过流式细胞术测定cd3b376和cd3b450对人t细胞的体外结合亲和力。对人t细胞进行初步研究以确定抗
‑
cd3示踪剂分子的饱和结合常数(kdt)。然后将固定浓度的示踪剂([t])与滴定浓度的测试mab用于竞争结合测定法。测试分子的ic
50
(实现50％抑制时的浓度)值用于使用下式确定结合亲和力(k
d
)：k
d
＝ic50/(1+([t]/k
d
t))。使用五名人供体测定示踪剂：可商购获得的alexafluor488 sp34
‑
2抗
‑
cd3(bioscience#557705)(数据未示出)的饱和结合常数(k
d
t)。
[0722]
测定示踪剂的饱和结合常数(k
d
t)
[0723]
方法：将人pan t细胞低温保存在氮气罐中直至使用。将t细胞解冻，用pbs洗涤，重悬于facs染色缓冲液中，计数(注明存活率)，并以0.5
×
106个细胞/ml重悬。以1μl/1
×
106个细胞加入far red live/dead染色剂(life technologies，aka invitrogen#l34974)(50μl的dmso到小瓶中)；并且将fcr阻滞剂(miltenyi biotec#130
‑
059
‑
901)(1ml的1:20稀释液/0.5
×
106个细胞)加入细胞中，各10分钟。将细胞以50,000个细胞/孔接种并洗涤。将递增浓度的alexafluor488 sp
‑
34抗
‑
cd3加入t细胞中，在4℃下保持2小时。洗涤细胞以除去未结合的抗体，固定15分钟，洗涤，并重悬于含有1mm edta的facs染色缓冲液中。
[0724]
使用ique intellicyte流式细胞仪测量结合。针对t细胞群，之后针对单细胞，之后针对活细胞(fl4)的细胞进行门控。测定每个孔的染色几何平均值(fl1)。
[0725]
将采集的平均荧光强度值作为抗体分子浓度的函数作图，并使用prism软件在单位点结合分析(总结合)中进行分析。该软件计算相应的k
d
值，该值描述抗体分子与受体(人pan t细胞上的cd3)的结合，该结合遵循质量作用定律。公式如下：y＝(b
max
×
x)/(k
d
+x)；其中：bmax为最大结合；k
d
是达到半最大结合所需的配体浓度。
[0726]
结果：推导出针对每名供体的k
d
值，并且获得平均值。推导出针对人t
‑
细胞的饱和结合常数(k
d
t)为5.6
±
1.0nm(n＝4)，并且将其用于前述公式中以确定k
d
结合亲和力。
[0727]
通过竞争测定法测定抗
‑
cd3 mab的结合亲和力
[0728]
竞争结合研究使用cd3b376和cd3b450进行。人pan t细胞用于测定mab的结合亲和力。所使用的示踪剂是可商购获得的alexafluor488 sp
‑
34抗
‑
cd3(bioscience#557705)并且该示踪剂的饱和结合常数如上所述。
[0729]
将t细胞低温保存在氮气罐中直至使用。将t细胞解冻，用pbs洗涤，重悬于facs染色缓冲液中，计数，注明存活率，并以0.5
×
106个细胞/ml重悬。以1μl/1
×
106个细胞加入far red live/dead染色剂(life technologies，aka invitrogen#l34974)(50μl的dmso到小瓶中)；并且将fcr阻滞剂(miltenyi biotec#130
‑
059
‑
901)(1ml的1:20稀释液/0.5
×
10^6个细胞)加入细胞中，各10分钟。将细胞以50,000个细胞/孔接种并洗涤。
[0730]
将mab(和同种型对照)从1000μg/ml或200μg/ml(2x)的起始浓度连续稀释1:2，并且将固定浓度的示踪剂(5μg/ml；2x)混合在一起以得到1x浓度。因此，示踪剂的最终(1x)浓度为2.5μg/ml＝16.6nm。将该混合物加入t细胞中，在4℃下保持2小时。然后洗涤细胞以除去未结合的抗体，固定15分钟，洗涤，并重悬于含有1mm edta的facs染色缓冲液中。
[0731]
使用ique intellicyte流式细胞仪测量结合。针对t细胞群，之后针对单细胞，之
后针对活细胞(fl4)的细胞进行门控。测定每个孔的染色几何平均值(fl1)。将采集的平均荧光强度值作为log抗体分子浓度(转化为nm)的函数作图，并使用prism软件在推导出ec50/ic50值(单位为nm)的s形剂量响应(可变斜率)中进行分析。使用以下公式推导出结合亲和力(k
d
)：k
d
＝ic50/(1+([t]/k
d
t))。其中：k
d
是竞争体的亲和力(未标记的分子)；测试化合物的ic50(单位为nm)；[t]为示踪剂的浓度(16.6nm)；k
d
t是通过饱和结合测定的示踪剂的k
d
(对于人为5.6nm)。
[0732]
cd3b376结合位点比二价和单价两种形式的cd3b450更紧密。
[0733]
表15.
[0734][0735]
cd3b219、cd3b376和cd3b450的cdr、vh和vl氨基酸序列示于表16中。
[0736]
表16.
[0737]
[0738][0739]
seq id no:76 cd3b219 hc；(igg4 s228p、f234a、l235a、f405l和r409k)
[0740]
evqlvesggglvqpggslrlscaasgftfntyamnwvrqapgkglewvarirskynnyatyyaasvkgrftisrddsknslylqmnslktedtavyycarhgnfgnsyvswfaywgqgtlvtvssastkgpsvfplapcsrstsestaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtktytcnvdhkpsntkvdkrveskygppcppcpapeaaggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvsqedpevqfnwyvdgvevhnaktkpreeqfnstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkglpssiektiskakgqprepqvytlppsqeemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfllyskltvdksrwqegnvfscsvmhealhnhytqkslslslgk
[0741]
seq id no:77 cd3b219 lcqtvvtqepsltvspggtvtltcrsstgavttsnyanwvqqkpgqaprgliggtnkrapgtparfsgsllggkaaltlsgvqpedeaeyycalwysnlwvfgggtkltvlgqpkaapsvtlfppsseelqankatlvclisdfypgavtvawkadsspvkagvetttpskqsnnkyaassylsltpeqwkshrsyscqvthegstvektvaptecs
[0742]
seq id no:78 cd3b376 hc(igg4 s228p、f234a、l235a、f405l和r409k)
[0743]
qvqlqqsgprlvrpsqtlsltcaisgdsvfnnnaawswirqspsrglewlgrtyyrskwlydyavsvksritvnpdtsrnqftlqlnsvtpedtalyycargysssfdywgqgtlvtvssastkgpsvfplapcsrstsestaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtktytcnvdhkpsntkvdkrveskygppcppcpapeaaggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvsqedpevqfnwyvdgvevhnaktkpreeqfnstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkglpssiektiskakgqprepqvytlppsqeemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfllyskltvdksrwqegnvfscsvmhealhnhytqkslslslgk
[0744]
seq id no:79 cd3b376 lc
[0745]
qsaltqpasvsgspgqsitisctgtssnigtykfvswyqqhpdkapkvllyevskrpsgvssrfsgsksgntasltisglqaedqadyhcvsyagsgtllfgggtkltvlgqpkaapsvtlfppsseelqankatlvclisdfypg
avtvawkadsspvkagvetttpskqsnnkyaassylsltpeqwkshrsyscqvthegstvektvaptecs
[0746]
表17示出了编码抗
‑
cd3抗体链的多核苷酸的seq id no:。
[0747]
表17
[0748][0749]
seq id no:105cd3b219 vh cdna
[0750]
gaagtgcagctggtggaatctggcggcggactggtgcagcctggcggatctctgagactgagctgtgccgccagcggcttcaccttcaacacctacgccatgaactgggtgcgccaggcccctggcaaaggcctggaatgggtggcccggatcagaagcaagtacaacaattacgccacctactacgccgcctccgtgaagggcagattcaccatcagccgggacgacagcaagaacagcctgtacctgcagatgaactccctgaaaaccgaggacaccgccgtgtactactgcgccagacacggcaacttcggcaacagctatgtgtcttggtttgcctactggggccagggcaccctcgtgaccgtgtcatct
[0751]
seq id no:106 cd3b219 vl cdna
[0752]
cagaccgtcgtgacccaggaacctagcctgaccgtgtctcctggcggcaccgtgaccctgacctgcagatcttctacaggcgccgtgaccaccagcaactacgccaactgggtgcagcagaagccaggccaggctcccagaggactgatcggcggcaccaacaagagagcccctggcacccctgccagattcagcggatctctgctgggaggaaaggccgccctgacactgtctggcgtgcagcctgaagatgaggccgagtactactgcgccctgtggtacagcaacctgtgggtgttcggcggaggcaccaagctgacagtgctg
[0753]
seq id no:80 cd3b219 hc cdna
[0754]
gaagtgcagctggtggaatctggcggcggactggtgcagcctggcggatctctgagactgagctgtgccgccagcggcttcaccttcaacacctacgccatgaactgggtgcgccaggcccctggcaaaggcctggaatgggtggcccggatcagaagcaagtacaacaattacgccacctactacgccgcctccgtgaagggcagattcaccatcagccgggacgacagcaagaacagcctgtacctgcagatgaactccctgaaaaccgaggacaccgccgtgtactactgcgccagacacggcaacttcggcaacagctatgtgtcttggtttgcctactggggccagggcaccctcgtgaccgtgtcatctgcttccaccaagggcccatccgtcttccccctggcgccctgctccaggagcacctccgagagcacagccgccctgggctgcctggtcaaggactacttccccgaaccggtgacggtgtcgtggaactcaggcgccctgaccagcggcgtgcacaccttcccggctgtcctacagtcctcaggactctactccctcagcagcgtggtgaccgtgccctccagcagcttgggcacgaaaacctacacctgcaacgtagatcacaagcccagcaacaccaaggtggacaagagagttgagtccaaatatggtcccccatgcccaccatgcccagcacctgaggccgccgggggaccatcagtcttcctgttccccccaaaacccaaggacactctcatgatctcccggacccctgaggtcacgtgcgtggtggtggacgtgagccaggaagaccccgaggtccagttcaactggtacgtggatggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagttcaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaacggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaaggcctcccgtcctccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagagccacaggtgtacaccctgcccccatcccaggaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctaccccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcctcctctacagcaagctaaccgtggacaagagcaggtggcaggaggggaatgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacacagaagagcctctccctgtctctgggtaaa
[0755]
seq id no:81 cd3b219 lc cdna
[0756]
cagaccgtcgtgacccaggaacctagcctgaccgtgtctcctggcggcaccgtgaccctgacctgcagatcttctacaggcgccgtgaccaccagcaactacgccaactgggtgcagcagaagccaggccaggctcccagaggactgatcggcggcaccaacaagagagcccctggcacccctgccagattcagcggatctctgctgggaggaaaggccgccctgacactgtctggcgtgcagcctgaagatgaggccgagtactactgcgccctgtggtacagcaacctgtgggtgttcggcggaggcaccaagctgacagtgctgggtcagcccaaggctgcacccagtgtcactctgttcccgccctcctctgaggagcttcaagccaacaaggccacactggtgtgtctcataagtgacttctacccgggagccgtgacagtggcctggaaggccgatagcagccccgtcaaggcgggagtggagaccaccacaccctccaaacaaagcaacaacaagtacgcggccagcagctatctgagcctgacgcctgagcagtggaagtcccacagaagctacagctgccaggtcacgcatgaagggagcaccgtggagaagacagtggcccctacagaatgttca
[0757]
seq id no:107 cd3b376 vh cdna
[0758]
caggtgcagctgcagcagtctggccctagactcgtgcggccttcccagaccctgtctctgacctgtgccatctccggcgactccgtgttcaacaacaacgccgcctggtcctggatccggcagagcccttctagaggcctggaatggctgggccggacctactaccggtccaagtggctgtacgactacgccgtgtccgtgaagtcccggatcaccgtgaaccctgacacctcccggaaccagttcaccctgcagctgaactccgtgacccctgaggacaccgccctgtactactgcgccagaggctactcctcctccttcgactattggggccagggcaccctcgtgaccgtgtcctct
[0759]
seq id no:108 cd3b376 vl cdna
[0760]
agtctgctctgacccagcctgcctccgtgtctggctctcccggccagtccatcaccatcagctgtaccggcacctcctccaacatcggcacctacaagttcgtgtcctggtatcagcagcaccccgacaaggcccccaaagtgctgctgtacgaggtgtccaagcggccctctggcgtgtcctccagattctccggctccaagtctggcaacaccgcctccctgaccatcagcggactgcaggctgaggaccaggccgactaccactgtgtgtcctacgctggctctggcaccctgctgtttggcggaggcaccaagctgaccgtgctg
[0761]
seq id no:82 cd3b376 hc cdna
[0762]
caggtgcagctgcagcagtctggccctagactcgtgcggccttcccagaccctgtctctgacctgtgccatctccggcgactccgtgttcaacaacaacgccgcctggtcctggatccggcagagcccttctagaggcctggaatggctgggccggacctactaccggtccaagtggctgtacgactacgccgtgtccgtgaagtcccggatcaccgtgaaccctgacacctcccggaaccagttcaccctgcagctgaactccgtgacccctgaggacaccgccctgtactactgcgccagaggctactcctcctccttcgactattggggccagggcaccctcgtgaccgtgtcctctgcttccaccaagggcccatccgtcttccccctggcgccctgctccaggagcacctccgagagcacagccgccctgggctgcctggtcaaggactacttccccgaaccggtgacggtgtcgtggaactcaggcgccctgaccagcggcgtgcacaccttcccggctgtcctacagtcctcaggactctactccctcagcagcgtggtgaccgtgccctccagcagcttgggcacgaaaacctacacctgcaacgtagatcacaagcccagcaacaccaaggtggacaagagagttgagtccaaatatggtcccccatgcccaccatgcccagcacctgaggccgccgggggaccatcagtcttcctgttccccccaaaacccaaggacactctcatgatctcccggacccctgaggtcacgtgcgtggtggtggacgtgagccaggaagaccccgaggtccagttcaactggtacgtggatggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagttcaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaacggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaaggcctcccgtcctccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagagccacaggtgtacaccctgcccccatcccaggaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctaccccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcctcctctacagc
aagctaaccgtggacaagagcaggtggcaggaggggaatgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacacagaagagcctctccctgtctctgggtaaa
[0763]
seq id no:83 cd3b376 lc cdna
[0764]
cagtctgctctgacccagcctgcctccgtgtctggctctcccggccagtccatcaccatcagctgtaccggcacctcctccaacatcggcacctacaagttcgtgtcctggtatcagcagcaccccgacaaggcccccaaagtgctgctgtacgaggtgtccaagcggccctctggcgtgtcctccagattctccggctccaagtctggcaacaccgcctccctgaccatcagcggactgcaggctgaggaccaggccgactaccactgtgtgtcctacgctggctctggcaccctgctgtttggcggaggcaccaagctgaccgtgctgggtcagcccaaggctgcacccagtgtcactctgttcccgccctcctctgaggagcttcaagccaacaaggccacactggtgtgtctcataagtgacttctacccgggagccgtgacagtggcctggaaggccgatagcagccccgtcaaggcgggagtggagaccaccacaccctccaaacaaagcaacaacaagtacgcggccagcagctatctgagcctgacgcctgagcagtggaagtcccacagaagctacagctgccaggtcacgcatgaagggagcaccgtggagaagacagtggcccctacagaatgttca
[0765]
实施例7.双特异性tmeff2xcd3抗体的生成
[0766]
选定单特异性抗
‑
tmeff2和抗
‑
cd3抗体表示为igg4/κ。在抗
‑
cd3抗体中进行f405l和r409k置换(eu编号)，而抗
‑
tmeff2抗体具有野生型igg4。除了位置405和409置换之外，igg4 mab被工程化为具有s228p、f234a和l235a置换。
[0767]
使用蛋白质a柱(hitrap mabselect sure柱)使用标准方法表达并纯化单特异性抗体。洗脱后，将收集物透析至d
‑
pbs(ph 7.2)。
[0768]
通过在体外fab臂交换中组合单特异性tmeff2 mab和单特异性cd3mab来生成双特异性tmeff2xcd3抗体，如国际专利公开wo2011/131746中所述。简而言之，将约1
‑
20mg/ml的每种抗体的pbs溶液(ph 7
‑
7.4)和75mm 2
‑
巯基乙醇胺(2
‑
mea)以摩尔比1:1混合在一起并在25
‑
37℃下温育2
‑
6小时，之后采用标准方法通过透析、渗滤、切向流过滤和/或旋转细胞过滤除去2
‑
mea。
[0769]
在体外fab臂交换之后，使用疏水相互作用色谱法进一步纯化双特异性抗体，以使用标准方法最大程度减少残余的亲本抗
‑
tmeff2和抗
‑
cd3抗体。
[0770]
表18和表19示出了所生成的双特异性抗体。
[0771]
表18.
[0772]
[0773]
表19.
[0774][0775]
实施例8.双特异性tmeff2
×
cd3抗体的表征
[0776]
通过分析超速离心进行纯度分析(auc)
[0777]
分析超速离心(auc)允许测定溶液中大分子的尺寸、形状、聚集状态和可逆相互作用。沉降速度(sv)是一种auc技术，该技术允许大分子的浓度梯度在离心机旋转时移动到样品夹持器(池)的外半径。这实现沉降系数的测定，该沉降系数是分子的尺寸和形状的因子，并且对于每种分子均是独特的。出于此目的，使用beckman optima auc仪器。将样本装载到配备有1.2cm beckman中心件(额定为50krpm)和石英窗的离心池中。将离心池装配并扭转至130lbs。将离心池置于an
‑
50(8孔)或an
‑
60(4孔)转子中并置于auc室内。在开始运行之前，利用室中的转子将auc的温度平衡至20.5℃并持续至少一小时。对于mab样品，按以下设置来运行：40k rpm，扫描计数(250次扫描)、扫描收集频率(90秒)、数据分辨率(10μm)、280nm波长。使用直接边界拟合软件sedanal分析数据。测量双特异性抗体tmcb150及其亲本mab的纯度。tmcb150显示出97.1％的单体、2.8％的二聚体单体并且不聚集，如通过auc满足瞬时表达的研究材料的可接受标准以用于进一步生物物理表征所测定的。tmeb762显示出95.5％单体、4.5％二聚体并且无聚集，而cd3b376显示出97.7％单体和2.2％二聚体，且无聚集。最少两步纯化分子的>5％的聚集体水平可对生物活性、溶解度、稳定性和储存寿命具有显著影响。
[0778]
通过dsc测定的抗
‑
tmeff2/cd3双特异性抗体的构象稳定性
[0779]
通过dsc(差示扫描量热法)测定tmcb150热解折叠，dsc显示在解折叠开始时tm＝52.6℃，第一热转变(tm1)为61.8℃，第二热转变(tm2)为67.6℃，并且第三热转变(tm3)为75.5℃。基于如通过之前dsc所评估的亲本抗体(抗
‑
tmeff2、tmeb762和抗
‑
cd3、cd3b376)的热转变特征，tmcb150的tm1对应于cd3b376 fab解折叠，并且tmcb150的tm3对应于tmeb762 fab解折叠转变。
[0780]
血清稳定性
[0781]
开发血清稳定性测定法以评估非特异性或脱靶结合至人血清组分的前导候选物
的特性。这可预测较差的药代动力学和生物分布特性。使用基于荧光的色谱法在缓冲液和人血清两者中评估tmcb150的结合和稳定性。用alexa fluor 488缀合物(invitrogen试剂盒，根据制造商的说明)标记双特异性抗体，将其在hepes缓冲液和人血清(sigma，目录号h4522)中在4℃和37℃下温育2天，然后使用配备有荧光检测器的agilent hplc系统通过sec
‑
hplc进行分析。由每个峰曲线下面积的积分计算聚集体百分比。tmcb150在时间零点在hepes缓冲液中显示出2.4％聚集，并且在4℃和37℃下两天后分别显示出2.0％和1.3％聚集。在人血清中，tmcb150在时间零点显示出1.7％聚集，并且在4℃和37℃下两天后显示出1.1％聚集。
[0782]
非特异性结合
[0783]
通过生物传感器技术(biacore 8k)测定前导分子与不相关表面的非特异性结合。使抗体在涂覆有不相关蛋白质的spr表面上通过。如果抗体显示出与这些不相关表面的显著结合，则预测该抗体具有较差的体内特性并且表现出制造难题。在1μm的最终浓度下测试前导分子。不相关的表面包括带负电的蛋白质(大豆胰蛋白酶抑制剂)、带正电的蛋白质(溶菌酶和β
‑
防御素)、疏水性蛋白质(rh
‑
整联蛋白a4b7)、人igg、粘性蛋白质(rh
‑
cd19)。在该实验中使用适当的对照。前导分子在两个表面上流动，一个表面是空白，另一个表面具有直接固定的分子。响应单元(ru)水平通过从测试表面ru中减去空白ru来确定。tmcb150和亲本mab的ru在下表中给出。响应单位≥100预测非特异性结合至带电/疏水性/igg表面的风险高，这将在制造期间产生挑战并转化为不良pk特性。无一种抗体显示出与不相关表面的非特异性结合，这预测制造和体内行为的风险低至无风险。
[0784]
表20.
[0785] stiβ
‑
防御素
‑
3人igg溶菌酶rh
‑
整联蛋白a4b7rh
‑
cd19tmcb1501.66.47.54.203.4tmeb76204.18.44.603.3cd3b37619.53.10.40.200
[0786]
高浓度稳定性
[0787]
许多单克隆抗体以高浓度(≥100mg/ml)配制以减小注射体积，从而有利于皮下施用。此外，所有单克隆抗体在纯化过程中暴露于瞬时高浓度(≥50mg/ml)。因此，高浓度稳定性是这些分子的关键质量属性。使用具有30kda mwco膜的离心超滤装置进行浓缩。将5.1mg至5.3mg的每种蛋白质初始稀释至相同的起始浓度并以4000
×
g以15分钟的间隔离心。在每个15分钟离心步骤结束时，将浓缩器从离心机中取出并记录剩余样本体积的视觉估计。通过solovpe仪器测量浓度。将浓缩的样本在4℃和40℃下温育2周，并且每隔一段时间抽取等分试样以通过分析sec检查完整性。将tmcb150和亲本mab(cd3b376和tmeb762)正常浓缩。tmcb150的最终浓度为99.4mg/ml，并且亲本mab的最终浓度为52.2mg/ml(tmeb762)和52.6mg/ml(cd3b376)。在4℃和40℃下，在2周内浓度保持相同，这表明分子具有良好的固有特性，没有聚集或吸附到eppendorf管的可能性。如由sec峰积分测量的物质％(a：聚集体；m：单体；f：片段)提供于下表中。在高浓度下，在40℃下保存2周之后，分子是完整的，具有4
‑
5％的聚集体和≤0.3％的片段，这预测良好的储存寿命。
[0788]
表21.
[0789][0790]
通过动力学排斥测定法(kinexa)测定的抗
‑
tmeff2/cd3双特异性抗体的亲和力
[0791]
使用kinexa 3200仪器(sapidyne instruments,inc.)来测量双特异性mab tmcb150及其二价tmeff2亲本tmeb762 mab与人tmeff2胞外域(ecd)的溶液平衡亲和力k
d
。在ph为7.4的10mm hepes、150mm nacl、0.05％表面活性剂p20、0.1％bsa和0.02％nan3中用恒定浓度的抗
‑
tmeff2 mab制备人tmeff2胞外域(ecd)的系列稀释液。将反应混合物在rt下温育直至结合相互作用达到平衡。使用kinexa软件模拟确定温育的持续时间。通过在由双丙烯酰胺/吖内酯共聚物(pierce biotechnology,inc.)构成的预活化珠上通过氨基偶联直接共价固定tmeff2
‑
ecd来制备珠。温育后，在kinexa仪器上运行样本，以通过使混合物通过tmeff2修饰的珠并使用荧光标记的二次抗体检测捕集的抗体来评估混合物中的游离抗体。使用kinexa pro软件，以1:1结合模型拟合数据。
[0792]
表22.
[0793]
mab样本k
d
pm95％ci，k
d
pmtmcb15063.655.8
‑
71.9tmeb76246.138.0
‑
55.1
[0794]
抗
‑
tmeff2/cd3双特异性抗体与n
‑
末端cd3ε肽的结合亲和力的测量
[0795]
通过使用biacore 8k(ge healthcare)和抗人fc生物传感器表面进行的spr测量动力学速率常数。将抗人免疫球蛋白抗体共价偶联到cm4传感器芯片(ge healthcare)的表面。在抗人免疫球蛋白传感器芯片上捕集所关注的抗体，之后在含有0.05％表面活性剂p20(tween
tm 20)和100μg/ml bsa的hepes缓冲盐水中注射不同浓度的n
‑
末端cd3ε肽。以100μl/min的速率两次脉冲注射30μl 0.8％磷酸，使表面再生。所报告的数据是含有所捕集抗体的流动池与不含捕集抗体的参考池之间的spr信号的差异。通过从扣除参考的信号中减去空白注射的数据来除去对信号的额外仪器贡献。通过使用biaevaluation软件(biacore,inc.)，用1:1结合模型拟合所有浓度下的缔合相和解离相(全局拟合)来分析数据。将数据报告为平均值+95％ci(置信区间)，其通过95％ci的t值*标准差/平行测定数目的平方根计算。
[0796]
表23.
[0797][0798]
实施例9.双特异性tmeff2xcd3抗体在t
‑
细胞介导的前列腺癌细胞杀伤中是有效的。
[0799]
体外t细胞介导的前列腺癌细胞杀伤。
[0800]
评估选定双特异性tmeff2xcd3抗体介导t
‑
细胞介导的前列腺癌细胞杀伤的能力。
[0801]
使用半胱天冬酶细胞毒性测定法测量t
‑
细胞介导的tmeff2xcd3双特异性抗体的杀伤，该测定法通过活性半胱天冬酶3/7裂解荧光底物来间接测量细胞杀伤。底物的裂解产生荧光dna染料，其中荧光局限于细胞核。在整个测定过程中，使用能够在相同坐标下对孔精确成像的10x机动物镜，在每个孔中进行重复荧光测量。基于限定的尺寸限制和/或通过使用第二标记来鉴别靶细胞群。
[0802]
通过阴性选择从正常健康供体中分离冷冻的pan cd3
+ t细胞(biological specialty corporation,colmar,pa)。将表达tmeff2的前列腺癌细胞(lncap
‑
ar)在具有10％hi fbs+补充剂的rpmi 1640(life technologies)中培养。在无选择试剂的情况下，将t细胞和靶细胞在无酚红rpmi+10％fbs和补充剂(life technologies)中以3:1的效应子与靶标比率(e:t)组合，并且根据制造商指导将0.6μl nucview半胱天冬酶试剂(essen bioscience)添加至每ml细胞中。将总体积为0.1ml的细胞添加至透明的96孔平底板(bd falcon)的适当孔中。在如上所示制备的无酚红rpmi中以2x最终浓度制备tmeff2xcd3双特异性抗体，并将0.1ml的化合物添加至每个孔。在室温下温育30分钟以最大程度减少孔边缘处的细胞聚集之后，将板转移至保持在37℃、5％co2下的zoom incucyte仪器(essen bioscience)中。
[0803]
根据制造指南为所测试的每种细胞系设计incucyte上的加工定义。每六小时进行测量，直到观察到半胱天冬酶信号中的平台，之后是从含有最高浓度的测试化合物的孔中的最大信号开始的三次或更多次连续减小。
[0804]
在完成测定之后，使用适当的处理定义来分析每块板。从incucyte zoom软件导出原始荧光数据，并将其粘贴到graphpad prism(graphpad software,inc.,la jolla,ca)中。通过计算graphpad中每个孔的曲线下面积(auc)来确定半胱天冬酶3/7活性。将auc值作为log10 nm化合物的函数作图。在非线性回归分析(4参数拟合，最小二乘法)之后报告以纳摩尔(nm)为单位的每条剂量曲线的ec50。每个测定含有最少三个生物平行测定样，并且使用来自五名健康供体的t细胞测试每种细胞系。使用非线性回归模型通过非临床统计进一步分析数据。
[0805]
图3示出了通过选定双特异性tmeff2xcd3抗体所致的如通过半胱天冬酶3/7活性增大测量的随时间推移lncap细胞的杀伤。
[0806]
双特异性tmeff2xcd3抗体在体内前列腺癌肿瘤模型中是有效的
[0807]
在雄性nsg小鼠中在离体lncap前列腺癌模型中测试选定双特异性抗体。对于该研究，在第0天通过皮下注射将在0.2ml/动物中的106个lncap细胞的50％cultrex溶液施用于右胁腹。当肿瘤达到约100
‑
150mm3体积时，将动物随机化，并且在第15天时腹膜注射206个t细胞/小鼠。每组十只动物。在注射t细胞后1
‑
3天开始用抗体处理。抗体经腹膜施用，每周两次。在给药之前，所有动物均接受ivig+fc阻断剂。评估肿瘤体积和体重，每周两次，直到肿瘤达到约1200mm3。处理组示于表24中。在这些测定中使用cd3xnull抗体作为阴性对照，该抗体具有cd3b219 cd3结合臂和结合hivgp120的空臂。
[0808]
表24.
[0809]
组处理剂量1cd3xnull5mg/kg2tmcb93(tmeb675
×
cd3b219)5mg/kg
3tmcb93(tmeb675
×
cd3b219)0.5mg/kg4tmcb101(tmeb570
×
cd3b219)5mg/kg5tmcb101(tmeb570
×
cd3b219)0.5mg/kg6tmcb131(tmeb570
×
cd3b376)5mg/kg7tmcb131(tmeb570
×
cd3b376)0.5mg/kg8tmcb132(tmeb675
×
cd3b376)5mg/kg9tmcb132(tmeb675
×
cd3b376)0.5mg/kg
[0810]
表25示出了肿瘤移植后第38天时每一组的肿瘤生长抑制百分比。
[0811]
图4示出了肿瘤移植后平均肿瘤体积随时间推移而减小。图5a示出了用0.5mg/kg tmcb93处理的每只小鼠的平均肿瘤体积的减小。图5b示出了用0.5mg/kg tmcb132处理的每只小鼠的平均肿瘤体积的减小。
[0812]
表25.
[0813]
处理第38天时的tgi％cnto7008(null
×
cd3) tmcb93(tmeb675
×
cd3b219)5mg/kg83.9tmcb93(tmeb675
×
cd3b219)0.5mg/kg75.6tmcb132(tmeb675
×
cd3b37)5mg/kg48tmcb132(tmeb675
×
cd3b376)0.5mg/kg47.7tmcb101(tmeb570
×
cd3b219)5mg/kg25tmcb101(tmeb570
×
cd3b219)0.5mg/kg38.3tmcb131(tmeb570
×
cd3b376)5mg/kg23.3tmcb131(tmeb570
×
cd3b376)0.5mg/kg35
[0814]
在用20e6个t细胞人源化的雄性nod.cg
‑
prkdc
scid il2rg
tm1wjl
/szj(nsg)小鼠中的已建立lncap异种移植物中评估了tmeb762xcd3b376(tmcb150)的功效。在肿瘤移植后第13天时，通过平均肿瘤体积将动物随机分成各10只动物的组。将0.5、0.1和0.05mg/kg的tmeb762xcd3b376或0.5mg/kg的nullxcd3b376抗体对照ip给药，每周两次，持续5周。在肿瘤移植后第35天时，当每组保留至少八只动物时，计算由肿瘤体积确定的肿瘤生长抑制(％tgi)。与nullxcd3对照(图6)相比，用0.5mg/kg和0.1mg/kg，而不是0.05mg/kg的tmeb762xcd3b376观察到统计意义上显著的肿瘤生长抑制。与nullxcd3处理的对照相比，0.5mg/kg、0.1mg/kg和0.05mg/kg的tmeb762xcdb376分别引发110％、88％和25％的肿瘤生长抑制。0.5mg/kg和0.1mg/k的tmeb762xcdb376处理分别导致七个和三个完全应答。通过卡尺测量皮下lncap肿瘤，每周两次，结果表示为平均肿瘤体积(mm3)
±
sem(每组剩余≥8只小鼠)。
[0815]
响应于施用tmcb132的t细胞活化
[0816]
通过流式细胞术测量lncap前列腺癌细胞中的t细胞活化，具体地通过评估用tmcb132处理后72小时的6名单独的正常健康供体(9642、9672、9762、9772、9832、9852)中cd3+/cd8+ t细胞的cd25阳性来测量(图7)。响应于在lncap前列腺癌细胞上施用tmcb132，观察到以3:1的效应子:靶标比率添加的cd3+pan
‑
t细胞的活化。
[0817]
体外tmcb132的t细胞介导的细胞毒性。
[0818]
使用t细胞介导的细胞毒性测定法，使用incucyte平台上的实时时光流逝成像来评估体外tmcb132的潜在细胞毒性。在来自健康供体的分离的pan人cd3+ t细胞的存在下，以3:1的(效应子:靶标)效应子:靶标比率(e:t比率)在tmeff2阳性细胞系lncap中测试tmcb132。通过在96小时的时间段内测量活性半胱天冬酶
‑
3/7的荧光信号来监测凋亡引起的细胞死亡。随着时间的增加，tmcb132促进活lncap细胞的剂量依赖性减少。半胱天冬酶
‑
3/7活性或荧光信号的剂量依赖性增强表明在存在t细胞的情况下lncap细胞中的细胞死亡(图8)。数据表明，tmcb132在诱导lncap肿瘤细胞中t细胞介导的死亡方面是有效的。
[0819]
tmcb132在t
‑
细胞人源化小鼠中已建立sc人前列腺异种移植物中的功效。
[0820]
在用20e6个t细胞人源化的雄性nod.cg
‑
prkdcscid il2rgtm1wjl/szj(nsg,the jackson laboratory,bar harbor,me)小鼠中的已建立皮下(sc)人前列腺lncap异种移植物中评估tmcb132的抗肿瘤功效。nsg雄性。在肿瘤移植后第13天时，通过平均肿瘤体积将动物随机分成各10只动物的组。将0.5mg/kg、0.1mg/kg和0.05mg/kg的tmcb132或0.5mg/kg的nullxcd3b219抗体对照ip给药，每周两次，持续4周。在肿瘤移植后第45天时，当每组保留至少七只动物时，计算由肿瘤体积确定的肿瘤生长抑制(％tgi)。与nullxcd3对照(图9，p≤0.0001)相比，用0.5mg/kg和0.1mg/kg和0.05mg/kg的tmcb132观察到统计意义上显著的肿瘤生长抑制。与nullxcd3处理的对照相比，0.5mg/kg、0.1mg/kg和0.05mg/kg的tmcb132分别引发102％、109％和47％的肿瘤生长抑制。0.5mg/kg、0.1mg/kg和0.05mg/kg的tmcb132处理分别导致三个、两个和一个完全应答。