新型猪链球菌噬菌体STR-SUP-2及其在抑制猪链球菌细菌增殖方面的用途的制作方法

新型猪链球菌噬菌体str-sup-2及其在抑制猪链球菌细菌增殖方面的用途
技术领域
[0001]
本发明涉及一种从自然界分离出的噬菌体，该噬菌体感染猪链球菌，从而杀死猪链球菌，本发明还涉及一种使用包含上述噬菌体作为活性成分的组合物来预防和治疗由猪链球菌引起的疾病的方法。更具体地，本发明涉及一种从自然界分离出的长尾噬菌体科噬菌体str-sup-2(保藏号：kctc 13515bp)，其具有杀死猪链球菌的能力，并且具有由seq id no:1表示的基因组，本发明还涉及一种使用包含上述噬菌体作为活性成分的组合物来预防或者治疗由猪链球菌引起的疾病的方法。


背景技术：

[0002]
猪链球菌是一种花生形革兰氏阳性细菌，且已知猪链球菌感染是一种在世界范围内出现的重大动物源性疾病。根据荚膜抗原(capsular,k)将猪链球菌细菌分为29种血清型。基于全世界猪链球菌细菌的血清型报告，血清型1至9的分布较广，约占其总数的75％，且在大多数国家，已知血清型2是从致病猪体内分离出的最常见的血清型。
[0003]
同时，感染猪链球菌的猪主要表现出厌食、嗜睡、出疹、发烧和麻痹的症状。特定地，在育肥猪中可出现诸如肺炎等的呼吸道感染，从而给猪养殖业造成严重的经济损失。另外，猪链球菌是导致猪患上脑膜炎、败血症、关节炎、心内膜炎和阴道炎的已知主要病原体，并且在世界范围(包括韩国、北美、欧洲等)内已报道了猪链球菌的爆发。因此，急需研发出可用于预防和治疗猪链球菌感染的方法。
[0004]
虽然已经使用各种抗生素来预防或者治疗由猪链球菌引起的疾病，但是目前，细菌对这种抗生素的耐药性日益增强，因此急需研发出除了抗生素之外的其他方法。
[0005]
最近，使用噬菌体作为应对感染性细菌疾病的对策引起了广泛关注。尤其是，这些噬菌体由于具有对抗耐抗生素细菌的强抗菌活性而受到极大的关注。噬菌体是感染细菌的很小的微生物。一旦噬菌体感染了细菌，该噬菌体就会在该细菌细胞内增殖。在增殖之后，该噬菌体的后代会破坏该细菌细胞壁并且从该宿主细菌中逸出，这表明该噬菌体具有杀死细菌的能力。该噬菌体感染细菌的方式的特征在于其具有非常高的特异性，因此，感染某种特定细菌的噬菌体类型的范围有限。即，某种噬菌体只能感染某种特定的细菌，这表示某种噬菌体只能针对某种特定细菌产生抗菌作用。由于噬菌体的这种细菌特异性，噬菌体只对目标细菌具有抗菌作用，而不影响环境中或者动物体内的共生细菌。已经被广泛用于细菌治疗的常规抗生素会顺带影响许多其他种类的细菌，这导致诸如污染环境和干扰动物体内正常菌群等问题。对比之下，使用噬菌体不会干扰动物体内的正常菌群，因为目标细菌是通过使用噬菌体来选择性地杀死的。因此，可以安全地利用噬菌体，这样一来，与抗生素相比较，大大减少了使用噬菌体会产生不利影响的可能性。
[0006]
噬菌体最初由英国细菌学家twort于1915年发现，当时他注意到微球菌菌落由于未知的某物而被软化并且变得透明。在1917年，法国细菌学家d'herelle发现痢疾患者粪便滤液中的痢疾志贺氏菌被某物破坏，并且对该现象进行了进一步研究。结果他独立鉴定出
了噬菌体，并且将其命名为“噬菌体”，意为“细菌吞噬者”。自此以后，对诸如志贺氏菌、伤寒链球菌和霍乱弧菌等致病菌起作用的噬菌体被不断地鉴定出来。
[0007]
由于噬菌体杀死细菌的独特能力，噬菌体自被发现以来就作为一种应对细菌感染可能的有效对策引起了关注，并且已经进行了许多与之相关的研究。然而，自弗莱明发现青霉素以来，由于抗生素的普遍传播，有关噬菌体的研究仅在一些东欧国家和前苏联仍继续进行。自2000年以来，由于耐抗生素细菌的增加，常规抗生素的局限性已经变得显而易见，研发噬菌体作为常规抗生素的替代品的可能性已经突显，因此，作为抗菌剂的噬菌体再次引起关注。
[0008]
如上所述，噬菌体往往对目标细菌具有高度特异性。由于噬菌体对细菌的高度特异性，即使在相同的物种内，噬菌体通常也只对某些细菌菌株表现出抗菌作用。另外，噬菌体的抗菌强度会根据目标菌株而变化。因此，为了有效地控制特定细菌，有必要收集多种有用的噬菌体。因此，为了研发出一种用于控制猪链球菌的有效的噬菌体利用方法，必须获得对猪链球菌表现出抗菌作用的多种噬菌体。此外，需要从所得到的噬菌体中筛选出在抗菌强度和光谱方面优于其他噬菌体的噬菌体。


技术实现要素：

技术问题
[0009]
因此，本发明的发明人致力于研发一种适用于使用从自然界分离出的并且能够杀死猪链球菌的噬菌体来预防和治疗由猪链球菌引起的疾病的组合物，并且进一步致力于建立一种使用该组合物来预防和治疗由猪链球菌引起的疾病的方法。其结果是，本发明的发明人从自然界分离出了一种适于该目的的噬菌体，并且确定了将分离出的噬菌体与其他噬菌体区别开来的基因组序列。之后，本发明的发明人研发出一种包含噬菌体作为活性成分的组合物，并且确定了该组合物能够有效地用于预防和治疗由猪链球菌引起的疾病，由此形成本发明。
[0010]
因此，本发明的一个目的是提供一种从自然界分离出的长尾噬菌体科噬菌体str-sup-2(保藏号：kctc 13515bp)，其具有杀死猪链球菌的能力，并且具有由seq id no:1表示的基因组。
[0011]
本发明的另一目的是提供一种适用于预防或者治疗由猪链球菌引起的疾病的组合物，该组合物包含分离出的噬菌体str-sup-2(保藏号：kctc 13515bp)作为活性成分，该分离出的噬菌体str-sup-2感染猪链球菌，从而杀死猪链球菌。
[0012]
本发明的又一目的是提供一种使用适用于预防和治疗由猪链球菌引起的疾病的组合物来预防和治疗由猪链球菌引起的疾病的方法，该组合物包含分离出的噬菌体str-sup-2(保藏号：kctc 13515bp)作为活性成分，该分离出的噬菌体str-sup-2感染猪链球菌，从而杀死猪链球菌。
[0013]
本发明的再一目的是提供一种用于使用所述组合物来预防和治疗由猪链球菌引起的疾病的消毒剂。
[0014]
本发明的又一目的是提供一种通过使用所述组合物来预防和治疗由猪链球菌引起的疾病以对养殖管理起作用的饮用水添加剂。
[0015]
本发明的再一目的是提供一种通过使用所述组合物来预防和治疗由猪链球菌引
起的疾病以对养殖管理起作用的饲料添加剂。技术解决方案
[0016]
本发明提供了一种从自然界分离出的长尾噬菌体科噬菌体str-sup-2(保藏号：kctc 13515bp)，其具有特定地杀死猪链球菌的能力，并且具有由seq id no:1表示的基因组，本发明还涉及一种使用包含该噬菌体作为活性成分的组合物来预防和治疗由猪链球菌引起的疾病的方法。
[0017]
本发明的发明人分离出噬菌体str-sup-2，然后于2018年4月24日将其保藏在韩国生物科学与生物技术研究所的韩国典型培养物保藏中心(保藏号：kctc 13515bp)。
[0018]
另外，本发明提供了一种适用于预防和治疗由猪链球菌引起的疾病的消毒剂、饮用水添加剂和饲料添加剂，该消毒剂、饮用水添加剂和饲料添加剂包含噬菌体str-sup-2作为活性成分。
[0019]
由于本发明的组合物所包含的噬菌体str-sup-2能有效地杀死猪链球菌，因此，其在预防(预防感染)或者治疗(治疗感染)由猪链球菌引起的疾病方面是有效的。因此，本发明的组合物能够被用来预防和治疗由猪链球菌引起的疾病。
[0020]
本文中使用的“预防”一词是指(i)预防猪链球菌感染和(ii)抑制由猪链球菌感染引起的疾病的发展。
[0021]
本文中使用的“治疗”一词是指(i)抑制由猪链球菌引起的疾病和(ii)缓解由猪链球菌引起的疾病的病理状况。
[0022]
本文中使用的“分离”一词是指通过使用各种实验技术来从自然界分离出噬菌体并且取得可以将本发明的噬菌体与其他噬菌体区别开来的特征的行为，并且进一步包括使用生物工程技术来使本发明的噬菌体增殖以使该噬菌体在工业上适用的行为。
[0023]
本发明的组合物所包括的在药学上可接受的载体是一种通常用于制备药物制剂的载体，并且其示例包括：乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、淀粉、阿拉伯胶、磷酸钙、藻酸盐、明胶、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水、糖浆、甲基纤维素、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸镁和矿物油，但是不限于此。除了上述成分之外，本发明的组合物还可以包括润滑剂、润湿剂、甜味剂、调味剂、乳化剂、悬浮剂和防腐剂。
[0024]
本发明的组合物中包含噬菌体str-sup-2作为活性成分。以1
×
101pfu/ml至1
×
10
30
pfu/ml或者1
×
101pfu/g至1
×
10
30
pfu/g的浓度，优选地以1
×
104pfu/ml至1
×
10
15
pfu/ml或者1
×
104pfu/g至1
×
10
15
pfu/g的浓度包含噬菌体str-sup-2。
[0025]
可以根据本发明所属领域的技术人员可以容易实施的方法，使用在药学上可接受的载体和/或赋形剂来配制本发明的组合物，以按照单位剂型来制备该组合物或者将该组合物加入到多剂量容器中。此处，可以油或者水介质中的溶液、悬浮液、或者乳剂的形式，或者以提取物、粉剂、颗粒、片剂或者胶囊的形式来提供所述制剂，并且该制剂还可以包含分散剂或者稳定剂。
[0026]
可以根据其使用目的将本发明的组合物制备为消毒剂或者饮用水添加剂或者饲料添加剂，但是不限于此。为了提高其效力，还可以将对其他细菌物种具有抗菌活性的噬菌体包括在本发明的组合物中。另外，还可以将对猪链球菌具有抗菌活性的其他类型的噬菌体包括在本发明的组合物中。可以适当地组合这些噬菌体以使组合物的抗菌作用最大化，因为这些噬菌体对猪链球菌的相应抗菌活性可能因抗菌强度或者抗菌谱的不同而有所不
同。有益效果
[0027]
根据本发明，与基于现有抗生素的常规方法相比较，使用包含噬菌体str-sup-2作为有效成分的组合物来预防和治疗由猪链球菌引起的疾病的方法具有对猪链球菌具有非常高的特异性的优点。这意味着该组合物可以用于预防和治疗由猪链球菌引起的疾病，而不影响其他有用的共生细菌，并且具有较小的由于其用途而导致的副作用。通常，当使用抗生素时，共生细菌也受到损害，最终降低动物的免疫力，因此，使用抗生素会引起各种副作用。同时，对于各种对相同细菌物种表现出抗菌活性的噬菌体而言，该噬菌体的抗菌作用因为抗菌强度或者抗菌谱[即施用于个别细菌菌株的噬菌体的抗菌活性谱，就属于猪链球菌的各种细菌菌株而言，即使在相同的物种内，噬菌体通常也仅对某些细菌菌株起作用，因而，即使对于相同的细菌物种，噬菌体的抗菌活性也取决于细菌菌株]的不同而有所不同。因此，本发明可以针对猪链球菌提供与其他对猪链球菌起作用的噬菌体的抗菌活性有差别的抗菌活性，当将其应用于工业领域时，这一点将在有效性上产生很大的差异。
附图说明
[0028]
图1是示出了噬菌体str-sup-2的形态的电子显微照片。
[0029]
图2是示出了通过比较噬菌体str-sup-2的基因组序列和与其具有相对较高的基因组序列同源性的链球菌噬菌体phi5218的基因组序列在基因特征方面的差异的示意图。
[0030]
图3是示出了有关噬菌体str-sup-2杀死猪链球菌的能力的实验结果的照片。基于平板培养基的中心线，在平板培养基的左侧仅不包含噬菌体str-sup-2的缓冲液成斑，而在平板培养基的右侧含有噬菌体str-sup-2的溶液成斑。在右侧观察到的洁净区是由于噬菌体str-sup-2的作用而通过裂解目标细菌形成的噬斑。
具体实施方式
[0031]
通过以下示例，将更好地理解本发明，这些示例仅为了说明本发明，而不应该被解释为限制本发明的范围。
[0032]
示例1：能够杀死猪链球菌的噬菌体的分离
[0033]
使用从自然界收集的样品来分离出能够杀死猪链球菌的噬菌体。此处，从韩国典型培养物保藏中心(保藏号：kctc 3557)获得用于噬菌体分离的猪链球菌菌株。
[0034]
下文中详细描述了分离所述噬菌体的过程。将收集到的样品添加到以1/1,000的比率接种了猪链球菌的thb(todd hewitt肉汤)培养基(心脏输注，3.1g/l；蛋白，20g/l；葡萄糖，2g/l；氯化钠，2g/l；磷酸二钠，0.4g/l；碳酸钠，2.5g/l)，然后在37℃下振荡培养3至4小时。在培养完成之后，以8,000rpm进行20分钟离心，并且回收上清液。以1/1000的比率给回收的上清液接种猪链球菌，然后在37℃下振荡培养3至4小时。当样品中包括所述噬菌体时，总共重复上述过程5次以充分增加噬菌体的数量(滴度)。在重复该过程5次之后，以8,000rpm将培养肉汤离心20分钟。在离心之后，使用0.45μm的过滤器对回收的上清液进行过滤。将由此获得的滤液用于典型的斑点测定以便评估其中是否包括能够杀死猪链球菌的噬菌体。
[0035]
如下所示进行斑点测定。以1/1,000的比率接种了猪链球菌的thb培养基，然后在
37℃下振荡培养一夜。将如上所述制备的3ml(od600为1.5)的猪链球菌培养液散开在tha(todd hewitt琼脂：心脏输注，3.1g/l；蛋白，20g/l；葡萄糖，2g/l；氯化钠，2g/l；磷酸二钠，0.4g/l；碳酸钠，2.5g/l，琼脂，15g/l)板上。将板放在洁净的工作台上大约30分钟以使散开的溶液干燥。在干燥之后，在散有猪链球菌的板上对如上所述制备的10μl的滤液进行成斑，然后放置大约30分钟进行干燥。干燥之后，在37℃下将经过成斑的板静置培养1天，然后针对在滴有滤液的位置处洁净区的形成进行检查。如滤液产生洁净区，则判断其中包括了能够杀死猪链球菌的噬菌体。通过上述检查，能够获得包含具有杀死猪链球菌的能力的噬菌体的滤液。
[0036]
从证实具有能够杀死猪链球菌的噬菌体的滤液中分离出纯噬菌体。使用典型的噬斑测定来分离纯噬菌体。具体地，使用无菌吸液头回收在噬斑测定过程中形成的噬斑，将噬斑添加到猪链球菌培养肉汤，然后，在37℃下培养4至5小时。此后，以8,000rpm进行20分钟离心以获得上清液。以1/50的容积比向所获得的上清液添加猪链球菌培养肉汤，然后，在37℃下培养4至5小时。为了增加噬菌体的数量，重复上述过程至少5次，在这之后，以8,000rpm进行20分钟离心以获得最终的上清液。使用由此获得的最终的上清液来再次进行噬斑测定。通常，当上述过程执行了一次时，纯噬菌体的分离并未完成，因此使用如上所述形成的噬斑重复该过程。在重复至少5次之后，获得包含纯噬菌体的溶液。重复分离纯噬菌体的过程直到所产生的噬斑在大小和形态方面都变得彼此大致相似为止。附加地，使用电子显微镜来确认纯噬菌体的最终分离。重复上述过程，直到利用电子显微镜确认分离出了纯噬菌体为止。以典型的方法进行电子显微镜检查。简而言之，将包含纯噬菌体的溶液装载在铜网上，然后用2％的乙酸铀酰进行负染并且干燥。然后，使用透射电子显微镜来观察其形态。在图1中示出了分离出的纯噬菌体的电子显微照片。基于其形态特征，确认如上所分离出的新型噬菌体属于长尾噬菌体科噬菌体。
[0037]
将包含如上所确认的纯噬菌体的溶液进行以下纯化处理。基于该噬菌体溶液的总容积，以1/50的容积比向包含该纯噬菌体的溶液添加猪链球菌培养肉汤，然后，另外培养4至5小时。此后，以8,000rpm进行20分钟离心以获得上清液。总共重复该过程5次以获得包含足够数量噬菌体的溶液。使用0.45μm的过滤器对从最后一次离心获得的上清液进行过滤，然后进行典型的聚乙二醇(peg)沉淀处理。具体地，向100ml的滤液添加peg和nacl，从而达到10％peg 8000和0.5m nacl，然后将其在4℃下静置2至3小时。此后，以8,000rpm进行30分钟离心以获得噬菌体沉淀物。将所得到的噬菌体沉淀物悬浮在5ml的缓冲液(10mm tris-hcl、10mm mgso4、0.1％明胶，ph值8.0)中。所得到的材料可以被称为噬菌体悬浮液或者噬菌体溶液。
[0038]
收集如上所述的纯化的噬菌体，将其命名为噬菌体str-sup-2，然后于2018年4月24日将其保藏在韩国生物科学与生物技术研究所的韩国典型培养物保藏中心(保藏号：kctc 13515bp)。
[0039][0040]
示例2：对噬菌体str-sup-2的基因组的分离和序列分析
[0041]
噬菌体str-sup-2的基因组分离如下。从使用与示例1中所述的相同的方法而获得的噬菌体悬浮液中分离出基因组。首先，为了去除悬浮液中所包括的猪链球菌的dna和rna，将200u的dnase i和200u的rnase a添加到10ml的噬菌体悬浮液中，然后将其在37℃下静置
30分钟。在将其静置30分钟之后，为了使dnase i和rnase a的活性失活，向其添加500μl的0.5m乙二胺四乙酸(edta)，然后将所得到的混合物静置10分钟。另外，再将所得到的混合物在65℃下静置10分钟，然后，向其添加100μl的蛋白酶k(20mg/ml)以破坏该噬菌体的外壁，然后在37℃下反应20分钟。此后，向其添加500μl的10％十二烷基硫酸钠(sds)，然后在65℃下反应1小时。在发生反应1小时之后，向所得到的反应溶液添加10ml的成分比为25∶24∶1的苯酚、氯仿和异戊醇的混合溶液，然后将其充分混合。然后以13,000rpm将所得到的混合物离心15分钟从而分离混合物的各层。在分离出的各层中，选择上层，以1.5的容积比向其添加异丙醇，并且以13,000rpm将其离心10分钟以使基因组沉淀。在收集沉淀物之后，向该沉淀物添加70％乙醇，并且以13,000rpm将其离心10分钟来洗涤该沉淀物。回收洗涤过的沉淀物，对其进行真空干燥，然后将其溶解在100μl的水中。重复该过程，从而获得噬菌体str-sup-2的足够量的基因组。
[0042]
使用macrogen公司提供的illumina mi-seq测序仪进行下一代测序分析来获得有关由此获得的噬菌体str-sup-2的基因组的序列信息。噬菌体str-sup-2最终分析出的基因组大小为32,673bp，并且整个基因组序列由seq id no:1表示。
[0043]
在网络上使用blast调查了如上所获得的噬菌体str-sup-2基因组序列与先前报道的噬菌体基因组序列的同源性(相似性)。基于blast调查的结果，噬菌体str-sup-2的基因组序列被发现与链球菌噬菌体phi5218(genbank保藏号：kc348600.1)的序列具有相对较高的同源性。然而，噬菌体str-sup-2具有长尾噬菌体科的形态特征，而链球菌噬菌体phi5218具有短尾噬菌体科的形态特征，他们之间存在明显的形态差异。此外，噬菌体str-sup-2基因组的开放阅读框(orf)的数量为59，而我们发现链球菌噬菌体phi5218具有64个开放阅读框，基于此，这两个噬菌体也被评估为在基因上不同。这两个噬菌体之间的形态特征和基因特征的差异可以表明，在两个噬菌体之间以各种方式表达的各种特征存在外部差异和功能差异。而且，这两个噬菌体之间的差异还暗示着两个噬菌体的工业适用性存在差异。同时，在图2中示意性地示出了通过比较这两个噬菌体的基因组序列观察到的基因特征的差异。
[0044]
因此，可以得出以下结论：噬菌体str-sup-2是与先前报道的噬菌体不同的新型噬菌体。此外，由于噬菌体的抗菌强度和抗菌谱通常根据噬菌体的类型而变化，因此，认为噬菌体str-sup-2可以提供与任何其他先前报道的噬菌体的抗菌活性不同的抗菌活性。
[0045][0046]
示例3：对噬菌体str-sup-2对猪链球菌的杀伤能力的评估
[0047]
对分离出的噬菌体str-sup-2对猪链球菌的杀伤能力进行了评估。为了对其杀伤能力进行评估，以与示例1中所述的相同的方式使用斑点测定来观察洁净区的形成。使用本发明的发明人分离出的并且鉴定为猪链球菌的总共10个菌株，或者从kctc或者韩国兽医培养物保藏中心获得的总共10个菌株作为用于对杀伤能力进行评估的猪链球菌菌株。噬菌体str-sup-2具有总共杀死10个猪链球菌菌株中的8个菌株(包括kctc 3557)的能力，达到了实验目标。在图3中示出了有代表性的实验结果。同时，还检查了噬菌体str-sup-2杀死支气管败血波氏杆菌、粪肠球菌、屎肠球菌、缓症链球菌、乳房链球菌和铜绿假单胞菌的能力。结果，噬菌体str-sup-2不具有杀死这些微生物的能力。
[0048]
因此，可以得出以下结论：噬菌体str-sup-2具有很强的杀死猪链球菌的能力，并
且会对许多猪链球菌菌株表现出抗菌作用，这表明噬菌体str-sup-2可以用作用于预防和治疗由猪链球菌引起的疾病的组合物的活性成分。
[0049][0050]
示例4：使用噬菌体str-sup-2来预防猪链球菌感染的实验
[0051]
向包含9ml thb培养基的试管中添加100μl的浓度为1
×
108pfu/ml的噬菌体str-sup-2溶液。向另一根包含9mlthb培养基的试管中仅另外添加相同量的thb培养基。然后，向每根试管添加猪链球菌培养肉汤，使得在600nm处的吸光度达到大约0.5。在添加猪链球菌之后，将试管转移到在37℃下的培养箱，然后进行振荡培养，在此期间，观察猪链球菌的生长状态。如下面的表1中示出的，观察到：在添加了噬菌体str-sup-2溶液的试管中，猪链球菌的生长受到抑制，而在未添加噬菌体溶液的试管中，猪链球菌的生长未受到抑制。
[0052][0053]
【表1】对猪链球菌的生长抑制
[0054]
上述结果表明：本发明的噬菌体str-sup-2不仅抑制猪链球菌的生长，而且具有杀死猪链球菌的能力。因此，得出以下结论：噬菌体str-sup-2可以用作用于预防由猪链球菌引起的疾病的组合物中的活性成分。
[0055][0056]
示例5：使用噬菌体str-sup-2来预防由猪链球菌引起的疾病的动物试验
[0057]
使用断奶仔猪评估噬菌体str-sup-2对由猪链球菌引起的疾病的预防作用。将十头25日龄的断奶仔猪总共分为2组(每组5头猪)，并在实验养猪室(1.1m
×
1.0m)中将其分开喂养，进行14天的实验。使用加热器控制周围环境，并且使得养猪室中的温度和湿度保持恒定，并且每天对养猪室地板进行洗涤。自实验开始到实验结束，以典型的饲养方式来向实验组(给予了包含该噬菌体的饲料)中的猪提供包含1
×
108pfu/g噬菌体str-sup-2的饲料。为了与之进行比较，从实验开始到实验结束，以相同的饲养方式来向对照组(给予了不包含该噬菌体的饲料)中的猪提供具有相同组合物但不包含噬菌体str-sup-2的饲料。从实验开始之后的第7天起持续2天，另外在饲料中添加1
×
108cfu/g的猪链球菌，每天向实验组(给予了包含该噬菌体的饲料)和对照组(给予了不包含该噬菌体的饲料)中的所有猪提供两次饲料，从而造成感染猪链球菌。从用包含猪链球菌的饲料进行饲养之日起(从实验开始之后的第7天起)，每天对所有试验动物的鼻分泌物中检测到的猪链球菌的水平进行检查。
[0058]
对鼻分泌物(鼻拭子)中的猪链球菌的检测进行如下。将鼻分泌样品散开在血琼脂平板上，然后在37℃下培养18至24小时。在所得菌落中，分离出推测为猪链球菌的菌落。将由此选择的菌落用作样品，并对其进行猪链球菌特异性的聚合酶链反应(pcr)，从而最终确认对应菌落是否为猪链球菌。下表2中示出了细菌检测的结果。
[0059][0060]
【表2】猪链球菌的检测结果(平均值)
[0061]
从上述结果可见，可以确认本发明的噬菌体str-sup-2在预防由猪链球菌引起的疾病方面非常有效。
[0062][0063]
示例6：使用噬菌体str-sup-2治疗由猪链球菌引起的疾病
[0064]
评估噬菌体str-sup-2对由猪链球菌引起的疾病的治疗效果如下。将八头25日龄的断奶仔猪总共分为2组，并在实验养猪室(1.1m
×
1.0m)中将其分开喂养，进行14天的实验。使用加热器控制周围环境，使养猪室中的温度和湿度保持恒定，并且每天对养猪室地板进行洗涤。从实验开始之后的第4天，将5ml的猪链球菌溶液(109cfu/ml)喷射到所有猪的鼻腔中。用于鼻腔给药的猪链球菌溶液制备如下。在使用thb培养基在37℃下将猪链球菌细菌培养18小时之后，分离其细胞，然后使其悬浮在生理盐水(ph值7.2)中以将细胞浓度调节至109cfu/ml。从强迫感染猪链球菌的第二天起，以与猪链球菌溶液的给药方式相同的方式每天对实验组(给予了该噬菌体溶液的组)中的猪进行两次109pfu的噬菌体str-sup-2的鼻内给药。对照组(未进行该噬菌体溶液给药的组)中的猪不进行任何治疗。以相同方式向对照组和实验组提供饲料和饮用水。从强迫感染猪链球菌之后的第3天起(从实验开始的第7天起)，检查所有试验动物的由猪链球菌细菌引起的萎缩性鼻炎的发展状况。通过测量鼻分泌物的量来进行由猪链球菌细菌引起的萎缩性鼻炎的调查。根据试验员的观察，通过将正常水平标记为“0”，将略微较高的水平标记为“1”且将严重水平标记为“2”来指示鼻分泌物的量。在下表3中示出了其结果。
[0065][0066]
【表3】鼻分泌物的调查结果(平均值)
[0067]
从上述结果可见，可以确认本发明的噬菌体str-sup-2在治疗由猪链球菌引起的疾病方面非常有效。
[0068][0069]
示例7：制备饲料添加剂和饲料
[0070]
使用噬菌体str-sup-2溶液来制备饲料添加剂，使得每克饲料添加剂包含数量为1
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108pfu的噬菌体str-sup-2。按照以下方式来制备饲料添加剂：向该噬菌体溶液添加麦芽糊精(50％，w/v)，然后将其冻干并最终粉碎成细粉。在上述制备过程中，可以将干燥处理替换为减压干燥、加热干燥或者是室温干燥。为了制备用于比较的对照，不使用该噬菌体溶液，而是使用用于制备该噬菌体溶液的缓冲液(10mm tris-hcl、10mm mgso4、0.1％明胶，ph值8.0)来制备不包含该噬菌体的饲料添加剂。
[0071]
以1,000的重量比将由此制备的两种饲料添加剂分别与猪饲料混合，从而最终制备两种饲料。
[0072][0073]
示例8：制备饮用水添加剂和消毒剂
[0074]
以相同方式制备饮用水添加剂和消毒剂，这是因为它们仅在用途上不同，但在剂型上相同。使用噬菌体str-sup-2溶液来制备饮用水添加剂(或者消毒剂)。在制备饮用水添加剂(或者消毒剂)的方法中，添加噬菌体str-sup-2溶液，使得用于制备该噬菌体溶液的每毫升缓冲液包含数量为1x10
9 pfu的噬菌体str-sup-2，并且充分地予以混合。为了制备用于比较的对照，原样使用用于制备该噬菌体溶液的缓冲液作为不包含该噬菌体的饮用水添加剂(或者消毒剂)。
[0075]
以1,000的容积比用水来稀释由此制备的两种饮用水添加剂(或者消毒剂)，从而获得最终的饮用水或者消毒剂。
[0076][0077]
示例9：确认猪养殖的饲养效果
[0078]
评估了使用示例7和8中制备的饲料、饮用水和消毒剂是否对猪养殖起作用。特定地，本评估将重点放在测量增重的程度上。将总共六十头25日龄的断奶仔猪分为三组，每组包括20头猪(a组：用饲料进行饲养，b组：用饮用水进行饲养，c组：用消毒剂进行治疗)，进行四个星期的实验。将每一组再分成各包括10头猪的子组，并且将子组分类为施用噬菌体str-sup-2的子组(子组
-①
)和不施用噬菌体的子组(子组
-②
)。在本实验中，在单独子组中分开喂养断奶仔猪。如下表4所示对子组进行分类和命名。
[0079][0080]
【表4】猪养殖实验中的子组分类和表达
[0081]
就提供饲料而言，如表4中所示，以典型的饲养方式提供在示例7中制备的饲料，且如表4中所示，以典型的饲养方式提供在示例8中制备的饮用水。就消毒而言，消毒与常规消毒交替进行，每周3次。在喷洒本发明的消毒剂的当日不进行使用典型消毒剂的消毒。基于实验结果，与未添加噬菌体str-sup-2的组相比，添加了噬菌体str-sup-2的组的增重程度明显更好(表5)。作为参考，也如示例5中所示调查了试验动物的鼻分泌物中的猪链球菌细菌的分离率。在未施用噬菌体str-sup-2的组中的一些动物的鼻分泌物中检测到猪链球菌细菌。另一方面，在施用了噬菌体str-sup-2的组中的所有动物中，在试验周期期间未检测到猪链球菌细菌。
[0082][0083]
【表5】猪养殖实验的结果
[0084]
上述结果表明，用根据本发明制备的饲料和饮用水进行饲养以及使用根据本发明的消毒剂对于猪养殖是有效的。因此，可得出结论，本发明的组合物在用于喂养猪时是有效的。
[0085][0086]
虽然已经参照本发明的示例性实施例明确示出和描述了本发明，但是本领域的技术人员应了解，具体描述仅是优选实施例，并且本发明的范围不限于此。因此，本发明的范围应由所附权利要求书及其等效物限定。
[0087][0088]
[保藏号]
[0089]
保藏机构名称：kctc
[0090]
保藏号：kctc 13515bp
[0091]
保藏日期：20180424
[0092][0093]