包含IL-15/IL-15RaFc融合蛋白和PD-1抗原结合结构域的靶向PD-1的异源二聚体融合蛋白及其用途的制作方法

相关申请的交叉引用

本申请要求于2018年4月18日提交的美国临时申请62/659,571的优先权，该公开以其整体通过引用在此并入。

背景技术：

细胞因子如il-2和il-15的功能有助于b细胞、t细胞和nk细胞的增殖和分化。这两种细胞因子均通过与三聚体复合物结合而发挥其细胞信号传导功能，所述三聚体复合物由两个共有受体，即共同γ链(γc；cd132)和il-2受体β链(il-2rβ；cd122)，以及每种细胞因子特有的α链受体：il-2受体α(il-2rα；cd25)或il-15受体α(il-15rα；cd215)组成。这两种细胞因子均被认为是肿瘤学中潜在有价值的治疗剂，并且il-2已被批准用于患有转移性肾细胞癌和恶性黑素瘤的患者。尽管正在进行几项临床试验，但目前尚未批准使用重组il-15。然而，作为潜在的药物，两种细胞因子都具有非常快的清除率，半衰期测得为几分钟。当以高剂量施用以克服快速清除时，il-2免疫疗法已与全身毒性相关。在最近的临床试验中，il-15免疫疗法也报道了这种全身毒性(guo等，jimmunol，2015，195(5)：2353-64)。

t细胞活化后，免疫检查点蛋白(例如pd-1)被上调，以通过与免疫检查点配体(例如pd-l1)结合而耗尽活化的t细胞来排除自身免疫。然而，免疫检查点蛋白在肿瘤浸润淋巴细胞(til)中也上调，并且免疫检查点配体在肿瘤细胞上过表达，从而有助于肿瘤细胞的免疫逃逸。

在肿瘤治疗中仍存在对利用细胞因子的治疗策略的未满足的需求，该细胞因子不需要高剂量并且靶向肿瘤以避免全身毒性。本发明通过提供具有延长的半衰期的靶向pd-1的il-15融合蛋白(图2)和更选择性地靶向til以改善安全性满足了这一需求。

技术实现要素：

本发明涉及新颖的靶向pd-1的il-15/rα异源二聚体fc融合蛋白、它们的用途以及制备该异源二聚体fc融合蛋白的方法，包括：

因此，在一些方面，本发明提供了靶向pd-1的il-15/rα异源二聚体fc融合蛋白。在该方面，靶向pd-1的il-15/rα异源二聚体fc融合蛋白包括：

(a)第一单体，其从n-端至c-端包含：

(i)il-15受体α(il-15rα)寿司结构域(sushidomain)，

(ii)第一结构域连接子，

(iii)变体il-15结构域，和

(iv)第二结构域连接子，和

(v)包含ch2-ch3的第一变体fc结构域；和

(b)第二单体，其从n端到c端包含：含vh-ch1-铰链-ch2-ch3的重链，其中所述ch2-ch3是第二变体fc结构域；和

(c)轻链，所述轻链包含vl-cl；

其中所述vh和vl形成结合人pd-1的抗原结合结构域，并具有选自下列对的序列：xenp22553的1c11[pd-1]_h3l3(seqidnos：186和187)、xenp25806的1c11[pd-1]_h3.234_l3.144(seqidnos：578-57)、xenp25812的1c11[pd-1]_h3.240_l3.148(seqidno：584)、xenp25813的1c11[pd-1]_h3.241_l3.148(seqidno：585)、xenp25819的1c11[pd-1]_h3.241_l3.92(seqidno：591)、xenp26940的1c11[pd-1]_h3.303_l3.152(seqidnos：642和1103)、xenp28026的1c11[pd-1]_h3.329_l3.220(seqidnos：708和1169)和xenp28652的1c11[pd-1]_h3.328_l3.152(seqidnos：719和1180)；和

其中所述第一变体和第二变体fc结构域分别地并根据eu编号具有一组选自以下的氨基酸取代：s267k/l368d/k370s:s267k/ls364k/e357q；s364k/e357q:l368d/k370s；l368d/k370s:s364k；l368e/k370s:s364k；t411e/k360e/q362e:d401k；l368d/k370s:s364k/e357l；l368d/k370s:s364k/e357q；和k370s:s364k/e357q。

在一些实施方案中，根据eu编号，靶向pd-1的il-15/rα异源二聚体fc融合蛋白的第一变体fc结构域和/或第二变体fc结构域具有包含q295e/n384d/q418e/n421d的氨基酸取代。

在一些实施方案中，根据eu编号，第一变体fc结构域和/或第二变体fc结构域各自具有选自以下的氨基酸取代：g236r/l328r、e233p/l234v/l235a/g236del/s239k、e233p/l234v/l235a/g236del/s267k、e233p/l234v/l235a/g236del/s239k/a327g、e233p/l234v/l235a/g236del/s267k/a327g和e233p/l234v/l235a/g236del。

在一些实施方案中，根据eu编号，第一变体和第二变体fc结构域各自具有氨基酸取代m428l/n434s。

在一些实施方案中，变体il-15结构域包含seqidno：2的氨基酸序列。在其他实施方案中，变体il-15结构域包含seqidno：2的氨基酸序列和选自n4d/n65d、d30n/n65d和d30n/e64q/n65d的氨基酸取代。

在一些实施方案中，il-15rα寿司结构域包含seqidno：4的氨基酸序列。

在一些实施方案中，靶向pd-1的il-15/rα异源二聚体fc融合蛋白选自seqidno：925、926和1216所示的xenp29482、seqidno：370-372所示的xenp25937以及以下图中描绘的任一种：图126a(seqidnos:925-929)、图126b(seqidnos:930-935)、图126c(seqidnos:936-941)、图126d(seqidnos:942-947)、图127a(seqidnos:948-953)、图127b(seqidnos:954-959)、图127c(seqidnos:960-965)、图127d(seqidnos:966-971)、图128a(seqidnos:972-977)、图128b(seqidnos:978-983)、图128c(seqidnos:984-989)、图128d(seqidnos:990-995)、图128e(seqidnos:996-1001)、图128f(seqidnos:1002-1007)、图128g(seqidnos:1008-1013)、图128h(seqidnos:1014-1019)、图128i(seqidnos:1020-1025)、图128j(seqidnos:1026-1031)、图128k(seqidnos:1032-1035)、图128l(seqidnos:1036-1041)。

在其他方面，本文提供了靶向pd-1的il-15/rα异源二聚体fc融合蛋白，其包括：

(a)第一单体，其从n-端至c-端包含：

(i)il-15受体α(il-15rα)寿司结构域，

(ii)第一结构域连接子，

(iii)变体il-15结构域，

(iv)第二结构域连接子，和

(v)包含ch2-ch3的第一变体fc结构域；和

(b)第二单体，其从n-端至c-端包含：

(i)结合人pd-1的单链fv结构域(scfv)，其中所述scfv包含：

(1)可变重域(vh)，

(2)scfv连接子；和

(3)可变轻结构域(vl)，以及

(ii)第二变体fc结构域；

其中vhcdr1、vhcdr2、vhcdr3、vlcdr1、vlcdr2和vlcdr3选自来自以下的cdr：xenp22538的1c11[pd-1]_h3l3(seqidno：417)、xenp25806的1c11[pd-1]_h3.234_l3.144(seqidnos：578-579)、xenp25812的1c11[pd-1]_h3.240_l3.148(seqidno：584)、xenp25813的1c11[pd-1]_h3.241_l3.148(seqidno：585)、xenp25819的1c11[pd-1]_h3.241_l3.92(seqidno：591)、xenp26940的1c11[pd-1]_h3.303_l3.152(seqidnos：642和1103)、xenp28026的1c11[pd-1]_h3.329_l3.220(seqidnos：708和1169)和xenp28652的1c11[pd-1]_h3.328_l3.152(seqidnos：719和1180)；和

其中所述第一变体和第二变体fc结构域分别地并根据eu编号具有一组选自以下的氨基酸取代：s267k/l368d/k370s:s267k/ls364k/e357q；s364k/e357q:l368d/k370s；l368d/k370s:s364k；l368e/k370s:s364k；t411e/k360e/q362e:d401k；l368d/k370s:s364k/e357l；l368d/k370s:s364k/e357q；和k370s:s364k/e357q。

在一些实施方案中，第二单体的vh和vl选自以下对：xenp22538的1c11[pd-1]_h3l3(seqidno：417)、xenp25806的1c11[pd-1]_h3.234_l3.144(seqidnos：578-579)、xenp25812的1c11[pd-1]_h3.240_l3.148(seqidno：584)、xenp25813的1c11[pd-1]_h3.241_l3.148(seqidno：585)、xenp25819的1c11[pd-1]_h3.241_l3.92(seqidno：591)、xenp26940的1c11[pd-1]_h3.303_l3.152(seqidnos：642和1103)、xenp28026的1c11[pd-1]_h3.329_l3.220(seqidnos：708和1169)和xenp28652的1c11[pd-1]_h3.328_l3.152(seqidnos：719和1180)。

在一些实施方案中，根据eu编号，第一变体和第二变体fc结构域具有另外一组包含q295e/n384d/q418e/n421d的氨基酸取代。

在一些实施方案中，根据eu编号，第一变体和第二变体fc结构域各自具有另外一组由以下组成的氨基酸取代：g236r/l328r、e233p/l234v/l235a/g236del/s239k、e233p/l234v/l235a/g236del/s267k、e233p/l234v/l235a/g236del/s239k/a327g、e233p/l234v/l235a/g236del/s267k/a327g和e233p/l234v/l235a/g236del。

在一些实施方案中，根据eu编号，第一变体和第二变体fc结构域各自具有另外的氨基酸取代m428l/n434s。

在一些实施方案中，变体il-15结构域包含seqidno：2的氨基酸序列。在某些实施方案中，变体il-15结构域包含seqidno：2的氨基酸序列和选自n4d/n65d、d30n/n65d和d30n/e64q/n65d的氨基酸取代。

在一些实施方案中，il-15rα寿司结构域具有seqidno：4的氨基酸序列。

在一些实施方案中，第一单体包含：具有选自n4d/n65d、d30n/nn65d和d30n/e64q/n65d的氨基酸取代的seqidno：4的il-15rα寿司结构域和seqidno：2的变体il-15结构域；并且scfv包含：所述vh和vl选自以下对：xenp25806的1c11[pd-1]_h3.234_l3.144(seqidnos：578-579)、xenp25812的1c11[pd-1]_h3.240_l3.148(seqidno：584)、xenp25813的1c11[pd-1]_h3.241_l3.148(seqidno：585)、xenp25819的1c11[pd-1]_h3.241_l3.92(seqidno：591)、xenp26940的1c11[pd-1]_h3.303_l3.152(seqidnos：642和1103)、xenp28026的1c11[pd-1]_h3.329_l3.220(seqidnos：708和1169)和xenp28652的1c11[pd-1]_h3.328_l3.152(seqidnos：719和1180)。

在其他方面，本文提供了编码本文概述的任何异源二聚体fc融合蛋白的第一单体的核酸组合物。另外，本文提供了编码本文概述的任何异源二聚体fc融合蛋白的第二单体的核酸组合物。另外，提供了编码本文概述的任何异源二聚体fc融合蛋白的轻链的核酸组合物。

在一些方面，本文提供了表达载体，其包含编码本文所述的任何一种第一单体的任何核酸组合物。另外，本文提供了表达载体，其包含编码本文所述的任何一种第二单体的任何核酸组合物。另外，本文提供了表达载体，其包含编码本文所述的任何一条轻链的任何核酸组合物，使得异源二聚体fc融合蛋白的vl和vh结合人pd-1。

本文提供了表达载体，其包含一种或多种本文所述的核酸组合物。本文提供了包含一种或多种表达载体的宿主细胞。

在一些方面，本文提供了产生靶向pd-1的il-15/rα异源二聚体fc融合蛋白的方法，其包括：在合适的条件下培养本文所述的宿主细胞，其中所述异源二聚体fc融合蛋白被表达；并回收所述蛋白。

在一些方面，本发明提供靶向pd-1的il-15/rα异源二聚体fc融合蛋白，其选自seqidno：925、926和1216所示的xenp29482、seqidno：370-372所示的xenp25937以及以下图中描绘的任一种：图126a(seqidnos:925-929)、图126b(seqidnos:930-935)、图126c(seqidnos:936-941)、图126d(seqidnos:942-947)、图127a(seqidnos:948-953)、图127b(seqidnos:954-959)、图127c(seqidnos:960-965)、图127d(seqidnos:966-971)、图128a(seqidnos:972-977)、图128b(seqidnos:978-983)、图128c(seqidnos:984-989)、图128d(seqidnos:990-995)、图128e(seqidnos:996-1001)、图128f(seqidnos:1002-1007)、图128g(seqidnos:1008-1013)、图128h(seqidnos:1014-1019)、图128i(seqidnos:1020-1025)、图128j(seqidnos:1026-1031)、图128k(seqidnos:1032-1035)、图128l(seqidnos:1036-1041)。

在其他方面，本发明提供药物组合物，其包含靶向pd-1的il-15/rα异源二聚体fc融合蛋白和药学上可接收的载体，所述蛋白选自seqidno：925、926和1216所示的xenp29482、seqidno：370-372所示的xenp25937以及以下图中描绘的任一种：图126a(seqidnos:925-929)、图126b(seqidnos:930-935)、图126c(seqidnos:936-941)、图126d(seqidnos:942-947)、图127a(seqidnos:948-953)、图127b(seqidnos:954-959)、图127c(seqidnos:960-965)、图127d(seqidnos:966-971)、图128a(seqidnos:972-977)、图128b(seqidnos:978-983)、图128c(seqidnos:984-989)、图128d(seqidnos:990-995)、图128e(seqidnos:996-1001)、图128f(seqidnos:1002-1007)、图128g(seqidnos:1008-1013)、图128h(seqidnos:1014-1019)、图128i(seqidnos:1020-1025)、图128j(seqidnos:1026-1031)、图128k(seqidnos:1032-1035)、图128l(seqidnos:1036-1041)。

在某些方面，本发明提供了一种在有需要的患者中治疗癌症的方法，包括施用治疗有效量的本文所述的任何一种靶向pd-1的il-15rα异二聚体fc融合蛋白或其药物组合物。

在一些实施方案中，该方法还包括施用治疗有效量的检查点阻断抗体。

在一些实施方案中，检查点阻断抗体选自抗pd-1抗体、抗pd-l1抗体、抗tim3抗体、抗tigit抗体、抗lag3抗体和抗ctla-4抗体。

在一些实施方案中，所述抗pd-1抗体是纳武单抗、派姆单抗或匹地珠单抗。在一些实施方案中，抗pd-l1抗体是阿特珠单抗、阿维鲁单抗或杜巴单抗。

附图说明

图1描绘了与它的受体il-15rα(cd215)、il-15rβ(cd122)和共同γ链(cd132)复合物il-15的结构。

图2描绘了靶向pd-1的il-15/rα-fc融合蛋白对表达pd-1的肿瘤反应性肿瘤浸润淋巴细胞的选择性。

图3a-图3b描绘il-15及其受体的序列。

图4a-图4e描绘异源二聚变体组的有用对(包括偏斜和pi变体)。有些变体没有相应的“单体2”变体；这些是pi变体，可以单独用于任一单体。

图5描绘等排变体抗体恒定区和其各自的取代的列表。pi_(-)表示较低的pi变体，而pi_(+)表示较高的pi变体。这些可以与本发明的其它异源二聚化变体(以及其它变体类型，如本文所概述的)任选且独立地组合。

图6描绘有用消融变体，其消融fcγr结合(有时被称为“敲除”或“ko”变体)。通常，在两种单体上都发现了消融变体，尽管在一些情况下其可能仅在一种单体上。

图7a-图7e显示本发明的il-15/rα-fc融合蛋白的“非细胞因子”组分的特别有用的实施方案。

图8a-图8f展示本发明的靶向pd-1的il-15/rα-fc融合蛋白的“非细胞因子”/“非fv”组分的特别有用的实施方案。

图9描绘用于il-15/rα-fc融合蛋白的多种例示性可变长度的连接子。在一些实施方案中，这些连接子可用于将il-15和/或il-15rα(寿司)的c端连接于fc区的n端。在一些实施方案中，这些连接子可用于将il-15与il-15rα(寿司)融合。

图10描绘许多带电荷的scfv连接子，其可用于增加或减少利用一个或多个scfv作为组分的异源二聚体抗体的pi。(+h)阳性连接子在本文中特别有用。根据whitlow等人,《蛋白质工程(proteinengineering)》6(8):989-995(1993)，具有单一电荷的单个现有技术scfv连接子被称为“whitlow”。应注意，这种连接子用于减少scfv的聚合和增强scfv的蛋白水解稳定性。

图11a-图11d展示基于人类igg1的几个有用的il-15/rα-fc形式主链序列，而无细胞因子序列(例如，il-15和/或il-15rα(寿司))。重要的是要注意，这些主链也可用于靶向pd-1的il-15/rα-fc蛋白的某些实施方案中。主链1基于人类igg1(356e/358m同种异型)，并且包括两条链上的c220s、s364k/e357q:l368d/k370s偏斜变体、具有l368d/k370s偏斜变体的链上的q295e/n384d/q418e/n421dpi变体以及两条链上的e233p/l234v/l235a/g236del/s267k消融变体。主链2基于人类igg1(356e/358m同种异型)，并且包括两条链上的c220s、s364k:l368d/k370s偏斜变体、具有l368d/k370s偏斜变体的链上的q295e/n384d/q418e/n421dpi变体以及两条链上的e233p/l234v/l235a/g236del/s267k消融变体。主链3基于人类igg1(356e/358m同种异型)，并且包括两条链上的c220s、s364k:l368e/k370s偏斜变体、具有l368e/k370s偏斜变体的链上的q295e/n384d/q418e/n421dpi变体以及两条链上的e233p/l234v/l235a/g236del/s267k消融变体。主链4基于人类igg1(356e/358m同种异型)，并且包括两条链上的c220s、d401k:k360e/q362e/t411e偏斜变体、具有k360e/q362e/t411e偏斜变体的链上的q295e/n384d/q418e/n421dpi变体以及两条链上的e233p/l234v/l235a/g236del/s267k消融变体。主链5基于人类igg1(356d/358l同种异型)，并且包括两条链上的c220s、s364k/e357q:l368d/k370s偏斜变体、具有l368d/k370s偏斜变体的链上的q295e/n384d/q418e/n421dpi变体以及两条链上的e233p/l234v/l235a/g236del/s267k消融变体。主链6基于人类igg1(356e/358m同种异型)，并且包括两条链上的c220s、s364k/e357q:l368d/k370s偏斜变体、具有l368d/k370s偏斜变体的链上的q295e/n384d/q418e/n421dpi变体和两条链上的e233p/l234v/l235a/g236del/s267k消融变体以及两条链上的n297a变体。除了突变是n297s之外，主链7与6相同。主链6和7的替代形式可以不含两条链中的消融变体e233p/l234v/l235a/g236del/s267k。主链8基于人类igg4，并且包括s364k/e357q:l368d/k370s偏斜变体、具有l368d/k370s偏斜变体的链上的q295e/n384d/q418e/n421dpi变体以及两条链上的s228p(eu编号，这是kabat中的s241p)变体，其消融如所属领域已知的fab臂交换。主链9基于人类igg2，并且包括s364k/e357q:l368d/k370s偏斜变体、具有l368d/k370s偏斜变体的链上的q295e/n384d/q418e/n421dpi变体。主链10基于人类igg2，并且包括s364k/e357q:l368d/k370s偏斜变体、具有l368d/k370s偏斜变体的链上的q295e/n384d/q418e/n421dpi变体以及两条链上的s267k变体。除了其包含m428l/n434sxtend突变之外，主链11与主链1相同。主链12基于人igg1(356e/358m同种异型)，并且包含：两条相同的链上的c220s、两条相同的链上的e233p/l234v/l235a/g236del/s267k消融变体。主链13基于人类igg1(356e/358m同种异型)，并且包括两条链上的c220s、s364k/e357q:l368d/k370s偏斜变体、具有s364k/e357q偏斜变体的链上的p217r/p229r/n276kpi变体和两条链上的e233p/l234v/l235a/g236del/s267k消融变体。

如本领域技术人员所理解和概述的，这些序列可与本文概述的任何il-15和il-15rα(寿司)对一起使用，包括但不限于il-15/rα-异源fc、ncil-15/rα和scil-15/rα，如图22和36中示意性描绘的。另外，任何il-15和/或il-15rα(寿司)变体可以任何组合并入这些图11a-11d主链中。

在这些主链的每一个内包括与所列举的序列90％、95％、98％和99％同一的(如本文所定义)和/或含有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个额外的氨基酸取代的序列(与图的“亲本”相比，如所属领域技术人员将理解，与亲本人igg1(或igg2或igg4，这取决于主链)相比，其已含有多个氨基酸修饰)。即，除了图11a-11d的主链内所含的偏斜变体、pi变体和消融变体之外，所列举主链可以含有额外的氨基酸修饰(通常是氨基酸取代)。

图12展示基于人igg1的几个有用的靶向pd-1的il-15/rα-fc融合形式主链序列，而无细胞因子序列(例如，il-15和/或il-15rα(寿司))或vh，并且进一步排除图13中所描绘的轻链主链。主链1基于人类igg1(356e/358m同种异型)，并且包括s364k/e357q:l368d/k370s偏斜变体、具有l368d/k370s偏斜变体的链上的c220s和q295e/n384d/q418e/n421dpi变体和两条链上的e233p/l234v/l235a/g236del/s267k消融变体。主链2基于人igg1(356e/358m同种异型)，并且包括s364k/e357q:l368d/k370s偏斜变体、具有l368d/k370s偏斜变体的链上的n208d/q295e/n384d/q418e/n421dpi变体、具有s364k/e357q变体的链上的c220s和两条链上的e233p/l234v/l235a/g236del/s267k消融变体。主链3基于人类igg1(356e/358m同种异型)，并且包括s364k/e357q:l368d/k370s偏斜变体、具有l368d/k370s偏斜变体的链上的n208d/q295e/n384d/q418e/n421dpi变体、具有s364k/e357q变体的链上的q196k/i199t/p217r/p228r/n276kpi变体和两条链上的e233p/l234v/l235a/g236del/s267k消融变体。

在某些实施方案中，这些序列可以是356d/358l同种异型。在其它实施方案中，这些序列可包括n297a或n297s取代。在一些其它实施方案中，这些序列可包括m428l/n434sxtend突变。在又其它实施方案中，这些序列可以代替地基于人igg4，并且包括两条链上的s228p(eu编号，这是kabat中的s241p)变体，其消除如所属领域已知的fab臂交换。在又其它实施方案中，这些序列可以代替地基于人igg2。此外，这些序列可以替代地利用图4a-4e、5和6中描绘的其它偏斜变体、pi变体和消融变体。

如所属领域技术人员将理解并且如下所概述，这些序列可与本文概述的任何il-15和il-15rα(寿司)对一起使用，包括但不限于scil-15/rα、ncil-15/rα和dsil-15rα，如图65a-65k中示意性描绘。此外，如所属领域技术人员将理解并且如下所概述，任何il-15和/或il-15rα(寿司)变体可以并入这些主链中。此外，如所属领域技术人员将理解并且如下所概述，这些序列可与本文概述的任何vh和vl对一起使用，包括scfv或fab。

在这些主链的每一个内包括与所列举的序列90％、95％、98％和99％同一的(如本文所定义)和/或含有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个额外的氨基酸取代的序列(与图的“亲本”相比，如所属领域技术人员将理解，与亲本人igg1(或igg2或igg4，这取决于主链)相比，其已含有多个氨基酸修饰)。即，除了此图的主链内所含的偏斜变体、pi变体和消融变体之外，所列举主链可以含有额外的氨基酸修饰(通常是氨基酸取代)。

图13描绘可用于本发明的靶向pd-1的il-15/rα-fc融合蛋白的轻链的“非fv”主链(即恒定轻链)。

图14描绘了说明性抗pd-1结合结构域的可变区序列。cdr加下划线。如本文所提及且对含有cdr每一序列而言确实如此，取决于所使用的编号方法(如表1中所示)，cdr位置的精确标识可能略微不同，且因此本文中不仅包括带下划线的cdr且还包括使用其它编号系统的vh和vl结构域内所包括的cdr。此外，如对于附图中的所有序列，这些vh和vl序列可以scfv形式或fab形式使用。

图15a-图15f描绘了可用于本发明的靶向pd-1的il-15/rα-fc融合蛋白中的其他pd-1-3abd的可变区。cdr加下划线。如本文所提及且对含有cdr每一序列而言确实如此，取决于所使用的编号方法(如表1中所示)，cdr位置的精确标识可能略微不同，且因此本文中不仅包括带下划线的cdr且还包括使用其它编号系统的vh和vl结构域内所包括的cdr。此外，对于图中的所有序列，这些vh和vl序列可以以scfv格式或fab格式使用。

图16描绘了xenp21575的序列，其是基于杂交瘤克隆1c11和人igg1的可变区的嵌合抗pd-1抗体，在重链中具有e233p/l234v/l235a/g236del/s267k取代。cdr用粗体显示，且斜杠表示可变结构域的边界。如本文所述并且对于本文包含cdr的每个序列都是如此，cdr位置的精确鉴定可以根据表1中所示使用的编号略微不同，因此本文包括的不仅是下划线的cdr而且是使用其他编号系统在vh和vl域内包括的cdr。

图17描绘了通过抗pd-1克隆1c11阻断经pd-1转染的hek293t细胞上的pd-1/pd-l1相互作用。

图18描绘了抗pd-1克隆1c11与经seb刺激的t细胞的结合。

图19a-图19b描绘了seb刺激人pbmc并用抗pd-1克隆1c11处理后的细胞因子释放测定(图19a：il-2；图19b：ifnγ)。

图20a-图20c描绘了以人igg1形式的抗pd-1克隆1c11的说明性人源化变体的序列，其作为双变体抗体，其中在重链中具有e233p/l234v/l235a/g236del/s267k取代。cdr用粗体显示，且斜杠表示可变结构域的边界。如本文所提及且对含有cdr每一序列而言确实如此，取决于所使用的编号方法(如表1中所示)，cdr位置的精确标识可能略微不同，且因此本文中不仅包括粗体cdr且还包括使用其它编号系统的vh和vl结构域内所包括的cdr。如本领域技术人员所理解的，vh和vl结构域可以被格式化为fab或scfv，用于本发明的靶向pd-1的il-15/rα-fc融合蛋白。

图21描绘了通过octet确定的xenp22553对pd-1的亲和力(以及相关传感器图)。

图22a-图22g描绘用于本发明的il-15/rα-fc融合蛋白的几种形式。il-15rα异源二聚体fc融合物或“il-15/rα-异源fc”(图22a)包含以重组方式与异源二聚体fc的一侧融合的il-15和以重组方式与异源二聚体fc的另一侧融合的il-15rα(寿司)。il-15和il-15rα(寿司)可以在fc区的c端与n端之间具有可变长度的gly-ser连接子。单链il-15/rα-fc融合物或“scil-15/rα-fc”(图22b)包含通过可变长度的连接子与il-15融合的il-15rα(寿司)(称为“单链”il-15/il-15rα(寿司)复合物或“scil-15/rα”)，其随后与异源二聚体fc区的n端融合，分子的另一侧是“仅fc”或“空fc”。非共价il-15/rα-fc或“ncil-15/rα-fc”(图22c)包含与异源二聚体fc区融合的il-15rα(寿司)，同时单独转染il-15以使得形成非共价il-15/rα复合物，分子的另一侧是“仅fc”或“空fc”。二价非共价il-15/rα-fc融合物或“二价ncil-15/rα-fc”(图22d)包含与同源二聚体fc区的n端融合的il-15rα(寿司)，同时单独转染il-15以使得形成非共价il-15/rα复合物。二价单链il-15/rα-fc融合物或“二价scil-15/rα-fc”(图22e)包含通过可变长度的连接子与il-15rα(寿司)融合的il-15(称为“单链”il-15/il-15rα(寿司)复合物或“scil-15/rα”)，其随后与同源二聚体fc区的n端融合。fc-非共价il-15/rα融合物或“fc-ncil-15/rα”(图22f)包含与异源二聚体fc区的c端融合的il-15rα(寿司)，同时单独转染il-15以使得形成非共价il-15/rα复合物，分子的另一侧是“仅fc”或“空fc”。fc-单链il-15/rα融合物或“fc-scil-15/rα”(图22g)包含通过可变长度的连接子与il-15rα(寿司)融合的il-15(称为“单链”il-15/il-15rα(寿司)复合物或“scil-15/rα”)，其随后与异源二聚体fc区的c端融合，分子的另一侧是“仅fc”或“空fc”。

图23描绘“il-15/rα-异源fc”形式的说明性il-15/rα-fc融合蛋白xenp20818和xenp21475的序列。il-15和il-15rα(寿司)加下划线，连接子加双下划线(尽管如所属领域技术人员将理解，连接子可以用其它连接子代替，其中一些描绘于图9和10中)，并且斜线(/)表示il-15、il-15rα、连接子与fc区之间的边界。

图24描绘“scil-15/rα-fc”形式的说明性il-15/rα-fc融合蛋白xenp21478的序列。il-15和il-15rα(寿司)加下划线，连接子加双下划线(尽管如所属领域技术人员将理解，连接子可以用其它连接子代替，其中一些描绘于图9和10中)，并且斜线(/)表示il-15、il-15rα、连接子与fc区之间的边界。

图25a和图25b描绘了“ncil-15/rα-fc”形式的说明性il-15/rα-fc融合蛋白xenp21479、xenp22366和xenp24348的序列。il-15和il-15rα(寿司)加下划线，连接子加双下划线(尽管如所属领域技术人员将理解，连接子可以用其它连接子代替，其中一些描绘于图9和10中)，并且斜线(/)表示il-15、il-15rα、连接子与fc区之间的边界。

图26描绘“二价ncil-15/rα-fc”形式的说明性il-15/rα-fc融合蛋白xenp21978的序列。il-15和il-15rα(寿司)加下划线，连接子加双下划线(尽管如所属领域技术人员将理解，连接子可以用其它连接子代替，其中一些描绘于图9和10中)，并且斜线(/)表示il-15、il-15rα、连接子与fc区之间的边界。

图27描绘“二价scil-15/rα-fc”形式的说明性il-15/rα-fc融合蛋白的序列。il-15和il-15rα(寿司)加下划线，连接子加双下划线(尽管如所属领域技术人员将理解，连接子可以用其它连接子代替，其中一些描绘于图9和10中)，并且斜线(/)表示il-15、il-15rα、连接子与fc区之间的边界。

图28描绘“fc-ncil-15/rα”形式的说明性il-15/rα-fc融合蛋白xenp22637的序列。il-15和il-15rα(寿司)加下划线，连接子加双下划线(尽管如所属领域技术人员将理解，连接子可以用其它连接子代替，其中一些描绘于图9和10中)，并且斜线(/)表示il-15、il-15rα、连接子与fc区之间的边界。

图29描绘“fc-scil-15/rα”形式的说明性il-15/rα-fc融合蛋白的序列。il-15和il-15rα(寿司)加下划线，连接子加双下划线(尽管如所属领域技术人员将理解，连接子可以用其它连接子代替，其中一些描绘于图9和10中)，并且斜线(/)表示il-15、il-15rα、连接子与fc区之间的边界。

图30a-图30c描绘通过具有如由facs测量的基于ki67表达的不同连接子长度的形式a的说明性il-15/rα-fc融合蛋白，(图30a)nk(cd56+/cd16+)细胞、(图30b)cd4+t细胞和(图30c)cd8+t细胞增殖的诱导。

图31a-图31c描绘通过如由facs测量的基于ki67表达的scil-15/rα-fc形式(xenp21478)和ncil-15/rα-fc形式(xenp21479)的说明性il-15/rα-fc融合蛋白，(图31a)nk(cd56+/cd16+)细胞、(图31b)cd4+t细胞和(图31c)cd8+t细胞增殖的诱导。

图32描绘展示工程化的二硫键对位置的il-15/rα异二聚体的结构模型。

图33描绘为了充当工程化的半胱氨酸残基的骨架，用c端处的额外残基工程化的说明性il-15rα(寿司)变体的序列。

图34描绘为了与用半胱氨酸工程化的il-15rα(寿司)变体形成共价二硫键，用半胱氨酸工程化的说明性il-15变体的序列。

图35描绘为了与用半胱氨酸工程化的il-15变体形成共价二硫键，用半胱氨酸工程化的说明性il-15rα(寿司)变体的序列。

图36a-图36d描绘了用于本发明的具有工程化二硫键的il-15/rα-fc融合蛋白的其他形式。二硫键键合的il-15/rα异源二聚体fc融合物或“dsil-15/rα-异源fc”(图36a)与“il-15/rα-异源fc”相同，但其中由于工程化的半胱氨酸，il-15rα(寿司)和il-15进一步共价连接。二硫键键合的il-15/rαfc融合物或“dsil-15/rα-fc”(图36b)与“ncil-15/rα-fc”相同，但其中由于工程化的半胱氨酸，il-15rα(寿司)和il-15进一步共价连接。二价二硫键键合的il-15/rα-fc或“二价dsil-15/rα-fc”(图36c)与“二价ncil-15/rα-fc”相同，但其中由于工程化的半胱氨酸，il-15rα(寿司)和il-15进一步共价连接。fc-二硫键键合的il-15/rα融合物或“fc-dsil-15/rα”(图36d)与“fc-ncil-15/rα”相同，但其中由于工程化的半胱氨酸，il-15rα(寿司)和il-15进一步共价连接。

图37a-图37b描绘“dsil-15/rα-异源fc”形式的说明性il-15/rα-fc融合蛋白xenp22013、xenp22014、xenp22015和xenp22017的序列。il-15和il-15rα(寿司)加下划线，连接子加双下划线(尽管如所属领域技术人员将理解，连接子可以用其它连接子代替，其中一些描绘于图9中)，并且斜线(/)表示il-15、il-15rα、连接子与fc区之间的边界。

图38a-图38b描绘“dsil-15/rα-fc”形式的说明性il-15/rα-fc融合蛋白xenp22357、xenp22358、xenp22359、xenp22684和xenp22361的序列。il-15和il-15rα(寿司)加下划线，连接子加双下划线(尽管如所属领域技术人员将理解，连接子可以用其它连接子代替，其中一些描绘于图9和10中)，并且斜线(/)表示il-15、il-15rα、连接子与fc区之间的边界。

图39描绘“二价dsil-15/rα-fc”形式的说明性il-15/rα-fc融合蛋白xenp22634、xenp22635和xenp22636的序列。il-15和il-15rα(寿司)加下划线，连接子加双下划线(尽管如所属领域技术人员将理解，连接子可以用其它连接子代替，其中一些描绘于图9和图10中)，并且斜线(/)表示il-15、il-15rα、连接子与fc区之间的边界。

图40描绘“fc-dsil-15/rα”形式的说明性il-15/rα-fc融合蛋白xenp22639和xenp22640的序列。il-15和il-15rα(寿司)加下划线，连接子加双下划线(尽管如所属领域技术人员将理解，连接子可以用其它连接子代替，其中一些描绘于图9和10中)，并且斜线(/)表示il-15、il-15rα、连接子与fc区之间的边界。

图41描绘具有和不具有如由cef测定的工程化的二硫键的说明性il-15/rα-fc融合蛋白的纯度和均匀性。

图42示出基于通过facs测量的ki67表达的a)nk(cd56+/cd16+)细胞、b)cd8⁺t细胞和c)cd4⁺t细胞通过说明性il-15/rα-fc融合蛋白诱导增殖，该蛋白有和没有工程化二硫键。

图43描绘与il-15rα、il-2rβ和共同γ链复合的il-15的结构。示出了被设计来降低效能的取代位置。

图44描绘了工程设计用于降低效力的说明性il-15的变体的序列。在这些变体il-15序列的每一个内包括与所列举的序列90％、95％、98％和99％一致(如本文所定义)和/或含有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个额外的氨基酸取代的序列。在一非限制性实例中，所列举的序列可以含有额外的氨基酸修饰，例如有助于形成如实施例3b中所述的共价二硫键的氨基酸修饰。

图45a-图45d描绘为降低效力而工程化的“il-15/rα-异源fc”形式的说明性il-15/rα-fc融合蛋白xenp22821、xenp22822、xenp23554、xenp23557、xenp23561、xenp24018、xenp24019、xenp24045、xenp24051和xenp24052的序列。il-15和il-15rα(寿司)加下划线，连接子加双下划线(尽管如所属领域技术人员将理解，连接子可以用其它连接子代替，其中一些描绘于图9和10中)，并且斜线(/)表示il-15、il-15rα、连接子与fc区之间的边界。

图46a-图46c描绘了为降低效能而工程化的“scil-15/rα-fc”形式的说明性il-15/rα-fc融合蛋白xenp24015、xenp24050、xenp24475、xenp24476、xenp24478、xenp24479和xenp24481的序列。il-15和il-15rα(寿司)加下划线，连接子加双下划线(尽管如所属领域技术人员将理解，连接子可以用其它连接子代替，其中一些描绘于图9和10中)，并且斜线(/)表示il-15、il-15rα、连接子与fc区之间的边界。

图47a-图47b描绘了为降低的效能而工程化的“ncil-15/rα-fc”形式的说明性il-15/rα-fc融合蛋白xenp24349、xenp24890和xenp25138的序列。il-15和il-15rα(寿司)加下划线，连接子加双下划线(尽管如所属领域技术人员将理解，连接子可以用其它连接子代替，其中一些描绘于图9和图10中)，并且斜线(/)表示il-15、il-15rα、连接子与fc区之间的边界。

图48描绘为效能降低而工程化的说明性ncil-15/rα异源二聚体xenp22801和xenp22802的序列。重要的是要注意这些序列在il-15rα(寿司)的c端使用聚组氨酸(his6或hhhhhh)c端标签产生。

图49描绘为效能降低而工程化的“二价ncil-15/rα-fc”形式的说明性il-15/rα-fc融合蛋白xenp24342的序列。il-15和il-15rα(寿司)加下划线，连接子加双下划线(尽管如所属领域技术人员将理解，连接子可以用其它连接子代替，其中一些描绘于图9和图10中)，并且斜线(/)表示il-15、il-15rα、连接子与fc区之间的边界。

图50描绘为效能降低而工程化的“dsil-15/rα-fc的”形式的说明性il-15/rα-fc融合蛋白xenp23472和xenp23473的序列。il-15和il-15rα(寿司)加下划线，连接子加双下划线(尽管如所属领域技术人员将理解，连接子可以用其它连接子代替，其中一些描绘于图9和10中)，并且斜线(/)表示il-15、il-15rα、连接子与fc区之间的边界。

图51描绘基于通过facs测量的ki67表达的a)nk细胞、b)cd8⁺(cd45ra-)t细胞和c)cd4⁺(cd45ra-)t细胞通过变体il-15/rα-fc融合蛋白诱导增殖。

图52描绘了通过变体il-15/rα-fc融合蛋白诱导nk和cd8⁺t细胞增殖的ec50，和相对于xenp20818的ec50的倍数减小。

图53a-图53c描绘了用于图56中描绘的实验的淋巴细胞和亚群的门控。图53a显示门控的淋巴细胞群。图53b显示了cd3阴性和cd3阳性亚群。图53c显示了cd3阴性细胞的cd16阴性和cd16阳性亚群。

图54a-图54c描绘了用于图56中描绘的实验的cd3⁺淋巴细胞亚群的门控。图54a显示了cd3⁺t细胞的cd4⁺、cd8⁺和γδt细胞亚群。图54b显示了cd4⁺t细胞的cd45ra(-)和cd45ra(+)亚群。图54c显示了cd8⁺t细胞的cd45ra(-)和cd45ra(+)亚群。

图55a-图55b描绘了在用xenp22821孵育人pbmc之前(图55a)和之后(图55b)的cd69和cd25表达。

图56a-图56d描绘了与所示的变体il-15/rα-fc融合蛋白孵育四天的人pbmc中的细胞增殖。图56a-56c显示了增殖nk细胞(cd3-cd16⁺)(图56a)、cd8⁺t细胞(cd3+cd8+cd45ra-)(图56b)和cd4⁺t细胞(cd3+cd4+cd45ra-)(图56c)的百分比。图56d展示相对于对照(xenp20818)，各种il15/il15rαfc异源二聚体的ec50的倍数变化。

图57a-图57d描绘了与所示变体il-15/rα-fc融合蛋白孵育三天的人pbmc中的细胞增殖。图57a-c展示增殖cd8⁺(cd45ra-)t细胞(图57a)、cd4⁺(cd45ra-)t细胞(图57b)、γδt细胞(图57c)和nk细胞(图57d)的百分比。

图58a-图58c描绘了在用额外il-15/rα变体处理之后(图58a)cd8+t细胞、(图58b)cd4+t细胞、和(图58c)nk细胞上的ki67表达的百分比。

图59a-59e描绘在用il-15/rα变体处理之后(图59a)cd8+(cd45ra-)t细胞、(图59b)cd4+(cd45ra-)t细胞、(图59c)γδt细胞、(图59d)nk(cd16+cd8α-)细胞和(图59e)nk(cd56+cd8α-)细胞上的ki67表达的百分比。

图60a-60e描绘在用il-15/rα变体处理之后(图60a)cd8+(cd45ra-)t细胞、(图60b)cd4+(cd45ra-)t细胞、(图60c)γδt细胞、(图60d)nk(cd16+cd8α-)细胞和(图60e)nk(cd56+cd8α-)细胞上的ki67表达的百分比。

图61a-图61d描绘了在用额外il-15/rα变体处理之后(图61a)cd8+t细胞、(图61b)cd4+t细胞、(图61c)γδt细胞和(图61d)nk(cd16+)细胞上的ki67表达的百分比。

图62a-图62d描绘了在用额外il-15/rα变体处理之后(图62a)cd8+t细胞、(图62b)cd4+t细胞、(图62c)γδt细胞和(图62d)nk(cd16+)细胞上的ki67表达的百分比。

图63描绘在0.1mg/kg单次剂量下的c57bl/6小鼠中各种il-15/rαf融合蛋白或对照的iv-tv剂量pk。

图64描绘在用为效能较低而工程化的il-15/rα-fc融合蛋白处理之后半衰期对比nk细胞效能的相关性。

图65a-图65k描绘用于本发明的靶向pd-1的il-15/rα-fc融合蛋白的几种形式。“scil-15/rα×scfv”形式(图65a)包含通过可变长度的连接子与il-15融合的il-15rα(寿司)(称为“scil-15/rα”)，其随后与异源二聚体fc区的n端融合，scfv与异源二聚体fc的另一侧融合。“scfv×ncil-15/rα”形式(图65b)包含与异源二聚体fc区的n端融合的scfv，il-15rα(寿司)与异源二聚体fc的另一侧融合，同时单独转染il-15以使得形成非共价il-15/rα复合物。“scfv×dsil-15/rα”形式(图65c)与“scfv×ncil-15/rα”形式相同，但其中由于工程化的半胱氨酸，il-15rα(寿司)和il-15共价连接。“scil-15/rαxfab”形式(图65d)包含通过可变长度的连接子与il-15融合的il-15rα(寿司)(称为“scil-15/rα”)，其随后与异源二聚体fc区的n端融合，可变重链(vh)与异源二聚体fc的另一侧融合，同时单独转染相应轻链以形成具有vh的fab。“ncil-15/rα×fab”形式(图65e)包含与异源二聚体fc区的n端融合的vh，il-15rα(寿司)与异源二聚体fc的另一侧融合，同时单独转染相应轻链以形成具有vh的fab，并且同时单独转染il-15以使得形成非共价il-15/rα复合物。“dsil-15/rα×fab”形式(图65f)与“ncil-15/rα×fab”形式相同，但其中由于工程化的半胱氨酸，il-15rα(寿司)和il-15共价连接。“mab-scil-15/rα”形式(图65g)包含与第一和第二异源二聚体fc的n端融合的vh，il-15与随后与异源二聚体fc区中的一个的c端进一步融合的il-15rα(寿司)融合，同时单独转染相应轻链以形成具有vh的fab。“mab-ncil-15/rα”形式(图65h)包含与第一和第二异源二聚体fc的n端融合的vh，il-15rα(寿司)与异源二聚体fc区中的一个的c端融合，同时单独转染相应轻链以形成具有vh的fab，并且同时单独转染il-15以使得形成非共价il-15/rα复合物。“mab-dsil-15/rα”形式(图65i)与“mab-ncil-15/rα”形式相同，但其中由于工程化的半胱氨酸，il-15rα(寿司)和il-15共价连接。“中心-il-15/rα”形式(图65j)包含以重组方式与随后与异源二聚体fc的一侧进一步融合的il-15的n端融合的vh和以重组方式与随后与异源二聚体fc的另一侧进一步融合的il-15rα(寿司)的n端融合的vh，同时单独转染相应轻链以形成具有vh的fab。“中心-scil-15/rα”形式(图65k)包含与il-15rα(寿司)的n端融合的vh和与异源二聚体fc的另一侧融合的vh，所述il-15rα(寿司)与随后与异源二聚体fc的一侧进一步融合的il-15融合，同时单独转染相应轻链以形成具有vh的fab。

图66描绘“scil-15/rαxscfv”形式的说明性靶向pd-1的il-15/rα-fc融合蛋白xenp21480的序列。cdr加粗。如本文所提及且对含有cdr每一序列而言确实如此，取决于所使用的编号方法(如表1中所示)，cdr位置的精确标识可能略微不同，且因此本文中不仅包括粗体cdr且还包括使用其它编号系统的vh和vl结构域内所包括的cdr。il-15和il-15rα(寿司)加下划线，连接子加双下划线(尽管如所属领域技术人员将理解，连接子可以用其它连接子代替，其中一些描绘于图9和图10中)，并且斜线(/)表示il-15、il-15rα、连接子、可变区域和恒定/fc区之间的边界。

图67描绘“scfvxncil-15/rα”形式的说明性靶向pd-1的il-15/rα-fc融合蛋白的序列。cdr加粗。如本文所提及且对含有cdr每一序列而言确实如此，取决于所使用的编号方法(如表1中所示)，cdr位置的精确标识可能略微不同，且因此本文中不仅包括粗体cdr且还包括使用其它编号系统的vh和vl结构域内所包括的cdr。il-15和il-15rα(寿司)加下划线，连接子加双下划线(尽管如所属领域技术人员将理解，连接子可以用其它连接子代替，其中一些描绘于图9和图10中)，并且斜线(/)表示il-15、il-15rα、连接子、可变区域和恒定/fc区之间的边界。

图68描绘“scfvxdsil-15/rα”形式的说明性靶向pd-1的il-15/rα-fc融合蛋白的序列。cdr加粗。如本文所提及且对含有cdr每一序列而言确实如此，取决于所使用的编号方法(如表1中所示)，cdr位置的精确标识可能略微不同，且因此本文中不仅包括粗体cdr且还包括使用其它编号系统的vh和vl结构域内所包括的cdr。il-15和il-15rα(寿司)加下划线，连接子加双下划线(尽管如所属领域技术人员将理解，连接子可以用其它连接子代替，其中一些描绘于图9和图10中)，并且斜线(/)表示il-15、il-15rα、连接子、可变区域和恒定fc区之间的边界。

图69a-69c描绘“scil-15/rαxfab”形式的说明性靶向pd-1的il-15/rα-fc融合蛋白的序列。cdr加粗。如本文所提及且对含有cdr每一序列而言确实如此，取决于所使用的编号方法(如表1中所示)，cdr位置的精确标识可能略微不同，且因此本文中不仅包括粗体cdr且还包括使用其它编号系统的vh和vl结构域内所包括的cdr。il-15和il-15rα(寿司)加下划线，连接子加双下划线(尽管如所属领域技术人员将理解，连接子可以用其它连接子代替，其中一些描绘于图9和图10中)，并且斜线(/)表示il-15、il-15rα、连接子、可变区域和恒定fc区之间的边界。

图70描绘“fabxncil-15/rα”形式的说明性靶向pd-1的il-15/rα-fc融合蛋白xenp22112的序列。cdr加粗。如本文所提及且对含有cdr每一序列而言确实如此，取决于所使用的编号方法(如表1中所示)，cdr位置的精确标识可能略微不同，且因此本文中不仅包括粗体cdr且还包括使用其它编号系统的vh和vl结构域内所包括的cdr。il-15和il-15rα(寿司)加下划线，连接子加双下划线(尽管如所属领域技术人员将理解，连接子可以用其它连接子代替，其中一些描绘于图9和图10中)，并且斜线(/)表示il-15、il-15rα、连接子、可变区域和恒定fc区之间的边界。

图71描绘“fabxdsil-15/rα”形式的说明性靶向pd-1的il-15/rα-fc融合蛋白xenp22641的序列。cdr加粗。如本文所提及且对含有cdr每一序列而言确实如此，取决于所使用的编号方法(如表1中所示)，cdr位置的精确标识可能略微不同，且因此本文中不仅包括粗体cdr且还包括使用其它编号系统的vh和vl结构域内所包括的cdr。il-15和il-15rα(寿司)加下划线，连接子加双下划线(尽管如所属领域技术人员将理解，连接子可以用其它连接子代替，其中一些描绘于图9和图10中)，并且斜线(/)表示il-15、il-15rα、连接子、可变区域和恒定/fc区之间的边界。

图72a-图72b描绘“mabxscil-15/rα”形式的说明性靶向pd-1的il-15/rα-fc融合蛋白的序列。cdr加粗。如本文所提及且对含有cdr每一序列而言确实如此，取决于所使用的编号方法(如表1中所示)，cdr位置的精确标识可能略微不同，且因此本文中不仅包括粗体cdr且还包括使用其它编号系统的vh和vl结构域内所包括的cdr。il-15和il-15rα(寿司)加下划线，连接子加双下划线(尽管如所属领域技术人员将理解，连接子可以用其它连接子代替，其中一些描绘于图9和图10中)，并且斜线(/)表示il-15、il-15rα、连接子、可变区域和恒定/fc区之间的边界。

图73a-图73b描绘“mabxncil-15/rα”形式的说明性靶向pd-1的il-15/rα-fc融合蛋白xenp22642和xenp22643的序列。cdr加粗。如本文所提及且对含有cdr每一序列而言确实如此，取决于所使用的编号方法(如表1中所示)，cdr位置的精确标识可能略微不同，且因此本文中不仅包括粗体cdr且还包括使用其它编号系统的vh和vl结构域内所包括的cdr。il-15和il-15rα(寿司)加下划线，连接子加双下划线(尽管如所属领域技术人员将理解，连接子可以用其它连接子代替，其中一些描绘于图9和图10中)，并且斜线(/)表示il-15、il-15rα、连接子、可变区域和恒定/fc区之间的边界。

图74描绘“mabxdsil-15/rα”形式的说明性靶向pd-1的il-15/rα-fc融合蛋白xenp22644和xenp22645的序列。cdr加粗。如本文所提及且对含有cdr每一序列而言确实如此，取决于所使用的编号方法(如表1中所示)，cdr位置的精确标识可能略微不同，且因此本文中不仅包括粗体cdr且还包括使用其它编号系统的vh和vl结构域内所包括的cdr。il-15和il-15rα(寿司)加下划线，连接子加双下划线(尽管如所属领域技术人员将理解，连接子可以用其它连接子代替，其中一些描绘于图9和图10中)，并且斜线(/)表示il-15、il-15rα、连接子、可变区域和恒定/fc区之间的边界。

图75描绘“中心-il-15/rα”形式的说明性靶向pd-1的il-15/rα-fc融合蛋白的序列。cdr加粗。如本文所提及且对含有cdr每一序列而言确实如此，取决于所使用的编号方法(如表1中所示)，cdr位置的精确标识可能略微不同，且因此本文中不仅包括粗体cdr且还包括使用其它编号系统的vh和vl结构域内所包括的cdr。il-15和il-15rα(寿司)加下划线，连接子加双下划线(尽管如所属领域技术人员将理解，连接子可以用其它连接子代替，其中一些描绘于图9和图10中)，并且斜线(/)表示il-15、il-15rα、连接子、可变区域和恒定/fc区之间的边界。

图76描绘“中心-scil-15/rα”形式的说明性靶向pd-1的il-15/rα-fc融合蛋白的序列。cdr加粗。如本文所提及且对含有cdr每一序列而言确实如此，取决于所使用的编号方法(如表1中所示)，cdr位置的精确标识可能略微不同，且因此本文中不仅包括粗体cdr且还包括使用其它编号系统的vh和vl结构域内所包括的cdr。il-15和il-15rα(寿司)加下划线，连接子加双下划线(尽管如所属领域技术人员将理解，连接子可以用其它连接子代替，其中一些描绘于图9和图10中)，并且斜线(/)表示il-15、il-15rα、连接子、可变区域和恒定/fc区之间的边界。

图77a-图77f提供了说明性靶向pd-1的il-15/rα-fc融合蛋白xenp21480的数据。图77a描绘了说明性靶向pd-1的il-15/rα-fc融合蛋白xenp21480的形式。图77b描绘了通过sec确定的xenp21480的纯度和均质性。图77c描绘了通过cef确定的xenp21480的纯度和均质性。图77d描绘了由ocnet确定的xenp21480对il-2rβ的亲和力。图77e描绘了由ocnet确定的xenp21480对pd-1的亲和力。图77f描绘了由dsf确定的xenp21480的稳定性。

图78a-图78b描绘了来自octet实验的传感图，用于确认两批xenp25850与il-2rβ：共同γ链复合物(图78a)和pd-1(图78b)的结合。

图79a-图79c描绘通过说明性靶向pd-1的il-15/rα-fc融合蛋白和对照诱导nk(cd56⁺/cd16⁺)细胞(图79a)、cd4⁺t细胞(图79b)和cd8⁺t细胞(图79c)增殖。

图80描绘在seb刺激的pbmc测定中通过说明性靶向pd-1的il-15/rα-fc融合蛋白和对照相对于pbs增强il-2分泌。

图81描绘在用说明性靶向pd-1的il-15/rα-fc融合蛋白xenp25850和对照治疗后在植入hupbmc的小鼠的血清中第4、7和11天的ifnγ水平。

图82a-图82c描绘了在用说明性的靶向pd-1的il-15/rα-fc融合蛋白xenp25850和对照治疗后植入hupbmc的小鼠的血清中第4天(图82a)、第7天(图82b)和第11天(图82c)的cd8+t细胞计数。

图83a-图83c描绘了在用说明性的靶向pd-1的il-15/rα-fc融合蛋白xenp25850和对照治疗后植入hupbmc的小鼠的血清中第4天(图83a)、第7天(图83b)和第11天(图83c)的cd4+t细胞计数。

图84a-图84c描绘了在用说明性的靶向pd-1的il-15/rα-fc融合蛋白xenp25850和对照治疗后植入hupbmc的小鼠的血清中第4天(图84a)、第7天(图84b)和第11天(图84c)的cd45+t细胞计数。

图85a-图85c描绘了在用说明性的靶向pd-1的il-15/rα-fc融合蛋白xenp25850和对照治疗后第4天(图85a)、第7天(图85b)和第11天(图85c)植入hupbmc的小鼠的体重占初始体重的百分比。每个点代表一只nsg小鼠。将体重降至初始体重的70％以下的小鼠实施安乐死。死老鼠占70％。

图86描绘了具有消融变体(e233p/l234v/l235a/g236del/s267k,“igg1_pva_/s267k”)的二价抗pd-1mabxenp16432的序列。cdr加下划线。如本文所提及且对含有cdr每一序列而言确实如此，取决于所使用的编号方法(如表1中所示)，cdr位置的精确标识可能略微不同，且因此本文中不仅包括带下划线的cdr且还包括使用其它编号系统的vh和vl结构域内所包括的cdr。

图87描绘了以人igg1形式的抗pd-1克隆1c11单臂抗体的说明性人源化变体(xenp25951)的序列，其中在重链中具有e233p/l234v/l235a/g236del/s267k取代。cdr用粗体显示，且斜杠表示可变结构域的边界。如本文所述并且对于本文包含cdr的每个序列都是如此，cdr位置的精确鉴定可以根据表1中所示使用的编号略微不同，因此本文包括的不仅是下划线的cdr而且是使用其他编号系统在vh和vl域内包括的cdr。如本领域技术人员所理解的，vh和vl结构域可以被格式化为fab或scfv，用于本发明的il-15/rαx抗-pd-1异源二聚蛋白。

图88a-图88c描绘了在用指定的测试物品处理后第4天(图88a)、第7天(图88b)和第11天(图88c)在nsg小鼠中的cd45⁺细胞计数。

图89a-图89c描绘了在用指定的测试物品处理后第4天(图89a)、第7天(图89b)和第11天(图89c)在nsg小鼠中的cd3⁺细胞计数。

图90a-图90c描绘了在用xenp24050(0.61mg/kg)、xenp25951(0.82mg/kg)、xenp25951(0.82mg/kg)+xenp24050(0.61mg/kg)或xenp25850(1.0mg/kg)处理后第4天(图90a)、第7天(图90b)和第11天(图90c)在nsg小鼠中的cd4⁺细胞计数。

图91a-图91c描绘了在用指定的测试物品处理后第4天(图91a)、第7天(图91b)和第11天(图91c)在nsg小鼠中的cd8⁺细胞计数。

图92a-图92h描绘了通过xenp20818(wtil-15/rα-fc)、xenp24050(说明性效力降低的il-15/rα-fc)和xenp25850(说明性靶向pd-1的il-15/rα-fc融合蛋白)在cd4⁺cd45ra⁺cd25^-(图92a)、cd4⁺cd45ra⁺cd25⁺(图92b)、cd4⁺cd45ra^-cd25⁺(图92c)、cd4⁺cd45ra^-cd25^-(图92d)、cd8⁺cd45ra⁺cd25^-(图92e)、cd8⁺cd45ra⁺cd25⁺(图92f)、cd8⁺cd45ra^-cd25⁺(图92g)和cd8⁺cd45ra^-cd25^-(图92h)上诱导stat5磷酸化。新鲜细胞用虚线表示，激活的细胞用实线表示。新鲜细胞都是cd25^-。

图93a-图93t描绘了抗pd-1克隆1c11的说明性scfv变体的序列。scfv变体名称是加粗的，cdr是带下划线的，scfv连接子是带双下划线的(在序列中，scfv连接子是带正电scfv(gkpgs)4连接子，尽管如将为所属领域的技术人员所了解，此连接子可以替换为其它连接子，包括不带电或带负电连接子，例如但不限于图9和图10中的那些)，且斜杠表示可变结构域的边界。如本文所提及且对含有cdr每一序列而言确实如此，取决于所使用的编号方法(如表1中所示)，cdr位置的精确标识可能略微不同，且因此本文中不仅包括带下划线的cdr且还包括使用其它编号系统的vh和vl结构域内所包括的cdr。此外，命名规则说明scfv由n端到c端的方向；此图中的一些序列定向为vh-scfv连接子-vl(由n端到c端)，虽然一些被定向为vl-scfv连接子-vh(由n端到c端)，但如所属领域的技术人员将了解，这些序列也可以从本文中的描述按相反方向使用。此外，如所属领域的技术人员将了解，vh和vl结构域可以格式化为fab或scfv。另外，每个cdr在序列表中具有其自身的seqidno:或序列标识符，且每个vh和vl结构域在序列表中具有其自身的seqidno:或序列标识符。

图94a到94ap描绘了基于克隆1c11的说明性变体抗pd-1mab的序列。变体抗pd-1mab名称是加粗的，cdr是带下划线的，且斜杠表示可变结构域的边界。如本文所提及且对含有cdr每一序列而言确实如此，取决于所使用的编号方法(如表1中所示)，cdr位置的精确标识可能略微不同，且因此本文中不仅包括带下划线的cdr且还包括使用其它编号系统的vh和vl结构域内所包括的cdr。如所属领域的技术人员将了解，vh和vl结构域可以格式化为fab或scfv。另外，每个cdr在序列表中具有其自身的seqidno:或序列标识符，且每个vh和vl结构域在序列表中具有其自身的seqidno:或序列标识符。

图95a-95j描绘了基于xenp22553的重链的变体重链的序列。可变重链名称为粗体，并且cdr带下划线。如本文所提及且对含有cdr每一序列而言确实如此，取决于所使用的编号方法(如表1中所示)，cdr位置的精确标识可能略微不同，且因此本文不仅包括带下划线的cdr还包括vh结构域内所包括的cdr。如所属领域的技术人员将了解，vh结构域可以用于fab或scfv中。另外，每个cdr在序列表中具有其自身的seqidno:或序列标识符，且每个vh结构域在序列表中具有其自身的seqidno:或序列标识符。

图96a-96f描绘了基于xenp22553的轻链的变体轻链的序列。可变轻链名称为粗体，并且cdr带下划线。如本文所提及且对含有cdr每一序列而言确实如此，取决于所使用的编号方法(如表1中所示)，cdr位置的精确标识可能略微不同，且因此本文中不仅包括带下划线的cdr且还包括使用其它编号系统的vl结构域内所包括的cdr。如所属领域的技术人员将了解，vl结构域可以用于fab或scfv中。另外，每个cdr在序列表中具有其自身的seqidno:或序列标识符，且每个vl结构域在序列表中具有其自身的seqidno:或序列标识符。

图97a-97p描绘了通过dsf所确定的变体抗pd-1scfv的稳定性和通过octet所确定的基于来自变体scfv的vh/vl的抗pd-1mab的平衡解离常数(kd)、缔合速率(ka)和解离速率(kd)。scfv的xenp用粗体表示，全长mab的xenp用括号括起来。

图98描绘了通过octet所确定的变体抗pd-1mab的平衡解离常数(kd)、缔合速率(ka)和解离速率(kd)。

图99描绘了通过octet所确定的变体抗pd-1mab的平衡解离常数(kd)、缔合速率(ka)和解离速率(kd)。

图100描绘了通过octet所确定的人类pd-1的抗pd-11c11变体的亲和/解离常数(kd)、缔合速率(ka)和解离速率(kd)。

图101描绘了通过octet所确定的人类pd-1的抗pd-11c11变体的亲和/解离常数(kd)、缔合速率(ka)和解离速率(kd)。

图102描绘了通过octet所确定的人类pd-1的抗pd-11c11变体的亲和/解离常数(kd)、缔合速率(ka)和解离速率(kd)。

图103描绘了通过octet所确定的人类pd-1的抗pd-11c11变体的亲和/解离常数(kd)、缔合速率(ka)和解离速率(kd)。

图104描绘了通过octet所确定的人类pd-1和食蟹猴pd-1的抗pd-11c11变体的亲和/解离常数(kd)、缔合速率(ka)和解离速率(kd)。

图105a-105e描绘了通过octet所确定的变体抗pd-1mab的平衡解离常数(kd)、缔合速率(ka)和解离速率(kd)。变体由图95a-95j和图96a-96f中所描绘的重链和轻链xend所定义。

图106描绘了通过octet所确定的变体抗pd-1mab的平衡解离常数(kd)、缔合速率(ka)和解离速率(kd)。变体由图95a-95j和图96a-96f中所描绘的重链和轻链xend所定义。

图107描绘了通过biacore所确定的抗pd-11c11变体的亲和力(kd)。

图108描绘了亲和力优化的抗pd-11c11变体与经seb刺激t细胞的结合。

图109a-图109d描绘了包括亲和力优化的pd-1靶向臂的说明性靶向pd-1的il-15/rα-fc融合体的序列。cdr加粗。如本文所提及且对含有cdr每一序列而言确实如此，取决于所使用的编号方法(如表1中所示)，cdr位置的精确标识可能略微不同，且因此本文中不仅包括粗体cdr且还包括使用其它编号系统的vh和vl结构域内所包括的cdr。il-15和il-15rα(寿司)加下划线，连接子加双下划线(尽管如所属领域技术人员将理解，连接子可以用其它连接子代替，其中一些描绘于图9和图10中，并且斜线(/)表示il-15、il-15rα、连接子、可变区域和恒定/fc区之间的边界。

图110a-图110b描绘了以靶向pd-1的il-15/rα-fc融合蛋白(和对照)诱导a)cd8⁺t细胞和b)cd4⁺t细胞的增殖，以增殖细胞百分比(基于cfse稀释度确定)表示。数据显示，与未靶向的il-15(d30n/e64q/n65d)/rα-fc融合蛋白(以及对照靶向rsv的il-15/rα-fc融合蛋白)相比，靶向pd-1的il-15/rα-fc融合蛋白在诱导cd4⁺t细胞增殖方面更有效。值得注意的是，具有较高亲和力pd-1结合结构域的xenp29159在cd8⁺和cd4⁺t细胞增殖方面都比xenp25850(以及xenp24306和xenp26007)更有效。

图111a-图111b描绘了靶向pd-1的il-15/rα-fc融合蛋白(和对照)对a)cd8记忆t细胞和b)cd8幼稚t细胞增殖的诱导，以增殖细胞百分比(基于cfse稀释度确定)表示。数据显示，与未靶向的il-15(d30n/e64q/n65d)/rα-fc融合蛋白(以及对照靶向rsv的il-15/rα-fc融合蛋白)相比，以靶向pd-1的il-15/rα-fc融合蛋白在诱导cd8记忆t细胞增殖方面更有效。值得注意的是，具有较高亲和力pd-1结合结构域的xenp29159在cd8记忆t细胞增殖方面比xenp25850更有效。

图112a-图112b描绘了如细胞计数所示，通过靶向pd-1的il-15/rα-fc融合蛋白(和对照)诱导a)cd8记忆t细胞和b)cd8幼稚t细胞增殖。

图113a-图113b描绘了靶向pd-1的il-15/rα-fc融合蛋白(和对照)对a)cd4记忆t细胞和b)cd4幼稚t细胞增殖的诱导，以增殖细胞百分比(基于cfse稀释度确定)表示。数据显示，与未靶向的il-15(d30n/e64q/n65d)/rα-fc融合蛋白(以及对照靶向rsv的il-15/rα-fc融合蛋白)相比，以靶向pd-1的il-15/rα-fc融合蛋白在诱导cd4记忆t细胞增殖方面更有效。值得注意的是，具有较高亲和力pd-1结合结构域的xenp29159在cd4记忆t细胞增殖方面比xenp25850更有效。

图114a-图143b描绘了如细胞计数所示，通过靶向pd-1的il-15/rα-fc融合蛋白(和对照)诱导a)cd4记忆t细胞和b)cd4幼稚t细胞增殖。数据显示，与未靶向的il-15(d30n/e64q/n65d)/rα-fc融合蛋白(以及对照靶向rsv的il-15/rα-fc融合蛋白)相比，以靶向pd-1的il-15/rα-fc融合蛋白在扩大cd4记忆t细胞方面更有效。值得注意的是，具有较高亲和力pd-1结合结构域的xenp29159在cd4记忆t细胞增殖方面比xenp25850更有效。

图115a-图115b描绘了通过靶向pd-1的il-15/rα-fc融合(和对照)诱导nk细胞增殖，如a)通过增殖细胞百分比(基于cfse稀释度确定)和b)通过细胞计数所示。

图116a-图116d描绘了在与靶向pd-1的il-15/rα-fc融合(和对照)孵育后t细胞的活化，如a)表达cd25的cd8记忆t细胞的百分数，b)表达cd25的cd8幼稚t细胞的百分数，c)表达cd25的cd4记忆t细胞的百分数，和d)表达cd25的cd4幼稚t细胞的百分数所示。数据显示，与未靶向的il-15(d30n/e64q/n65d)/rα-fc融合(以及对照靶向rsv的il-15/rα-fc融合蛋白)相比，靶向pd-1的il-15/rα-fc融合蛋白似乎更有效地上调在cd8⁺和cd4⁺t细胞上的cd25。

图117a-图117d描绘了与靶向pd-1的il-15/rα-fc融合(和对照)孵育后，cd8⁺t细胞的活化，如a)cd8记忆t细胞上的hla-drmfi，b)表达hla-dr的cd8记忆t细胞的百分比，c)cd8幼稚t细胞上的hla-drmfi和d)表达hla-dr的cd8幼稚t细胞百分比所示。

图118a-图118d描绘了与靶向pd-1的il-15/rα-fc融合蛋白(和对照)孵育后，cd4⁺t细胞的活化，如a)cd4记忆t细胞上的hla-drmfi，b)表达hla-dr的cd4记忆t细胞的百分比，c)cd4幼稚t细胞上的hla-drmfi和d)表达hla-dr的cd4幼稚t细胞百分比所示。

图119描绘了包含野生型il-15和xtendfc(m428l/n434s)变体的il-15/rα-异源fc融合体xenp22853的序列。il-15和il-15rα(寿司)加下划线，连接子加双下划线(尽管如所属领域技术人员将理解，连接子可以用其它连接子代替，其中一些描绘于图9和图10中，并且斜线(/)表示il-15、il-15rα、连接子和恒定/fc区之间的边界。

图120描绘了包含il-15(n4d/n65d)变体和xtendfc(m428l/n434s)变体的il-15/rα-异源fc融合体xenp4113的序列。il-15和il-15rα(寿司)加下划线，连接子加双下划线(尽管如所属领域技术人员将理解，连接子可以用其它连接子代替，其中一些描绘于图9和图10中，并且斜线(/)表示il-15、il-15rα、连接子和恒定/fc区之间的边界。

图121描绘了包含il-15(n4d/n65d)变体和xtendfc(m428l/n434s)取代的scil-15/rα-fc融合体xenp24294的序列。il-15和il-15rα(寿司)加下划线，连接子加双下划线(尽管如所属领域技术人员将理解，连接子可以用其它连接子代替，其中一些描绘于图9和图10中，并且斜线(/)表示il-15、il-15rα、连接子和恒定/fc区之间的边界。

图122描绘了包含il-15(d30n/e64q/n65d)变体和xtendfc(m428l/n434s)取代的il-15/rα-异源fc融合蛋白xenp24306的序列。il-15和il-15rα(寿司)加下划线，连接子加双下划线(尽管如所属领域技术人员将理解，连接子可以用其它连接子代替，其中一些描绘于图9和图10中，并且斜线(/)表示il-15、il-15rα、连接子和恒定/fc区之间的边界。

图123描绘了在以所示相对浓度的第一剂量之后，在食蟹猕猴中所指定的测试物随时间的血清浓度。

图124a-图124c描绘了包含另外的il-15功效变体的说明性scil-15/rα-fc融合蛋白的序列。il-15和il-15rα(寿司)加下划线，连接子加双下划线(尽管如所属领域技术人员将理解，连接子可以用其它连接子代替，其中一些描绘于图9和图10中)，并且斜线(/)表示il-15、il-15rα、连接子、可变区域和恒定/fc区之间的边界。另外，scil-15/rα-fc融合蛋白的每个组分在序列表中具有其自己的seqidno:。

图125a-图125g描绘了将pbmc与所示测试物孵育3天后，a)cd4⁺cd45ra^-、b)cd4⁺cd45ra⁺、c)cd8⁺cd45ra^-、d)cd8⁺cd45ra⁺、e)cd16⁺nk细胞、f)cd56⁺nk细胞、和g)γδ细胞表达ki67的百分比。

图126a-图126d描绘了包含il-15(d30n/n65d)变体的说明性靶向pd-1的il-15/rα-fc融合体的序列。cdr加粗。如本文所提及且对含有cdr每一序列而言确实如此，取决于所使用的编号方法(如表1中所示)，cdr位置的精确标识可能略微不同，且因此本文中不仅包括粗体cdr且还包括使用其它编号系统的vh和vl结构域内所包括的cdr。il-15和il-15rα(寿司)加下划线，连接子加双下划线(尽管如所属领域技术人员将理解，连接子可以用其它连接子代替，其中一些描绘于图9和图10中)，并且斜线(/)表示il-15、il-15rα、连接子、可变区域和恒定/fc区之间的边界。另外，每个cdr在序列表中具有其自身的seqidno:，且每个vl结构域在序列表中具有其自身的seqidno:。

图127a-图127d描绘了包含il-15(d30n/e64q/n65d)变体的说明性靶向pd-1的il-15/rα-fc融合体的序列。cdr加粗。如本文所提及且对含有cdr每一序列而言确实如此，取决于所使用的编号方法(如表1中所示)，cdr位置的精确标识可能略微不同，且因此本文中不仅包括粗体cdr且还包括使用其它编号系统的vh和vl结构域内所包括的cdr。il-15和il-15rα(寿司)加下划线，连接子加双下划线(尽管如所属领域技术人员将理解，连接子可以用其它连接子代替，其中一些描绘于图9和图10中)，并且斜线(/)表示il-15、il-15rα、连接子、可变区域和恒定/fc区之间的边界。另外，每个cdr在序列表中具有其自身的seqidno:，且每个vl结构域在序列表中具有其自身的seqidno:。

图128a-图128l描述了包含xtend(m428l/n434s)取代以延长血清半衰期的说明性靶向pd-1的il-15/rα-fc融合蛋白的序列。cdr加粗。如本文所提及且对含有cdr每一序列而言确实如此，取决于所使用的编号方法(如表1中所示)，cdr位置的精确标识可能略微不同，且因此本文中不仅包括粗体cdr且还包括使用其它编号系统的vh和vl结构域内所包括的cdr。il-15和il-15rα(寿司)加下划线，连接子加双下划线(尽管如所属领域技术人员将理解，连接子可以用其它连接子代替，其中一些描绘于图9和图10中)，并且斜线(/)表示il-15、il-15rα、连接子、可变区域和恒定/fc区之间的边界。应当注意，本文描绘的任何序列可以包括或排除m428l/n434s取代。另外，每个cdr在序列表中具有其自身的seqidno:，且每个vl结构域在序列表中具有其自身的seqidno:。

图129a-图129b描绘了对照靶向rsv的il-15/rα-fc融合蛋白xenp26007、xenp29481和xenp30432的序列。cdr加下划线。如本文所提及且对含有cdr每一序列而言确实如此，取决于所使用的编号方法(如表1中所示)，cdr位置的精确标识可能略微不同，且因此本文中不仅包括粗体cdr且还包括使用其它编号系统的vh和vl结构域内所包括的cdr。il-15和il-15rα(寿司)为斜体，连接子加双下划线(尽管如所属领域技术人员将理解，连接子可以用其它连接子代替，其中一些描绘于图9和图10中)，并且斜线(/)表示il-15、il-15rα、连接子、可变区域和恒定/fc区之间的边界。另外，每个cdr在序列表中具有其自身的seqidno:，且每个vl结构域在序列表中具有其自身的seqidno:。

具体实施方式

i.材料的并入

a.图和图例

2018年4月18日提交的美国临时申请62/659,571和2017年10月16日提交的国际申请wo2018/071918以及2017年10月16日提交的美国专利申请2018/0118828的所有附图、随附的图例和序列(及其标识符和/或描述)，其全部均明确地且独立地通过引用整体并入本文，特别是其中描述的氨基酸序列。

另外的il-15/il-15rα异源二聚体fc融合蛋白在例如以下文献中有详细描述：题为“il-15/il-raheterodimericfcfusionproteinsandusesthereof”且一并提交的美国临时申请、2016年10月14日提交的美国临时申请第62/408,655号、2016年11月1日提交的美国临时申请第62/416,087号、2017年1月6日提交的美国临时申请第62/443,465号、2017年3月28日提交的美国临时申请第62/477,926号、2017年10月16日提交的美国专利申请第15/785,401号和2017年10月16日提交的pct国际申请pct/us2017/056829，所述文献以全文引用的方式明确地并入，尤其参考其中的附图、图例和权利要求书。

另外的靶向pd-1的il-15/il-15rα-fc融合蛋白在例如以下文献中有详细描述：2016年10月14日提交的美国临时申请第62/408,655号、2016年11月1日提交的美国临时申请第62/416,087号、2017年1月6日提交的美国临时申请第62/443,465号、2017年3月28日提交的美国临时申请第62/477,926号、2017年10月16日提交的美国专利申请第15/785,393号和2017年10月16日提交的pct国际申请pct/us2017/056826，所述文献以全文引用的方式明确地并入，尤其参考其中的附图、图例和权利要求书。

b.序列

参考如下随附的序列表：尽管可以将其中的fv序列格式化为图94a-94ap的pd-1fab序列的scfvs)和seqidnos，尽管其中的fab序列可被格式化为scfv)，适合用作abd的抗pd-1序列包括图93a-93s的pd-1scfv序列的seqidnos。如所属领域的技术人员将理解，这些序列识别符以“成对”形式出现在可变重链和轻链中，如将从序列识别符显而易见。

适用于靶向pd-1的il-15/il-15rα-fc融合蛋白的il-15序列包括图3a的人成熟il-15的seqidno、具有氨基酸取代n4d/n65d的图3a的人成熟il-15的seqidno序列、具有氨基酸取代d30n/n65d的图3a的人成熟il-15的seqidno：和具有氨基取代d30n/e64q/n65d的图3a的人成熟il-15的seqidno：。在一些实施方案中，本发明的靶向pd-1的il-15/il-15rα-fc融合蛋白的il-15包括具有一个或多个氨基酸取代的图3a的人成熟il-15的seqidno，所述氨基酸取代选自n1d、n4d、d8n、d30n、d61n、e64q、n65d、q108e和图44a-44c所示的那些以及相应的序列标识符。适用于靶向pd-1的il-15/il-15rα-fc融合蛋白的il-15rα序列包括图3a的人il-15rα(寿司)结构域的seqidno。

c.命名法

本发明的靶向pd-1的il-15/il-15rα-fc融合蛋白以几种形式列出。在一些情况下，多肽被给予唯一的“xenp”编号(或在一些情况下，“xencs”编号)，但是将在所属领域中了解，较长序列可能含有较短编号。这些xenp编号在序列表以及标识符中，并且用在附图中。另外，包括三个组分的一个分子产生多个序列标识符。举例来说，fab单体的清单具有全长序列、可变重链序列以及可变重链序列的三个cdr；轻链具有全长序列、可变轻链序列以及可变轻链序列的三个cdr；并且scfv-fc结构域具有全长序列、scfv序列、可变轻链序列、3个轻链cdr、scfv连接子、可变重链序列以及3个重链cdr。在一些情况下，本文中具有scfv结构域的分子使用单个带电scfv连接子(+h)，但也可以使用其它。另外，特定可变结构域的命名法使用“hx.xx_ly.yy”类型的形式，其中编号是特定可变链序列的唯一标识符。因此，xenp25937的fab侧的可变结构域为“1c11[pd-1]_h3l3”，其指示可变重链结构域h3与轻链结构域l3组合。在scfv序列(例如xenp25812)的情况下，名称“1c11_h3.240_l3.148”表示可变重链结构域h3.240与轻链结构域l3.148结合，并且处于vh-连接子-vl方向(从n到c端)。具有与重链和轻链可变结构域一致但呈相反顺序的序列的这种分子将命名为“1c11_l3.148_h3.240”。类似地，不同构建体可以“混合并匹配”重链和轻链，如根据序列表和附图将显而易见的。

ii.定义

为了能更全面地了解本申请，下文阐述几种定义。这些定义意味着包含语法等同物。

本文中的“消融”意指活性的降低或去除。因此，例如，“消融fcγr结合”意指fc区氨基酸变体与不含有特异性变体的fc区相比具有少于50％的起始结合，优选少于70％-80％-90％-95％-98％的活性损失，并且通常所述活性低于biacore测定中可检测结合的水平。fcγr结合的消融中的特定用途如图6所示的特定用途。然而，除非另有说明，否则本发明的fc单体保持与fcrn受体的结合。

如本文所用的“adcc”或“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性”是指细胞介导的反应，其中表达fcγr的非特异性细胞毒性细胞识别靶细胞上的结合抗体并且随后引起靶细胞的裂解。adcc与结合fcγriiia相关；与fcγriiia结合增加引起adcc活性增加。如本文所讨论的，本发明的许多实施方案完全消融adcc活性。

本文所用的“adcp”或抗体依赖性细胞介导的吞噬作用是指细胞介导的反应，其中表达fcγr的非特异性细胞毒性细胞识别靶细胞上的结合抗体，并且随后引起靶细胞的吞噬作用。

“抗原结合结构域”或“abd”在本文中是指一组六个互补决定区(complementarydeterminingregion，cdr)，当作为多肽序列的一部分存在时其特异性结合如本文所论述的靶抗原。因此，“检查点抗原结合结构域”与如本文概述的靶检查点抗原结合。如本领域所已知的，这些cdr通常作为第一组可变重cdr(vhcdr或vhcdr)和第二组可变轻cdr(vlcdr或vlcdr)存在，各自包括三个cdr：重链的vhcdr1、vhcdr2、vhcdr3以及轻链的vlcdr1、vlcdr2和vlcdr3。cdr分别存在于可变重结构域和可变轻结构域中并且一起形成fv区。因此，在一些情况下，抗原结合结构域的六个cdr由可变重链和可变轻链贡献。在“fab”形式中，6个cdr的组由两个不同的多肽序列贡献，可变重链结构域(vh或vh；含有vhcdr1、vhcdr2和vhcdr3)和可变轻链结构域(vl或vl；含有vlcdr1、vlcdr2和vlcdr3)，其中vh结构域的c端连接到重链ch1结构域的n端，并且vl结构域的c端连接到轻链恒定结构域的n端(并且因此形成轻链)。在scfv形式中，vh和v1结构域通常通过使用如本文所述的连接子共价连接成单个多肽序列，其可以是(从n端开始)vh-连接子-vl或vl-连接子-vh，前者通常是优选的(包括每侧的可选结构域连接子，这取决于使用的形式(例如us62/353,511的图1中的))。

本文中的“修饰”意指多肽序列中的氨基酸取代、插入和/或缺失或对与蛋白质化学连接的部分的更改。例如，修饰可以是连接于蛋白质的改变的碳水化合物或peg结构。本文的“氨基酸修饰”意指多肽序列中的氨基酸取代、插入和/或缺失。出于清楚起见，除非另外说明，否则氨基酸修饰总是针对由dna编码的氨基酸，例如具有dna和rna中的密码子的20种氨基酸。

本文的“氨基酸取代”或“取代”是指用不同的氨基酸替换亲本多肽序列中特定位置的氨基酸。特别地，在一些实施方案中，取代是针对并非天然存在于特定位置、并非天然存在于生物体内或任何生物体内的氨基酸。例如，取代e272y是指变体多肽，在这一情况下是指fc变体，其中位置272处的谷氨酸用酪氨酸代替。为了清楚起见，已经过工程改造以改变核酸编码序列但不改变起始氨基酸(例如将cgg(编码精氨酸)换成cga(仍然编码精氨酸)来提高宿主生物体表达水平)的蛋白质不是“氨基酸取代”；也就是说，尽管创建了编码相同蛋白质的新基因，但是如果蛋白质在其起始的特定位置具有相同的氨基酸，那么它就不是氨基酸取代。

如本文所使用的，“氨基酸插入”或“插入”意指在亲本多肽序列中的特定位置处添加氨基酸序列。例如，-233e或233e表示在位置233之后和位置234之前插入谷氨酸。另外，-233ade或a233ade表示在位置233之后和位置234之前插入alaaspglu。

本文所用的“氨基酸缺失”或“缺失”是指除去亲本多肽序列中特定位置的氨基酸序列。例如，e233-或e233#，e233()或e233del表示在位置233处的谷氨酸的缺失。另外，eda233-或eda233#表示从位置233开始的序列gluaspala的缺失。

本文所用的“变体蛋白质”或“蛋白质变体”或“变体”是指通过至少一个氨基酸修饰而不同于亲本蛋白质的蛋白质。蛋白变体可以指代蛋白质本身、包括所述蛋白质的组合物或编码所述蛋白质的氨基酸序列。优选地，蛋白变体与亲本蛋白相比具有至少一种氨基酸修饰，例如，与亲本相比，从约一种到约七十种氨基酸修饰，并且优选地从约一种到约五种氨基酸修饰。如下所述，在一些实施方案中，亲本多肽，例如fc亲本多肽，是人野生型序列，例如来自igg1、igg2、igg3或igg4的fc区，尽管具有变体的人序列也可以充当“亲本多肽”，例如可包括igg1/2杂合物。本文的蛋白质变体序列优选与亲本蛋白质序列具有至少约80％的同一性，最优选至少约90％的同一性，更优选至少约95-98-99％的同一性。变体蛋白质可以指变体蛋白质本身、包含蛋白质变体的组合物或编码它的dna序列。

因此，如本文所使用的，“抗体变体”或“变体抗体”意指由于至少一个氨基酸修饰而与亲本抗体不同的抗体，如本文所使用的，“igg变体”或“变体igg”意指由于至少一个氨基酸修饰而与亲本igg(再次，在许多情况下，来自人igg序列)不同的抗体，并且如本文所使用的，“免疫球蛋白变体”或“变体免疫球蛋白”意指由于至少一个氨基酸修饰而与亲本免疫球蛋白序列不同的免疫球蛋白序列。如本文所使用的，“fc变体”或“变体fc”意指包括如与人igg1、igg2、igg3或igg4的fc结构域相比，在fc结构域中的氨基酸修饰的蛋白质。本发明的fc变体根据构成其的氨基酸修饰进行定义。因此，例如，n434s或434s是相对于亲本fc多肽在434位具有取代丝氨酸的fc变体，其中编号是根据eu索引。同样，m428l/n434s定义了相对于亲本fc多肽具有取代m428l和n434s的fc变体。wt氨基酸的身份标识可以是非特定的，在此情况下前述变体称为428l/434s。应注意，提供取代的顺序是任意的，也就是说，例如，428l/434s是与m428l/n434s相同的fc变体等。对于本发明所讨论的涉及抗体的所有位置，除非另外指出，否则氨基酸位置编号是根据eu索引。eu指数或如kabat或eu编号方案中的eu指数是指eu抗体的编号(edelman等人,1969,《美国国家科学院院刊》63:78-85，其通过引用在此整体并入)。修饰可以是是添加、缺失或取代。取代可包括天然存在的氨基酸，并且在一些情况下，可包括合成氨基酸。实例包括us6,586,207；wo98/48032；wo03/073238；us2004/0214988a1；wo05/35727a2；wo05/74524a2；j.w.chinetal.，(2002)，journaloftheamericanchemicalsociety124:9026-9027；j.w.chin、&p.g.schultz、(2002)、chembiochem11:1135-1137；j.w.chin等,(2002),picasunitedstatesofamerica99:11020-11024；和l.wang,&p.g.schultz,(2002)chem.1-10，所有文献通过引用整体并入本文中。

如本文所使用的，本文的“蛋白质”意指至少两个共价连接氨基酸，包含蛋白质、多肽、寡肽和肽。另外，多肽可包括一个或多个侧链或末端的合成衍生、糖基化、聚乙二醇化、环状排列、环化、与其它分子的连接子、与蛋白质或蛋白质结构域的融合以及肽标签或标记的添加。

如本文所用的“残基”意味着蛋白质中的位置和其相关的氨基酸身份标识。举例来说，天冬酰胺297(也称为asn297或n297)是人抗体igg1中位置297处的残基。

本文所用的“fab”或“fab区”是指包含vh、ch1、vl和cl免疫球蛋白结构域的多肽。fab可以单独指代该区域，或者在全长抗体、抗体片段或fab融合蛋白的背景下指代该区域。在fab的上下文中，除了ch1和cl结构域之外，fab还包括fv区。

本文所用的“fv”或“fv片段”或“fv区”是指包含单一抗体的vl和vh结构域的多肽。如本领域技术人员所理解的，这些通常由两条链组成，或者可以组合(通常与本文所述的连接子)以形成scfv。

本文中的“单链fv”或“scfv”意指通常使用如本文所讨论的scfv连接子来与可变轻结构域共价连接以形成scfv或scfv结构域的可变重结构域。scfv结构域由n端至c端可呈任一定向(vh-连接子-vl或vl-连接子-vh)。在序列表和图中所描绘的序列中，vh和vl结构域的顺序在名称中指示，例如，h.x_l.y意指n端到c端是vh-连接子-vl，并且l.y_h.x是vl-连接子-vh。

如本文所用，“igg子类修饰”或“同型修饰”意指将igg同型的一个氨基酸转化成不同比对的igg同型中的对应的氨基酸的氨基酸修饰。例如，因为在eu位置296处igg1包含酪氨酸并且igg2包含苯丙氨酸，所以igg2中的f296y取代被认为是igg亚类修饰。

如本文所用的“非天然存在的修饰”意指不是同型的氨基酸修饰。例如，因为igg均不包括位置434处的丝氨酸，所以igg1、igg2、igg3或igg4(或其杂交体)的取代434s被视为非天然存在的修饰。

如本文所使用的，“氨基酸”和“氨基酸同一性”意指由dna和rna编码的20个天然存在的氨基酸之一。

本文所用的“效应子功能”是指由抗体fc区与fc受体或配体相互作用产生的生物化学事件。效应子功能包含但不限于adcc、adcp和cdc。

如本文所使用的，“iggfc配体”意指来自与igg抗体的fc区结合以形成fc/fc配体络合物的任何生物体的分子，优选地是多肽。fc配体包含但不限于fcγri、fcγrii、fcγriii、fcrn、c1q、c3、甘露聚糖结合凝集素、甘露糖受体、葡萄球菌蛋白a、链球菌蛋白g和病毒性fcγr。fc配体还包括fc受体同源物(fcrh)，其是与fcγr同源的fc受体家族(davis等人,2002,《免疫评论(immunologicalreviews)》190:123-136，其以引用的方式整体并入本文中)。fc配体可以包括结合fc的未发现分子。特定的iggfc配体是fcrn和fcγ受体。如本文所使用的，“fc配体”意指来自与抗体的fc区结合以形成fc/fc配体络合物的任何生物体的分子，优选地是多肽。

如本文所使用的，“fcγ受体”或“fcγr”或“fcgammar”意指与igg抗体fc区结合并由fcγr基因编码的蛋白质家族的任何成员。在人类中，这个家族包括但不限于fcγri(cd64)，包括同种型fcγria、fcγrib和fcγric；fcγrii(cd32)，包括同种型fcγriia(包括同种异型h131和r131)、fcγriib(包括fcγriib-1和fcγriib-2)和fcγriic；和fcγriii(cd16)，包括同种型fcγriiia(包括同种异型v158和f158)和fcγriiib(包括同种异型fcγriiib-na1和fcγriiib-na2)(jefferis等人,2002,《免疫学快报(immunollett)》82:57-65，其以引用的方式整体并入本文中)，以及任何未发现的人类fcγr或fcγr同种型或同种异型。fcγr可以来自任何生物体，包括但不限于人类、小鼠、大鼠、兔和猴。小鼠fcγr包含但不限于fcγri(cd64)、fcγrii(cd32)、fcγriii(cd16)和fcγriii-2(cd16-2)以及任何未发现的小鼠fcγr或fcγr同种型或同种异型。

如本文所使用的，“fcrn”或“新生儿fc受体”意指与igg抗体fc区结合并且至少部分地由fcrn基因编码的蛋白质。fcrn可以来自任何生物体，包含但不限于人、小鼠、大鼠、兔和猴。如本领域已知的，功能fcrn蛋白包括两种肽，通常被称为重链和轻链。轻链是β-2微球蛋白且重链由fcrn基因编码。除非本文另有说明，否则fcrn或fcrn蛋白是指fcrn重链与β-2-微球蛋白的复合物。多种fcrn变体用于增加与fcrn受体的结合并且在一些情况下增加血清半衰期。通常，除非另有说明，否则本发明的fc单体保持与fcrn受体的结合(并且如下所述，可包括氨基酸变体以增加与fcrn受体的结合)。

本文所用的“亲本多肽”是指随后经过修饰以产生变体的起始多肽。亲本多肽可以是天然存在的多肽或者天然存在的多肽的变体或工程化版本。亲本多肽可以指多肽本身、包含亲本多肽的组合物或编码它的氨基酸序列。因此，如本文所用的“亲本免疫球蛋白”意味着未修饰的免疫球蛋白多肽，其被修饰以产生变体，并且如本文所用的“亲本抗体”意味着未修饰的抗体，其被修饰以产生变体抗体。应注意，“亲本抗体”包括如下概述的已知的商业重组产生的抗体。

本文使用的“fc”或“fc区”或“fc结构域”是指包含抗体恒定区(不包括第一恒定区免疫球蛋白结构域(例如ch1))的多肽，并且在一些情况下是铰链的一部分。因此，fc是指iga、igd和igg的最后两个恒定区免疫球蛋白结构域(例如ch2和ch3)，ige和igm的最后三个恒定区免疫球蛋白结构域，以及这些结构域n端的柔性铰链。对于iga和igm，fc可包括j链。对于igg，fc结构域包括免疫球蛋白结构域cγ2和cγ3(cγ2和cγ3)以及位于cγ1(cγ1)与cγ2(cγ2)之间的下部铰链区。虽然fc区的边界可以变化，但人igg重链fc区通常被定义成在其羧基端包含残基c226或p230，其中根据如kabat中的eu索引进行编号。在一些实施方案中，如下文更全面地描述，对fc区进行氨基酸修饰，例如改变与一种或多种fcγr受体或fcrn受体的结合。

“重链恒定区”在本文中是指抗体的ch1-铰链-ch2-ch3部分。

本文中的“fc融合蛋白”或“免疫粘附素”是指包含fc区的蛋白质，通常与不同的蛋白质连接(任选通过如本文所述的连接子部分)，例如与il-15和/或il-15r，如本文所述。在一些情况下，两种fc融合蛋白可以形成同源二聚体fc融合蛋白或异源二聚体fc融合蛋白，后者是优选的。在一些情况下，异源二聚体fc融合蛋白的一种单体包含单独的fc结构域(例如，空fc结构域)，并且另一种单体是fc融合物，其包含变体fc结构域和蛋白结构域，例如受体、配体或其它结合搭配物。

如本文所用的“位置”意指蛋白序列中的位置。位置可以顺序编号，或根据确定的形式(例如用于抗体编号的eu编号)编号。

本发明的异源二聚体抗体的单体背景中的“链性(strandedness)”是指，与“匹配”的两条dna链相似，将异源二聚化变体掺入每种单体中以保持“匹配”以形成异源二聚体的能力。例如，如果将一些pi变体工程化为单体a(例如使pi更高)，则还可以利用的“电荷对”的空间变体不会干扰pi变体，例如将使pi更高的电荷变体放在相同的“链”或“单体”上以保持两种功能。类似地，对于组中成对出现的“偏斜”变体，如下面更全面概述的，技术人员在决定将进入合并一组对的哪一条链或单体时将考虑pi，使得也使用偏斜的pi使pi分离最大化。

本文所用的“靶抗原”是指由给定抗体的可变区特异性结合的分子。靶抗原可以是蛋白质、碳水化合物、脂质或其他化学化合物。下面描述多种合适的靶抗原。

本文使用的“靶细胞”是指表达靶抗原的细胞。

本文所用的“可变区”是指免疫球蛋白的区域，其包含一个或多个基本上由分别构成κ、λ和重链免疫球蛋白基因座的vκ、vλ和/或vh基因编码的ig结构域。

“野生型或wt”在本文中意指在自然界中发现的氨基酸序列或核苷酸序列，包括等位基因变体。wt蛋白质具有未经有意修饰的氨基酸序列或核苷酸序列。

本发明的抗体通常是分离的或重组的。当用于描述本文公开的各种多肽时，“分离的”是指多肽已经从表达其的细胞或细胞培养物中鉴定和分离和/或回收。通常，通过至少一个纯化步骤制备分离的多肽。“分离的蛋白”是指基本上不含具有不同结合特异性的其他蛋白的蛋白。“重组”是指使用重组核酸技术在外源宿主细胞中产生蛋白。

相对于蛋白序列的“百分比(％)氨基酸序列同一性”定义为在比对序列和如果需要引入缺口以实现最大百分比序列同一性并且不考虑任何保守取代作为序列同一性的一部分之后，候选序列中氨基酸残基与特定(亲本)序列中的氨基酸残基相同的百分比。出于确定氨基酸序列同一性百分比的目的的比对可以以本领域的技术内的各种方式实现，例如使用可开获得的计算机软件，如blast、blast-2、align或megalign(dnastar)软件实现。本领域的技术人员可以确定用于测量比对的适当参数，包括在进行比较的序列的全长内实现最大比对所需的任何算法。一种特定程序是美国公开号20160244525的[0279]到[0280]段落中所概述的align-2程序，所述美国专利在此通过引用并入。

本发明的氨基酸序列(“发明序列”)与亲代氨基酸序列之间的同一性的程度被计算为在两个序列的比对中精确匹配的数除以“发明序列”的长度或亲代序列的长度，以最短者为准。结果以同一性百分比表示。

在一些实施方案中，两个或更多个氨基酸序列是至少50％、60％、70％、80％或90％同一。在一些实施方案中，两个或更多个氨基酸序列具有至少95％、97％、98％、99％或甚至100％相同。

“特异性结合”或“特异性结合于”特定抗原或表位，或“对”特定抗原或表位“具有特异性”意指与非特异性相互作用可测量地不同的结合。特异性结合可以例如通过与对照分子的结合相比测定分子的结合来测量，所述对照分子通常是不具有结合活性的类似结构的分子。举例而言，特异性结合可藉由与类似于目标的对照分子竞争来确定。

特定抗原或表位的特异性结合可以通过例如抗体来展现，所述抗体针对抗原或表位的kd为至少约10^-4m、至少约10^-5m、至少约10^-6m、至少约10^-7m、至少约10^-8m、至少约10^-9m、或者至少约10^-10m、至少约10^-11m、至少约10^-12m或更大，其中kd是指特定抗体-抗原相互作用的解离速率。典型地，特异性结合抗原的抗体的kd是对照分子相对于抗原或表位的kd的20倍、50倍、100倍、500倍、1000倍、5,000倍、10,000倍或更多倍。

另外，可以例如通过抗体对抗原或表位的ka或ka对于表位相对于对照大至少20倍、50倍、100倍、500倍、1000倍、5,000倍、10,000倍或更多倍来展现对特定抗原或表位的特异性结合，其中ka或ka是指特定抗体-抗原相互作用的缔合速率。通常使用biacore测试法测量结合亲和力。

iii.简介

本发明提供了靶向的异源二聚体融合蛋白，其可以与检查点抑制剂pd-1抗原结合并且可以与共同的γ链(γc；cd132)和/或il-2受体β-链(il-2rβ；cd122)复合。通常，本发明的异源二聚体融合蛋白具有三种功能组分：il-15/il-15rα(寿司)组分，本文通常称为“il-15复合物”，抗pd-1组分，和fc组分，其中每一种可以采用不同的形式，并且每种形式可以以任何构型与其他组分组合。il-15/il-15rα-fc融合蛋白可包括与il-15rα共价连接的il-15蛋白和fc结构域。在一些实施方案中，il-15蛋白和il-15rα蛋白是非共价连接的。

如图所示，il-15复合物可以采用几种形式。如上所述，il-15蛋白本身不如与il-15rα蛋白复合时稳定。如本领域所知，il-15rα蛋白含有“寿司结构域”，它是保留il-15结合活性的受体的最短区域。因此，尽管可以制备包含整个il-15rα蛋白的异源二聚体融合蛋白，但本文的优选实施方案包括仅使用寿司结构域的复合物，其序列示于图中。

因此，本发明的靶向pd-1的il-15/rα异源二聚fc融合蛋白的il-15复合物通常包含人成熟il-15蛋白(包括人成熟il-15蛋白变体)和il-15rα的寿司结构域(除非另有说明使用全长序列，否则“il-15rα”、“il-15rα(寿司)”和“寿司”在整个本文中可互换使用。该复合物可以以多种不同的形式使用。如图22a、22c、22d和22f所示，il-15蛋白和il-15rα(寿司)不是共价连接的，而是通过规则配体-配体相互作用自组装。如本文更全面描述的，它可以是与fc结构域共价连接的il-15变体或il-15rα寿司结构域(通常使用任选的结构域连接子)。在图23(“il-15/rα-异源fc”形式)、图24(“scil-15/rα-fc”形式)、图25a-25b(“ncil-15/rα-fc”形式)、图26(“二价ncil-15/rα-fc”形式)、图27(“二价scil-15/rα-fc”形式)、图28(“fc-ncil-15/rα”形式)和图29(“fc-scil-15/rα”形式)中提供了各形式的氨基酸序列。可替代地，它们可以使用如图22b、22e和22g所示的结构域连接子共价连接。图22e将寿司域描述为n末端结构域，尽管这可以颠倒。最后，il-15和il-15rα寿司结构域中的每一个都可以被设计成含有半胱氨酸氨基酸，其形成二硫键以形成复合物，如图36a、36b、36c和36d中一般地显示，同样，其中il-15结构域或il-15rα寿司结构域(使用任选的结构域连接子)与fc结构域共价连接。在图37a-37b(“dsil-15/rα-异源fc”形式)、图38a-38b(“dsil-15/rα-fc”形式)、图39(“二价dsil-15/rα-fc”形式)和图40(“fc-dsil-15/rα”形式)中提供了各形式的氨基酸序列。

在一些实施方案中，靶向pd-1的il-15/rαfc融合蛋白已经被工程化以与它们的亲本构建体相比表现出降低的效力。例如，可以将一种或多种氨基酸取代引入il-15/rα复合物的人成熟il-15蛋白的氨基酸序列中。在一些实施方案中，本发明的靶向pd-1的il-15/rαfc融合蛋白包含具有氨基酸取代n4d/n65d的人成熟il-15蛋白变体。在某些实施方案中，本发明的靶向pd-1的il-15/rαfc融合蛋白包含具有氨基酸取代d30n/n65d的人成熟il-15蛋白变体。在特定的实施方案中，本发明的靶向pd-1的il-15/rαfc融合蛋白包含具有氨基酸取代d30n/e64q/n65d的人成熟il-15蛋白变体。图45a-45d、46a-46c、47a-47b、48、49、50、126和127提供了具有降低的效力的靶向pd-1的il-15/rαfc融合蛋白及其氨基酸序列的示例性实施方案。

a.pd-1抗原结合结构域

本发明的pd-1抗原结合结构域(abd)(例如抗pd-1组分)通常是一组6个cdr和/或可变重链结构域和可变轻链结构域，其形成可结合人pd-1的fv结构域。如本文所示，抗pd-1abd可以是scfv的形式，其中vh和vl结构域使用scfv连接子连接，所述scfv连接子可以任选地是带电荷的scfv连接子。如本领域技术人员所理解的，scfv可以从n-末端到c-末端组装为n-vh-scfv连接子-vl-c或作为n-vl-scfv连接子-vh-c与c末端组装。scfv结构域通常与铰链-ch2-ch3fc结构域连接。可以以scfv形式或fab形式使用合适的fv(包括cdr组和可变重/可变轻结构域)，在图中显示以及在2018年11月8日提交的wo2017/218707和pct/us2018/059887中公开，特此明确完整地并入本文，特别是用于描述抗pd-1序列的图、图例和seq标识符。在一些实施方案中，本发明的pd-1abd基于1c11克隆，如图所示，特别是图93a-93s和94a-94ap。在一些实施方案中，本发明的pd-1abd基于根据图96a-96f中所示的1c11克隆(xenp22553)的重链的变体重链。在一些实施方案中，本发明的pd-1abd基于根据图97a-97q所示的1c11克隆(xenp22553)的轻链的轻链变体。

在有用的实施方案中，本发明的靶向pd-1的il-15/rαfc融合蛋白包括针对人pd-1的abd。在一些实施方案中，赋予与pd-1结合的六个cdr选自图93a-93s和94a-94ap中的任一个中所描绘的那些。

在一些实施方案中，本发明的靶向pd-1的il-15/rαfc融合蛋白包括scfv形式的针对人pd-1的abd。在一些实施方案中，针对人pd-1的abd含有赋予与pd-1结合的六个cdr，其选自图93a-93s中任一个所描绘的那些，或图93a-93s中任何abd的vh和vl结构域。

在特定实施方案中，本发明的靶向pd-1的il-15/rαfc融合蛋白包括fab形式的针对人pd-1的abd。在一些实施方案中，针对人pd-1的abd含有赋予与pd-1结合的六个cdr，其选自图94a-94ap中任一个所描绘的那些，或图94a-94ap中任何abd的vh和vl结构域。如所属领域的技术人员将理解，这些序列识别符以“成对”形式出现在可变重链和轻链中，如将从序列识别符显而易见。

在某些实施方案中，本发明的靶向pd-1的il-15/rαfc融合蛋白包括针对人pd-1的abd。在一些情况下，abd的可变重结构域的cdr选自图95a-95j中任一个所描绘的那些，而abd的轻链结构域的cdr选自图96a-96f中任一个所描绘的那些。

在具有针对人pd-1的scfvabd的许多实施方案中，特别适用的是图93r中描绘的xenp258061c11[pd-1]_h3.234_l3.144的abd，包括seqidnos:578-579。因此，来自xenp25806(seqidnos:578-579)的六个cdr和/或vh和vl结构域可以用于本发明的构建体中。

在具有针对人pd-1的scfvabd的许多实施方案中，特别适用的是图93r中描绘的xenp258121c11[pd-1]_h3.240_l3.148的abd，包括seqidnos:584。因此，来自xenp25812(seqidno:584)的六个cdr和/或vh和vl结构域可以用于本发明的构建体中。

在具有针对人pd-1的scfvabd的许多实施方案中，特别适用的是图93r中描绘的xenp258131c11[pd-1]_h3.241_l3.148的abd，包括seqidnos:585。因此，来自xenp25813(seqidno:585)的六个cdr和/或vh和vl结构域可以用于本发明的构建体中。

在具有针对人pd-1的scfvabd的许多实施方案中，特别适用的是图93s中描绘的xenp258191c11[pd-1]_h3.241_l3.92的abd，包括seqidnos:591。因此，来自xenp25819(seqidno:591)的六个cdr和/或vh和vl结构域可以用于本发明的构建体中。

在具有针对人pd-1的fababd的许多实施方案中，特别有用的是xenp269401c11[pd-1]_h3.303_l3.152的abd，如图94n所描绘，包括seqidnos：642和1103。因此，来自xenp26940(seqidnos:642和1103)的六个cdr和/或vh和vl结构域可以用于本发明的构建体中。

在具有针对人pd-1的fababd的许多实施方案中，特别有用的是xenp280261c11[pd-1]_h3.329_l3.220的abd，如图94ae所描绘，包括seqidnos：708和1169。因此，来自xenp28026(seqidnos:708和1169)的六个cdr和/或vh和vl结构域可以用于本发明的构建体中。

在具有针对人pd-1的fababd的许多实施方案中，特别有用的是xenp286521c11[pd-1]_h3.328_l3.152的abd，如图94ag所描绘，包括seqidnos：719和1180。因此，来自xenp28652(seqidnos:719和1180)的六个cdr和/或vh和vl结构域可以用于本发明的构建体中。

b.fc结构域

本发明的fc结构域组分如本文所述，其通常包含偏斜变体和/或可选的pi变体和/或本文概述的消融变体。

fc结构域可以衍生自iggfc结构域，例如igg1、igg2、igg3或igg4fc结构域，其中igg1fc结构域在本发明中特别有用。以下描述了可用于il-15/il-15rαfc融合单体的fc结构域和本发明的双特异性异源二聚体蛋白的检查点抗体片段。

每条链的羧基末端部分限定了主要负责效应子功能的恒定区kabat等。收集了重链和轻链可变区的许多一级序列。基于序列的保守程度，他们将单个一级序列分类为cdr和框架并列出其列表(参见《免疫学相关序列(sequencesofimmunologicalinterest)》,第5版,nih公开第91-3242号,e.a.在整个本说明书中，当提及可变结构域(大致是轻链可变区的残基1-107和重链可变区的残基1-113)中的残基以及用于fc区的eu编号系统时，通常使用kabat编号系统(例如kabat等人,见上文(1991))。

在免疫球蛋白的igg亚类中，重链中存在几种免疫球蛋白结构域。“免疫球蛋白(ig)结构域”在本文中意指具有不同三级结构的免疫球蛋白区域。本发明相关的是重结构域，包括重恒定(ch)结构域和铰链结构域。在igg抗体的情况下，igg同型各自具有三个ch区。因此，在igg的上下文中，“ch”结构域如下：“ch1”是指根据如kabat中的eu编号的位置118-220。“ch2”根据如kabat中的eu编号是指位置237-340，并且“ch3”根据如kabat中的eu编号是指位置341-447。如本文所示和下文所述，pi变体可以在一个或多个ch区以及铰链区中，在下面讨论。

重链的另一种类型的ig结构域是铰链区。“铰链”或“铰链区”或“抗体铰链区”或“免疫球蛋白铰链区”在本文中意味着包含抗体的第一与第二恒定结构域之间的氨基酸的柔性多肽。在结构上，iggch1结构域在eu位置220处终止，并且iggch2结构域在残基eu位置237处开始。因此，对于igg，抗体铰链在本文中定义为包括位置221(igg1中的d221)到236(igg1中的g236)，其中所述编号根据如kabat中的eu编号。在一些实施方案中，例如在fc区的背景下，包括下铰链，“下铰链”通常指的是位置226或230。如本文所述，pi变体也可以在铰链区中制备。

因此，本发明提供不同的抗体结构域,例如不同fc结构域。如本文所述和所属领域已知，本发明的异源二聚体蛋白包含不同结构域，其也可以重叠。这些结构域包括但不限于fc结构域、ch1结构域、ch2结构域、ch3结构域、铰链结构域和重链恒定结构域(ch1-铰链-fc结构域或ch1-铰链-ch2-ch3)。

因此，“fc结构域”包括-ch2-ch3结构域和可选的铰链结构域，并且可以来自人igg1、igg2、igg3或igg4。当来自igg1时，fc结构域可以是变体人类igg1结构域，例如包括氨基酸取代427l/434s。另外，变体igg1fc结构域可包含消融变体，例如e233p/l234v/l235a/g236del/s267k取代。

在本文中的一些实施方案中，当蛋白质片段(例如il-15或il-15rα)连接于fc结构域时，il-15或il-15rα构筑体的c端连接于fc结构域的全部或部分铰链；例如其通常连接于作为铰链起点的序列epks。在其他实施方案中，当蛋白质片段(例如il-15或il-15rα)连接至fc结构域时，il-15或il-15rα构建体的c-末端连接至ch1结构域。fc结构域。

在fc结构域蛋白的本文概述的一些构建体和序列中，il-15或il-15rα蛋白片段的c-端附着于结构域连接子的n-端，结构域连接子的c-端连接到恒定fc结构域的n端(n-il-15或il-15rα蛋白片段-连接子-fc结构域-c)，不过其可以转换(n-fc结构域-连接子-il-15或il-15rα蛋白片段-c)。在本文概述的其它构建体和序列中，可选地第一蛋白片段的c-端通过结构域连接子连接于第二蛋白片段的n端，可选地第二蛋白片段的c-端通过结构域连接子连接于恒定fc结构域的n端。在本文概述的又其它构建体和序列中，提供不与第一蛋白质片段或第二蛋白质片段连接的恒定fc结构域。异源二聚体fc融合蛋白可含有两种或更多种本文所述的例示性单体fc结构域蛋白。

在一些实施方案中，连接子是“结构域连接子”，其用于将如本文概述的任何两个结构域连接在一起，其中一些描绘于图9中。虽然可以使用任何合适的连接子，但许多实施方案使用甘氨酸-丝氨酸聚合物，包括例如(gs)n、(gsggs)n(seqidno:1217)、(ggggs)n(seqidno:1218)和(gggs)n(seqidno:1219)，其中n是至少一的整数(并且通常为1到2到3到4到5)以及允许具有足够的长度和柔性的两个结构域重组连接的任何肽序列以允许每个结构域保留其生物学功能。在一些情况下，并且注意“链型”，如下所概述，带电荷的结构域连接子。

在一个实施方案中，异源二聚体fc融合蛋白含有至少两个恒定结构域，其可以被工程化以产生异源二聚体，例如pi工程化。可以使用的其它fc结构域包括：含有一个或多个已经过pi工程化的本发明的ch1、ch2、ch3和铰链结构域的片段。特别地，该格式中所描绘图21和图64是异源二聚体fc融合蛋白，意味着该蛋白质具有两个相关联的fc序列的自组装成异源二聚体fc结构域和至少一种蛋白质片段(例如，1,2或更多种蛋白质片段)如下文更全面地描述。在一些情况下，第一蛋白质片段与第一fc序列连接，并且第二蛋白质片段与第二fc序列连接。在其他情况下，第一蛋白质片段与第一fc序列连接，并且第一蛋白质片段非共价连接至不与fc序列连接的第二蛋白质片段。在一些情况下，异源二聚体fc融合蛋白含有与第二蛋白片段连接的第一蛋白片段，其与第一fc序列连接，和第二fc序列，其不与第一或第二蛋白片段连接。

因此，在一些实施方案中，本发明提供异源二聚体免疫调节抗体，其依赖于使用两种不同的重链变体fc序列，其将自组装以形成异源二聚体fc结构域和异源二聚体抗体。

本发明涉及新的构建体，以提供允许与一种或多种结合配偶体，配体或受体结合的异源二聚体fc融合蛋白。异源二聚体fc融合构建体基于抗体重链的两个fc结构域的自组装性质，例如组装成“二聚体”的两个“单体”。异源二聚体fc融合物通过改变如下面更充分讨论的每种单体的氨基酸序列来制备。因此，本发明一般涉及异源二聚体fc融合蛋白的形成，其可以几种方式共同接合结合搭配物或配体或受体，这依赖于每条链上不同的恒定区中的氨基酸变体，以促进异源二聚体形成和/或允许异源二聚体比同源二聚体更易于纯化。

有许多机制可用于产生本发明的异源二聚体。此外，如所属领域的技术人员将了解，这些机制可以组合以确保高度异二聚化。因此，引起异源二聚体产生的氨基酸变体称为“异二聚化变体”。如下文所论述，异二聚化变体可以包括空间变体(例如下文所述的“杵和臼”或“偏斜”变体以及下文所述的“电荷对”变体)以及“pi变体”，其允许从异源二聚体中纯化同二聚体。正如wo2014/145806(全文特此并入本文供参考)中大体所述，且如下文关于“异二聚化变体”的论述具体所述，适用的异二聚化机制包括“杵和臼”(“kih”；本文中有时称为“偏斜”变体)(参见wo2014/145806中的论述)、如wo2014/145806中所述的“静电转向”或“电荷对”、如wo2014/145806中所述的pi变体，以及如wo2014/145806和下文中所概述的一般额外fc变体。

在本发明中，有几种基本机制可以导致易于纯化异源二聚体抗体；一种机制依赖于pi变体的使用，使得每种单体具有不同的pi，因此允许a-a、a-b和b-b二聚体蛋白的等电纯化。或者，某些格式还允许基于大小进行分离。如下面进一步概述，还可以“偏斜”形成异源二聚体而非同源二聚体。因此，空间异源二聚化变体与pi变体或电荷对变体的组合特别用于本发明。

一般而言，本发明中特定使用的实施方案依赖于包括偏斜变体的变体组，其相对于同型二聚体形成促进异源二聚体形成，与pi变体偶联，这增加两个单体之间的pi差异。

另外，如下面更全面概述的，取决于异源二聚体抗体的形式，pi变体可以包含在单体的恒定和/或fc结构域内，或者可以使用带电荷的连接子(结构域连接子或scfv连接子)。也就是说，本发明还提供在一种或两种单体上的pi变体，和/或带电荷的结构域连接子。此外，用于替代功能的额外氨基酸工程化也可赋予pi变化，例如fc、fcrn和ko变体。

在利用pi作为分离机制以允许异源二聚体蛋白质的纯化的本发明中，可以将氨基酸变体引入一种或两种单体多肽中；也就是说，其中一种单体(本文简称为“单体a”)的pi可以设计远离单体b，或者单体a和b都改变，单体a的pi增加，单体b的pi减少。如讨论的，可以通过去除或添加带电荷残基(例如，中性氨基酸被带正电荷或带负电荷的氨基酸残基代替，例如甘氨酸至谷氨酸)、将带电荷残基从正或负变为相反电荷(例如天冬氨酸至赖氨酸)或将带电荷残基改变为中性残基(例如电荷丢失；赖氨酸变为丝氨酸)，进行任一种或两种单体的pi变化。许多这些变体显示在图中。

相应地，本发明的这个实施方案使得至少一个单体的pi产生了足够的变化，从而可以将异源二聚体与同二聚体分离。如本领域技术人员所理解的，并且如下文进一步讨论的，这可以通过使用“野生型”重链恒定区和已经改造以增加或降低其pi的变体区域(wta-+b或wta--b)或通过增加一个区域并减少其他区域(a+-b-或a-b+)来完成。

因此，通常，本发明的一些实施方案的组分是抗体恒定区中的氨基酸变体，其旨在改变二聚体蛋白的至少一种(如果不是两种)单体的等电点(pi)，以通过将氨基酸取代(“pi变体”或“pi取代”)掺入一种或两种单体中形成“pi抗体”)。如本文所示，如果两种单体的pi差别小至0.1ph单位，则可以实现异源二聚体与两种同型二聚体的分离，其中0.2、0.3、0.4和0.5或更高都可用于本发明。

如本领域技术人员所理解的，为了获得良好分离而包含在每种或两种单体上的pi变体的数量将部分取决于感兴趣的scfv和fab的起始pi。如本领域所知，不同的fv将具有在本发明中利用的不同起始pi。通常，如本文所概述的，pi被设计成导致每种单体的总pi差异为至少约0.1log，优选0.2至0.5，如本文所述。

如本领域技术人员所理解的，为了获得良好分离而包含在每种或两种单体上的pi变体的数量将部分取决于感兴趣的scfv和fab的起始pi。也就是说，为了确定要工程化哪种单体或在哪种“方向”(例如更正或更负)，计算fc结构域、并且在一些情况下，连接于fc结构域的蛋白结构域的序列，并且据此作出决定。如所属领域所知，不同的fc结构域和/或蛋白结构域将具有在本发明中利用的不同起始pi。一般来说，如本文中所概述，pi经过工程化而使得每种单体的总pi差异达到至少约0.1log，如本文中所概述优选0.2到0.5。

此外，如所属领域技术人员将理解和本文概述，在一些实施方案中，异源二聚体可以基于尺寸与同源二聚体分离。如图中所示，例如，几种形式允许基于尺寸分离异源二聚体和同源二聚体。

在使用pi变体实现异源二聚化的情况下，通过使用fc结构域的恒定区，提供设计和纯化异源二聚体fc融合蛋白的更模块化方法。因此，在一些实施方案中，必须工程化异源二聚化变体(包括偏斜和纯化异源二聚化变体)。另外，在一些实施方案中，通过导入来自不同igg同型的pi变体以便在不引入显著免疫原性的情况下改变pi来显著降低pi变体导致免疫原性的可能性。因此，要解决的另一个问题是阐明具有高人类序列含量的低pi恒定结构域，例如在任何特定位置最小化或避免非人类残基。

这种pi工程化可以得到的额外益处也是血清半衰期延长和fcrn结合增加。也就是说，如us8,637,641(以全文引用的方式并入本文中)中所述，降低抗体恒定结构域(包括在抗体和fc融合物中发现的那些)的pi可导致体内更长的血清滞留。具有增加的血清半衰期的这些pi变体也促进了pi变化以进行纯化。

另外，应该注意的是，异源二聚化变体的pi变体为fc融合蛋白的分析和质量控制方法提供额外的益处，因为消除、最小化和区分同源二聚体何时存在的能力是显著的。类似地，可靠地测试异源二聚体fc融合蛋白产生的再现性的能力是重要的。

c.异二聚化变体

本发明提供了异源二聚体蛋白质，包括多种形式的异源二聚体抗体，其利用异源二聚体变体以允许异源二聚体形成和/或从同型二聚体纯化。异源二聚体融合构建体基于两个fc结构域的自组装性质，例如组装成“二聚体”的两个“单体”。

存在许多合适的异源二聚化偏斜变体组的对。这些变体以“组”的“对”出现。也就是说，将一组对并入第一单体中且将另一组对并入第二单体中。应该注意，这些组不一定表现为“臼包杵”型变体，其中一种单体上的残基与另一种单体上的残基之间存在一对一对应；即，组中的这些对形成了两种单体之间的界面，促进了异源二聚体形成并且阻碍了同源二聚体体形成，从而使在生物学条件下自发形成异源二聚体的百分比超过90％，而非预期的50％(25％同源二聚体a/a:50％异源二聚体a/b:25％同源二聚体b/b)。

d.空间变体

在一些实施方案中，可通过添加空间变体来促进异源二聚体的形成。也就是说，通过改变每个重链中的氨基酸，不同重链缔合形成异源二聚体结构的可能性大于与相同fc氨基酸序列形成同二聚体的可能性。合适的空间变体包括在us2016/0355608的图29中，所有这些文献都以全文引用的方式并入本文中，以及图1a-1e中。

一种机制在所属领域中通常称为“杵和臼”，还可以任选地使用所谓的氨基酸工程来产生空间影响以有利于形成异源二聚体而不利于形成同二聚体；这有时称为“杵和臼”，如以下文献中所述：ridgway等人，《蛋白质工程》9(7):617(1996)；atwell等人，《分子生物学杂志》1997270:26；美国专利第8,216,805号，所有这些文献全部并入本文供参考。附图标识了许多依赖于“杵和臼”的“单体a-单体b”对。另外，如merchant等人，《自然·生物技术》16:677(1998)中所述，这些“杵和臼”突变可以与二硫键组合以偏斜形成异二聚化。

一种用于产生异源二聚体抗体的另一种机制有时称为“静电转向”，如gunasekaran等人,《生物化学杂志》285(25):19637(2010)中所述，所述文献以全文引用的方式并入本文中。这在本文中有时被称作“电荷对”。在这个实施方案中，静电用于使形成偏向异源二聚化。如所属领域技术人员将了解，这些还可以影响pi，并且因此影响纯化，并且因此在一些情况下还可以被视为pi变体。然而，由于这些是为了强制发生异二聚化而产生且不是作为纯化工具使用，因此其被分类为“空间变体”。这些包括但不限于d221e/p228e/l368e与d221r/p228r/k409r配对(例如这些是“单体对应组”)和c220e/p228e/368e配对c220r/e224r/p228r/k409r。

另外的单体a和单体b变体可以与任选和独立地以任何量的其他变体组合，例如本文概述的pi变体或us2012/0149876的图37中显示的其他空间变体，其图和图例以及seqidno通过引用明确地并入本文。

在一些实施方案中，本文所概述的空间变体可以任选地且独立地与任何pi变体(或其它变体，如fc变体、fcrn变体等)一起并入一个或两个单体中，且可以独立地且任选地包含于本发明的蛋白质中或从本发明的蛋白质中排除。

在图4a-4c中找到合适的偏斜变体的列表。在多个实施方案中，特别适用的组中的对，其包含(但不限于)s364k/e357q:l368d/k370s；l368d/k370s:s364k；l368e/k370s:s364k；t411e/k360e/q362e:d401k；l368d/k370s:s364k/e357l、k370s:s364k/e357q和t366s/l368a/y407v:t366w(任选地包括二硫桥键，t366s/l368a/y407v/y349c：t366w/s354c)。就命名法而言，对“s364k/e357q:l368d/k370s”意指单体中的一者具有双变体组s364k/e357q并且另一者具有双变体组l368d/k370s；如上文所提及，这些对的“链型”取决于起始pi。

e.异源二聚体的pi(等电点)变体

一般来说，如所属领域的技术人员将了解，pi变体存在两种通用类别：提高蛋白质pi(碱性变化)的变体和降低蛋白质pi(酸性变化)的变体。如本文所述，可以进行这些变体的所有组合：一种单体可以是野生型，或者不显示与野生型显著不同的pi的变体，并且另一种可以是更碱性或更酸性的。可替代地，改变每种单体，一种具有更强碱性且一种具有更强酸性。

pi变体的优选组合展示于us2016/0355608的图30中，所有这些文献都以全文引用的方式并入本文中。如本文所概述且如图中所示，这些变化是相对于igg1展示，而且所有同型以及同型杂合体均可以按此方式改变。在重链恒定结构域来自igg2-4的情况下，也可以使用r133e和r133q。

在一个实施方案中，如果fc单体之一包括ch1结构域，那么pi变体的优选组合具有包含208d/295e/384d/418e/421d变体(当相对于人类igg1时为n208d/q295e/n384d/q418e/n421d)的一种单体。在一些例子中，第二单体包含带正电荷的结构域连接子，包括(gkpgs)4。在一些情况下，第一单体包括ch1结构域，包括位置208。因此，在不包括ch1结构域的构建体中(例如对于在其中一个结构域上不利用ch1结构域的异源二聚体fc融合蛋白)，优选的负pi变体fc组包括295e/384d/418e/421d变体(当相对于人类igg1时为q295e/n384d/q418e/n421d)。

在一些实施方案中，突变在fc结构域的铰链结构域中进行，包括位置221、222、223、224、225、233、234、235和236。应该注意，可以进行233-236中的改变以增加igg2主链中的效应功能(以及327a)。因此，pi突变和特别是取代可以在位置221-225中的一个或多个中进行，其中1、2、3、4或5个突变可用于本发明。同样，单独或与其他域中的其他pi变体一起考虑所有可能的组合。

可用于降低铰链结构域的pi的特定取代包括但不限于位置221处的缺失、位置222处的非天然缬氨酸或苏氨酸、位置223处的缺失、位置224处的非天然谷氨酸、位置225处的缺失、位置235处的缺失和位置236处的缺失或非天然丙氨酸。在一些情况下，仅在铰链结构域中进行pi取代，并且在其他情况下，这些取代以任何组合添加至其他结构域中的其他pi变体。

在一些实施方案中，可以在ch2区域中进行突变，包括位置274、296、300、309、320、322、326、327、334和339。同样，可以对这10个位置进行所有可能的组合；例如，pi抗体可具有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个ch2pi取代。

可用于降低ch2结构域的pi的特定取代包括但不限于位置274处的非天然谷氨酰胺或谷氨酸、位置296处的非天然苯丙氨酸、位置300处的非天然苯丙氨酸、位置309处的非天然缬氨酸、位置320处的非天然谷氨酸、位置322处的非天然谷氨酸、位置326处的非天然谷氨酸、位置327处的非天然甘氨酸、位置334处的非天然谷氨酸、位置339处的非天然苏氨酸以及ch2和其它结构域内的所有可能组合。

在这个实施方案中，突变可以独立地和任选地选自位置355、359、362、384、389,392、397、418、419、444和447。可用于降低ch3结构域的pi的特定取代包括但不限于位置355处的非天然谷氨酰胺或谷氨酸、位置384处的非天然丝氨酸、位置392处的非天然天冬酰胺或谷氨酸、位置397处的非天然蛋氨酸、位置419处的非天然谷氨酸、位置359处的非天然谷氨酸、位置362处的非天然谷氨酸、位置389处的非天然谷氨酸、位置418处的非天然谷氨酸、位置444处的非天然谷氨酸和位置447处的缺失或非天然天冬氨酸。图中包括图5中提供pi变体的例示性实施方案。

f.同型变体

另外，本发明的许多实施方案依赖于将来自一种igg同型的特定位置的pi氨基酸“引进”另一种igg同型中，从而减少或排除变体中引入非所需免疫原性的可能性。多种这些变异体展示于美国公开us2014/0370013的图21中，此文献特此并入本文供参考。也就是说，igg1是治疗性抗体的常见同型，其原因有多种，包括高效应功能。然而，igg1的重链恒定区具有比igg2的重链恒定区更高的pi(8.10相对于7.31)。通过将特定位置的igg2残基引入igg1主链中，使得所得单体的pi降低(或提高)且另外展现出较长的血清半衰期。例如，igg1在137位具有甘氨酸(pi5.97)，igg2具有谷氨酸(pi3.22)；输入谷氨酸会影响所得蛋白的pi。如下所述，通常需要许多氨基酸取代来显著影响变体抗体的pi。然而，应该注意，如下所述，即使igg2分子的变化也允许增加血清半衰期。

在其它实施方案中，进行非同型氨基酸变化，以减少所得蛋白的总电荷状态(例如通过将更高的pi氨基酸变为更低的pi氨基酸)，或允许在结构中调节稳定性等等，如下文进一步描述。

此外，通过pi工程化重链和轻链恒定结构域，可以看到异源二聚体的每种单体的显著变化。如本文所讨论，使两种单体的pi相差至少0.5可以允许通过离子交换色谱或等电聚焦或对等电点敏感的其它方法进行分离。

g.计算pi

每种单体的pi可以取决于变体重链恒定结构域的pi和总单体的pi，总单体包括变体重链恒定结构域和融合搭配物。因此，在一些实施方案中，使用us2014/0370013中图19的图表，基于变体重链恒定结构域计算pi变化。如本文所讨论，要工程化哪个单体通常由每种单体的固有pi决定。

h.也赋予更好的fcrn体内结合的pi变体

在pi变体降低单体的pi的情况下，其可具有改善体内血清滞留的附加益处。

虽然仍处于审查，但是相信fc区使体内半衰期延长，原因是在核内体中在ph6结合到fcrn隔绝了fc(ghetie和ward，1997《今日免疫学(immunoltoday)》18(12):592-598，此文献完全并入本文供参考)。随后内体隔室使fc再循环到细胞表面。一旦区室打开到细胞外空间，较高的ph(约7.4)诱导fc释放回到血液中。dall'acqua等人表明，在小鼠中，在ph6和ph7.4下的fcrn结合增加的fc突变体实际上具有降低的血清浓度以及与野生型fc相同的半衰期(dall'acqua等人,2002,《免疫学杂志》169:5171-5180，其以引用的方式整体并入本文中)。fc对fcrn的亲和力在ph7.4增强被认为是禁止了fc释放回到血液中。因此，延长fc体内半衰期的fc突变理想地增强了较低ph下的fcrn结合，同时仍允许fc在较高ph下释放。在6.0到7.4的ph范围内，氨基酸组胺酸的电荷状态发生变化。因此，在fc/fcrn复合物中的重要位置找到his残基并不出乎意料。

图中包括图5中提供pi变体的例示性实施方案。

i.用于额外功能的额外fc变体

除了pi氨基酸变体之外，还存在许多有用的fc氨基酸修饰，其可以由于多种原因而制备，包括但不限于，改变与一种或多种fcγr受体的结合，改变与fcrn受体的结合，等等

相应地，本发明的蛋白可以包括氨基酸修饰，包括本文所概述的异源二聚化变体，包括pi变体和空间变体。每组变体可以独立地和任选地包括或不包括任何特定异源二聚体蛋白。

j.fcγr变体

因此，可以进行许多有用的fc取代以改变与一种或多种fcγr受体的结合。导致结合增加以及结合减少的取代可能是有用的。举例来说，已知与fcγriiia的结合增加引起adcc增加(抗体依赖性细胞介导的细胞毒性；细胞介导的反应，其中表达fcγr的非特异性细胞毒性细胞识别目标细胞上的所结合抗体且随后促使目标细胞溶解)。类似地，在一些情况下，与fcγriib的结合减弱(抑制性受体)也可能是有利的。可以用于本发明中的氨基酸取代包括ussn11/124,620(尤其是图41)、ussn11/174,287、ussn11/396,495、ussn11/538,406中列出的氨基酸取代，所有这些文献全文以及尤其是针对其中所揭露的变体所述内容特此并入本文中供参考。可以使用的特定变体包括但不限于236a、239d、239e、332e、332d、239d/332e、267d、267e、328f、267e/328f、236a/332e、239d/332e/330y、239d、332e/330l、243a、243l、264a、264v和299t。

另外，增加对fcγriic的亲和力的氨基酸取代也可包括在本文概述的fc结构域变体中。例如，ussn11/124,620和ussn14/578,305中描述的取代是有用的。

另外，存在额外的fc取代，其可用于增加与fcrn受体的结合和增加血清半衰期，如ussn12/341,769中具体公开的，其通过引用整体并入本文，包括但不限于434s、434a、428l、308f、259i、428l/434s、259i/308f、436i/428l、436i或v/434s、436v/428l和259i/308f/428l。

k.消融变体

类似地，另一类功能变体是“fcγr消融变体”或“fc敲除(fcko或ko)”变体。在这些实施方案中，对于一些治疗应用，期望减少或去除fc结构域与一种或多种或所有fcγ受体(例如fcγr1、fcγriia、fcγriib、fcγriiia等)的正常结合，以避免其他作用机制。即，例如，在许多实施方案中，特别是在使用靶向的免疫调节抗体时，需要消除fcγriiia结合以消除或显著降低adcc活性，使得一个fc结构域包含一个或多个fcγ受体消融变体。这些消融变体在ussn15/141,350的图31中描绘，将其全部通过引用以其整体并入本文，并且每一个都可以独立地和可选地被包括或不包括，其中优选的方面利用选自下述的消融变体：根据eu索引，g236r/l328r、e233p/l234v/l235a/g236del/s239k、e233p/l234v/l235a/g236del/s267k、e233p/l234v/l235a/g236del/s239k/a327g、e233p/l234v/l235a/g236del/s267k/a327g和e233p/l234v/l235a/g236del。应该注意，本文提及的消融变体消融fcγr结合，但通常不消融fcrn结合。

l.异源二聚体变体和fc变体的组合

如所属领域技术人员将理解，所有所列举的异源二聚化变体(包括偏斜和/或pi变体)可以任选地和独立地以任何方式组合，只要其保持其“链型”或“单体分区”即可。另外，所有这些变体可以按任一种异源二聚化形式组合。

在pi变体的情况下，虽然图中展示了可以特别使用的实施方案，但是可以根据改变两种单体之间的pi差异以辅助纯化的基本规则来产生其它组合。

此外，任何异源二聚化变体，偏斜和pi，也独立地和可选地与fc消融变体、fc变体、fcrn变体组合，如本文一般概述。

另外，单体fc结构域可包含一组氨基酸取代，其包括c220s/s267k/l368d/k370s或c220s/s267k/s364k/e357q。

此外，异源二聚体融合蛋白可包含偏斜变体(例如，ussn15/141,350的图1a-1c中所示的一组氨基酸取代，所有这些取代均以引用的方式整体并入本文)，特别有用的偏斜变体选自s364k/e357q:l368d/k370s；l368d/k370s:s364k；l368e/k370s:s364k；t411e/k360e/q362e:d401k；l368d/k370s:s364k/e357l、k370s:s364k/e357q、t366s/l368a/y407v:t366w和t366s/l368a/y407v/y349c:t366w/s354c，可选的消融变体，可选带电的结构域连接子和重链包含pi变体。

236r、239d、239e、243l、m252y、v259i、267d、267e、298a、v308f、328f、328r、330l、332d、332e、m428l、n434a、n434s、236r/328r、239d/332e、m428l、236r/328f、v259i/v308f、267e/328f、m428l/n434s、y436i/m428l、y436v/m428l、y436i/n434s、y436v/n434s、239d/332e/330l、m252y/s254t/t256e、v259i/v308f/m428l、e233p/l234v/l235a/g236del/s267k、g236r/l328r和pva/s267k。在一些情况下，fc结构域包含氨基酸取代239d/332e。在其他情况下，fc结构域包含氨基酸取代g236r/l328r或pva/s267k。

在一个实施方案中，可用于本发明的偏斜和pi变体的特定组合是t366s/l368a/y407v：t366w(可选地包括桥连二硫化物，t366s/l368a/y407v/y349c：t366w/s354c)，其中一种单体包含q295e/n384d/q418e/n481d和另一个带正电荷的结构域连接子。如所属领域所理解，“臼包杵”变体不改变pi，并且因此可用于任一单体。

图4a-4e中提供了有用的fc二聚化变体对(包括偏斜和pi变体)。图5中提供另外的pi变体。有用的消融变体在图6中提供。在图7a-7e和8a-8f中提供了本发明的靶向pd-1的il-15/il-15rα-fc融合蛋白的非细胞因子组分的有用实施方案。此外，有用的基于人igg1的il-15/rα-fc形式主链，不带il-15和il-15rα(寿司)结构域序列。

iv.本发明的有用形式

如图65a-65k所示，本发明的靶向pd-1的il-15/il-15rα-fc融合蛋白(也称为靶向pd-1的il-15/il-15rα异源二聚蛋白或异源二聚融合蛋白)有许多有用的形式。通常，本发明的异源二聚体融合蛋白具有三种功能组分：il-15/il-15rα(寿司)组分、抗pd-1组分，和fc组分，其中每一种可以采用本文所述的不同的形式，并且每种形式可以以任何构型与其他组分组合。

fc组分的第一和第二fc结构域可以具有选自以下的一组氨基酸取代：

a)s267k/l368d/k370s：s267k/ls364k/e357q；和b)s364k/e357q：l368d/k370s；c)l368d/k370s：s364k；d)l368e/k370s：s364k；

e)t411e/k360e/q362e：d401k；f)l368d/k370s：s364k/e357l和g)k370s：s364k/e357q(根据eu编号)。

在一些情况下，第一和第二fc结构域分别具有取代l368d/k370s：s364k/e357q。在某些情况下，第一和第二fc结构域分别具有取代s364k/e357q：l368d/k370s。

在一些实施方案中，根据eu编号，第一fc结构域和/或第二fc结构域具有另外一组包含q295e/n384d/q418e/n421d的氨基酸取代。

任选地，根据eu编号，第一fc结构域和/或第二fc结构域具有另外一组由以下组成的氨基酸取代：g236r/l328r、e233p/l234v/l235a/g236del/s239k、e233p/l234v/l235a/g236del/s267k、e233p/l234v/l235a/g236del/s239k/a327g、e233p/l234v/l235a/g236del/s267k/a327g和e233p/l234v/l235a/g236del。任选地，第一fc结构域和/或第二fc结构域具有用于半衰期延长的m428l/n434s变体。在一些实施方案中，第一fc结构域和/或第二fc结构域具有用于半衰期延长的428l/434s变体。在一些实施方案中，第一和第二fc结构域各自具有m428l/n434s变体。

a.scil-15/rαxscfv

一个实施方案示于图65a，并且包括两个单体。这通常被称为“scil-15/rα×scfv”，其中“sc”代表“单链”，是指使用共价连接子连接il-15和il-15rα寿司结构域。“scil-15/rαxscfv”形式(参见图65a)包含通过可变长度连接子(称为“scil-15/rα”)与人成熟il-15融合的人il-15rα(寿司)结构域，然后，该连接子与第一fc单体的n端融合，而将scfv与第二fc单体的n端融合。在一些实施方案中，第二fc单体包含全部或部分铰链-ch2-ch3。

在一些实施方案中，第一单体由n端到c端包含人il-15rα寿司结构域-结构域连接子-人il-15-任选的结构域连接子-ch2-ch3，并且第二单体包含vh-scfv连接子-vl-铰链-ch2-ch3或vl-scfv连接子-vh-铰链-ch2-ch3，尽管在任一定向上，结构域连接子可以取代铰链。对于本实施方案的fc变体的这类组合在图8a和8b中找到。

如图93a-93s、图94a-94ap、图95a-95j和图96a-96f提及且对含有cdr每一序列而言确实如此，取决于所使用的编号方法(如表1中所示)，cdr位置的精确标识可能略微不同，且因此本文中不仅包括带下划线的cdr且还包括使用其它编号系统的vh和vl结构域内所包括的cdr。另外，每个cdr具有其自身的seqidno:或序列标识符，且每个vh和vl结构域在序列表中具有其自身的seqidno:或序列标识符。

在scil-15/rαxscfv形式中，一种实施方案利用具有序列1g6_l1.194_h1.279的抗pd-1abd，如图66所述，包括序列标识符。图66提供了scil-15/rαxscfv形式的说明性靶向pd-1的il-15/il-15rα-fc融合蛋白例如xenp21480的氨基酸序列。在scil-15/rαxscfv形式中，一个实施方案利用偏斜变体对s364k/e357q：l368d/k370s。在scil-15/rαxscfv形式中，一种实施方案利用具有序列1g6_l1.194_h1.279的抗pd-1abd，如图66所示，和偏斜变体对s364k/e357q：l368d/k370s。在scil-15/rαxscfv形式中，一种实施方案利用具有如图66所示的序列1g6_l1.194_h1.279的抗pd-1abd，以图8a形式：例如偏斜变体s364k/e357q(在scfv-fc单体上)和l368d/k370s(在il-15复合物单体上)，pi变体q295e/n384d/q418e/n421d(在il-15复合物侧)，两种单体上的消融变体e233p/l234v/l235a/g236del/s267k，以及任选地在两侧的428l/434s变体。

在scil-15/rαxscfv形式中，一个实施方案利用具有来自xenp22538的1c11[pd-1]_h3l3的可变重链和可变轻链序列的抗pd-1abd，如图93a所示。在scil-15/rαxscfv形式中，一种实施方案利用具有xenp22538的序列1c11[pd-1]_h3l3的抗pd-1abd，如图93a所示，以图8a形式。一个实施方案利用抗pd-1abd，其具有1c11[pd-1]_h3l3的scfv变体的序列，如图93a-图93s所示，包括序列标识符。一个实施方案利用抗pd-1abd，其具有1c11[pd-1]_h3l3的变体的可变重链序列，如图95a-图95j所示，包括序列标识符，以及1c11[pd-1]_h3l3的变体的可变轻链序列，如图96a-图96f所示，包括序列标识符。在一些实施方案中，scil-15/rαxscfv融合蛋白的抗pd-1abd包含如图95a-图95j中所示的1c11[pd-1]_h3l3的变体的可变重链序列的cdr，包括序列标识符，以及如图96a-图96f中所示的1c11[pd-1]_h3l3的变体的可变轻链序列的cdr，包括序列标识符。

在scil-15/rαxscfv融合蛋白的一些实施方案中，抗pd-1scfv利用xenp或相应的seqidnos中任一项的abd的序列，如图93a-93s所示。在一些情况下，抗pd-1scfv具有选自以下的abd的序列：xenp22538、xenp23577、xenp23579、xenp23589、xenp23601、xenp23605、xenp23609、xenp23615、xenp23616、xenp23624、xenp23626、xenp23628、xenp23629、xenp23633、xenp23636、xenp23640、xenp23755、xenp23758、xenp23760、xenp23765、xenp23770、xenp23776、xenp23779、xenp23780、xenp23781、xenp23789、xenp23793、xenp23796、xenp23811、xenp24201、xenp24207、xenp24208、xenp24209、xenp24210、xenp24211、xenp24212、xenp24213、xenp24214、xenp24215、xenp24216、xenp24217、xenp24218、xenp24221、xenp24222、xenp24226、xenp24227、xenp24228、xenp24247、xenp42450、xenp24254、xenp24256、xenp24263、xenp24266、xenp24267、xenp24268、xenp24270、xenp24274、xenp24278、xenp24279、xenp24287、xenp24291、xenp24372、xenp24373、xenp24374、xenp24375、xenp24376、xenp24377、xenp24378、xenp24379、xenp24380、xenp24381、xenp24382、xenp24414、xenp24415、xenp24416、xenp24417、xenp24418、xenp24419、xenp24420、xenp24421、xenp24422、xenp24423、xenp24424、xenp24425、xenp24426、xenp24427、xenp24428、xenp24429、xenp24430、xenp24431、xenp24432、xenp24433、xenp24434、xenp24435、xenp24436、xenp24437、xenp24438、xenp24439、xenp24440、xenp24441、xenp24442、xenp24443、xenp24827、xenp24828、xenp24829、xenp24830、xenp24831、xenp24832、xenp24833、xenp24834、xenp24835、xenp24836、xenp24837、xenp24838、xenp24839、xenp24840、xenp24841、xenp24842、xenp24843、xenp24844、xenp24845、xenp24846、xenp24847、xenp24848、xenp24849、xenp24850、xenp24851、xenp24852、xenp24853、xenp24854、xenp24855、xenp24856、xenp24857、xenp24858、xenp25295、xenp25296、xenp25301、xenp23502、xenp25303、xenp25304、xenp25305、xenp25306、xenp25307、xenp25308、xenp25309、xenp25310、xenp25311、xenp25312、xenp25313、xenp25314、xenp25315、xenp25316、xenp25317、xenp25318、xenp25319、xenp25320、xenp25321、xenp25802、xenp25803、xenp25804、xenp25805、xenp25806、xenp25807、xenp25808、xenp25809、xenp25810、xenp25811、xenp25812、xenp25813、xenp25814、xenp25815、xenp25816、xenp25817、xenp25818和xenp25819，包括相应的seqidnos。

在一些实施方案中，scil-15/rαxscfv形式利用针对人pd-1的scfvabd，其具有xenp25806或1c11[pd-1]_h3.234_l3.144的abd的序列，如图93r所示，包括seqidnos。换句话说，来自xenp25806的六个cdr和/或vh和vl结构域可以示例性的scil-15/rαx抗pd-1scfv形式使用。

在某些实施方案中，scil-15/rαxscfv形式利用针对人pd-1的scfvabd，其具有xenp25812或1c11[pd-1]_h3.240_l3.148的abd的序列，如图93r所示，包括seqidnos。换句话说，来自xenp25812的六个cdr和/或vh和vl结构域可以示例性的scil-15/rαx抗pd-1scfv形式使用。

在特定实施方案中，scil-15/rαxscfv形式利用针对人pd-1的scfvabd，其具有xenp25813或1c11[pd-1]_h3.241_l3.148的abd的序列，如图93r所示，包括seqidnos。换句话说，来自xenp25813的六个cdr和/或vh和vl结构域可以示例性的scil-15/rαx抗pd-1scfv形式使用。

在其他实施方案中，scil-15/rαxscfv形式利用针对人pd-1的scfvabd，其具有xenp25819或1c11[pd-1]_h3.241_l3.92的abd的序列，如图93s所示，包括seqidnos。换句话说，来自xenp25819的六个cdr和/或vh和vl结构域可以示例性的scil-15/rαx抗pd-1scfv形式使用。

在scil-15/rαxscfv形式中，优选实施方案利用了xenp22022的链1的il-15复合物(寿司结构域-连接子-il-15)，如图69a所示，包括seqidnos。在scil-15/rαxscfv形式中，一个优选实施方案利用了xenp25850的链2的il-15复合物(寿司结构域-连接子-il-15变体n4d/n65d)，如图69c所示。在scil-15/rαxscfv形式中，另一个优选实施方案利用了xenp29482的链1的il-15复合物(寿司结构域-连接子-il-15变体d30n/n65d)，如图126a所示。在scil-15/rαxscfv形式中，另一个优选实施方案利用了xenp29286的链1的il-15复合物(寿司结构域-连接子-il-15变体d30n/e64q/n65d)，如图124c所示。

在scil-15/rαx抗pd-1scfv形式中，一种优选的实施方案利用具有如图66所示的序列1g6_l1.194_h1.279的抗pd-1abd和如图69a描绘的xenp22022的链1的il-15复合物(寿司结构域-连接子-il-15)。在某些情况下，scil-15/rαx抗pd-1scfvfc融合蛋白包含抗pd-1abd，其具有如图66所示的序列1g6_l1.194_h1.279，和xenp25850的链2的il-15复合物(寿司结构域-连接子-il-15变体n4d/n65d)，如图69c所示。在其他情况下，所述fc融合蛋白包含抗pd-1abd，其具有如图66所示的序列1g6_l1.194_h1.279，和xenp29482的链1的il-15复合物(寿司结构域-连接子-il-15变体d30n/n65d)，如图126a所示。在其他情况下，所述fc融合蛋白包含抗pd-1abd，其具有如图66所示的序列1g6_l1.194_h1.279，和xenp29286的il-15复合物(寿司结构域-连接子-il-15变体d30n/e64q/n65d)，如图124c所示。

在scil-15/rαx抗pd-1scfv形式中，一些实施方案包括抗pd-1abd，其具有xenp22538的序列1c11[pd-1]_h3l3，如图93a所示，和xenp22022的链1的il-15复合物(寿司结构域-连接子-il-15)，如图69a所示。在一些实施方案中，scil-15/rαx抗pd-1scfvfc融合蛋白包含抗pd-1abd，其具有如图93a所示的xenp22538的序列1c11[pd-1]_h3l3，和xenp25850的链2的il-15复合物(寿司结构域-连接子-il-15变体n4d/n65d)，如图69c所示。在其他实施方案中，这种fc融合蛋白包含抗pd-1abd，其具有如图93a所示的xenp22538的序列1c11[pd-1]_h3l3，和xenp29482的链1的il-15复合物(寿司结构域-连接子-il-15变体d30n/n65d)，如图126a所示。在某些实施方案中，这种fc融合蛋白包含抗pd-1abd，其具有如图93a所示的xenp22538的序列1c11[pd-1]_h3l3，和xenp29286的链1的il-15复合物(寿司结构域-连接子-il-15变体d30n/e64q/n65d)，如图124c所示。

在scil-15/rαx抗pd-1scfv形式中，一些实施方案包括抗pd-1abd，其具有1c11[pd-1]_h3l3的变体的可变重链序列，如图95a-95j所示，和1c11[pd-1]_h3l3的变体的可变轻链序列，如图96a-图96f所示，以及xenp22022的链1的il-15复合物(寿司结构域-连接子-il-15)，如图69a所示。在一些实施方案中，scil-15/rαx抗pd-1scfvfc融合蛋白包含抗pd-1abd，其具有1c11[pd-1]_h3l3的变体的可变重链序列，如图95a-95j所示，和1c11[pd-1]_h3l3的变体的可变轻链序列，如图96a-图96f所示，以及xenp25850的链2的il-15复合物(寿司结构域-连接子－il-15变体n4d/n65d)，如图69c所示。在其他实施方案中，这种fc融合蛋白包含抗pd-1abd，其具有1c11[pd-1]_h3l3的变体的可变重链序列，如图95a-95j所示，和1c11[pd-1]_h3l3的变体的可变轻链序列，如图96a-图96f所示，以及xenp29482的链1的il-15复合物(寿司结构域-连接子－il-15变体d30n/n65d)，如图126a所示。在一些实施方案中，这种fc融合蛋白包含抗pd-1abd，其具有1c11[pd-1]_h3l3的变体的可变重链序列，如图95a-95j所示，和1c11[pd-1]_h3l3的变体的可变轻链序列，如图96a-图96f所示，以及xenp29286的链1的il-15复合物(寿司结构域-连接子－il-15变体d30n/e64q/n65d)，如图124c所示。

在scil-15/rαx抗pd-1scfv形式中，一些实施方案包括抗pd-1abd，其具有xenp25806或1c11[pd-1]_h3.234_l3.144的序列，如图93r所示，和xenp22022的链1的il-15复合物(寿司结构域-连接子-il-15)，如图69a所示。在一些实施方案中，scil-15/rαx抗pd-1scfvfc融合蛋白包含抗pd-1abd，其具有如图93r所示的xenp25806或1c11[pd-1]_h3.234_l3.144的序列，和xenp25850的链2的il-15复合物(寿司结构域-连接子-il-15变体n4d/n65d)，如图69c所示。在一些实施方案中，这种fc融合蛋白包含抗pd-1abd，其具有如图93r所示的xenp25806或1c11[pd-1]_h3.234_l3.144的序列，和xenp29482的链1的il-15复合物(寿司结构域-连接子-il-15变体d30n/n65d)，如图126a所示。在一些实施方案中，这种fc融合蛋白包含抗pd-1abd，其具有如图93r所示的xenp25806或1c11[pd-1]_h3.234_l3.144的序列，和xenp29286的链1的il-15复合物(寿司结构域-连接子-il-15变体d30n/e64q/n65d)，如图124c所示。

在scil-15/rαx抗pd-1scfv形式中，一些实施方案包括抗pd-1abd，其具有xenp25812或1c11[pd-1]_h3.240_l3.148的序列，如图93r所示，和xenp22022的链1的il-15复合物(寿司结构域-连接子-il-15)，如图69a所示。在一些实施方案中，scil-15/rαx抗pd-1scfvfc融合蛋白包含抗pd-1abd，其具有如图93r所示的xenp25812或1c11[pd-1]_h3.240_l3.148的序列，和xenp25850的链2的il-15复合物(寿司结构域-连接子-il-15变体n4d/n65d)，如图69c所示。在一些实施方案中，这种fc融合蛋白包含抗pd-1abd，其具有如图93r所示的xenp25812或1c11[pd-1]_h3.240_l3.148的序列，和xenp29482的链1的il-15复合物(寿司结构域-连接子-il-15变体d30n/n65d)，如图126a所示。在一些实施方案中，这种fc融合蛋白包含抗pd-1abd，其具有如图93r所示的xenp25812或1c11[pd-1]_h3.240_l3.148的序列，和xenp29286的链1的il-15复合物(寿司结构域-连接子-il-15变体d30n/e64q/n65d)，如图124c所示。

在scil-15/rαx抗pd-1scfv形式中，一些实施方案包括抗pd-1abd，其具有xenp25813或1c11[pd-1]_h3.241_l3.148的序列，如图93r所示，和xenp22022的链1的il-15复合物(寿司结构域-连接子-il-15)，如图69a所示。在一些实施方案中，scil-15/rαx抗pd-1scfvfc融合蛋白包含抗pd-1abd，其具有如图93r所示的xenp25813或1c11[pd-1]_h3.241_l3.148的序列，和xenp25850的链2的il-15复合物(寿司结构域-连接子-il-15变体n4d/n65d)，如图69c所示。在一些实施方案中，这种fc融合蛋白包含抗pd-1abd，其具有如图93r所示的xenp25813或1c11[pd-1]_h3.241_l3.148的序列，和xenp29482的链1的il-15复合物(寿司结构域-连接子-il-15变体d30n/n65d)，如图126a所示。在一些实施方案中，此类fc融合蛋白包含具有图93r中所示的xenp25813或1c11[pd-1]_h3.241_l3.148的序列的抗pd-1abd和il-15复合物(寿司结构域-连接子-xenp29286的链1的il-15变体d30n/e64q/n65d)，如图所示124c。

在scil-15/rαx抗pd-1scfv形式中，一些实施方案包括抗pd-1abd，其具有xenp25819或1c11[pd-1]_h3.241_l3.92的序列，如图93s所示，和xenp22022的链1的il-15复合物(寿司结构域-连接子-il-15)，如图69a所示。在一些实施方案中，scil-15/rαx抗pd-1scfvfc融合蛋白包含抗pd-1abd，其具有如图93s所示的xenp25819或1c11[pd-1]_h3.241_l3.92的序列，和xenp25850的链2的il-15复合物(寿司结构域-连接子-il-15变体n4d/n65d)，如图69c所示。在一些实施方案中，这种fc融合蛋白包含抗pd-1abd，其具有如图93s所示的xenp25819或1c11[pd-1]_h3.241_l3.92的序列，和xenp29482的链1的il-15复合物(寿司结构域-连接子-il-15变体d30n/n65d)，如图126a所示。在一些实施方案中，这种fc融合蛋白包含抗pd-1abd，其具有如图93s所示的xenp25819或1c11[pd-1]_h3.241_l3.92的序列，和xenp29286的链1的il-15复合物(寿司结构域-连接子-il-15变体d30n/e64q/n65d)，如图124c所示。

在scil-15/rαx抗pd-1scfv形式中，一个优选的实施方案利用抗pd-1abd，其具有xenp26940或1c11_h3.303_l3.152的vh和vl序列，如图94n所示，和xenp22022的链1的il-15复合物(寿司结构域-连接子-il-15)，如图69a所示。在一些实施方案中，scil-15/rαxscfv包含抗pd-1abd，其具有xenp26940或1c11_h3.303_l3.152的vh和vl序列，如图94n所示，和xenp25850的链2的il-15复合物(寿司结构域-连接子-il-15变体n4d/n65d)，如图69c所示。在一些实施方案中，scil-15/rαxscfv包含抗pd-1abd，其具有xenp26940或1c11_h3.303_l3.152的vh和vl序列，如图94n所示，和xenp29482的链1的il-15复合物(寿司结构域-连接子-il-15变体d30n/n65d)，如图126a所示。在一些实施方案中，scil-15/rαxscfv包含抗pd-1abd，其具有xenp26940或1c11_h3.303_l3.152的vh和vl序列，如图94n所示，和xenp29286的链1的il-15复合物(寿司结构域-连接子-il-15变体d30n/e64q/n65d)，如图124c所示。

在scil-15/rαx抗pd-1scfv形式中，一个优选的实施方案利用抗pd-1abd，其具有xenp28026或1c11_h3.329_l3.220的vh和vl序列，如图94ae所示，和xenp22022的链1的il-15复合物(寿司结构域-连接子-il-15)，如图69a所示。在一些实施方案中，scil-15/rαxscfv包含抗pd-1abd，其具有xenp28026或1c11_h3.329_l3.220的vh和vl序列，如图94ae所示，和xenp25850的链2的il-15复合物(寿司结构域-连接子-il-15变体n4d/n65d)，如图69c所示。在一些实施方案中，scil-15/rαxscfv包含抗pd-1abd，其具有xenp28026或1c11_h3.329_l3.220的vh和vl序列，如图94ae所示，和xenp29482的链1的il-15复合物(寿司结构域-连接子-il-15变体d30n/n65d)，如图126a所示。在一些实施方案中，scil-15/rαxscfv包含抗pd-1abd，其具有xenp28026或1c11_h3.329_l3.220的vh和vl序列，如图94ae所示，和xenp29286的链1的il-15复合物(寿司结构域-连接子-il-15变体d30n/e64q/n65d)，如图124c所示。

在scil-15/rαxscfv形式中，一个优选的实施方案利用抗pd-1abd，其具有xenp28652或1c11_h3.328_l3.152的vh和vl序列，如图94ag所示，和xenp22022的链1的il-15复合物(寿司结构域-连接子-il-15)，如图69a所示。在一些实施方案中，scil-15/rαxscfv包含抗pd-1abd，其具有xenp28652或1c11_h3.328_l3.152的vh和vl序列，如图94ag所示，和xenp25850的链2的il-15复合物(寿司结构域-连接子-il-15变体n4d/n65d)，如图69c所示。在一些实施方案中，scil-15/rαxscfv包含抗pd-1abd，其具有xenp28652或1c11_h3.328_l3.152的vh和vl序列，如图94ag所示，和xenp29482的链1的il-15复合物(寿司结构域-连接子-il-15变体d30n/n65d)，如图126a所示。在一些实施方案中，scil-15/rαxscfv包含抗pd-1abd，其具有xenp28652或1c11_h3.328_l3.152的vh和vl序列，如图94ag所示，和xenp29286的链1的il-15复合物(寿司结构域-连接子-il-15变体d30n/e64q/n65d)，如图124c所示。

b.scfvxncil-15/rα

此实施方案示于图65b，并且包括三个单体。这通常被称为“ncil-15/rαxscfv”或“scfvxncil-15/rα”，其中“nc”代表“非共价”，是指il-15和il-15rα寿司结构域的自组装非共价连接。“scfvxncil-15/rα”形式(参见图65b)包含与第一fc单体的n末端融合的scfv，与第二fc单体融合的人il-15rα(寿司)，而人成熟il-15(例如人成熟il-15变体)被分别转染，从而形成非共价的il-15/rα复合物。

在一些实施方案中，第一单体包含由n端到c端的寿司结构域连接子-ch2-ch3，并且第二单体包含vh-scfv连接子-vl-铰链-ch2-ch3或vl-scfv连接子-vh-铰链-ch2-ch3，尽管在任一定向上，结构域连接子可以取代铰链。第三单体是成熟il-15结构域。对于本实施方案的变体的优选组合在图8a和8b中找到。

在ncil-15/rαxscfv形式中，一种优选实施方案利用具有序列1g6_l1.194_h1.279的抗pd-1abd，如图66所述。图67提供了scfvxncil-15/rα形式的示例性il-15/rαx抗pd-1异源二聚体蛋白的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗pd-1abd具有序列1g6_l1.194_h1.279_scfv，如图67的链1所示。

在ncil-15/rαxscfv形式中，一个优选实施方案利用偏斜变体对s364k/e357q:l368d/k370s。在ncil-15/rαxscfv形式中，一种优选实施方案利用具有序列1g6_l1.194_h1.279的抗pd-1abd，如图66所示，和偏斜变体对s364k/e357q：l368d/k370s。在ncil-15/rαxscfv形式中，一种优选实施方案利用具有如图66所示的序列1g6_l1.194_h1.279的抗pd-1abd，以图8b形式：例如偏斜变体s364k/e357q(在il-15rα(寿司)-fc单体上)和l368d/k370s(在scfv-fc单体上)，pi变体q295e/n384d/q418e/n421d(在scfv-fc单体上)，两种单体上的消融变体e233p/l234v/l235a/g236del/s267k，以及任选地在两侧的428l/434s变体。在ncil-15/rαxscfv形式中，一种优选实施方案利用具有序列1g6_l1.194_h1.279的抗pd-1abd，如图66所述，以图8b形式。

在ncil-15/rαxscfv形式中，一个优选实施方案利用具有来自xenp22538的1c11[pd-1]_h3l3的可变重链和可变轻链序列的抗pd-1abd，如图93a所示。在ncil-15/rαxscfv形式中，一种优选实施方案利用具有如图93a所示的xenp22538的序列1c11[pd-1]_h3l3的抗pd-1abd，以图8b形式：例如偏斜变体s364k/e357q(在il-15rα(寿司)-fc单体上)和l368d/k370s(在scfv-fc单体上)，pi变体q295e/n384d/q418e/n421d(在scfv-fc单体上)，两种单体上的消融变体e233p/l234v/l235a/g236del/s267k，以及任选地在两侧的428l/434s变体。在ncil-15/rαxscfv形式中，一个优选实施方案利用具有xenp22538的序列1c11[pd-1]_h3l3的抗pd-1abd，如图93a所示，以图8b的形式。在ncil-15/rαxscfv形式中，一个优选的实施方案利用了抗pd-1abd，其具有1c11[pd-1]_h3l3的scfv变体的序列，如图93a-图93s所示。在ncil-15/rαxscfv格式中，一个优选实施方案利用抗pd-1abd，其具有1c11[pd-1]_h3l3的变体的可变重链序列，如图95a-图95j所示，以及1c11[pd-1]_h3l3的变体的可变轻链序列，如图96a-图96f所示。

在一些实施方案中，ncil-15/rαxscfv形式利用针对人pd-1的scfvabd，其具有xenp25806或1c11[pd-1]_h3.234_l3.144的abd的序列，如图93r所示。换句话说，来自xenp25806的六个cdr和/或vh和vl结构域可以示例性的ncil-15/rαx抗pd-1scfv形式使用。在一些实施方案中，ncil-15/rαxscfv形式利用针对人pd-1的scfvabd，其具有xenp25806或1c11[pd-1]_h3.234_l3.144的abd的序列，如图93r中所示，以图8b形式：例如偏斜变体s364k/e357q(在il-15rα(寿司)-fc单体上)和l368d/k370s(在scfv-fc单体上)，pi变体q295e/n384d/q418e/n421d(在scfv-fc单体上)，两种单体上的消融变体e233p/l234v/l235a/g236del/s267k，以及任选地在两侧的428l/434s变体。

在某些实施方案中，ncil-15/rαxscfv形式利用针对人pd-1的scfvabd，其具有xenp25812或1c11[pd-1]_h3.240_l3.148的abd的序列，如图93r所示。换句话说，来自xenp25812的六个cdr和/或vh和vl结构域可以示例性的ncil-15/rαx抗pd-1scfv形式使用。在一些实施方案中，ncil-15/rαxscfv形式利用针对人pd-1的scfvabd，其具有xenp25812或1c11[pd-1]_h3.240_l3.148的abd的序列，如图93r中所示，以图8b形式：例如偏斜变体s364k/e357q(在il-15rα(寿司)-fc单体上)和l368d/k370s(在scfv-fc单体上)，pi变体q295e/n384d/q418e/n421d(在scfv-fc单体上)，两种单体上的消融变体e233p/l234v/l235a/g236del/s267k，以及任选地在两侧的428l/434s变体。

在特定实施方案中，ncil-15/rαxscfv形式利用针对人pd-1的scfvabd，其具有xenp25813或1c11[pd-1]_h3.241_l3.148的abd的序列，如图93r所示。换句话说，来自xenp25813的六个cdr和/或vh和vl结构域可以示例性的ncil-15/rαx抗pd-1scfv形式使用。在一些实施方案中，ncil-15/rαxscfv形式利用针对人pd-1的scfvabd，其具有xenp25813或1c11[pd-1]_h3.241_l3.148的abd的序列，如图93r中所示，以图8b形式：例如偏斜变体s364k/e357q(在il-15rα(寿司)-fc单体上)和l368d/k370s(在scfv-fc单体上)，pi变体q295e/n384d/q418e/n421d(在scfv-fc单体上)，两种单体上的消融变体e233p/l234v/l235a/g236del/s267k，以及任选地在两侧的428l/434s变体。

在其他实施方案中，ncil-15/rαxscfv形式利用针对人pd-1的scfvabd，其具有xenp25819或1c11[pd-1]_h3.241_l3.92的abd的序列，如图93s所示。换句话说，来自xenp25819的六个cdr和/或vh和vl结构域可以示例性的ncil-15/rαx抗pd-1scfv形式使用。在一些实施方案中，ncil-15/rαxscfv形式利用针对人pd-1的scfvabd，其具有xenp25819或1c11[pd-1]_h3.241_l3.92的abd的序列，如图93r中所示，以图8b形式：例如偏斜变体s364k/e357q(在il-15rα(寿司)-fc单体上)和l368d/k370s(在scfv-fc单体上)，pi变体q295e/n384d/q418e/n421d(在scfv-fc单体上)，两种单体上的消融变体e233p/l234v/l235a/g236del/s267k，以及任选地在两侧的428l/434s变体。

在一些实施方案中，本文概述的任何ncil-15/rαxscfv融合蛋白的抗pd-1scfv包含如图94n所示的xenp26940或1c11_h3.303_l3.152的vh和vl序列，如图94ae所示的xenp28026或1c11_h3.329_l3.220的vh和vl序列，或如图94ag所示的xenp28652或1c11_h3.328_l3.152的vh和vl序列。

在一些实施方案中，ncil-15/rαxscfv包含人il-15rα(寿司)结构域和人成熟il-15。在某些实施方案中，ncil-15/rαxscfv包含人il-15rα(寿司)结构域和具有氨基酸取代n4d/n65d的人成熟il-15变体。在特定实施方案中，ncil-15/rαxscfv包含人il-15rα(寿司)结构域和具有氨基酸取代d30n/n65d的人成熟il-15变体。在某些实施方案中，ncil-15/rαxscfv包含人il-15rα(寿司)结构域和具有氨基酸取代d30n/e64q/n65d的人成熟il-15变体。

在ncil-15/rαxscfv形式中，一个优选实施方案利用具有来自xenp22538的1c11[pd-1]_h3l3的可变重链和可变轻链序列的抗pd-1abd，如图93a所示。在ncil-15/rαxscfv形式中，一种优选实施方案利用具有如图93a所示的xenp22538的序列1c11[pd-1]_h3l3的抗pd-1abd，以图8b形式：例如偏斜变体s364k/e357q(在il-15rα(寿司)-fc单体上)和l368d/k370s(在scfv-fc单体上)，pi变体q295e/n384d/q418e/n421d(在scfv-fc单体上)，两种单体上的消融变体e233p/l234v/l235a/g236del/s267k，以及任选地在两侧的428l/434s变体。在ncil-15/rαxscfv形式中，一个优选实施方案利用具有xenp22538的序列1c11[pd-1]_h3l3的抗pd-1abd，如图93a所示，以图8b的形式。在ncil-15/rαxscfv形式中，一个优选的实施方案利用了抗pd-1abd，其具有1c11[pd-1]_h3l3的scfv变体的序列，如图93a-图93s所示。在ncil-15/rαxscfv格式中，一个优选实施方案利用抗pd-1abd，其具有1c11[pd-1]_h3l3的变体的可变重链序列，如图95a-图95j所示，以及1c11[pd-1]_h3l3的变体的可变轻链序列，如图96a-图96f所示。在一些实施方案中，ncil-15/rαxscfv包含人il-15rα(寿司)结构域和人成熟il-15。在某些实施方案中，ncil-15/rαxscfv包含人il-15rα(寿司)结构域和具有氨基酸取代n4d/n65d的人成熟il-15变体。在特定实施方案中，ncil-15/rαxscfv包含人il-15rα(寿司)结构域和具有氨基酸取代d30n/n65d的人成熟il-15变体。在某些实施方案中，ncil-15/rαxscfv包含人il-15rα(寿司)结构域和具有氨基酸取代d30n/e64q/n65d的人成熟il-15变体。

在ncil-15/rαxscfv形式中，一个优选的实施方案利用了抗pd-1abd，其具有如图93a-图93s所示的1c11[pd-1]_h3l3的scfv变体的序列、人il-15rα(寿司)结构域和人成熟il-15(例如人成熟il-15变体)。在某些实施方案中，ncil-15/rαxscfv包含如图93a-图93s所示的1c11[pd-1]_h3l3的scfv变体、人il-15rα(寿司)结构域和具有氨基酸取代n4d/n65d的人成熟il-15变体。在特定实施方案中，ncil-15/rαxscfv包含如图93a-图93s所示的1c11[pd-1]_h3l3的scfv变体、人il-15rα(寿司)结构域和具有氨基酸取代nd30n/n65d的人成熟il-15变体。在某些实施方案中，ncil-15/rαxscfv包含如图93a-图93s所示的1c11[pd-1]_h3l3的scfv变体、人il-15rα(寿司)结构域和具有氨基酸取代d30n/e64q/n65d的人成熟il-15变体。

在一些实施方案中，ncil-15/rαxscfv形式利用针对人pd-1的scfvabd，其具有如图93r所示的xenp25806或1c11[pd-1]_h3.234_l3.144的abd的序列、人il-15rα(寿司)结构域和人成熟il-15(例如人成熟il-15变体)。在某些实施方案中，ncil-15/rαxscfv包含对人pd-1的scfvabd，其具有如图93r所示的xenp25806或1c11[pd-1]_h3.234_l3.144的abd的序列、人il-15rα(寿司)结构域和具有氨基酸取代n4d/n65d的人成熟il-15变体。在特定实施方案中，ncil-15/rαxscfv包含对人pd-1的scfvabd，其具有如图93r所示的xenp25806或1c11[pd-1]_h3.234_l3.144的abd的序列、人il-15rα(寿司)结构域和具有氨基酸取代d30n/n65d的人成熟il-15变体。在某些实施方案中，ncil-15/rαxscfv包含对人pd-1的scfvabd，其具有如图93r所示的xenp25806或1c11[pd-1]_h3.234_l3.144的abd的序列、人il-15rα(寿司)结构域和具有氨基酸取代d30n/e64q/n65d的人成熟il-15变体。

在某些实施方案中，ncil-15/rαxscfv形式利用针对人pd-1的scfvabd，其具有如图93r所示的xenp25812或1c11[pd-1]_h3.240_l3.148的abd的序列、人il-15rα(寿司)结构域和人成熟il-15(例如人成熟il-15变体)。在某些实施方案中，ncil-15/rαxscfv包含对人pd-1的scfvabd，其具有如图93r所示的xenp25812或1c11[pd-1]_h3.240_l3.148的abd的序列、人il-15rα(寿司)结构域和具有氨基酸取代n4d/n65d的人成熟il-15变体。在特定实施方案中，ncil-15/rαxscfv包含对人pd-1的scfvabd，其具有如图93r所示的xenp25812或1c11[pd-1]_h3.240_l3.148的abd的序列、人il-15rα(寿司)结构域和具有氨基酸取代d30n/n65d的人成熟il-15变体。在某些实施方案中，ncil-15/rαxscfv包含对人pd-1的scfvabd，其具有如图93r所示的xenp25812或1c11[pd-1]_h3.240_l3.148的abd的序列、人il-15rα(寿司)结构域和具有氨基酸取代d30n/e64q/n65d的人成熟il-15变体。

在特定实施方案中，ncil-15/rαxscfv形式利用针对人pd-1的scfvabd，其具有如图93r所示的xenp25813或1c11[pd-1]_h3.241_l3.148的abd的序列、人il-15rα(寿司)结构域和人成熟il-15(例如人成熟il-15变体)。在某些实施方案中，ncil-15/rαxscfv包含对人pd-1的scfvabd，其具有如图93r所示的xenp25813或1c11[pd-1]_h3.241_l3.148的abd的序列、人il-15rα(寿司)结构域和具有氨基酸取代n4d/n65d的人成熟il-15变体。在特定实施方案中，ncil-15/rαxscfv包含对人pd-1的scfvabd，其具有如图93r所示的xenp25813或1c11[pd-1]_h3.241_l3.148的abd的序列、人il-15rα(寿司)结构域和具有氨基酸取代d30n/n65d的人成熟il-15变体。在某些实施方案中，ncil-15/rαxscfv包含对人pd-1的scfvabd，其具有如图93r所示的xenp25813或1c11[pd-1]_h3.241_l3.148的abd的序列、人il-15rα(寿司)结构域和具有氨基酸取代d30n/e64q/n65d的人成熟il-15变体。

在其他实施方案中，ncil-15/rαxscfv形式利用针对人pd-1的scfvabd，其具有如图93s所示的xenp25819或1c11[pd-1]_h3.241_l3.92的abd的序列、人il-15rα(寿司)结构域和人成熟il-15(例如人成熟il-15变体)。在某些实施方案中，ncil-15/rαxscfv包含对人pd-1的scfvabd，其具有如图93s所示的xenp25819或1c11[pd-1]_h3.241_l3.92的abd的序列、人il-15rα(寿司)结构域和具有氨基酸取代n4d/n65d的人成熟il-15变体。在特定实施方案中，ncil-15/rαxscfv包含对人pd-1的scfvabd，其具有如图93s所示的xenp25819或1c11[pd-1]_h3.241_l3.92的abd的序列、人il-15rα(寿司)结构域和具有氨基酸取代d30n/n65d的人成熟il-15变体。在某些实施方案中，ncil-15/rαxscfv包含对人pd-1的scfvabd，其具有如图93s所示的xenp25819或1c11[pd-1]_h3.241_l3.92的abd的序列、人il-15rα(寿司)结构域和具有氨基酸取代d30n/e64q/n65d的人成熟il-15变体。

c.scfvxdsil-15/rα

此实施方案示于图65c，并且包括三个单体。这通常称为“scfvxdsil-15/rα”或dsil-15/rαxscfv，其中“ds”代表“二硫键”。“scfv×dsil-15/rα”形式(图65c)与“scfv×ncil-15/rα”形式相同，但其中由于工程化的半胱氨酸，il-15rα(寿司)和il-15共价连接。“scfvxdsil-15/rα”形式包含与第一fc单体的n末端融合的scfv，与第二fc单体融合的人il-15rα(寿司)，而人成熟il-15(例如人成熟il-15变体)被分别转染，从而形成共价连接的il-15/rα复合物。

在一些实施方案中，第一单体包含由n端到c端的寿司结构域-结构域连接子-ch2-ch3，其中寿司结构域具有工程化的半胱氨酸残基，并且第二单体包含vh-scfv连接子-vl-铰链-ch2-ch3或vl-scfv连接子-vh-铰链-ch2-ch3，尽管在任一定向上，结构域连接子可以取代铰链。第三单体是il-15结构域，也被工程化成具有半胱氨酸变体氨基酸，因此允许在寿司结构域与il-15结构域之间形成二硫桥键。对于本实施方案的变体的优选组合在图8a和8b中可见。

在dsil-15/rαxscfv形式中，一种优选实施方案利用具有序列1g6_l1.194_h1.279的抗pd-1abd，如图66所述。图68提供了scfvxdsil-15/rα”形式的示例性il-15/rαx抗pd-1异源二聚体蛋白的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗pd-1abd包括序列1g6_l1.194_h1.279_scfv，如图66的链1所示。

在dsil-15/rαxscfv形式中，一个优选实施方案利用偏斜变体对s364k/e357q:l368d/k370s。在dsil-15/rαxscfv形式中，一种优选实施方案利用偏斜变体对s364k/e357q:l368d/k370s和具有序列1g6_l1.194_h1.279的抗pd-1abd，如图66所述。在dsil-15/rαxscfv形式中，一种优选实施方案利用具有如图66所示的序列1g6_l1.194_h1.279的抗pd-1abd，以图8b形式：例如偏斜变体s364k/e357q(在il-15rα(寿司)-fc单体上)和l368d/k370s(在scfv-fc单体上)，pi变体q295e/n384d/q418e/n421d(在scfv-fc单体上)，两种单体上的消融变体e233p/l234v/l235a/g236del/s267k，以及任选地在两侧的428l/434s变体。在dsil-15/rαxscfv形式中，一种优选实施方案利用具有序列1g6_l1.194_h1.279的抗pd-1abd，如图66所述，以图8b形式。

在dsil-15/rαxscfv形式中，一种优选实施方案利用具有序列1c11[pd-1]_h3l3的抗pd-1abd，如图93a所述。在dsil-15/rαxscfv形式中，一种优选实施方案利用具有如图93a所示的序列1c11[pd-1]_h3l3的抗pd-1abd，以图8b形式：例如偏斜变体s364k/e357q(在il-15rα(寿司)-fc单体上)和l368d/k370s(在scfv-fc单体上)，pi变体q295e/n384d/q418e/n421d(在scfv-fc单体上)，两种单体上的消融变体e233p/l234v/l235a/g236del/s267k，以及任选地在两侧的428l/434s变体。在dsil-15/rαxscfv形式中，一种优选实施方案利用具有序列1c11[pd-1]_h3l3的抗pd-1abd，如图93a所述，以图8b形式。

在dsil-15/rαxscfv形式中，一个优选实施方案利用具有来自xenp22538的1c11[pd-1]_h3l3的可变重链和可变轻链序列的抗pd-1abd，如图93a所示。在dsil-15/rαxscfv形式中，一种优选实施方案利用具有如图93a所示的xenp22538的序列1c11[pd-1]_h3l3的抗pd-1abd，以图8b形式：例如偏斜变体s364k/e357q(在il-15rα(寿司)-fc单体上)和l368d/k370s(在scfv-fc单体上)，pi变体q295e/n384d/q418e/n421d(在scfv-fc单体上)，两种单体上的消融变体e233p/l234v/l235a/g236del/s267k，以及任选地在两侧的428l/434s变体。在dsil-15/rαxscfv形式中，一个优选实施方案利用具有xenp22538的序列1c11[pd-1]_h3l3的抗pd-1abd，如图93a所示，以图8b的形式。在dsil-15/rαxscfv形式中，一个优选的实施方案利用了抗pd-1abd，其具有1c11[pd-1]_h3l3的scfv变体的序列，如图93a-图93s所示。在dsil-15/rαxscfv格式中，一个优选实施方案利用抗pd-1abd，其具有1c11[pd-1]_h3l3的变体的可变重链序列，如图95a-图95j所示，以及1c11[pd-1]_h3l3的变体的可变轻链序列，如图96a-图96f所示。

在一些实施方案中，dsil-15/rαxscfv形式利用针对人pd-1的scfvabd，其具有xenp25806或1c11[pd-1]_h3.234_l3.144的abd的序列，如图93r中所示，以图8b形式：例如偏斜变体s364k/e357q(在il-15rα(寿司)-fc单体上)和l368d/k370s(在scfv-fc单体上)，pi变体q295e/n384d/q418e/n421d(在scfv-fc单体上)，两种单体上的消融变体e233p/l234v/l235a/g236del/s267k，以及任选地在两侧的428l/434s变体。换句话说，来自xenp25806的六个cdr和/或vh和vl结构域可以示例性的dsil-15/rαx抗pd-1scfv形式使用。

在某些实施方案中，dsil-15/rαxscfv形式利用针对人pd-1的scfvabd，其具有xenp25812或1c11[pd-1]_h3.240_l3.148的abd的序列，如图93r所示。换句话说，来自xenp25812的六个cdr和/或vh和vl结构域可以示例性的dsil-15/rαx抗pd-1scfv形式使用。

在特定实施方案中，dsil-15/rαxscfv形式利用针对人pd-1的scfvabd，其具有xenp25813或1c11[pd-1]_h3.241_l3.148的abd的序列，如图93r中所示，以图8b形式：例如偏斜变体s364k/e357q(在il-15rα(寿司)-fc单体上)和l368d/k370s(在scfv-fc单体上)，pi变体q295e/n384d/q418e/n421d(在scfv-fc单体上)，两种单体上的消融变体e233p/l234v/l235a/g236del/s267k，以及任选地在两侧的428l/434s变体。换句话说，来自xenp25813的六个cdr和/或vh和vl结构域可以示例性的dsil-15/rαx抗pd-1scfv形式使用。

在其他实施方案中，dsil-15/rαxscfv形式利用针对人pd-1的scfvabd，其具有xenp25819或1c11[pd-1]_h3.241_l3.92的abd的序列，如图93s中所示，以图8b形式：例如偏斜变体s364k/e357q(在il-15rα(寿司)-fc单体上)和l368d/k370s(在scfv-fc单体上)，pi变体q295e/n384d/q418e/n421d(在scfv-fc单体上)，两种单体上的消融变体e233p/l234v/l235a/g236del/s267k，以及任选地在两侧的428l/434s变体。换句话说，来自xenp25819的六个cdr和/或vh和vl结构域可以示例性的dsil-15/rαx抗pd-1scfv形式使用。

在dsil-15/rαxscfv形式中，一个优选的实施方案利用了抗pd-1abd，其具有如图93a-图93s所示的1c11[pd-1]_h3l3的scfv变体的序列、人il-15rα(寿司)结构域和人成熟il-15(例如人成熟il-15变体)。在某些实施方案中，dsil-15/rαxscfv包含如图93a-图93s所示的1c11[pd-1]_h3l3的scfv变体、人il-15rα(寿司)结构域和具有氨基酸取代n4d/n65d的人成熟il-15变体。在特定实施方案中，dsil-15/rαxscfv包含如图93a-图93s所示的1c11[pd-1]_h3l3的scfv变体、人il-15rα(寿司)结构域和具有氨基酸取代d30n/n65d的人成熟il-15变体。在某些实施方案中，dsil-15/rαxscfv包含如图93a-图93s所示的1c11[pd-1]_h3l3的scfv变体、人il-15rα(寿司)结构域和具有氨基酸取代nd30n/e64q/n65d的人成熟il-15变体。

在dsil-15/rαxscfv格式中，一个优选实施方案利用抗pd-1abd，其具有如图95a-图95j所示的1c11[pd-1]_h3l3的变体的可变重链序列以及如图96a-图96f所示的1c11[pd-1]_h3l3的变体的可变轻链序列、人il-15rα(寿司)结构域和人成熟il-15(例如人成熟il-15变体)。在一些实施方案中，dsil-15/rαxscfv包括抗pd-1abd，其具有如图95a-图95j所示的1c11[pd-1]_h3l3的变体的可变重链序列以及如图96a-图96f所示的1c11[pd-1]_h3l3的变体的可变轻链序列、人il-15rα(寿司)结构域和具有氨基酸取代n4d/n65d的人成熟il-15变体。在特定实施方案中，dsil-15/rαxscfv包括抗pd-1abd，其具有如图95a-图95j所示的1c11[pd-1]_h3l3的变体的可变重链序列以及如图96a-图96f所示的1c11[pd-1]_h3l3的变体的可变轻链序列、人il-15rα(寿司)结构域和具有氨基酸取代d30n/n65d的人成熟il-15变体。在某些实施方案中，dsil-15/rαxscfv包括抗pd-1abd，其具有如图95a-图95j所示的1c11[pd-1]_h3l3的变体的可变重链序列以及如图96a-图96f所示的1c11[pd-1]_h3l3的变体的可变轻链序列、人il-15rα(寿司)结构域和具有氨基酸取代d30n/e64q/n65d的人成熟il-15变体。

在一些实施方案中，dsil-15/rαxscfv形式利用针对人pd-1的scfvabd，其具有如图93r所示的xenp25806或1c11[pd-1]_h3.234_l3.144的abd的序列、人il-15rα(寿司)结构域和人成熟il-15变体。在某些实施方案中，dsil-15/rαxscfv包含对人pd-1的scfvabd，其具有如图93r所示的xenp25806或1c11[pd-1]_h3.234_l3.144的abd的序列、人il-15rα(寿司)结构域和具有氨基酸取代n4d/n65d的人成熟il-15变体。在特定实施方案中，dsil-15/rαxscfv包含对人pd-1的scfvabd，其具有如图93r所示的xenp25806或1c11[pd-1]_h3.234_l3.144的abd的序列、人il-15rα(寿司)结构域和具有氨基酸取代d30n/n65d的人成熟il-15变体。在某些实施方案中，dsil-15/rαxscfv包含对人pd-1的scfvabd，其具有如图93r所示的xenp25806或1c11[pd-1]_h3.234_l3.144的abd的序列、人il-15rα(寿司)结构域和具有氨基酸取代d30n/e64q/n65d的人成熟il-15变体。

在某些实施方案中，dsil-15/rαxscfv形式利用针对人pd-1的scfvabd，其具有如图93r所示的xenp25812或1c11[pd-1]_h3.240_l3.148的abd的序列、人il-15rα(寿司)结构域和人成熟il-15变体。在某些实施方案中，dsil-15/rαxscfv包含对人pd-1的scfvabd，其具有如图93r所示的xenp25812或1c11[pd-1]_h3.240_l3.148的abd的序列、人il-15rα(寿司)结构域和具有氨基酸取代n4d/n65d的人成熟il-15变体。在特定实施方案中，dsil-15/rαxscfv包含对人pd-1的scfvabd，其具有如图93r所示的xenp25812或1c11[pd-1]_h3.240_l3.148的abd的序列、人il-15rα(寿司)结构域和具有氨基酸取代d30n/n65d的人成熟il-15变体。在某些实施方案中，dsil-15/rαxscfv包含对人pd-1的scfvabd，其具有如图93r所示的xenp25812或1c11[pd-1]_h3.240_l3.148的abd的序列、人il-15rα(寿司)结构域和具有氨基酸取代d30n/e64q/n65d的人成熟il-15变体。

在特定实施方案中，dsil-15/rαxscfv形式利用针对人pd-1的scfvabd，其具有如图93r所示的xenp25813或1c11[pd-1]_h3.241_l3.148的abd的序列、人il-15rα(寿司)结构域和人成熟il-15变体。在某些实施方案中，dsil-15/rαxscfv包含对人pd-1的scfvabd，其具有如图93r所示的xenp25813或1c11[pd-1]_h3.241_l3.148的abd的序列、人il-15rα(寿司)结构域和具有氨基酸取代n4d/n65d的人成熟il-15变体。在特定实施方案中，dsil-15/rαxscfv包含对人pd-1的scfvabd，其具有如图93r所示的xenp25813或1c11[pd-1]_h3.241_l3.148的abd的序列、人il-15rα(寿司)结构域和具有氨基酸取代d30n/n65d的人成熟il-15变体。在某些实施方案中，dsil-15/rαxscfv包含对人pd-1的scfvabd，其具有如图93r所示的xenp25813或1c11[pd-1]_h3.241_l3.148的abd的序列、人il-15rα(寿司)结构域和具有氨基酸取代d30n/e64q/n65d的人成熟il-15变体。

在其他实施方案中，dsil-15/rαxscfv形式利用针对人pd-1的scfvabd，其具有如图93s所示的xenp25819或1c11[pd-1]_h3.241_l3.92的abd的序列、人il-15rα(寿司)结构域和人成熟il-15变体。在某些实施方案中，dsil-15/rαxscfv包含对人pd-1的scfvabd，其具有如图93s所示的xenp25819或1c11[pd-1]_h3.241_l3.92的abd的序列、人il-15rα(寿司)结构域和具有氨基酸取代n4d/n65d的人成熟il-15变体。在特定实施方案中，dsil-15/rαxscfv包含对人pd-1的scfvabd，其具有如图93s所示的xenp25819或1c11[pd-1]_h3.241_l3.92的abd的序列、人il-15rα(寿司)结构域和具有氨基酸取代d30n/n65d的人成熟il-15变体。在某些实施方案中，dsil-15/rαxscfv包含对人pd-1的scfvabd，其具有如图93s所示的xenp25819或1c11[pd-1]_h3.241_l3.92的abd的序列、人il-15rα(寿司)结构域和具有氨基酸取代d30n/e64q/n65d的人成熟il-15变体。

在一些实施方案中，本文概述的任何dsil-15/rαxscfv融合蛋白的抗pd-1scfv包含如图94n所示的xenp26940或1c11_h3.303_l3.152的vh和vl序列，如图94ae所示的xenp28026或1c11_h3.329_l3.220的vh和vl序列，或如图94ag所示的xenp28652或1c11_h3.328_l3.152的vh和vl序列。

d.scil-15/rαxfab

此实施方案示于图65d，并且包括三个单体。这通常称为“scil-15/rαxfab”或“fabxscil-15/rα”，如可交换使用的，其中“sc”代表“单链”。“scil-15/rαxfab”形式(图65d)包含通过可变长度的连接子与il-15融合的il-15rα(寿司)(称为“scil-15/rα”)，其随后与第一fc单体的n端融合，可变重链(vh)与第二fc单体的另一侧融合，同时单独转染相应轻链以形成具有vh的fab。

如图94a-94ap、图95a-95j、图96a-96f、图126a-126d、图127a-127d和图128a-128l提及且对含有cdr每一序列而言确实如此，取决于所使用的编号方法(如表1中所示)，cdr位置的精确标识可能略微不同，且因此本文中不仅包括加粗的cdr且还包括使用其它编号系统的vh和vl结构域内所包括的cdr。另外，每个cdr具有其自身的seqidno:或序列标识符，且每个vh和vl结构域在序列表中具有其自身的seqidno:或序列标识符。

在一些实施方案中，第一单体由n端到c端包含人il-15rα寿司结构域-结构域连接子-人成熟il-15-任选的结构域连接子-ch2-ch3，并且第二单体包含重链vh-ch1-铰链-ch2-ch3。第三单体是轻链vl-cl。对于本实施方案的变体的优选组合在图8c中可见。

在一些实施方案中，在图69a-69c中提供了scil-15/rαxfab形式的示例性的靶向pd-1的xil-15/rα-fc融合蛋白，其包含xenp22022、xenp25849、xenp24535、xenp24536、xenp25850和xenp25937的氨基酸序列。

在一些实施方案中，scil-15/rαxfab包含偏斜变体s364k/e357q(在第二单体或重链-fc单体上)和l368d/k370s(在第一单体或il-15复合物-fc单体上)、pi变体q295e/n384d/q418e/n421d(在il-15复合物一侧)、两个单体的消融变体e233p/l234v/l235a/g236del/s267k以及任选地两侧的428l/434s变体。在scil-15/rαxfab形式中，一个优选实施方案利用偏斜变体对s364k/e357q:l368d/k370s。

在scil-15/rαxfab形式中，一种优选实施方案利用具有序列1g6_h1.279_l1.194的抗pd-1abd，如图14所述。在一些实施方案中，抗pd-1abd具有1g6_h1.279_l1.194的cdr和/或vh和vl结构域。在scil-15/rαxfab形式中，一种优选实施方案利用具有如图14所示的序列1g6_h1.279_l1.194的抗pd-1abd，以图8c形式：例如偏斜变体l368d/k370s(在il-15复合物fc单体上)和s364k/e357q(在重链fc单体上)，pi变体q295e/n384d/q418e/n421d(在il-15复合物侧)，两种单体上的消融变体e233p/l234v/l235a/g236del/s267k，以及任选地在两侧的428l/434s变体。在scil-15/rαxfab形式中，一种优选实施方案利用具有序列1g6_h1.279_l1.194的抗pd-1abd，如图14所述，以图8c形式。在scil-15/rαxfab形式中，一种优选实施方案利用具有序列1g6_h1.279_l1.194的抗pd-1abd，如图14所述，以及偏斜变体对s364k/e357q:l368d/k370s。

在一些实施方案中，抗pd-1fab利用如xenp22022的链2中所示的序列1g6_h1.278[pd-1]和如图69a的xenp22022的链3中所示的1g6_l1.188[pd-1]。在某些实施方案中，抗pd-1fab利用xenp25849的链1所示的序列1c11[pd-1]_h3和图69a的xenp25849的链3所示的1c11[pd-1]_l3。在其他实施方案中，抗pd-1fab利用xenp24535的链1所示的序列1c11[pd-1]_h3和图69b的xenp24535的链3所示的1c11[pd-1]_l3。在一些实施方案中，抗pd-1fab利用xenp24536的链1中所示的序列1c11[pd-1]_h3和图69b的xenp24536的链3中所示的1c11[pd-1]_l3。在一些实施方案中，抗pd-1fab利用xenp25850的链1所示的序列1c11[pd-1]_h3l3和如图69c的xenp25850的链3所示的1c11[pd-1]_l3。在某些实施方案中，抗pd-1fab利用xenp259357的链1所示的序列1c11[pd-1]_h3和如图69c的xenp25937的链3所示的1c11[pd-1]_l3。在一些实施方案中，抗pd-1fab利用xenp22553或1c11_h3l3的序列，如图94a所示。在某些情况下，抗pd-1fab利用来自xenp22553或1c11_h3l3的cdr和/或vh和vl结构域。在scil-15/rαxfab形式中，一种优选实施方案利用具有序列1c11[pd-1]_h3l3的抗pd-1abd，如图94所述。在scil-15/rαxfab形式中，一种优选实施方案利用具有如图94所示的序列1c11[pd-1]_h3l3的抗pd-1abd，以图8c形式：例如偏斜变体l368d/k370s(在il-15复合物fc单体上)和s364k/e357q(在重链fc单体上)，pi变体q295e/n384d/q418e/n421d(在il-15复合物侧)，两种单体上的消融变体e233p/l234v/l235a/g236del/s267k，以及任选地在两侧的428l/434s变体。

在一些实施方案中，抗pd-1fab利用xenp26940或1c11_h3.303_l3.152的序列，如图94n所示。在一些情况下，抗pd-1fab利用来自xenp26940或1c11_h3.303_l3.152的cdr和/或vh和vl结构域。在scil-15/rαxfab形式中，一种优选实施方案利用具有xenp26940或1c11_h3.303_l3.152的序列的抗pd-1abd。在scil-15/rαxfab形式中，一种优选实施方案利用具有如图94n所示的序列xenp26940或1c11_h3.303_l3.152的抗pd-1abd，以图8c形式：例如偏斜变体l368d/k370s(在il-15复合物fc单体上)和s364k/e357q(在重链fc单体上)，pi变体q295e/n384d/q418e/n421d(在il-15复合物侧)，两种单体上的消融变体e233p/l234v/l235a/g236del/s267k，以及任选地在两侧的428l/434s变体。在scil-15/rαxfab形式中，一种优选实施方案利用具有xenp26940或1c11_h3.303_l3.152的序列的抗pd-1abd，如图94n所示，以图8c形式。在scil-15/rαxfab形式中，一种优选实施方案利用具有序列xenp26940或1c11_h3.303_l3.152的抗pd-1abd，如图94n所述，以及偏斜变体对s364k/e357q:l368d/k370s。

在一些实施方案中，抗pd-1fab利用xenp28026或1c11_h3.329_l3.220的序列，如图94ae所示。在某些情况下，抗pd-1fab利用来自xenp28026或1c11_h3.329_l3.220的cdr和/或vh和vl域。在scil-15/rαxfab形式中，一种优选实施方案利用具有1c11_h3.329_l3.220的序列的抗pd-1abd。在scil-15/rαxfab形式中，一种优选实施方案利用具有如图94ae所示的序列xenp28026或1c11_h3.329_l3.220的抗pd-1abd，以图8c形式：例如偏斜变体l368d/k370s(在il-15复合物fc单体上)和s364k/e357q(在重链fc单体上)，pi变体q295e/n384d/q418e/n421d(在il-15复合物侧)，两种单体上的消融变体e233p/l234v/l235a/g236del/s267k，以及任选地在两侧的428l/434s变体。在scil-15/rαxfab形式中，一种优选实施方案利用具有xenp28026或1c11_h3.329_l3.220的序列的抗pd-1abd，如图94ae所示，以图8c形式。在scil-15/rαxfab形式中，一种优选实施方案利用具有序列xenp28026或1c11_h3.329_l3.220的抗pd-1abd，如图94ae所述，以及偏斜变体对s364k/e357q:l368d/k370s。

在一些实施方案中，抗pd-1fab利用xenp28652或1c11_h3.328_l3.152的序列，如图94ag所示。在某些情况下，抗pd-1fab利用来自xenp28652或1c11_h3.328_l3.152的cdr和/或vh和vl域。在scil-15/rαxfab形式中，一种优选实施方案利用具有xenp28652或1c11_h3.328_l3.152的序列的抗pd-1abd。在scil-15/rαxfab形式中，一种优选实施方案利用具有如图94ag所示的序列xenp28652或1c11_h3.328_l3.152的抗pd-1abd，以图8c形式：例如偏斜变体l368d/k370s(在il-15复合物fc单体上)和s364k/e357q(在重链fc单体上)，pi变体q295e/n384d/q418e/n421d(在il-15复合物侧)，两种单体上的消融变体e233p/l234v/l235a/g236del/s267k，以及任选地在两侧的428l/434s变体。在scil-15/rαxfab形式中，一种优选实施方案利用具有xenp28652或1c11_h3.328_l3.152的序列的抗pd-1abd，如图94ag所示，以图8c形式。在scil-15/rαxfab形式中，一种优选实施方案利用具有序列xenp28652或1c11_h3.328_l3.152的抗pd-1abd，如图94ag所述，以及偏斜变体对s364k/e357q:l368d/k370s。

在一个实施方案中，抗pd-1fab利用xenp或相应的seqidno标识符中任一项的序列，如图94a-94ap所示。在一些情况下，抗pd-1fab具有选自以下的序列：xenp22553、xenp25338、xenp25339、xenp26321、xenp26322、xenp26323、xenp26324、xenp26325、xenp26326、xenp26327、xenp26328、xenp26329、xenp26330、xenp26331、xenp26332、xenp26333、xenp26334、xenp26335、xenp26336、xenp26337、xenp26338、xenp26339、xenp26340、xenp26341、xenp26342、xenp26343、xenp26344、xenp26917、xenp26918、xenp26919、xenp26920、xenp26921、xenp26922、xenp26923、xenp26924、xenp26925、xenp26926、xenp26927、xenp26928、xenp26929、xenp26930、xenp26931、xenp26932、xenp26933、xenp26934、xenp26935、xenp26936、xenp26937、xenp26938、xenp26939、xenp26940、xenp26941、xenp26942、xenp26943、xenp26944、xenp26945、xenp26946、xenp26947、xenp26949、xenp26950、xenp26951、xenp26952、xenp26953、xenp26954、xenp26955、xenp27643、xenp27644、xenp27645、xenp27646、xenp27647、xenp47648、xenp27649、xenp27650、xenp27651、xenp27652、xenp27839、xenp27840、xenp27841、xenp27842、xenp27843、xenp27844、xenp27845、xenp27846、xenp27847、xenp27848、xenp27849、xenp27850、xenp27851、xenp27852、xenp27853、xenp27854、xenp27855、xenp27856、xenp27857、xenp27858、xenp27859、xenp27860、xenp27861、xenp27862、xenp27863、xenp27864、xenp27865、xenp27866、xenp27867、xenp27868、xenp27869、xenp27870、xenp27871、xenp27872、xenp27959、xenp27960、xenp27961、xenp27962、xenp27963、xenp28024、xenp28025、xenp28026、xenp28027、xenp28028、xenp28029、xenp28030、xenp28031、xenp28032、xenp28033、xenp28034、xenp28035、xenp28651、xenp28652、xenp28653、xenp28654、xenp28655、xenp28656、xenp28657、xenp28658、xenp28659、xenp29029、xenp29030、xenp29031、xenp29032、xenp29033、xenp29034、xenp29035、xenp29036、xenp29037、xenp29038、xenp29039、xenp29040、xenp29041、xenp29042、xenp29043、xenp29044、xenp29045、xenp29046、xenp29047、xenp29048、xenp29049、xenp29050、xenp29051、xenp29052、xenp29053、xenp29054、xenp29055和xenp29056，包括相应的seqidno标识符。

在另一个实施方案中，抗pd-1fab利用如图95a-95j所示的xend或相应的seqidno标识符中任一个的可变重链序列和如图96a-96f所示的xend或相应的seqidno标识符的任一个中的可变轻链序列。在某些情况下，可变重链的序列选自xend17478、xend18576、xend22097、xend22098、xend22099、xend22100、xend22101、xend22102、xend22103、xend22104、xend22105、xend22106、xend22107、xend22108、xend22109、xend22110、xend22111、xend22112、xend22113、xend22114、xend22115、xend22116、xend22117、xend22118、xend22119、xend22120、xend22121、xend22122、xend22123、xend22124、xend22125、xend22126、xend22127、xend22128、xend22129、xend22130、xend22131、xend22132、xend22133、xend22134、xend22135、xend22136、xend22137、xend22138、xend22139、xend22140、xend22141、xend22142、xend22143、xend22144、xend22145、xend22146、xend22147、xend22148、xend22149、xend22150、xend22150、xend22152、xend22153、xend22154、xend22155、xend22156、xend22157、xend22158、xend22159、xend22160、xend22161和xend22162，包括相应的seqidno标识符。在某些情况下，可变轻链的序列选自图96的xend17482、xend18472、xend22163、xend22164、xend22165、xend22166、xend22167、xend22168、xend22169、xend22170、xend22157、xend22158、xend22159、xend22161、xend22162、xend22171、xend22172、xend22173、xend22174、xend22175、xend22176、xend22177、xend22178、xend22179、xend22180、xend22181、xend22182、xend22183、xend22184、xend22185、xend22186、xend22184、xend22185、xend22186、xend22187、xend22188、xend22189、xend22190、xend22191、xend22192、xend22193、xend22194、xend22195、xend22196、xend22197、xend22198、xend22199、xend22200、xend22201、xend22202、xend22203、xend22204、xend22205、xend22206、xend22207、xend22208、xend22209、xend22210、xend22211、xend22212、xend22213、xend22214、xend22215、xend22216、xend22217、xend22218、xend22219、xend22220、xend22221、xend22222和xend22223，包括相应的seqidno标识符。

在scil-15/rαxfab形式，一种优选的实施方案利用具有如图14所示的1g6_h1.279_l1.194的序列(1g6_l1.194_h1.279)的抗pd-1abd和如图69a描绘的xenp22022的链1的il-15复合物(寿司结构域-连接子-il-15)。在一些实施方案中，scil-15/rαxfab包括具有如图14所示的1g6_h1.279_l1.194的序列(1g6_l1.194_h1.279)的抗pd-1abd和如图69c描绘的xenp25850的链2的il-15复合物(寿司结构域-连接子-il-15变体n4d/n65d)。在一些实施方案中，scil-15/rαxfab包括具有如图14所示的1g6_h1.279_l1.194的序列(1g6_l1.194_h1.279)的抗pd-1abd和如图126a描绘的xenp29482的链1的il-15复合物(寿司结构域-连接子-il-15变体d30n/n65d)。在一些实施方案中，scil-15/rαxfab包括具有如图14所示的1g6_h1.279_l1.194的序列(1g6_l1.194_h1.279)的抗pd-1abd和如图124c描绘的构建体的链1的il-15复合物(寿司结构域-连接子-il-15变体d30n/e64q/n65d)。

在scil-15/rαxfab形式，一种优选的实施方案利用具有如图94a所示的1c11_h3l3的序列的抗pd-1abd和如图69a描绘的xenp22022的链1的il-15复合物(寿司结构域-连接子-il-15)。在一些实施方案中，scil-15/rαxfab包括具有如图94a所示的1c11_h3l3的序列的抗pd-1abd和如图69c描绘的xenp25850的链2的il-15复合物(寿司结构域-连接子-il-15变体n4d/n65d)。在一些实施方案中，scil-15/rαxfab包括具有如图94a所示的1c11_h3l3的序列的抗pd-1abd和如图126a描绘的xenp29482的链1的il-15复合物(寿司结构域-连接子-il-15变体d30n/n65d)。在一些实施方案中，scil-15/rαxfab包括具有如图94a所示的1c11_h3l3的序列的抗pd-1abd和如图124c描绘的xenp29286的链1的il-15复合物(寿司结构域-连接子-il-15变体d30n/e64q/n65d)。

在scil-15/rαxfab形式中，一个优选的实施方案利用抗pd-1abd，其具有xenp26940或1c11_h3.303_l3.152的序列，如图94n所示，和xenp22022的链1的il-15复合物(寿司结构域-连接子-il-15)，如图69a所示。在一些实施方案中，scil-15/rαxfab包含抗pd-1abd，其具有xenp26940或1c11_h3.303_l3.152的序列，如图94n所示，和xenp25850的链2的il-15复合物(寿司结构域-连接子-il-15变体n4d/n65d)，如图69c所示。在一些实施方案中，scil-15/rαxfab包含抗pd-1abd，其具有xenp26940或1c11_h3.303_l3.152的序列，如图94n所示，和xenp29482的链1的il-15复合物(寿司结构域-连接子-il-15变体d30n/n65d)，如图126a所示。在一些实施方案中，scil-15/rαxfab包含抗pd-1abd，其具有xenp26940或1c11_h3.303_l3.152的序列，如图94n所示，和xenp29286的链1的il-15复合物(寿司结构域-连接子-il-15变体d30n/e64q/n65d)，如图124c所示。

在scil-15/rαxfab形式中，一个优选的实施方案利用抗pd-1abd，其具有xenp28026或1c11_h3.329_l3.220的序列，如图94ae所示，和xenp22022的链1的il-15复合物(寿司结构域-连接子-il-15)，如图69a所示。在一些实施方案中，scil-15/rαxfab包含抗pd-1abd，其具有xenp28026或1c11_h3.329_l3.220的序列，如图94ae所示，和xenp25850的链2的il-15复合物(寿司结构域-连接子-il-15变体n4d/n65d)，如图69c所示。在一些实施方案中，scil-15/rαxfab包含抗pd-1abd，其具有xenp28026或1c11_h3.329_l3.220的序列，如图94ae所示，和xenp29482的链1的il-15复合物(寿司结构域-连接子-il-15变体d30n/n65d)，如图126a所示。在一些实施方案中，scil-15/rαxfab包含抗pd-1abd，其具有xenp28026或1c11_h3.329_l3.220的序列，如图94ae所示，和xenp29286的链1的il-15复合物(寿司结构域-连接子-il-15变体d30n/e64q/n65d)，如图124c所示。

在scil-15/rαxfab形式中，一个优选的实施方案利用抗pd-1abd，其具有xenp28652或1c11_h3.328_l3.152的序列，如图94ag所示，和xenp22022的链1的il-15复合物(寿司结构域-连接子-il-15)，如图69a所示。在一些实施方案中，scil-15/rαxfab包含抗pd-1abd，其具有xenp28652或1c11_h3.328_l3.152的序列，如图94ag所示，和xenp25850的链2的il-15复合物(寿司结构域-连接子-il-15变体n4d/n65d)，如图69c所示。在一些实施方案中，scil-15/rαxfab包含抗pd-1abd，其具有xenp28652或1c11_h3.328_l3.152的序列，如图94ag所示，和xenp29482的链1的il-15复合物(寿司结构域-连接子-il-15变体d30n/n65d)，如图126a所示。在一些实施方案中，scil-15/rαxfab包含抗pd-1abd，其具有xenp28652或1c11_h3.328_l3.152的序列，如图94ag所示，和xenp29286的链1的il-15复合物(寿司结构域-连接子-il-15变体d30n/e64q/n65d)，如图124c所示。

在一些实施方案中，scil-15/rαxfab形式的抗pd-1fab具有如图93r所示的xenp25806或1c11[pd-1]_h3.234_l3.144的重链和轻链序列、如图93r所示的xenp25812或1c11[pd-1]_h3.240_l3.148的abd的重链和轻链序列、如图93r所示的xenp25813或1c11[pd-1]_h3.241_l3.148的重链和轻链序列、或如图93s所示的xenp25819或1c11[pd-1]_h3.241_l3.92的重链和轻链序列。

e.ncil-15/rαxfab

此实施方案示于图65e，并且包括三个单体。这通常被称为“ncil-15/rαxfab”或“fabxncil-15/rα”，如可以互换使用的，其中“nc”代表“非共价”，是指il-15和il-15rα寿司结构域的自组装非共价连接。ncil-15/rα×fab形式(见图65e)包含与异源二聚体fc区的n端融合的vh，il-15rα(寿司)与异源二聚体fc的另一侧融合，同时单独转染相应轻链以形成具有vh的fab，并且同时单独转染il-15以使得形成非共价il-15/rα复合物。图70提供了fabxncil-15/rα形式的示例性靶向pd-1的xil-15/rα-fc融合蛋白例如xenp22112的氨基酸序列。

在一些实施方案中，第一单体由n端到c端包含il-15rα寿司结构域-任选的结构域连接子-ch2-ch3，并且第二单体包含重链vh-ch1-铰链-ch2-ch3。第三单体是il-15结构域。对于本实施方案的fc变体的优选组合在图8d中可见。

在ncil-15/rαxfab形式中，一个优选实施方案利用偏斜变体对s364k/e357q:l368d/k370s。在ncil-15/rαxfab形式中，一种优选实施方案利用具有序列1g6_l1.194_h1.279的抗pd-1abd，如图14所述。在ncil-15/rαxfab形式中，一种优选实施方案利用具有如图14所示的序列1g6_l1.194_h1.279(1g6_h1.279_l1.194)的抗pd-1abd，以图8d形式：例如偏斜变体l368d/k370s(在重链fc单体上)和s364k/e357q(在寿司结构域fc单体上)，pi变体q295e/n384d/q418e/n421d(在重链fc单体上)，两种单体上的消融变体e233p/l234v/l235a/g236del/s267k，以及任选地在两侧的428l/434s变体。

在ncil-15/rαxfab形式中，一种优选实施方案利用具有序列1c11[pd-1]_h3l3的抗pd-1abd，如图20c所述，以及偏斜变体对s364k/e357q:l368d/k370s。在ncil-15/rαxfab形式中，一种优选实施方案利用具有如图20c所示的序列1c11[pd-1]_h3l3的抗pd-1abd，以图8d形式：例如偏斜变体l368d/k370s(在重链fc单体上)和s364k/e357q(在寿司结构域fc单体上)，pi变体q295e/n384d/q418e/n421d(在重链fc单体上)，两种单体上的消融变体e233p/l234v/l235a/g236del/s267k，以及任选地在两侧的428l/434s变体。

在一些实施方案中，本发明的ncil-15/rαxfab包含抗pd-1abd，其具有如图94n所示的xenp26940或1c11_h3.303_l3.152的序列、人il-15rα(寿司)结构域和人成熟il-15(包括人成熟il-15变体)。在一些实施方案中，本发明的ncil-15/rαxfab包含抗pd-1abd，其具有如图94n所示的xenp26940或1c11_h3.303_l3.152的序列、人il-15rα(寿司)结构域和具有氨基酸取代n4d/n65d的人成熟il-15变体。在一些实施方案中，ncil-15/rαxfab包含抗pd-1abd，其具有如图94n所示的xenp26940或1c11_h3.303_l3.152的序列、人il-15rα(寿司)结构域和具有氨基酸取代d30n/n65d的人成熟il-15变体。在一些实施方案中，ncil-15/rαxfab包含抗pd-1abd，其具有如图94n所示的xenp26940或1c11_h3.303_l3.152的序列、人il-15rα(寿司)结构域和具有氨基酸取代d30n/e64q/n65d的人成熟il-15变体。

在一些实施方案中，本发明的ncil-15/rαxfab包含抗pd-1abd，其具有如图94ae所示的xenp28026或1c11_h3.329_l3.220的序列、人il-15rα(寿司)结构域和人成熟il-15(包括人成熟il-15变体)。在一些实施方案中，本发明的ncil-15/rαxfab包含抗pd-1abd，其具有如图94ae所示的xenp28026或1c11_h3.329_l3.220的序列、人il-15rα(寿司)结构域和具有氨基酸取代n4d/n65d的人成熟il-15变体。在一些实施方案中，ncil-15/rαxfab包含抗pd-1abd，其具有如图94ae所示的xenp28026或1c11_h3.329_l3.220的序列、人il-15rα(寿司)结构域和具有氨基酸取代d30n/n65d的人成熟il-15变体。在一些实施方案中，ncil-15/rαxfab包含抗pd-1abd，其具有如图94ae所示的xenp28026或1c11_h3.329_l3.220的序列、人il-15rα(寿司)结构域和具有氨基酸取代d30n/e64q/n65d的人成熟il-15变体。

在一些实施方案中，本发明的ncil-15/rαxfab包含抗pd-1abd，其具有如图94ag所示的xenp28652或1c11_h3.328_l3.152的序列、人il-15rα(寿司)结构域和人成熟il-15(包括人成熟il-15变体)。在一些实施方案中，本发明的ncil-15/rαxfab包含抗pd-1abd，其具有如图94ag所示的xenp28652或1c11_h3.328_l3.152的序列、人il-15rα(寿司)结构域和具有氨基酸取代n4d/n65d的人成熟il-15变体。在一些实施方案中，ncil-15/rαxfab包含抗pd-1abd，其具有如图94ag所示的xenp28652或1c11_h3.328_l3.152的序列、人il-15rα(寿司)结构域和具有氨基酸取代d30n/n65d的人成熟il-15变体。在一些实施方案中，ncil-15/rαxfab包含抗pd-1abd，其具有如图94ag所示的xenp28652或1c11_h3.328_l3.152的序列、人il-15rα(寿司)结构域和具有氨基酸取代d30n/e64q/n65d的人成熟il-15变体。

在一些实施方案中，ncil-15/rαxfab形式的抗pd-1fab具有如图93r所示的xenp25806或1c11[pd-1]_h3.234_l3.144的重链和轻链序列、如图93r所示的xenp25812或1c11[pd-1]_h3.240_l3.148的abd的重链和轻链序列、如图93r所示的xenp25813或1c11[pd-1]_h3.241_l3.148的重链和轻链序列、或如图93s所示的xenp25819或1c11[pd-1]_h3.241_l3.92的重链和轻链序列。

f.dsil-15/rαxfab

此实施方案示于图65f并包括三个单体。这通常被称为“dsil-15/rαxfab”或“fabxdsil-15/rα”，其可互换使用，其中“ds”代表“二硫键”，是指il-15和寿司结构域的自组装非共价连接。dsil-15/rαxfab形式(见图65f)与“ncil-15/rαxfab”形式相同，但其中由于工程化的半胱氨酸，il-15rα(寿司)和il-15共价连接。fabxdsil-15/rα形式的示例性靶向pd-1的xil-15/rα-fc融合蛋白例如xenp22641的氨基酸序列提供在图71中。

在一些实施方案中，第一单体包含由n端到c端的寿司结构域-结构域连接子-ch2-ch3，其中寿司结构域被工程化成含有半胱氨酸残基，并且第二单体包含重链vh-ch1-铰链-ch2-ch3。第三单体是il-15结构域，也被工程化成具有半胱氨酸残基，使得在天然细胞条件下形成二硫桥键。对于本实施方案的变体的优选组合在wo2018/071918的图7中可见。

在dsil-15/rαxfab形式中，一个优选实施方案利用偏斜变体对s364k/e357q:l368d/k370s。在dsil-15/rαxfab形式中，一种优选实施方案利用具有序列1g6_l1.194_h1.279的抗pd-1abd，如图14所述。在dsil-15/rαxfab形式中，一种优选实施方案利用具有如图14所示的序列1g6_l1.194_h1.279(1g6_h1.279_l1.194)的抗pd-1abd，以图8d形式：例如偏斜变体l368d/k370s(在重链fc单体上)和s364k/e357q(在il-15复合物fc单体上)，pi变体q295e/n384d/q418e/n421d(在重链fc单体上)，两种单体上的消融变体e233p/l234v/l235a/g236del/s267k，以及任选地在两侧的428l/434s变体。

在dsil-15/rαxfab形式中，一种优选实施方案利用具有序列1c11[pd-1]_h3l3的抗pd-1abd，如图20c所述，以及偏斜变体对s364k/e357q:l368d/k370s。在dsil-15/rαxfab形式中，一种优选实施方案利用具有序列1c11[pd-1]_h3l3的抗pd-1abd，如图20c所述，以图8d形式。

在一些实施方案中，本发明的dsil-15/rαxfab包含具有图94n所示的xenp26940或1c11_h3.303_l3.152的序列的抗pd-1abd。在一些实施方案中，本发明的dsil-15/rαxfab包含具有图94ae所示的xenp28026或1c11_h3.329_l3.220的序列的抗pd-1abd。在一些实施方案中，本发明的dsil-15/rαxfab包含具有图94ag所示的xenp28652或1c11_h3.328_l3.152的序列的抗pd-1abd。

在一些实施方案中，本发明的dsil-15/rαxfab包含抗pd-1abd，其具有如图94n所示的xenp26940或1c11_h3.303_l3.152的序列、人il-15rα(寿司)结构域和人成熟il-15(包括人成熟il-15变体)。在一些实施方案中，本发明的dsil-15/rαxfab包含抗pd-1abd，其具有如图94n所示的xenp26940或f1c11_h3.303_l3.152的序列、人il-15rα(寿司)结构域和具有氨基酸取代n4d/n65d的人成熟il-15变体。在一些实施方案中，dsil-15/rαxfab包含抗pd-1abd，其具有如图94n所示的xenp26940或1c11_h3.303_l3.152的序列、人il-15rα(寿司)结构域和具有氨基酸取代d30n/n65d的人成熟il-15变体。在一些实施方案中，dsil-15/rαxfab包含抗pd-1abd，其具有如图94n所示的xenp26940或1c11_h3.303_l3.152的序列、人il-15rα(寿司)结构域和具有氨基酸取代d30n/e64q/n65d的人成熟il-15变体。

在一些实施方案中，本发明的dsil-15/rαxfab包含抗pd-1abd，其具有如图94ae所示的xenp28026或1c11_h3.329_l3.220的序列、人il-15rα(寿司)结构域和人成熟il-15(包括人成熟il-15变体)。在一些实施方案中，本发明的dsil-15/rαxfab包含抗pd-1abd，其具有如图94ae所示的xenp28026或1c11_h3.329_l3.220的序列、人il-15rα(寿司)结构域和具有氨基酸取代n4d/n65d的人成熟il-15变体。在一些实施方案中，dsil-15/rαxfab包含抗pd-1abd，其具有如图94ae所示的xenp28026或1c11_h3.329_l3.220的序列、人il-15rα(寿司)结构域和具有氨基酸取代d30n/n65d的人成熟il-15变体。在一些实施方案中，dsil-15/rαxfab包含抗pd-1abd，其具有如图94ae所示的xenp28026或1c11_h3.329_l3.220的序列、人il-15rα(寿司)结构域和具有氨基酸取代d30n/e64q/n65d的人成熟il-15变体。

在一些实施方案中，本发明的dsil-15/rαxfab包含抗pd-1abd，其具有如图94ag所示的xenp28652或1c11_h3.328_l3.152的序列、人il-15rα(寿司)结构域和人成熟il-15(包括人成熟il-15变体)。在一些实施方案中，本发明的dsil-15/rαxfab包含抗pd-1abd，其具有如图94ag所示的xenp28652或1c11_h3.328_l3.152的序列、人il-15rα(寿司)结构域和具有氨基酸取代n4d/n65d的人成熟il-15变体。在一些实施方案中，dsil-15/rαxfab包含抗pd-1abd，其具有如图94ag所示的xenp28652或1c11_h3.328_l3.152的序列、人il-15rα(寿司)结构域和具有氨基酸取代d30n/n65d的人成熟il-15变体。在一些实施方案中，dsil-15/rαxfab包含抗pd-1abd，其具有如图94ag所示的xenp28652或1c11_h3.328_l3.152的序列、人il-15rα(寿司)结构域和具有氨基酸取代d30n/e64q/n65d的人成熟il-15变体。

在一些实施方案中，dsil-15/rαxfab形式的抗pd-1fab具有如图93r所示的xenp25806或1c11[pd-1]_h3.234_l3.144的重链和轻链序列、如图93r所示的xenp25812或1c11[pd-1]_h3.240_l3.148的abd的重链和轻链序列、如图93r所示的xenp25813或1c11[pd-1]_h3.241_l3.148的重链和轻链序列、或如图93s所示的xenp25819或1c11[pd-1]_h3.241_l3.92的重链和轻链序列。

g.mab-scil-15/rα

此实施方案示于图65g，并且包括三个单体(尽管融合蛋白是四聚体)。这通常被称为“mab-scil-15/rα”，其中“sc”代表“单链”。mab-scil-15/rα形式(见图65g)包含与第一和第二异源二聚体fc的n端融合的vh，il-15与随后与异源二聚体fc区中的一个的c端进一步融合的il-15rα(寿司)融合，同时单独转染相应轻链以形成具有vh的fab。图72a-72b提供了mabxscil-15/rα形式的示例性靶向pd-1的xil-15/rα-fc融合蛋白的氨基酸序列。

在一些实施方案中，第一单体包含重链vh-ch1-铰链-ch2-ch3。第二单体包含具有scil-15复合物的重链，vh-ch1-铰链-ch2-ch3-结构域连接子-il-15rα寿司结构域-结构域连接子-il-15。第三(和第四)单体是轻链vl-cl。这通常被称为“mab-scil-15/rα”，其中“sc”代表“单链”。

在mab-scil-15/rα形式中，一个优选实施方案利用具有如图14所示的序列1g6_l1.194_h1.279的抗pd-1abd。在mab-scil-15/rα形式中，一个优选实施方案利用偏斜变体对s364k/e357q:l368d/k370s。在mab-scil-15/rα形式中，一个优选实施方案利用具有如图14所示的序列1g6_l1.194_h1.279的抗pd-1abd，以图8a-8f的有用形式。

在mab-scil-15/rα形式中，一种优选实施方案利用具有序列1c11[pd-1]_h3l3的抗pd-1abd，如图20c所示。

在mab-scil-15/rα形式中，一种优选实施方案利用具有序列1c11[pd-1]_h3l3的抗pd-1abd，如图20c所述，以及偏斜变体对s364k/e357q:l368d/k370s。在mab-scil-15/rα形式中，一个优选实施方案利用具有如图20c所示的序列1c11[pd-1]_h3l3的抗pd-1abd，以图8a-8f的有用形式。

在一些实施方案中，mab-scil-15/rα包含本文所述的任何抗pd-1abd。在一些实施方案中，mab-scil-15/rα包括抗pd-1abd，其包含：具有如图93r所示的xenp25806或1c11[pd-1]_h3.234_l3.144的重链和轻链序列、如图93r所示的xenp25812或1c11[pd-1]_h3.240_l3.148的abd的重链和轻链序列、如图93r所示的xenp25813或1c11[pd-1]_h3.241_l3.148的重链和轻链序列、或如图93s所示的xenp25819或1c11[pd-1]_h3.241_l3.92的重链和轻链序列。在一些实施方案中，本发明的mab-scil-15/rα包含具有图94n所示的xenp26940或1c11_h3.303_l3.152的序列的抗pd-1abd。在一些实施方案中，mab-scil-15/rα包含具有图94ae所示的xenp28026或1c11_h3.329_l3.220的序列的抗pd-1abd。在一些实施方案中，mab-scil-15/rα包含具有图94ag所示的xenp28652或1c11_h3.328_l3.152的序列的抗pd-1abd。

在mab-scil-15/rα形式中，一个优选的实施方案利用了本文所述的任何il-15复合物序列。在一些实施方案中，il-15复合物从n端到c端包含：人il-15rα寿司结构域、结构域连接子和人成熟il-15结构域(例如人成熟il-15变体)。在一些实施方案中，il-15复合物从n端至c端包含：人il-15rα寿司结构域、结构域连接子和具有氨基酸取代n4d/n65d的人成熟il-15变体。在一些实施方案中，il-15复合物从n端至c端包含：人il-15rα寿司结构域、结构域连接子和具有氨基酸取代nd30n/n65d的人成熟il-15变体。在一些实施方案中，il-15复合物从n端至c端包含：人il-15rα寿司结构域、结构域连接子和具有氨基酸取代d30n/e64q/n65d的人成熟il-15变体。

在mab-scil-15/rα形式，一种优选的实施方案利用具有如图94a所示的1c11_h3l3的序列的抗pd-1abd和例如图69a描绘的xenp22022的链1中的il-15复合物(寿司结构域-连接子-il-15)。在一些实施方案中，mab-scil-15/rα包括具有如图94a所示的1c11_h3l3的序列的抗pd-1abd和例如图69c描绘的xenp25850的链2中的il-15复合物(寿司结构域-连接子-il-15变体n4d/n65d)。在一些实施方案中，mab-scil-15/rα包括具有如图94a所示的1c11_h3l3的序列的抗pd-1abd和例如图126a描绘的xenp29482的链1中的il-15复合物(寿司结构域-连接子-il-15变体d30n/n65d)。在一些实施方案中，mab-scil-15/rα包括具有如图94a所示的1c11_h3l3的序列的抗pd-1abd和例如图124c描绘的xenp29286的链1中的il-15复合物(寿司结构域-连接子-il-15变体d30n/e64q/n65d)。

在一些实施方案中，mab-scil-15/rα包含抗pd-1abd，其具有如图94n所示的xenp26940或1c11_h3.303_l3.152的序列、人il-15rα(寿司)结构域和人成熟il-15(包括人成熟il-15变体)。在一些实施方案中，mab-scil-15/rα包含抗pd-1abd，其具有如图94n所示的xenp26940或1c11_h3.303_l3.152的序列、人il-15rα(寿司)结构域和具有氨基酸取代n4d/n65d的人成熟il-15变体。在一些实施方案中，mab-scil-15/rα包含抗pd-1abd，其具有如图94n所示的xenp26940或1c11_h3.303_l3.152的序列、人il-15rα(寿司)结构域和具有氨基酸取代d30n/n65d的人成熟il-15变体。在一些实施方案中，mab-scil-15/rα包含抗pd-1abd，其具有如图94n所示的xenp26940或1c11_h3.303_l3.152的序列、人il-15rα(寿司)结构域和具有氨基酸取代d30n/e64q/n65d的人成熟il-15变体。

在一些实施方案中，mab-scil-15/rα包含抗pd-1abd，其具有如图94ae所示的xenp28026或1c11_h3.329_l3.220的序列、人il-15rα(寿司)结构域和人成熟il-15(包括人成熟il-15变体)。在一些实施方案中，mab-scil-15/rα包含抗pd-1abd，其具有如图94ae所示的xenp28026或1c11_h3.329_l3.220的序列、人il-15rα(寿司)结构域和具有氨基酸取代n4d/n65d的人成熟il-15变体。在一些实施方案中，mab-scil-15/rα包含抗pd-1abd，其具有如图94ae所示的xenp28026或1c11_h3.329_l3.220的序列、人il-15rα(寿司)结构域和具有氨基酸取代d30n/n65d的人成熟il-15变体。在一些实施方案中，mab-scil-15/rα包含抗pd-1abd，其具有如图94ae所示的xenp28026或1c11_h3.329_l3.220的序列、人il-15rα(寿司)结构域和具有氨基酸取代d30n/e64q/n65d的人成熟il-15变体。

在一些实施方案中，mab-scil-15/rα包含抗pd-1abd，其具有如图94ag所示的xenp28652或1c11_h3.328_l3.152的序列、人il-15rα(寿司)结构域和人成熟il-15(包括人成熟il-15变体)。在一些实施方案中，mab-scil-15/rα包含抗pd-1abd，其具有如图94ag所示的xenp28652或1c11_h3.328_l3.152的序列、人il-15rα(寿司)结构域和具有氨基酸取代n4d/n65d的人成熟il-15变体。在一些实施方案中，mab-scil-15/rα包含抗pd-1abd，其具有如图94ag所示的xenp28652或1c11_h3.328_l3.152的序列、人il-15rα(寿司)结构域和具有氨基酸取代d30n/n65d的人成熟il-15变体。在一些实施方案中，mab-scil-15/rα包含抗pd-1abd，其具有如图94ag所示的xenp28652或1c11_h3.328_l3.152的序列、人il-15rα(寿司)结构域和具有氨基酸取代d30n/e64q/n65d的人成熟il-15变体。

h.mab-ncil-15/rα

此实施方案示于图65h，并且包括四个单体(虽然异源二聚体融合蛋白是五聚体)。这通常被称为“mab-ncil-15/rα”，其中“nc”代表“非共价”。mab-ncil-15/rα形式(图65h)包含与第一和第二异源二聚体fc的n端融合的vh，il-15rα(寿司)与异源二聚体fc区中的一个的c端融合，同时单独转染相应轻链以形成具有vh的fab，并且同时单独转染il-15以使得形成非共价il-15/rα复合物。图73a-73b提供了mabxncil-15/rα形式的示例性il-15/rαx抗pd-1异源二聚体蛋白质例如xenp22642和xenp22643的氨基酸序列。

在一些实施方案中，第一单体包含重链vh-ch1-铰链-ch2-ch3。第二单体包含具有il-15rα(寿司)结构域的重链、vh-ch1-铰链-ch2-ch3-结构域连接子-寿司结构域。第三单体是il-15结构域。第四(和第五)单体是轻链vl-cl。对于本实施方案的fc变体的优选组合在图8a-8f中可见。

在mab-ncil-15/rα形式中，一个优选实施方案利用具有如图14所示的序列1g6_l1.194_h1.279的抗pd-1abd。在mab-ncil-15/rα形式中，一个优选实施方案利用偏斜变体对s364k/e357q:l368d/k370s。在mab-ncil-15/rα形式中，一个优选实施方案利用具有如图14所示的序列1g6_l1.194_h1.279的抗pd-1abd，以图8a-8f的有用形式。

在mab-ncil-15/rα形式中，一种优选实施方案利用具有序列1c11[pd-1]_h3l3的抗pd-1abd，如图20c所示。

在mab-ncil-15/rα形式中，一种优选实施方案利用具有序列1c11[pd-1]_h3l3的抗pd-1abd，如图20c所述，以及偏斜变体对s364k/e357q:l368d/k370s。在mab-ncil-15/rα形式中，一个优选实施方案利用具有如图20c所示的序列1c11[pd-1]_h3l3的抗pd-1abd，以图8a-8f的有用形式。

在一些实施方案中，mab-ncil-15/rα包含本文所述的任何抗pd-1abd。在一些实施方案中，mab-ncil-15/rα包括抗pd-1abd，其包含：具有如图93r所示的xenp25806或1c11[pd-1]_h3.234_l3.144的重链和轻链序列、如图93r所示的xenp25812或1c11[pd-1]_h3.240_l3.148的abd的重链和轻链序列、如图93r所示的xenp25813或1c11[pd-1]_h3.241_l3.148的重链和轻链序列、或如图93s所示的xenp25819或1c11[pd-1]_h3.241_l3.92的重链和轻链序列。在一些实施方案中，本发明的mab-ncil-15/rα包含具有图94n所示的xenp26940或1c11_h3.303_l3.152的序列的抗pd-1abd。在一些实施方案中，mab-ncil-15/rα包含具有图94ae所示的xenp28026或1c11_h3.329_l3.220的序列的抗pd-1abd。在一些实施方案中，mab-ncil-15/rα包含具有图94ag所示的xenp28652或1c11_h3.328_l3.152的序列的抗pd-1abd。

在mab-ncil-15/rα形式中，一个优选的实施方案利用了本文所述的任何il-15复合物序列。

在mab-ncil-15/rα形式中，一个优选的实施方案利用了本文所述的任何il-15复合物序列。在一些实施方案中，il-15复合物包含人il-15rα寿司结构域和人成熟il-15结构域(例如人成熟il-15变体)。在一些实施方案中，il-15复合物包含人il-15rα寿司结构域和具有氨基酸取代n4d/n65d的人成熟il-15变体。在一些实施方案中，il-15复合物包含人il-15rα寿司结构域和具有氨基酸取代d30n/n65d的人成熟il-15变体。在一些实施方案中，il-15复合物包含人il-15rα寿司结构域和具有氨基酸取代d30n/e64q/n65d的人成熟il-15变体。

在一些实施方案中，mab-ncil-15/rα包含抗pd-1abd，其具有如图94n所示的xenp26940或1c11_h3.303_l3.152的序列、人il-15rα(寿司)结构域和人成熟il-15(包括人成熟il-15变体)。在一些实施方案中，mab-ncil-15/rα包含抗pd-1abd，其具有如图94n所示的xenp26940或1c11_h3.303_l3.152的序列、人il-15rα(寿司)结构域和具有氨基酸取代n4d/n65d的人成熟il-15变体。在一些实施方案中，mab-ncil-15/rα包含抗pd-1abd，其具有如图94n所示的xenp26940或1c11_h3.303_l3.152的序列、人il-15rα(寿司)结构域和具有氨基酸取代d30n/n65d的人成熟il-15变体。在一些实施方案中，mab-ncil-15/rα包含抗pd-1abd，其具有如图94n所示的xenp26940或1c11_h3.303_l3.152的序列、人il-15rα(寿司)结构域和具有氨基酸取代d30n/e64q/n65d的人成熟il-15变体。

在一些实施方案中，mab-ncil-15/rα包含抗pd-1abd，其具有如图94ae所示的xenp28026或1c11_h3.329_l3.220的序列、人il-15rα(寿司)结构域和人成熟il-15(包括人成熟il-15变体)。在一些实施方案中，mab-ncil-15/rα包含抗pd-1abd，其具有如图94ae所示的xenp28026或1c11_h3.329_l3.220的序列、人il-15rα(寿司)结构域和具有氨基酸取代n4d/n65d的人成熟il-15变体。在一些实施方案中，mab-ncil-15/rα包含抗pd-1abd，其具有如图94ae所示的xenp28026或1c11_h3.329_l3.220的序列、人il-15rα(寿司)结构域和具有氨基酸取代d30n/n65d的人成熟il-15变体。在一些实施方案中，mab-ncil-15/rα包含抗pd-1abd，其具有如图94ae所示的xenp28026或1c11_h3.329_l3.220的序列、人il-15rα(寿司)结构域和具有氨基酸取代d30n/e64q/n65d的人成熟il-15变体。

在一些实施方案中，mab-ncil-15/rα包含抗pd-1abd，其具有如图94ag所示的xenp28652或1c11_h3.328_l3.152的序列、人il-15rα(寿司)结构域和人成熟il-15(包括人成熟il-15变体)。在一些实施方案中，mab-ncil-15/rα包含抗pd-1abd，其具有如图94ag所示的xenp28652或1c11_h3.328_l3.152的序列、人il-15rα(寿司)结构域和具有氨基酸取代n4d/n65d的人成熟il-15变体。在一些实施方案中，mab-ncil-15/rα包含抗pd-1abd，其具有如图94ag所示的xenp28652或1c11_h3.328_l3.152的序列、人il-15rα(寿司)结构域和具有氨基酸取代d30n/n65d的人成熟il-15变体。在一些实施方案中，mab-ncil-15/rα包含抗pd-1abd，其具有如图94ag所示的xenp28652或1c11_h3.328_l3.152的序列、人il-15rα(寿司)结构域和具有氨基酸取代d30n/e64q/n65d的人成熟il-15变体。

i.mab-dsil-15/rα

此实施方案示于图65i，并且包括四个单体(虽然异源二聚体融合蛋白是五聚体)。这通常被称为“mab-ncil-15/rα”，其中“nc”代表“非共价”。mab-ncil-15/rα形式(见图65h)包含与第一和第二异源二聚体fc的n端融合的vh，il-15rα(寿司)与异源二聚体fc区中的一个的c端融合，同时单独转染相应轻链以形成具有vh的fab，并且同时单独转染il-15以使得形成非共价il-15/rα复合物。图74a-74b提供了mabxdsil-15/rα形式的示例性il-15/rαx抗pd-1异源二聚体蛋白质例如xenp22644和xenp22645的氨基酸序列。

在一些实施方案中，抗pd-1abd包括序列纳武单抗_h0，如图74a和74b的链2和链3中所示。在一些实施方案中，抗pd-1abd包括序列纳武单抗_l0，如图74a和74b的链4中所示。

第一单体包含重链vh-ch1-铰链-ch2-ch3。第二单体包含具有il-15rα(寿司)结构域：vh-ch1-铰链-ch2-ch3-结构域连接子-寿司结构域的重链，其中寿司结构域被工程化成含有半胱氨酸残基。第三单体是il-15结构域，其已被工程化成含有半胱氨酸残基，使得il-15复合物在生理条件下形成。第四(和第五)单体是轻链vl-cl。用于该实施方案的fc变体的有用组合在图8a-8f中可见。

在mab-dsil-15/rα形式中，一个优选实施方案利用具有如图14所示的序列1g6_l1.194_h1.279的抗pd-1abd。

在mab-dsil-15/rα形式中，一个优选实施方案利用偏斜变体对s364k/e357q:l368d/k370s。在一些实施方案中，mab-dsil-15/rα包含具有如图14所示的序列1g6_l1.194_h1.279的抗pd-1abd和偏斜变体对s364k/e357q：l368d/k370s。在一些实施方案中，mab-dsil-15/rα包含具有如图14所示的序列1g6_l1.194_h1.279的抗pd-1abd，其以图8a-8f的有用形式。

在mab-dsil-15/rα形式中，一种优选实施方案利用具有序列1c11[pd-1]_h3l3的抗pd-1abd，如图20c所示。

在一些实施方案中，mab-dsil-15/rα包含偏斜变体对s364k/e357q：l368d/k370s。在一些实施方案中，mab-dsil-15/rα包含具有如图20c所示的序列1c11[pd-1]_h3l3的抗pd-1abd和偏斜变体对s364k/e357q：l368d/k370s。在mab-dsil-15/rα形式中，一个优选实施方案利用具有如图20c所示的序列1c11[pd-1]_h3l3的抗pd-1abd，以图8a-8f的有用形式。

在一些实施方案中，mab-dsil-15/rα包含本文所述的任何抗pd-1abd。在一些实施方案中，mab-dsil-15/rα包括抗pd-1abd，其包含：具有如图93r所示的xenp25806或1c11[pd-1]_h3.234_l3.144的重链和轻链序列、如图93r所示的xenp25812或1c11[pd-1]_h3.240_l3.148的abd的重链和轻链序列、如图93r所示的xenp25813或1c11[pd-1]_h3.241_l3.148的重链和轻链序列、或如图93s所示的xenp25819或1c11[pd-1]_h3.241_l3.92的重链和轻链序列。在一些实施方案中，本发明的mab-dsil-15/rα包含具有图94n所示的xenp26940或1c11_h3.303_l3.152的序列的抗pd-1abd。在一些实施方案中，mab-dsil-15/rα包含具有图94ae所示的xenp28026或1c11_h3.329_l3.220的序列的抗pd-1abd。在一些实施方案中，mab-dsil-15/rα包含具有图94ag所示的xenp28652或1c11_h3.328_l3.152的序列的抗pd-1abd。

在mab-dsil-15/rα形式中，一个优选的实施方案利用了本文所述的任何il-15复合物序列。在mab-dsil-15/rα形式中，一个优选的实施方案利用了本文所述的任何il-15复合物序列。在一些实施方案中，il-15复合物包含人il-15rα寿司结构域和人成熟il-15结构域(例如人成熟il-15变体)。在一些实施方案中，il-15复合物包含人il-15rα寿司结构域和具有氨基酸取代n4d/n65d的人成熟il-15变体。在一些实施方案中，il-15复合物包含人il-15rα寿司结构域和具有氨基酸取代d30n/n65d的人成熟il-15变体。在一些实施方案中，il-15复合物包含人il-15rα寿司结构域和具有氨基酸取代d30n/e64q/n65d的人成熟il-15变体。

在一些实施方案中，mab-dsil-15/rα包含抗pd-1abd，其具有如图94n所示的xenp26940或1c11_h3.303_l3.152的序列、人il-15rα(寿司)结构域和人成熟il-15(包括人成熟il-15变体)。在一些实施方案中，mab-dsil-15/rα包含抗pd-1abd，其具有如图94n所示的xenp26940或1c11_h3.303_l3.152的序列、人il-15rα(寿司)结构域和具有氨基酸取代n4d/n65d的人成熟il-15变体。在一些实施方案中，mab-dsil-15/rα包含抗pd-1abd，其具有如图94n所示的xenp26940或1c11_h3.303_l3.152的序列、人il-15rα(寿司)结构域和具有氨基酸取代d30n/n65d的人成熟il-15变体。在一些实施方案中，mab-dsil-15/rα包含抗pd-1abd，其具有如图94n所示的xenp26940或1c11_h3.303_l3.152的序列、人il-15rα(寿司)结构域和具有氨基酸取代d30n/e64q/n65d的人成熟il-15变体。

在一些实施方案中，mab-dsil-15/rα包含抗pd-1abd，其具有如图94ae所示的xenp28026或1c11_h3.329_l3.220的序列、人il-15rα(寿司)结构域和人成熟il-15(包括人成熟il-15变体)。在一些实施方案中，mab-dsil-15/rα包含抗pd-1abd，其具有如图94ae所示的xenp28026或1c11_h3.329_l3.220的序列、人il-15rα(寿司)结构域和具有氨基酸取代n4d/n65d的人成熟il-15变体。在一些实施方案中，mab-dsil-15/rα包含抗pd-1abd，其具有如图94ae所示的xenp28026或1c11_h3.329_l3.220的序列、人il-15rα(寿司)结构域和具有氨基酸取代d30n/n65d的人成熟il-15变体。在一些实施方案中，mab-dsil-15/rα包含抗pd-1abd，其具有如图94ae所示的xenp28026或1c11_h3.329_l3.220的序列、人il-15rα(寿司)结构域和具有氨基酸取代d30n/e64q/n65d的人成熟il-15变体。

在一些实施方案中，mab-dsil-15/rα包含抗pd-1abd，其具有如图94ag所示的xenp28652或1c11_h3.328_l3.152的序列、人il-15rα(寿司)结构域和人成熟il-15(包括人成熟il-15变体)。在一些实施方案中，mab-dsil-15/rα包含抗pd-1abd，其具有如图94ag所示的xenp28652或1c11_h3.328_l3.152的序列、人il-15rα(寿司)结构域和具有氨基酸取代n4d/n65d的人成熟il-15变体。在一些实施方案中，mab-dsil-15/rα包含抗pd-1abd，其具有如图94ag所示的xenp28652或1c11_h3.328_l3.152的序列、人il-15rα(寿司)结构域和具有氨基酸取代d30n/n65d的人成熟il-15变体。在一些实施方案中，mab-dsil-15/rα包含抗pd-1abd，其具有如图94ag所示的xenp28652或1c11_h3.328_l3.152的序列、人il-15rα(寿司)结构域和具有氨基酸取代d30n/e64q/n65d的人成熟il-15变体。

j.中心-il-15/rα

此实施方案示于图65j中并包含四种单体，形成四聚体。这通常被称为“中心-il-15/rα”。中心-il-15/rα形式(见图65j)包含以重组方式与随后与异源二聚体fc的一侧进一步融合的il-15的n端融合的vh和以重组方式与随后与异源二聚体fc的另一侧进一步融合的il-15rα(寿司)的n端融合的vh，同时单独转染相应轻链以形成具有vh的fab。图75提供了中心il-15/rα形式的示例性il-15/rαx抗pd-1异源二聚体蛋白的氨基酸序列。

在一些实施方案中，抗pd-1abd包括序列1c11[pd-1]_h3，如图75的链1和链2中所示。在一些实施方案中，抗pd-1abd包括序列1c11[pd-1]_l3，如图75的链3中所示。

在中心-il-15/rα形式中，一个优选实施方案利用具有如图14所示的序列1g6_l1.194_h1.279的抗pd-1abd。

在中心-il-15/rα形式中，一个优选实施方案利用偏斜变体对s364k/e357q:l368d/k370s。在一些实施方案中，中心-il-15/rα包含具有如图14所示的序列1g6_l1.194_h1.279的抗pd-1abd和偏斜变体对s364k/e357q：l368d/k370s。在一些实施方案中，mab-dsil-15/rα包含具有如图14所示的序列1g6_l1.194_h1.279的抗pd-1abd，其以图8a-8f的有用形式。

在中心il-15/rα形式中，一种优选实施方案利用具有序列1c11[pd-1]_h3l3的抗pd-1abd，如图20c所示。

在一些实施方案中，中心il-15/rα包含偏斜变体对s364k/e357q：l368d/k370s。在一些实施方案中，中心il-15/rα包含具有如图20c所示的序列1c11[pd-1]_h3l3的抗pd-1abd和偏斜变体对s364k/e357q：l368d/k370s。在中心il-15/rα形式中，一个优选实施方案利用具有如图20c所示的序列1c11[pd-1]_h3l3的抗pd-1abd，以图8a-8f的有用形式。

在一些实施方案中，中心il-15/rα包含本文所述的任何抗pd-1abd。在一些实施方案中，中心il-15/rα包括抗pd-1abd，其包含：具有如图93r所示的xenp25806或1c11[pd-1]_h3.234_l3.144的重链和轻链序列、如图93r所示的xenp25812或1c11[pd-1]_h3.240_l3.148的abd的重链和轻链序列、如图93r所示的xenp25813或1c11[pd-1]_h3.241_l3.148的重链和轻链序列、或如图93s所示的xenp25819或1c11[pd-1]_h3.241_l3.92的重链和轻链序列。在一些实施方案中，中心il-15/rα包含具有图94n所示的xenp26940或1c11_h3.303_l3.152的序列的抗pd-1abd。在一些实施方案中，中心il-15/rα包含具有图94ae所示的xenp28026或1c11_h3.329_l3.220的序列的抗pd-1abd。在一些实施方案中，中心il-15/rα包含具有图94ag所示的xenp28652或1c11_h3.328_l3.152的序列的抗pd-1abd。

在中心il-15/rα形式中，一个优选的实施方案利用了本文所述的任何il-15复合物序列。在中心il-15/rα形式中，一个优选的实施方案利用了本文所述的任何il-15复合物序列。在一些实施方案中，il-15复合物包含人il-15rα寿司结构域和人成熟il-15结构域(例如人成熟il-15变体)。在一些实施方案中，il-15复合物包含人il-15rα寿司结构域和具有氨基酸取代n4d/n65d的人成熟il-15变体。在一些实施方案中，il-15复合物包含人il-15rα寿司结构域和具有氨基酸取代d30n/n65d的人成熟il-15变体。在一些实施方案中，il-15复合物包含人il-15rα寿司结构域和具有氨基酸取代d30n/e64q/n65d的人成熟il-15变体。

在一些实施方案中，中心il-15/rα包含抗pd-1abd，其具有如图94n所示的xenp26940或1c11_h3.303_l3.152的序列、人il-15rα(寿司)结构域和人成熟il-15(包括人成熟il-15变体)。在一些实施方案中，中心il-15/rα包含抗pd-1abd，其具有如图94n所示的xenp26940或1c11_h3.303_l3.152的序列、人il-15rα(寿司)结构域和具有氨基酸取代n4d/n65d的人成熟il-15变体。在一些实施方案中，中心il-15/rα包含抗pd-1abd，其具有如图94n所示的xenp26940或1c11_h3.303_l3.152的序列、人il-15rα(寿司)结构域和具有氨基酸取代d30n/n65d的人成熟il-15变体。在一些实施方案中，中心il-15/rα包含抗pd-1abd，其具有如图94n所示的xenp26940或1c11_h3.303_l3.152的序列、人il-15rα(寿司)结构域和具有氨基酸取代d30n/e64q/n65d的人成熟il-15变体。

在一些实施方案中，中心il-15/rα包含抗pd-1abd，其具有如图94ae所示的xenp28026或1c11_h3.329_l3.220的序列、人il-15rα(寿司)结构域和人成熟il-15(包括人成熟il-15变体)。在一些实施方案中，中心il-15/rα包含抗pd-1abd，其具有如图94ae所示的xenp28026或1c11_h3.329_l3.220的序列、人il-15rα(寿司)结构域和具有氨基酸取代n4d/n65d的人成熟il-15变体。在一些实施方案中，中心il-15/rα包含抗pd-1abd，其具有如图94ae所示的xenp28026或1c11_h3.329_l3.220的序列、人il-15rα(寿司)结构域和具有氨基酸取代d30n/n65d的人成熟il-15变体。在一些实施方案中，中心il-15/rα包含抗pd-1abd，其具有如图94ae所示的xenp28026或1c11_h3.329_l3.220的序列、人il-15rα(寿司)结构域和具有氨基酸取代d30n/e64q/n65d的人成熟il-15变体。

在一些实施方案中，中心il-15/rα包含抗pd-1abd，其具有如图94ag所示的xenp28652或1c11_h3.328_l3.152的序列、人il-15rα(寿司)结构域和人成熟il-15(包括人成熟il-15变体)。在一些实施方案中，中心il-15/rα包含抗pd-1abd，其具有如图94ag所示的xenp28652或1c11_h3.328_l3.152的序列、人il-15rα(寿司)结构域和具有氨基酸取代n4d/n65d的人成熟il-15变体。在一些实施方案中，中心il-15/rα包含抗pd-1abd，其具有如图94ag所示的xenp28652或1c11_h3.328_l3.152的序列、人il-15rα(寿司)结构域和具有氨基酸取代d30n/n65d的人成熟il-15变体。在一些实施方案中，中心il-15/rα包含抗pd-1abd，其具有如图94ag所示的xenp28652或1c11_h3.328_l3.152的序列、人il-15rα(寿司)结构域和具有氨基酸取代d30n/e64q/n65d的人成熟il-15变体。

k.中心scil-15/rα

此实施方案示于图64k，并且包括四个单体，形成四聚体。这通常被称为“中心-scil-15/rα”，其中“sc”代表“单链”。中心-scil-15/rα形式(见图65k)包含与il-15rα(寿司)的n端融合的vh和与异源二聚体fc的另一侧融合的vh，所述il-15rα(寿司)与随后与异源二聚体fc的一侧进一步融合的il-15融合，同时单独转染相应轻链以形成具有vh的fab。图76提供了中心-scil-15/rα形式的示例性il-15/rαx抗pd-1异源二聚体蛋白的氨基酸序列。

在一些实施方案中，抗pd-1abd包括序列1c11[pd-1]_h3，如图76的链1和链2中所示。在一些实施方案中，抗pd-1abd包括序列1c11[pd-1]_l3，如图76的链3中所示。

第一单体包含vh-ch1-[任选的结构域连接子]-寿司结构域-结构域连接子-il-15-[任选的结构域连接子]-ch2-ch3，其中第二任选的结构域连接子有时是铰链结构域。第二单体包含vh-ch1-铰链-ch2-ch3。第三(和第四)单体是轻链vl-cl。对于本实施方案的变体的优选组合在图8a-8f中可见。

在中心-scil-15/rα形式中，一个优选实施方案利用具有如图14所示的序列1g6_l1.194_h1.279的抗pd-1abd。

在中心-scil-15/rα形式中，一个优选实施方案利用偏斜变体对s364k/e357q:l368d/k370s。在一些实施方案中，中心-scil-15/rα包含具有如图14所示的序列1g6_l1.194_h1.279的抗pd-1abd和偏斜变体对s364k/e357q：l368d/k370s。在一些实施方案中，中心-scil-15/rα包含具有如图14所示的序列1g6_l1.194_h1.279的抗pd-1abd，其以图8a-8f的有用形式。

在中心-scil-15/rα形式中，一种优选实施方案利用具有序列1c11[pd-1]_h3l3的抗pd-1abd，如图20c所示。

在一些实施方案中，中心-scil-15/rα包含偏斜变体对s364k/e357q：l368d/k370s。在一些实施方案中，中心-scil-15/rα包含具有如图20c所示的序列1c11[pd-1]_h3l3的抗pd-1abd和偏斜变体对s364k/e357q：l368d/k370s。在中心-scil-15/rα形式中，一个优选实施方案利用具有如图20c所示的序列1c11[pd-1]_h3l3的抗pd-1abd，以图8a-8f的有用形式。

在一些实施方案中，中心-scil-15/rα包含本文所述的任何抗pd-1abd。在一些实施方案中，中心-scil-15/rα包括抗pd-1abd，其包含：具有如图93r所示的xenp25806或1c11[pd-1]_h3.234_l3.144的重链和轻链序列、如图93r所示的xenp25812或1c11[pd-1]_h3.240_l3.148的abd的重链和轻链序列、如图93r所示的xenp25813或1c11[pd-1]_h3.241_l3.148的重链和轻链序列、或如图93s所示的xenp25819或1c11[pd-1]_h3.241_l3.92的重链和轻链序列。在一些实施方案中，中心-scil-15/rα包含具有如图94n中所示的xenp26940或1c11_h3.303_l3.152的序列。在一些实施方案中，中心-scil-15/rα包含具有图94ae所示的xenp28026或1c11_h3.329_l3.220的序列的抗pd-1abd。在一些实施方案中，中心-scil-15/rα包含具有图94ag所示的xenp28652或1c11_h3.328_l3.152的序列的抗pd-1abd。

在中心-scil-15/rα形式中，一个优选的实施方案利用了本文所述的任何il-15复合物序列。在一些实施方案中，il-15复合物从n端到c端包含：人il-15rα寿司结构域、结构域连接子和人成熟il-15结构域(例如人成熟il-15变体)。在一些实施方案中，il-15复合物从n端至c端包含：人il-15rα寿司结构域、结构域连接子和具有氨基酸取代n4d/n65d的人成熟il-15变体。在一些实施方案中，il-15复合物从n端至c端包含：人il-15rα寿司结构域、结构域连接子和具有氨基酸取代nd30n/n65d的人成熟il-15变体。在一些实施方案中，il-15复合物从n端至c端包含：人il-15rα寿司结构域、结构域连接子和具有氨基酸取代d30n/e64q/n65d的人成熟il-15变体。

在一些实施方案中，中心-scil-15/rα包含抗pd-1abd，其具有如图94n所示的xenp26940或1c11_h3.303_l3.152的序列、人il-15rα(寿司)结构域和人成熟il-15(包括人成熟il-15变体)。在一些实施方案中，中心-scil-15/rα包含抗pd-1abd，其具有如图94n所示的xenp26940或1c11_h3.303_l3.152的序列、人il-15rα(寿司)结构域和具有氨基酸取代n4d/n65d的人成熟il-15变体。在一些实施方案中，中心-scil-15/rα包含抗pd-1abd，其具有如图94n所示的xenp26940或1c11_h3.303_l3.152的序列、人il-15rα(寿司)结构域和具有氨基酸取代d30n/n65d的人成熟il-15变体。在一些实施方案中，中心-scil-15/rα包含抗pd-1abd，其具有如图94n所示的xenp26940或1c11_h3.303_l3.152的序列、人il-15rα(寿司)结构域和具有氨基酸取代d30n/e64q/n65d的人成熟il-15变体。

在一些实施方案中，中心-scil-15/rα包含抗pd-1abd，其具有如图94ae所示的xenp28026或1c11_h3.329_l3.220的序列、人il-15rα(寿司)结构域和人成熟il-15(包括人成熟il-15变体)。在一些实施方案中，中心-scil-15/rα包含抗pd-1abd，其具有如图94ae所示的xenp28026或1c11_h3.329_l3.220的序列、人il-15rα(寿司)结构域和具有氨基酸取代n4d/n65d的人成熟il-15变体。在一些实施方案中，中心-scil-15/rα包含抗pd-1abd，其具有如图94ae所示的xenp28026或1c11_h3.329_l3.220的序列、人il-15rα(寿司)结构域和具有氨基酸取代d30n/n65d的人成熟il-15变体。在一些实施方案中，中心-scil-15/rα包含抗pd-1abd，其具有如图94ae所示的xenp28026或1c11_h3.329_l3.220的序列、人il-15rα(寿司)结构域和具有氨基酸取代d30n/e64q/n65d的人成熟il-15变体。

在一些实施方案中，中心-scil-15/rα包含抗pd-1abd，其具有如图94ag所示的xenp28652或1c11_h3.328_l3.152的序列、人il-15rα(寿司)结构域和人成熟il-15(包括人成熟il-15变体)。在一些实施方案中，中心-scil-15/rα包含抗pd-1abd，其具有如图94ag所示的xenp28652或1c11_h3.328_l3.152的序列、人il-15rα(寿司)结构域和具有氨基酸取代n4d/n65d的人成熟il-15变体。在一些实施方案中，中心-scil-15/rα包含抗pd-1abd，其具有如图94ag所示的xenp28652或1c11_h3.328_l3.152的序列、人il-15rα(寿司)结构域和具有氨基酸取代d30n/n65d的人成熟il-15变体。在一些实施方案中，中心-scil-15/rα包含抗pd-1abd，其具有如图94ag所示的xenp28652或1c11_h3.328_l3.152的序列、人il-15rα(寿司)结构域和具有氨基酸取代d30n/e64q/n65d的人成熟il-15变体。

v.il-15/il-15rα-fc融合单体

本发明的fc融合蛋白包括il-15/il-15受体α(il-15rα)-fc融合单体；参见2016年10月14日提交的wo2018/171918、wo2018/071919、us2018/0118805、us2018/0118828、ussn62/408,655，2017年1月6日提交的ussn62/443,465和2017年3月28日提交的ussn62/477,926，其通过引用以其整体并入本文，尤其是其中概述的图、图例和序列。

在一些实施方案中，人il-15蛋白具有ncbi参考序列第np_000576.1号或seqidno:1中所阐述的氨基酸序列。在一些情况下，人类il-15的编码序列阐述于ncbi参考序列第nm_000585号中。本文概述的fc融合异源二聚体蛋白的例示性il-15蛋白可具有seqidno:2的氨基酸序列或seqidno:1的氨基酸49-162。

seqidno:1是

mriskphlrsisiqcylclllnshflteagihvfilgcfsaglpkteanwvnvisdlkkiedliqsmhidatlytesdvhpsckvtamkcfllelqvislesgdasihdtvenliilannslssngnvtesgckeceeleeknikeflqsfvhivqmfints。

seqidno:2是

nwvnvisdlkkiedliqsmhidatlytesdvhpsckvtamkcfllelqvislesgdasihdtvenliilannslssngnvtesgckeceeleeknikeflqsfvhivqmfints。

在一些实施方案中，il-15蛋白具有与seqidno:2至少90％、例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性。在一些实施方案中，il-15蛋白质具有seqidno：2的氨基酸序列和一个或多个选自c42s、l45c、q48c、v49c、l52c、e53c、e87c和e89c的氨基酸取代。在一些实施方案中，il-15蛋白具有一个或多个选自n1d、n4d、d8n、d30n、d61n、e64q、n65d和q108e的氨基酸取代。fc融合蛋白的il-15蛋白可具有1、2、3、4、5、6、7、8、9或更多个氨基酸取代。在一些实施方案中，il-15蛋白质具有seqidno：2的氨基酸序列和一个或多个选自n1d、n4d、d8n、d30n、d61n、e64q、n65d和q108e的氨基酸取代。在其他实施方案中，氨基酸取代是n4d/n65d。在其他实施方案中，氨基酸取代是d30n/e64q/n65d。在一些情况下，氨基酸取代是d30n/n65d。在一些实施方案中，il-15蛋白与seqidno：2和n4d/n65d取代具有至少97％或98％的序列同一性。在一些实施方案中，il-15蛋白与seqidno：2和d30n/n65d取代具有至少97％或98％的序列同一性。在一些实施方案中，il-15蛋白与seqidno：2和d30n/n65d取代具有至少96％或97％的序列同一性。

在一些实施方案中，人类il-15受体α(il-15rα)蛋白具有ncbi参考序列第np_002180.1号或seqidno:3中所阐述的氨基酸序列。在一些情况下，人类il-15rα的编码序列阐述于ncbi参考序列第nm_002189.3号中。本文概述的fc融合异源二聚体蛋白的il-15rα蛋白的例示性可包含seqidno:3的寿司结构域(例如，seqidno:3的氨基酸31-95)或由其组成，或换句话说，seqidno:4的氨基酸序列。

seqidno:3是

maprrargcrtlglpalllllllrppatrgitcpppmsvehadiwvksyslysreryicnsgfkrkagtssltecvlnkatnvahwttpslkcirdpalvhqrpappstvttagvtpqpeslspsgkepaasspssnntaattaaivpgsqlmpskspstgtteisshesshgtpsqttaknweltasashqppgvypqghsdttvaiststvllcglsavsllacylksrqtpplasvemeamealpvtwgtssrdedlencshhl。

seqidno:4是

itcpppmsvehadiwvksyslysreryicnsgfkrkagtssltecvlnkatnvahwttpslkcir。

在一些实施方案中，il-15rα蛋白具有seqidno:4的氨基酸序列和选自由以下组成的群组的氨基酸插入：d96、p97、a98、d96/p97、d96/c97、d96/p97/a98、d96/p97/c98和d96/c97/a98，其中氨基酸位置是相对于全长人类il-15rα蛋白或seqidno:3。举例来说，可以将例如d(例如asp)、p(例如pro)、a(例如ala)、dp(例如asp-pro)、dc(例如asp-cys)、dpa(例如asp-pro-ala)、dpc(例如asp-pro-cys)或dca(例如asp-cys-ala)的氨基酸添加到seqidno:4的il-15rα蛋白的c端。在一些实施方案中，il-15rα蛋白具有seqidno:4的氨基酸序列和一个或多个选自由以下组成的群组的氨基酸取代：k34c、a37c、g38c、s40c和l42c，其中氨基酸位置是相对于seqidno:4。il-15rα蛋白可具有1、2、3、4、5、6、7、8个或更多个氨基酸突变(例如，取代、插入和/或缺失)。

vi.结构域连接子

在一些实施方案中，il-15蛋白与fc结构域的n端连接，并且il-15rα蛋白与il-15蛋白的n端连接。在其它实施方案中，il-15rα蛋白与fc结构域的n端连接，并且il-15rα蛋白与il-15蛋白非共价连接。在又其它实施方案中，il-15rα蛋白与fc结构域的c端连接，并且il-15rα蛋白与il-15蛋白非共价连接。

在一些实施方案中，il-15蛋白和il-15rα蛋白通过连接子连接在一起(例如“scil-15/rα”形式)。任选地，蛋白质不通过连接子连接，并利用如本文所述的天然自组装或二硫键。在其他实施方案中，il-15蛋白和il-15rα蛋白是非共价连接的。在一些实施方案中，il-15蛋白通过连接子与fc结构域连接。在某些实施方案中，il-15蛋白直接连接至fc结构域，例如没有连接子。在特定的实施方案中，il-15蛋白经由铰链区或其片段连接至fc结构域。在其它实施方案中，il-15rα蛋白通过连接子与fc结构域连接。在其他实施方案中，il-15rα蛋白直接连接至fc结构域，例如不用连接子。在特定的实施方案中，il-15rα蛋白通过铰链区或其片段连接至fc结构域。任选地，il-15蛋白或il-15rα蛋白不使用连接子与fc结构域连接。

在一些情况下，pd-1abd通过连接子(例如结构域连接子)共价连接至fc结构域的n末端。在一些实施方案中，pd-1abd直接连接至fc结构域，例如没有连接子。在特定的实施方案中，pd-1abd经由铰链区或其片段连接至fc结构域。

在一些实施方案中，连接子是“结构域连接子”，其用于将如本文所概述的任何两个域连接在一起。虽然可以使用任何合适的连接子，但许多实施方案使用甘氨酸-丝氨酸聚合物，包括例如(gs)n、(gsggs)n、(ggggs)n和(gggs)n，其中n是至少1的整数(并且通常为1到2到3到4到5)以及允许具有足够的长度和柔性的两个结构域重组连接的任何肽序列以允许每个结构域保留其生物学功能。在一些情况下，并且注意“链型”，如下所概述，可以如本文所讨论和图9和10中所示使用带电荷的结构域连接子。

vii.pd-1抗体单体

本发明涉及与pd-1结合的双特异性异源二聚体蛋白质和表达il-2rβ和共同γ链(γc；cd132)的细胞的产生。双特异性异源二聚体蛋白质可包括可与免疫检查点抗原结合的任何有用抗体形式的抗体单体。在一些实施方案中，抗体单体包括与fc结构域连接的fab或scfv。在一些情况下，pd-1抗体单体含有抗pd1(vh)-ch1-fc和抗pd-1vl-ckappa。在一些情况下，pd-1抗体单体含有抗pd-1scfv-fc。

在一些实施方案中，本发明的异源二聚体fc融合蛋白的pd-1靶向臂包含选自由以下组成的组的cdr的vhcdr1、vhcdr2、vhcdr3、vlcdr1、vlcdr2和vlcdr3的序列：来自xenp22553的1c11[pd-1]_h3l3、来自xenp25806的1c11[pd-1]_h3.234_l3.144、来自xenp25812的1c11[pd-1]_h3.240_l3.148、来自xenp25813的1c11[pd-1]_h3.241_l3.148、来自xenp25819的1c11[pd-1]_h3.241_l3.92、来自xenp26940的1c11[pd-1]_h3.303_l3.152、来自xenp28026的1c11[pd-1]_h3.329_l3.220和来自xenp28652的1c11[pd-1]_h3.328_l3.152。在一些实施方案中，vhcdr1、vhcd2和vhcdr3的序列选自图95a-95j中描绘的序列和相应的序列标识符。在一些实施方案中，vhcdr1、vhcd2和vhcdr3的序列选自图96a-96f中描绘的序列和相应的序列标识符。

在一些实施方案中，本发明的异源二聚体fc融合蛋白的pd-1靶向臂包含选自由以下组成的组的对的可变重结构域和可变轻结构域：来自xenp22553的1c11[pd-1]_h3l3、来自xenp25806的1c11[pd-1]_h3.234_l3.144、来自xenp25812的1c11[pd-1]_h3.240_l3.148、来自xenp25813的1c11[pd-1]_h3.241_l3.148、来自xenp25819的1c11[pd-1]_h3.241_l3.92、来自xenp26940的1c11[pd-1]_h3.303_l3.152、来自xenp28026的1c11[pd-1]_h3.329_l3.220和来自xenp28652的1c11[pd-1]_h3.328_l3.152。在一些实施方案中，pd-1靶向臂的可变重结构域与选自由以下对组成的组的可变重结构域的序列具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性，pd-1靶向臂的可变轻结构域与选自由以下对组成的组的可变轻结构域的序列具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列的序列同一性：来自xenp22553的1c11[pd-1]_h3l3、来自xenp25806的1c11[pd-1]_h3.234_l3.144、来自xenp25812的1c11[pd-1]_h3.240_l3.148、来自xenp25813的1c11[pd-1]_h3.241_l3.148、来自xenp25819的1c11[pd-1]_h3.241_l3.92、来自xenp26940的1c11[pd-1]_h3.303_l3.152、来自xenp28026的1c11[pd-1]_h3.329_l3.220和来自xenp28652的1c11[pd-1]_h3.328_l3.152，以及相应的序列标识符。

此类抗体片段的附加示例性实施方案提供于xenp21480(链2；图65a)，xenp22022(链2和3；图65d)，xenp22112(链1和4；图65e)，xenp22641(链1和3；图65f)中。，xenp22642(链1-3；图65h)和xenp22644(链1-3；图65i)。

abd可以呈各种形式，例如fab形式或scfv形式。在wo2017/218707和pct/us2018/059887中公开了用于本发明的示例性abd，包括附图、图例和序列表在内的内容出于所有目的通过引用整体并入本文。

例如，结合pd-1的合适abd显示在us2018/0118836的图11和12中，以及本文中图13和14及seqidnos:中概述的那些。如本领域技术人员所理解的，合适的abd可以包括如本文图中所示的一组6个cdr，不是因为它们加了下划线，就是在如上面所述使用不同编号方案的情况下就是作为在us2018/0118836的图11和12的vh和vl序列内使用其他比对鉴定的cdr。合适的abd还可以包括如这些附图中所描绘的整个vh和vl序列，用作scfv或fab。具体的scfv序列显示在us2018/0118836的图11中，其使用特定的带电荷连接子，但也可以使用其他连接子，例如图7中描绘的连接子。在本文的许多含有fv结合pd-1的实施方案中，是scfv单体结合pd-1。在us2018/0118836中，图11显示了优选的scfv序列，并且图12描绘了合适的fab序列，尽管如本文所讨论的，vh和vl可以用于任一种配置。

b.抗体

如下所讨论，通常使用术语“抗体”。可以用于本发明的抗体可以采用如本文所述的多种形式，包括本文所述和图中所描绘的传统抗体以及抗体衍生物、片段和模拟物。本发明提供含有检查点抗原结合结构域和fc结构域的抗体融合蛋白。在一些实施方案中，抗体融合蛋白与本文所述的il-15/il-15rα-fc蛋白形成双特异性异源二聚体蛋白。在其他实施方案中，抗体融合蛋白与另一种抗体融合蛋白形成双特异性异源二聚体蛋白，所述另一种抗体融合蛋白包含检查点抗原结合结构域和fc结构域。此类靶向pd-1的异源二聚体蛋白的实施方案包括但不限于xenp21480、xenp22022、xenp22112、xenp22641、xenp22642、xenp22644、xenp25850和xenp25937。

传统的抗体结构单元通常包含四聚体。每个四聚体通常由两对相同的多肽链构成，每对具有一个“轻链”(通常具有约25kda的分子量)和一个“重链”(通常具有约50-70kda的分子量)。人轻链被分类为κ和λ轻链。本发明涉及通常基于igg类的抗体或抗体片段(抗体单体)，其具有几个亚类，包括但不限于igg1、igg2、igg3和igg4。通常，igg1、igg2和igg4比igg3更频繁地使用。应注意igg1具有在356(d或e)和358(l或m)处具有多型性的不同同种异型。本文描述的序列使用356d/358m同种异型，然而本文包括其它同种异型。也就是说，本文包括的包括igg1fc结构域的任何序列可以具有替代356d/358m同种异型的356e/358l。

另外，本文中的许多序列在位置220处的至少一个半胱氨酸被丝氨酸取代；通常，这是在本文中所描绘的大多数序列的“scfv单体”侧，尽管它也可以在“fab单体”侧或两者上，以减少二硫化物的形成。本文序列中特别包括这些半胱氨酸中的一个或两个被取代(c220s)。

因此，如本文所用，“同型”意指根据其恒定区的化学和抗原特征界定的免疫球蛋白的任一子类。应了解治疗抗体还可以包含同型和/或子类的杂合体。例如，如通过引用并入的us2009/0163699中所示，本发明覆盖igg1/g2杂合体的pi工程化。

每条链的氨基端部分包括主要负责抗原识别的约100至110个或更多个氨基酸的可变区，在本领域和本文中通常称为“fv结构域”或“fv区”。在可变区中，重链和轻链的每个v结构域聚集三个环以形成抗原结合位点。每个环被称为互补决定区(下文中称为“cdr”)，其中氨基酸序列的变化是最显著的。“可变”是指可变区的某些区段在抗体之间序列差异很大的事实。可变区内的可变性不是均匀分布的。相反，v区由通过称为“高变区”的极端可变的较短区分隔开的称为框架区(fr)的15-30个氨基酸的相对不变的区段组成，所述高变区各自9-15个氨基酸长或更长。

每个vh和vl由三个高变区(“互补决定区”，“cdr”)和四个fr构成，从氨基端到羧基端按以下顺序排列：fr1-cdr1-fr2-cdr2-fr3-cdr3-fr4。

高变区通常涵盖来自轻链可变区中约氨基酸残基24-34(lcdr1；“l”表示轻链)、50-56(lcdr2)和89-97(lcdr3)以及重链可变区中约31-35b(hcdr1；“h”表示重链)、50-65(hcdr2)和95-102(hcdr3)的氨基酸残基；kabat等人,《免疫学相关蛋白质的序列(sequencesofproteinsofimmunologicalinterest)》,第5版.马里兰州贝塞斯达美国国家卫生研究院公共卫生服务部(publichealthservice,nationalinstitutesofhealth,bethesda,md.)(1991)和/或那些形成高变环的残基(例如轻链可变区中的残基26-32(lcdr1)、50-52(lcdr2)和91-96(lcdr3)以及重链可变区中的26-32(hcdr1)、53-55(hcdr2)和96-101(hcdr3)；chothia和lesk(1987)《分子生物学杂志(j.mol.biol.)》196:901-917。下面描述本发明的特定cdr。

如本领域技术人员所理解，cdr的确切编号和放置在不同编号系统之间可以是不同的。然而，应理解，可变重链和/或可变轻链序列的公开内容包括相关(固有)cdr的公开内容。因此，每个重链可变区的公开内容是vhcdr(例如vhcdr1、vhcdr2和vhcdr3)的公开内容，并且每个轻链可变区的公开内容是vlcdr(例如vlcdr1、vlcdr2和vlcdr3)的公开内容。

cdr编号的有用比较如下，参见lafranc等人,《发育与比较免疫学(dev.comp.immunol.)》27(1):55-77(2003)：

表1

在通篇本发明说明书中，当提及可变结构域中的残基(大致是轻链可变区中的残基1-107和重链可变区中的残基1-113)时通常使用kabat编号系统且fc区使用eu编号系统(例如kabat等人，同上(1991))。

本发明提供大量不同的cdr组。在这种情况下，“完整cdr组”包含三个可变轻链和三个可变重链cdr，例如vlcdr1、vlcdr2、vlcdr3、vhcdr1、vhcdr2和vhcdr3。这些可以分别是较大可变轻链结构域或可变重链结构域的一部分。另外，如本文中更全面地概述，当使用重链和轻链时(例如当使用fab时)，可变重结构域和可变轻结构域可以位于单独的多肽链上，或在scfv序列的情况下位于单个多肽链上。

cdr有助于形成抗体的抗原结合位点，或更具体来说，表位结合位点。

“表位”是指与称为互补位的抗体分子可变区中的特定抗原结合位点相互作用的决定簇。表位是例如氨基酸或糖侧链的分子的分组，并且通常具有特定的结构特征以及特定的电荷特征。单个抗原可具有多于一个表位。

表位可以包含直接参与结合的氨基酸残基(也称为表位的免疫显性组分)和不直接参与结合的其它氨基酸残基，例如被特异性抗原结合肽有效阻断的氨基酸残基；换句话说，氨基酸残基在特异性抗原结合肽的覆盖面积内。

表位可以是构象的也可以是线性的。通过来自线性多肽链的不同区段的空间并置的氨基酸产生构象表位。线性表位是由多肽链中的相邻氨基酸残基产生的表位。构形和非构形表位的区别可以在于在变性溶剂存在下，与前者而非后者的结合丧失。

表位通常包括独特空间构象中的至少3个，并且更通常至少5个或8-10个氨基酸。识别相同表位的抗体可以在简单的免疫分析中验证，展示一种抗体阻断另一种抗体与目标抗原结合的能力，例如“框并”。如下文所概述，本发明不仅包括本文所列举的抗原结合结构域和抗体，还包括竞争与所列举的抗原结合结构域结合的表位结合的抗原结合结构域和抗体。

每条链的羧基端部分限定了主要负责效应功能的恒定区。kabat等人收集了重链和轻链的可变区的多个一级序列。基于序列的保守程度，他们将单个一级序列分类为cdr和框架并列出其列表(参见《免疫学相关序列(sequencesofimmunologicalinterest)》，第5版，nih公开第91-3242号，e.a.

在免疫球蛋白的igg亚类中，重链中存在几种免疫球蛋白结构域。“免疫球蛋白(ig)结构域”在本文中意指具有不同三级结构的免疫球蛋白区域。本发明相关的是重结构域，包括重恒定(ch)结构域和铰链结构域。在igg抗体的情况下，igg同型各自具有三个ch区。因此，在igg的上下文中，“ch”结构域如下：“ch1”是指根据如kabat中的eu编号的位置118-220。“ch2”根据如kabat中的eu编号是指位置237-340，并且“ch3”根据如kabat中的eu编号是指位置341-447。如本文所示和下文所述，pi变体可以在一个或多个ch区以及铰链区中，在下面讨论。

重链的另一种类型的ig结构域是铰链区。“铰链”或“铰链区”或“抗体铰链区”或“免疫球蛋白铰链区”在本文中意味着包含抗体的第一与第二恒定结构域之间的氨基酸的柔性多肽。在结构上，iggch1结构域在eu位置220处终止，并且iggch2结构域在残基eu位置237处开始。因此，对于igg，抗体铰链在本文中定义为包括位置221(igg1中的d221)到236(igg1中的g236)，其中所述编号根据如kabat中的eu编号。在一些实施方案中，例如在fc区的背景下，包括下铰链，“下铰链”通常指的是位置226或230。如本文所述，pi变体也可以在铰链区中制备。

轻链通常包含两个结构域，即可变轻链结构域(含有轻链cdr并且与可变重链结构域一起形成fv区)和恒定轻链区(通常称为cl或cκ)。

下文概述的用于其它取代的另一相关区是fc区。

如本文所述以及所属领域中已知，本发明的abd包括重链和轻链内的不同结构域，其也可以是重叠的。这些结构域包含但不限于fc结构域、ch1结构域、ch2结构域、ch3结构域、铰链结构域、重恒定结构域(ch1-铰链-fc结构域或ch1-铰链-ch2-ch3)、可变重结构域、可变轻结构域、轻恒定结构域、fab结构域和scfv结构域。

因此，“fc结构域”包括-ch2-ch3结构域和任选的铰链结构域。在本文的实施方案中，当scfv连接于fc结构域时，scfv构建体的c端连接于fc结构域的全部或部分铰链；例如，其通常连接于是铰链的开始的序列epks(seqidno:1220)。重链包含可变重链结构域和恒定结构域，其包括包含ch2-ch3的ch1-任选的铰链-fc结构域。轻链包括可变轻链结构域和轻链恒定结构域。scfv包括可变重链、scfv连接子以及可变轻链结构域。在本文概述的大多数构建体和序列中，可变轻链的c末端连接至scfv连接子的n末端，其c末端连接至可变重链的n末端(n-vh-连接子-vl-c)，尽管其可以被转换(n-vl-连接子-vh-c)。

本发明的一些实施方案包含至少一个scfv结构域，其虽然不是天然存在的，但是通常包括由scfv连接子连接在一起的可变重链结构域和可变轻链结构域。如本文所概述的，虽然scfv结构域通常从n-末端到c-末端定向为vh-scfv连接子-vl，但对于任何scfv结构域(或使用来自fab的vh和vl序列构建的那些)，这可以是相反为vl-scfv连接子-vh，其中在一端或两端具有可选的连接子，这取决于形式(一般地参见us62/353,511的图4a-4b)。

如本文所示，可以使用许多合适的scfv连接子，包括通过重组技术产生的传统肽键。连接子肽可以主要包含以下氨基酸残基：gly、ser、ala或thr。连接子肽应当具有足够以此方式连接两个分子的长度：所述分子假设相对于彼此的正确构象使得其保留期望活性。在一个实施方案中，连接子具有约1到50个氨基酸的长度，优选约1到30个氨基酸的长度。在一个实施方案中，可以使用长度为1个到20个氨基酸的连接子，在一些实施方案中使用约5个到约10个氨基酸。有用的连接子包括甘氨酸-丝氨酸聚合物(包括例如(gs)n、(gsggs)n、(ggggs)n和(gggs)n，其中n是至少为一(并且通常为3到4)的整数)、甘氨酸-丙氨酸聚合物、丙氨酸-丝氨酸聚合物和其它柔性连接子。替代性地，各种非蛋白质聚合物可以用作连接子，包含但不限于聚乙二醇(peg)、聚丙二醇、聚氧化烯、或聚乙二醇和聚丙二醇的共聚物。

其它连接子序列可以包括cl/ch1结构域的任何长度的任何序列，但不包括cl/ch1结构域的所有残基；例如cl/ch1结构域的前5-12个氨基酸残基。连接子可以来源于免疫球蛋白轻链，例如cκ或cλ。连接子可以来源于任何同型的免疫球蛋白重链，包括例如cγ1、cγ2、cγ3、cγ4、cα1、cα2、cδ、cε和cμ。连接子序列还可以来源于其它蛋白质，如ig样蛋白质(例如tcr、fcr、kir)、铰链区源序列，和来自其它蛋白质的其它天然序列。

在一些实施方案中，连接子是“结构域连接子”，其用于将如本文所概述的任何两个域连接在一起。虽然可以使用任何适合的连接子，但是许多实施方案利用甘氨酸-丝氨酸聚合物以及允许以足够允许每个结构域保持其生物学功能的长度和柔性来重组连接这两个结构域的任何肽序列，所述甘氨酸-丝氨酸聚合物包含例如(gs)n、(gsggs)n、(ggggs)n和(gggs)n，其中n是至少为一(并且通常为3到4到5)的整数。在一些情况下，并且注意“链型”，如下所概述，可以使用如在scfv连接子的一些实施方案中使用的带电荷的结构域连接子。

在一些实施方案中，scfv连接子是带电荷scfv连接子，其中的许多在图10示出。因此，本发明进一步提供带电荷的scfv连接子，以促进第一和第二单体(例如il-15/il-15rα单体和pd-1abd单体)之间的pi分离。也就是说，通过并入带正或负(或两者，在不同单体上使用scfv的骨架的情况下)电的scfv连接子，由此允许包含带电连接子的单体改变pi而不会在fc结构域中产生进一步的变化。这些带电连接子可以被取代到含有标准连接子的任何scfv中。此外，如所属领域的技术人员将了解，根据所期望的pi变化，在适当的“链”或单体上使用带电scfv连接子。举例来说，如本文所论述，为了产生三重f形式异源二聚体抗体，计算每个所期望抗原结合结构域的fv区的初始pi，且选择其一来产生scfv，且依据pi选择正性或负性连接子。

带电结构域连接子还可以用于增加本发明的单体的pi分离，并且因此图10中所包含的那些在本文中可以用于利用连接子的任何实施方案中。

在一个实施方案中，抗体是抗体片段，只要其含有至少一个恒定结构域，其可以被工程化以产生异源二聚体，例如pi工程化。可以使用的其他抗体片段包括含有一个或多个已经过pi工程改造的本发明的ch1、ch2、ch3、铰链和cl结构域的片段。特别地，图65a-65k中描绘的形式是靶向pd-1的异源二聚体fc融合蛋白，通常称为“双特异性异源二聚体融合蛋白”，意味着该蛋白质具有至少两个相关的fc序列自组装成异源二聚体fc结构域和至少一个fv区域，无论作为fab或作为scfv。

c.嵌合和人源化抗体

在一些实施方案中，本文的抗体可衍生自来自不同物种的混合物，例如嵌合抗体和/或人源化抗体。通常，“嵌合抗体”和“人源化抗体”都是指组合来自超过一种物种的区域的抗体。举例来说，“嵌合抗体”传统上包含来自小鼠(或在一些情况下为大鼠)的可变区和来自人类的恒定区。“人源化抗体”通常是指非人类抗体，其具有与人类抗体中发现的序列交换的可变结构域框架区。通常，在人源化抗体中，除cdr之外的整个抗体由人类来源的聚核苷酸编码或除了在其cdr内之外，与这种抗体相同。cdr(部分或全部由源自非人类生物体的核酸编码)被移植到人类抗体可变区的β-折叠框架中以形成抗体，其特异性由移植的cdr决定。这类抗体的形成描述于例如wo92/11018，jones,1986,《自然》321:522-525，verhoeyen等人,1988,《科学》239:1534-1536中，其以引用的方式整体并入本文中。所选择的受体框架残基“回复突变”到相应的供体残基通常需要重新获得在初始移植构筑体中丧失的亲和力(us5530101；us5585089；us5693761；us5693762；us6180370；us5859205；us5821337；us6054297；us6407213，其以引用的方式整体并入本文中)。人源化抗体最佳地还将包含免疫球蛋白恒定区(通常是人类免疫球蛋白的恒定区)的至少一部分，并且因此通常包含人类fc区。人源化抗体也可使用具有基因工程化的免疫系统的小鼠产生。roque等人,2004,《生物技术进展(biotechnol.prog.)》20:639-654，其以引用的方式整体并入本文中。用于人源化和重塑非人类抗体的多种技术和方法是所属领域熟知的(参见tsurushita和vasquez,2004,《单克隆抗体的人源化(humanizationofmonoclonalantibodies)》,《b细胞分子生物学(molecularbiologyofbcells)》,533-545,爱思唯尔科学公司(elsevierscience)(美国)和其中引用的参考文献，其以引用的方式整体并入本文中)。人源化方法包括但不限于以下文献中所述的方法：jones等人,1986,《自然》321:522-525；riechmann等人,1988,《自然》332:323-329；verhoeyen等人,1988,《科学》239:1534-1536；queen等人,1989,《美国国家科学院院刊》86:10029-33；he等人,1998,《免疫学杂志(j.immunol.)》160:1029-1035；carter等人,1992,《美国国家科学院院刊》89:4285-9；presta等人,1997,《癌症研究(cancerres.)》57(20):4593-9；gorman等人,1991,《美国国家科学院院刊》88:4181-4185；o'connor等人,1998,《蛋白质工程(proteineng)》11:321-8，所有这些文献以引用的方式整体并入本文中。降低非人类抗体可变区免疫原性的人源化或其它方法可以包括表面再塑方法，如例如roguska等人,1994,《美国国家科学院院刊》91:969-973中所述，其以引用的方式整体并入本文中。在某些实施方案中，本发明的抗体包含来自特定种系重链免疫球蛋白基因的重链可变区和/或来自特定种系轻链免疫球蛋白基因的轻链可变区。举例来说，这类抗体可包含人类抗体或由人类抗体组成，所述人类抗体包含作为特定种系序列“的产物”或“衍生自”特定种系序列的重链或轻链可变区。通过比较人类抗体的氨基酸序列与人类种系免疫球蛋白的氨基酸序列并选择序列与人类抗体序列最接近(即，最大％同一性)的人类种系免疫球蛋白，可以鉴定人类抗体是人类种系免疫球蛋白序列“的产物”或“衍生自”人类种系免疫球蛋白序列。由于例如天然存在的体细胞突变或有意引入定点突变，作为特定人类种系免疫球蛋白序列“的产物”或“衍生自”特定人类种系免疫球蛋白序列的人类抗体与种系序列相比可含有氨基酸差异。然而，人源化抗体通常与由人类种系免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列在氨基酸序列上具有至少90％相同，并且在与其它物种的种系免疫球蛋白氨基酸序列(例如，鼠种系序列)进行比较时，含有将抗体鉴定为源自人类序列的氨基酸残基。在某些情况下，人源化抗体可以与由种系免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列在氨基酸序列上至少95％、96％、97％、98％或99％，或甚至至少96％、97％、98％或99％相同。通常，源自特定人类种系序列的人源化抗体将显示出与由人类种系免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列不多于10-20个氨基酸差异(在引入本文中的任何偏斜变体、pi变体和消融变体之前；也就是说，在引入本发明的变体之前，变体的数量通常较低)。在某些情况下，相比于由生殖系免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列，人源化抗体可显示不超过5或甚至不超过4、3、2或1个氨基酸差异(同样，在引入本文的任何偏斜、pi和消融变体之前；也就是说，在引入本发明的变体之前，变体数目通常较低)。在一个实施方案中，亲本抗体已经发生亲和成熟，如所属领域中已知。基于结构的方法可用于人源化和亲和力成熟，例如us7,657,380中所述。基于选择的方法可以用于人源化和/或亲和成熟抗体可变区，包括但不限于以下文献中所述的方法：wu等人,1999,《分子生物学杂志》294:151-162；baca等人,1997,《生物化学杂志(j.biol.chem.)》272(16):10678-10684；rosok等人,1996,《生物化学杂志》271(37):22611-22618；rader等人,1998，《美国国家科学院院刊》95:8910-8915；krauss等人,2003,《蛋白质工程化(proteinengineering)》16(10):753-759，所有所述文献都以引用的方式整体并入本文中。其它人源化方法可涉及仅移植部分cdr，包括但不限于以下文献中所述的方法：ussn09/810,510；tan等人,2002,《免疫学杂志》169:1119-1125；depascalis等人,2002,《免疫学杂志》169:3076-3084，所有所述文献都以引用的方式整体并入本文中。

viii.本发明的有用实施方案

如所属领域技术人员将了解并且下文更充分地论述，本发明的靶向pd-1的il-15/rα-fc异源二聚体融合蛋白可以采用多种多样的构形，如图65a-65k中大体所描绘。图66、67、68、69a、69b、69c、70、71、72a、72b、73a、73b、74a、74b、75、76、126a-126d、127a-127d和128a-128l提供了示例性靶向pd-1的il-15/rα-fc融合蛋白的氨基酸序列。

本文提供了scil-15/rαxfab形式的靶向pd-1的il-15/rα-fc融合蛋白。在一些实施方案中，靶向pd-1的il-15/rα-fc融合蛋白包含：(a)第一单体，其从n端至c端包含：人il-15rα(寿司)结构域、结构域连接子、人成熟il-15变体、结构域连接子、和包含ch2-ch3的第一fc变体结构域；(b)第二单体，其从n至c端包含：重链，其包含vh-ch1-铰链-ch2-ch3，使得第二单体的ch2-ch3为第二fc变体结构域；(c)轻链，其包含vl-cl，使得vh和vl形成结合人pd-1的抗原结合结构域。在一些实施方案中，vh和vl选自由以下组成的对：来自xenp22553的1c11[pd-1]_h3l3、来自xenp25806的1c11[pd-1]_h3.234_l3.144、来自xenp25812的1c11[pd-1]_h3.240_l3.148、来自xenp25813的1c11[pd-1]_h3.241_l3.148、来自xenp25819的1c11[pd-1]_h3.241_l3.92、来自xenp26940的1c11[pd-1]_h3.303_l3.152、来自xenp28026的1c11[pd-1]_h3.329_l3.220和来自xenp28652的1c11[pd-1]_h3.328_l3.152。在一些实施方案中，图93a-93s和图94a-94ap中描绘了抗原结合结构域的vh和vl的序列以及相应的序列标识符。

在一些实施方案中，人il-15rα(寿司)结构域是seqidno：4。在一些实施方案中，人成熟il-15变体是seqidno：2。在一些实施方案中，人成熟il-15变体是具有氨基酸取代n4d/n65d的seqidno：2。在某些实施方案中，人成熟il-15变体是具有氨基酸取代d30n/n65d的seqidno：2。在一些实施方案中，人成熟il-15变体是具有氨基酸取代d30n/e64q/n65d的seqidno：2。

在一些实施方案中，scil-15/rαxfab形式的第一fc变体结构域包含氨基酸取代c220s、l368d/k370s、q295e/n384d/q418e/n421d和e233p/l234v/l235a/g236del/s267k及任选地m248l/n434s；第二fc变体结构域包含氨基酸取代s364k/e357q和e233p/l234v/l235a/g236del/s267k及任选地m248l/n434s。

在一些实施方案中，靶向pd-1的il-15/rα-fc融合蛋白包含：第一单体，其从n端至c端包含：seqidno：4的人il-15rα(寿司)结构域、结构域连接子、具有n4d/n65d取代的seqidno：2的人成熟il-15变体、以及包含氨基酸取代c220s、l368d/k370s、q295e/n384d/q418e/n421d、e233p/l234v/l235a/g236del/s267k及任选的m248l/n434s的第一个fc变体结构域；第二单体，其包括包含vh-ch1-铰链-ch2-ch3的重链，其中ch2-ch3是包含氨基酸取代s364k/e357q、e233p/l234v/l235a/g236del/s267k及任选地m248l/n434s的第二fc变体结构域；包含vl-cl的轻链，其中vh和vl来自xenp22553的1c11[pd-1]_h3l3。在一些实施方案中，靶向pd-1的il-15/rα-fc融合蛋白的vh和vl来自xenp25806的1c11[pd-1]_h3.234_l3.144。在一些实施方案中，靶向pd-1的il-15/rα-fc融合蛋白的vh和vl来自xenp25812的1c11[pd-1]_h3.240_l3.148。在一些实施方案中，靶向pd-1的il-15/rα-fc融合蛋白的vh来自xenp25813的1c11[pd-1]_h3.241_l3.148。在一些实施方案中，靶向pd-1的il-15/rα-fc融合蛋白的vh和vl来自xenp25819的1c11[pd-1]_h3.241_l3.92。在一些实施方案中，靶向pd-1的il-15/rα-fc融合蛋白的vh和vl来自xenp26940的1c11[pd-1]_h3.303_l3.152。在一些实施方案中，vh和vl来自xenp28026的1c11[pd-1]_h3.329_l3.220。在一些实施方案中，靶向pd-1的il-15/rα-fc融合蛋白的vh和vl来自xenp28652的1c11[pd-1]_h3.328_l3.152。如本领域的技术人员将理解，scfv的可变重链和轻链结构域的cdr“成对”出现，如将从序列标识别符和对应的图93a-93s和图94a-94ap显见的。在一些情况下，第一fc变体结构域包含ch2-ch3。在其他情况下，第一fc变体结构域包含铰链-ch2-ch3。在一些实施方案中，fc变体结构域(例如，第一和/或第二fc变体结构域)选自人igg1、igg2、igg3和igg4的fc结构域。在一些实施方案中，fc变体结构域选自人igg1、igg2和igg4的fc结构域。在一些实施方案中，fc变体结构域选自人igg1的fc结构域。

在其他实施方案中，靶向pd-1的il-15/rα-fc融合蛋白包含：第一单体，其从n端至c端包含：seqidno：4的人il-15rα(寿司)结构域、结构域连接子、具有d30n/n65d取代的seqidno：2的人成熟il-15变体、以及包含氨基酸取代c220s、l368d/k370s、q295e/n384d/q418e/n421d、e233p/l234v/l235a/g236del/s267k及任选的m248l/n434s的第一个fc变体结构域；第二单体，其包括包含vh-ch1-铰链-ch2-ch3的重链，其中ch2-ch3是包含氨基酸取代s364k/e357q、e233p/l234v/l235a/g236del/s267k及任选地m248l/n434s的第二fc变体结构域；包含vl-cl的轻链，其中靶向pd-1的il-15/rα-fc融合蛋白的vh和vl来自xenp22553的1c11[pd-1]_h3l3。在一些实施方案中，靶向pd-1的il-15/rα-fc融合蛋白的vh和vl来自xenp25806的1c11[pd-1]_h3.234_l3.144。在一些实施方案中，靶向pd-1的il-15/rα-fc融合蛋白的vh和vl来自xenp25812的1c11[pd-1]_h3.240_l3.148。在一些实施方案中，靶向pd-1的il-15/rα-fc融合蛋白的vh和vl来自xenp25813的1c11[pd-1]_h3.241_l3.148。在一些实施方案中，靶向pd-1的il-15/rα-fc融合蛋白的vh和vl来自xenp25819的1c11[pd-1]_h3.241_l3.92。在一些实施方案中，靶向pd-1的il-15/rα-fc融合蛋白的vh和vl来自xenp26940的1c11[pd-1]_h3.303_l3.152。在一些实施方案中，靶向pd-1的il-15/rα-fc融合蛋白的vh和vl来自xenp28026的1c11[pd-1]_h3.329_l3.220。在一些实施方案中，靶向pd-1的il-15/rα-fc融合蛋白的vh和vl来自xenp28652的1c11[pd-1]_h3.328_l3.152。如本领域的技术人员将理解，scfv的可变重链和轻链结构域的cdr“成对”出现，如将从序列标识别符和对应的图93a-93s和图94a-94ap显见的。在一些情况下，第一fc变体结构域包含ch2-ch3。在其他情况下，第一fc变体结构域包含铰链-ch2-ch3。在一些实施方案中，fc变体结构域(例如，第一和/或第二fc变体结构域)选自人igg1、igg2、igg3和igg4的fc结构域。在一些实施方案中，fc变体结构域选自人igg1、igg2和igg4的fc结构域。在一些实施方案中，fc变体结构域选自人igg1的fc结构域。

在一些实施方案中，靶向pd-1的il-15/rα-fc融合蛋白包含：第一单体，其从n端至c端包含：seqidno：4的人il-15rα(寿司)结构域、结构域连接子、具有d30n/e64q/n65d取代的seqidno：2的人成熟il-15变体、以及包含氨基酸取代c220s、l368d/k370s、q295e/n384d/q418e/n421d、e233p/l234v/l235a/g236del/s267k及任选的m248l/n434s的第一个fc变体结构域；第二单体，其包括包含vh-ch1-铰链-ch2-ch3的重链，其中ch2-ch3是包含氨基酸取代s364k/e357q、e233p/l234v/l235a/g236del/s267k及任选地m248l/n434s的第二fc变体结构域；包含vl-cl的轻链，其中靶向pd-1的il-15/rα-fc融合蛋白的vh和vl来自xenp22553的1c11[pd-1]_h3l3。在一些实施方案中，靶向pd-1的il-15/rα-fc融合蛋白的vh和vl来自xenp25806的1c11[pd-1]_h3.234_l3.144。在一些实施方案中，靶向pd-1的il-15/rα-fc融合蛋白的vh和vl来自xenp25812的1c11[pd-1]_h3.240_l3.148。在一些实施方案中，靶向pd-1的il-15/rα-fc融合蛋白的vh和vl来自xenp25813的1c11[pd-1]_h3.241_l3.148。在一些实施方案中，靶向pd-1的il-15/rα-fc融合蛋白的vh和vl来自xenp25819的1c11[pd-1]_h3.241_l3.92。在一些实施方案中，靶向pd-1的il-15/rα-fc融合蛋白的vh和vl来自xenp26940的1c11[pd-1]_h3.303_l3.152。在一些实施方案中，靶向pd-1的il-15/rα-fc融合蛋白的vh和vl来自xenp28026的1c11[pd-1]_h3.329_l3.220。在一些实施方案中，靶向pd-1的il-15/rα-fc融合蛋白的vh和vl来自xenp28652的1c11[pd-1]_h3.328_l3.152。如本领域的技术人员将理解，scfv的可变重链和轻链结构域的cdr“成对”出现，如将从序列标识别符和对应的图93a-93s和图94a-94ap显见的。在一些情况下，第一fc变体结构域包含ch2-ch3。在其他情况下，第一fc变体结构域包含铰链-ch2-ch3。在一些实施方案中，fc变体结构域(例如，第一和/或第二fc变体结构域)选自人igg1、igg2、igg3和igg4的fc结构域。在一些实施方案中，fc变体结构域选自人igg1、igg2和igg4的fc结构域。在一些实施方案中，fc变体结构域选自人igg1的fc结构域。

在一些实施方案中，在图126a-126d、图127a-127k、图128a-128l以及序列表的相应序列标识符和seqidnos中描绘了scil-15/rαx抗pd-1fab。

本文提供了scil-15/rαxscfv形式的靶向pd-1的il-15/rα-fc融合蛋白。在一些实施方案中，靶向pd-1的il-15/rα-fc融合蛋白包含：(a)第一单体，其从n端至c端包含：人il-15rα(寿司)结构域、结构域连接子、人成熟il-15变体、任选的结构域连接子和包含ch2-ch3的第一fc变体结构域；(b)第二单体，其从n端到c端包含：结合人pd-1的scfv结构域，使得scfv包含可变重结构域(vh)、scfv连接子和可变轻结构域(vl)(例如在某些情况下，scfv从n到c端包含：vh-scfv连接子-vl，或者在其他情况下，scfv从n到c端包含：vl-scfv连接子-vh)；以及第二fc变体结构域。在一些实施方案中，vh和vl选自由以下组成的对：来自xenp22553的1c11[pd-1]_h3l3、来自xenp25806的1c11[pd-1]_h3.234_l3.144、来自xenp25812的1c11[pd-1]_h3.240_l3.148、来自xenp25813的1c11[pd-1]_h3.241_l3.148、来自xenp25819的1c11[pd-1]_h3.241_l3.92、来自xenp26940的1c11[pd-1]_h3.303_l3.152、来自xenp28026的1c11[pd-1]_h3.329_l3.220和来自xenp28652的1c11[pd-1]_h3.328_l3.152。在一些实施方案中，图93a-93s和图94a-94ap中描绘了抗原结合结构域的vh和vl的序列以及相应的序列标识符。

在一些实施方案中，人il-15rα(寿司)结构域是seqidno：4。在一些实施方案中，人成熟il-15变体是seqidno：2。在一些实施方案中，人成熟il-15变体是具有氨基酸取代n4d/n65d的seqidno：2。在某些实施方案中，人成熟il-15变体是具有氨基酸取代d30n/n65d的seqidno：2。在一些实施方案中，人成熟il-15变体是具有氨基酸取代d30n/e64q/n65d的seqidno：2。

在一些实施方案中，scil-15/rαxscfv形式的第一fc变体结构域包含氨基酸取代c220s、l368d/k370s、q295e/n384d/q418e/n421d和e233p/l234v/l235a/g236del/s267k及任选地m248l/n434s；第二fc变体结构域包含氨基酸取代c220s、s364k/e357q和e233p/l234v/l235a/g236del/s267k及任选地m248l/n434s。

在特定实施方案中，靶向pd-1的il-15/rα-fc融合蛋白包含：第一单体，其从n端至c端包含：seqidno：4的人il-15rα(寿司)结构域、结构域连接子、seqidno：2的人成熟il-15变体、任选的结构域连接子、以及包含氨基酸取代c220s、l368d/k370s、q295e/n384d/q418e/n421d、e233p/l234v/l235a/g236del/s267k及任选的m248l/n434s的第一个fc变体结构域；和第二单体，其包括抗pd-1scfv和包含氨基酸取代c220s、s364k/e357q、e233p/l234v/l235a/g236del/s267k及任选地m248l/n434s的第二fc变体结构域。在一些实施方案中，抗pd-1scfv包含来自xenp22553的1c11[pd-1]_h3l3的vhcdr1、vhcd2、vhcdr3、vlcdr1、vlcdr2和vlcdr3的序列。在一些实施方案中，cdr来自xenp25806的1c11[pd-1]_h3.234_l3.144。在一些实施方案中，cdr来自xenp25812的1c11[pd-1]_h3.240_l3.148。在一些实施方案中，cdr来自xenp25813的1c11[pd-1]_h3.241_l3.148。在一些实施方案中，cdr来自xenp25819的1c11[pd-1]_h3.241_l3.92。在一些实施方案中，cdr来自xenp26940的1c11[pd-1]_h3.303_l3.152。在一些实施方案中，cdr来自xenp28026的1c11[pd-1]_h3.329_l3.220。在一些实施方案中，cdr来自xenp28652的1c11[pd-1]_h3.328_l3.152。如本领域的技术人员将理解，scfv的可变重链和轻链结构域的cdr“成对”出现，如将从序列标识别符显见的。在一些情况下，第一fc变体结构域包含ch2-ch3。在其他情况下，第一fc变体结构域包含铰链-ch2-ch3。在一些实施方案中，fc变体结构域(例如，第一和/或第二fc变体结构域)选自人igg1、igg2、igg3和igg4的fc结构域。在一些实施方案中，fc变体结构域选自人igg1、igg2和igg4的fc结构域。在一些实施方案中，fc变体结构域选自人igg1的fc结构域。

在一些实施方案中，靶向pd-1的il-15/rα-fc融合蛋白包含：第一单体，其从n端至c端包含：seqidno：4的人il-15rα(寿司)结构域、结构域连接子、具有n4d/n65d取代的seqidno：2的人成熟il-15变体、任选的结构域连接子、以及包含氨基酸取代c220s、l368d/k370s、q295e/n384d/q418e/n421d、e233p/l234v/l235a/g236del/s267k及任选的m248l/n434s的第一个fc变体结构域；和第二单体，其包括抗pd-1scfv和包含氨基酸取代c220s、s364k/e357q、e233p/l234v/l235a/g236del/s267k及任选地m248l/n434s的第二fc变体结构域。在一些实施方案中，抗pd-1scfv包含来自xenp22553的1c11[pd-1]_h3l3的vhcdr1、vhcd2、vhcdr3、vlcdr1、vlcdr2和vlcdr3的序列。在一些实施方案中，cdr来自xenp25806的1c11[pd-1]_h3.234_l3.144。在一些实施方案中，cdr来自xenp25812的1c11[pd-1]_h3.240_l3.148。在一些实施方案中，cdr来自xenp25813的1c11[pd-1]_h3.241_l3.148。在一些实施方案中，cdr来自xenp25819的1c11[pd-1]_h3.241_l3.92。在一些实施方案中，cdr来自xenp26940的1c11[pd-1]_h3.303_l3.152。在一些实施方案中，cdr来自xenp28026的1c11[pd-1]_h3.329_l3.220。在一些实施方案中，cdr来自xenp28652的1c11[pd-1]_h3.328_l3.152。如本领域的技术人员将理解，scfv的可变重链和轻链结构域的cdr“成对”出现，如将从序列标识别符显见的。在一些情况下，第一fc变体结构域包含ch2-ch3。在其他情况下，第一fc变体结构域包含铰链-ch2-ch3。在一些实施方案中，fc变体结构域(例如，第一和/或第二fc变体结构域)选自人igg1、igg2、igg3和igg4的fc结构域。在一些实施方案中，fc变体结构域选自人igg1、igg2和igg4的fc结构域。在一些实施方案中，fc变体结构域选自人igg1的fc结构域。

在一些实施方案中，靶向pd-1的il-15/rα-fc融合蛋白包含：第一单体，其从n端至c端包含：seqidno：4的人il-15rα(寿司)结构域、结构域连接子、具有d30n/n65d取代的seqidno：2的人成熟il-15变体、任选的结构域连接子、以及包含氨基酸取代c220s、l368d/k370s、q295e/n384d/q418e/n421d、e233p/l234v/l235a/g236del/s267k及任选的m248l/n434s的第一个fc变体结构域；和第二单体，其包括抗pd-1scfv和包含氨基酸取代c220s、s364k/e357q、e233p/l234v/l235a/g236del/s267k及任选地m248l/n434s的第二fc变体结构域。在一些实施方案中，抗pd-1scfv包含来自xenp22553的1c11[pd-1]_h3l3的vhcdr1、vhcd2、vhcdr3、vlcdr1、vlcdr2和vlcdr3的序列。在一些实施方案中，cdr来自xenp25806的1c11[pd-1]_h3.234_l3.144。在一些实施方案中，cdr来自xenp25812的1c11[pd-1]_h3.240_l3.148。在一些实施方案中，cdr来自xenp25813的1c11[pd-1]_h3.241_l3.148。在一些实施方案中，cdr来自xenp25819的1c11[pd-1]_h3.241_l3.92。在一些实施方案中，cdr来自xenp26940的1c11[pd-1]_h3.303_l3.152。在一些实施方案中，cdr来自xenp28026的1c11[pd-1]_h3.329_l3.220。在一些实施方案中，cdr来自xenp28652的1c11[pd-1]_h3.328_l3.152。如本领域的技术人员将理解，scfv的可变重链和轻链结构域的cdr“成对”出现，如将从序列标识别符显见的。在一些情况下，第一fc变体结构域包含ch2-ch3。在其他情况下，第一fc变体结构域包含铰链-ch2-ch3。在一些实施方案中，fc变体结构域(例如，第一和/或第二fc变体结构域)选自人igg1、igg2、igg3和igg4的fc结构域。在一些实施方案中，fc变体结构域选自人igg1、igg2和igg4的fc结构域。在一些实施方案中，fc变体结构域选自人igg1的fc结构域。

在特定实施方案中，靶向pd-1的il-15/rα-fc融合蛋白包含：第一单体，其从n端至c端包含：seqidno：4的人il-15rα(寿司)结构域、结构域连接子、具有d30n/e64q/n65d取代的seqidno：2的人成熟il-15变体、任选的结构域连接子、以及包含氨基酸取代c220s、l368d/k370s、q295e/n384d/q418e/n421d、e233p/l234v/l235a/g236del/s267k及任选的m248l/n434s的第一个fc变体结构域；和第二单体，其包括抗pd-1scfv和包含氨基酸取代c220s、s364k/e357q、e233p/l234v/l235a/g236del/s267k及任选地m248l/n434s的第二fc变体结构域。在一些实施方案中，抗pd-1scfv包含来自xenp22553的1c11[pd-1]_h3l3的vhcdr1、vhcd2、vhcdr3、vlcdr1、vlcdr2和vlcdr3的序列。在一些实施方案中，cdr来自xenp25806的1c11[pd-1]_h3.234_l3.144。在一些实施方案中，cdr来自xenp25812的1c11[pd-1]_h3.240_l3.148。在一些实施方案中，cdr来自xenp25813的1c11[pd-1]_h3.241_l3.148。在一些实施方案中，cdr来自xenp25819的1c11[pd-1]_h3.241_l3.92。在一些实施方案中，cdr来自xenp26940的1c11[pd-1]_h3.303_l3.152。在一些实施方案中，cdr来自xenp28026的1c11[pd-1]_h3.329_l3.220。在一些实施方案中，cdr来自xenp28652的1c11[pd-1]_h3.328_l3.152。如本领域的技术人员将理解，scfv的可变重链和轻链结构域的cdr“成对”出现，如将从序列标识别符显见的。在一些情况下，第一fc变体结构域包含ch2-ch3。在其他情况下，第一fc变体结构域包含铰链-ch2-ch3。在一些实施方案中，fc变体结构域(例如，第一和/或第二fc变体结构域)选自人igg1、igg2、igg3和igg4的fc结构域。在一些实施方案中，fc变体结构域选自人igg1、igg2和igg4的fc结构域。在一些实施方案中，fc变体结构域选自人igg1的fc结构域。

在一些实施方案中，将本发明的靶向pd-1的il-15/rα-fc融合蛋白施用于患者，例如患有癌症的人类患者。

在一些实施方案中，本文提供了一种核酸组合物，其包含编码本发明的第一单体的核酸和编码本发明的第二单体的核酸。

在一些实施方案中，本文提供了表达载体，其包含编码本发明的第一单体的核酸。在一些实施方案中，本文提供了表达载体，其包含编码本发明的第二单体的核酸。在一些实施方案中，本文提供了表达载体，其包含编码第一单体的核酸和编码第二单体的核酸。在一些实施方案中，宿主细胞包含本文所述的一种或多种表达载体。

在一些实施方案中，本文提供了一种核酸组合物，其包含编码本发明的第一单体的核酸、编码本发明的第二单体的核酸和编码轻链的核酸，使得靶向pd-1的il-15/rα-fc融合蛋白的vh和vl可以结合pd-1。

在一些实施方案中，本文提供了表达载体，其包含编码第一单体的核酸。在一些实施方案中，本文提供了表达载体，其包含编码第二单体的核酸。在一些实施方案中，本文提供了表达载体，其包含编码第一单体的核酸和编码第二单体的核酸。在一些实施方案中，本文提供了表达载体，其包含编码轻链的核酸，使得靶向pd-1的il-15/rα-fc融合蛋白的vh和vl可以结合pd-1。在一些实施方案中，本文提供了表达载体，其包含编码第一单体的核酸和编码轻链的核酸。在一些实施方案中，本文提供了表达载体，其包含编码第二单体的核酸和编码轻链的核酸。在一些实施方案中，本文提供了表达载体，其包含编码第一单体的核酸、编码第二单体的核酸和编码轻链的核酸。在一些实施方案中，本文提供了包含一种或多种本文描述的表达载体的宿主细胞。

本文提供了一种制备本文概述的靶向pd-1的il-15/rα-fc融合蛋白中的任一种的方法，包括：在诸如细胞培养条件的条件下培养宿主细胞，使得靶向pd-1的il-15/rα-fc融合蛋白被细胞表达，并回收该融合蛋白。

本文提供了一种治疗患者癌症的方法，其包括将靶向pd-1的il-15/rα-fc融合蛋白施用于患者。

ix.本发明的其他实施方案

如所属领域技术人员将了解并且下文更充分地论述，本发明的靶向pd-1的il-15/rα-fc异源二聚体融合蛋白可以采用多种多样的构形，如图65a-65k中大体所描绘。图66、67、68、69a、69b、69c、70、71、72a、72b、73a、73b、74a、74b、75、76、126a-126d、127a-127d和128a-128l提供了示例性靶向pd-1的il-15/rα-fc融合蛋白的氨基酸序列。

本发明提供了包含融合蛋白和抗体融合蛋白的靶向pd-1的il-15/rα-fc融合蛋白。融合蛋白包含第一蛋白结构域、第二蛋白结构域和第一fc结构域。在一些情况下，使用第一结构域连接子将第一蛋白结构域共价连接至第二蛋白结构域的n端，使用第二结构域连接子将第二蛋白结构域共价连接至第一fc结构域的n端，并且第一蛋白结构域包含il-15rα蛋白，第二蛋白结构域包含il-15蛋白。抗体融合蛋白包含pd-1抗原结合结构域和第二fc结构域，使得pd-1抗原结合结构域共价连接至第二fc结构域的n末端，并且pd-1抗原结合结构域是单链可变片段(scfv)或fab片段。在一些实施方案中，第一和第二fc结构域根据eu编号具有一组选自以下的氨基酸取代：s267k/l368d/k370s:s267k/ls364k/e357q；s364k/e357q:l368d/k370s；l368d/k370s:s364k；l368e/k370s:s364k；t411e/k360e/q362e:d401k；l368d/k370s:s364k/e357l；l368d/k370s:s364k/e357q；和k370s:s364k/e357q。在一些情况下，根据eu编号，第一和/或第二fc结构域具有包含q295e/n384d/q418e/n421d的另外一组氨基酸取代。在一些情况下，根据eu编号，第一fc结构域和/或第二fc结构域具有另外一组由以下组成的氨基酸取代：g236r/l328r、e233p/l234v/l235a/g236del/s239k、e233p/l234v/l235a/g236del/s267k、e233p/l234v/l235a/g236del/s239k/a327g、e233p/l234v/l235a/g236del/s267k/a327g和e233p/l234v/l235a/g236del。

在一些实施方案中，il-15蛋白具有选自全长人il-15和成熟人il-15的多肽序列，并且il-15rα蛋白具有选自全长人il-15rα和人il-15rα的寿司结构域的多肽序列。fc融合蛋白的il-15蛋白可具有1、2、3、4、5、6、7、8或9个氨基酸取代。在一些实施方案中，fc融合蛋白的人类il-15蛋白具有氨基酸取代n4d。在一些实施方案中，fc融合蛋白的人类il-15蛋白具有氨基酸取代n65d。在一些实施方案中，fc融合蛋白的人类il-15蛋白具有氨基酸取代n4d/n65d。在一些实施方案中，fc融合蛋白的人类il-15蛋白具有氨基酸取代d30n/e64q/n65d。il-15蛋白和il-15rα蛋白可以具有一组选自以下的氨基酸取代：分别地，e87c:d96/p97/c98；e87c:d96/c97/a98；v49c:s40c；l52c:s40c；e89c:k34c；q48c:g38c；e53c:l42c；c42s:a37c；和l45c:a37c。

在一些实施方案中，第一蛋白结构域直接共价连接至第一fc结构域的n末端，而不使用第一结构域连接子，和/或第二蛋白结构域直接共价连接至第二fc结构域的n末端，而不使用第二结构域连接子。

在一些实施方案中，pd-1抗原结合结构域的vh和vl选自由以下组成的对：来自xenp22553的1c11[pd-1]_h3l3、来自xenp25806的1c11[pd-1]_h3.234_l3.144、来自xenp25812的1c11[pd-1]_h3.240_l3.148、来自xenp25813的1c11[pd-1]_h3.241_l3.148、来自xenp25819的1c11[pd-1]_h3.241_l3.92、来自xenp26940的1c11[pd-1]_h3.303_l3.152、来自xenp28026的1c11[pd-1]_h3.329_l3.220和来自xenp28652的1c11[pd-1]_h3.328_l3.152。在一些实施方案中，pd-1抗原结合结构域的vhcdr1、vhcd2、vhcdr3、vlcdr1、vlcdr2和vlcdr3选自由以下组成的组的cdr：来自xenp22553的1c11[pd-1]_h3l3、来自xenp25806的1c11[pd-1]_h3.234_l3.144、来自xenp25812的1c11[pd-1]_h3.240_l3.148、来自xenp25813的1c11[pd-1]_h3.241_l3.148、来自xenp25819的1c11[pd-1]_h3.241_l3.92、来自xenp26940的1c11[pd-1]_h3.303_l3.152、来自xenp28026的1c11[pd-1]_h3.329_l3.220和来自xenp28652的1c11[pd-1]_h3.328_l3.152。在一些实施方案中，vhcdr1、vhcd2和vhcdr3的序列选自图95a-95j中描绘的序列和相应的序列标识符。在一些实施方案中，vhcdr1、vhcd2和vhcdr3的序列选自图96a-96f中描绘的序列和相应的序列标识符。

在一些实施方案中，靶向pd-1的il-15/rα-fc融合蛋白包含通过与异源二聚体fc多肽的第一fc结构域的n端融合的可变长度连接子与il-15蛋白融合的il-15rα(寿司)蛋白，和与异源二聚体fc多肽的第二fc结构域的n端融合的抗pd-1scfv(参见“scil-15/rαxscfv”形式和图65a)。在某些情况下，靶向pd-1的il-15/rα-fc融合蛋白是xenp21480。在某些情况下，靶向pd-1的il-15/rα-fc融合蛋白是xenp21480的变体，其在每个fc单体上包含氨基酸取代m428l/n434s。

在一些实施方案中，靶向pd-1的il-15/rα-fc融合蛋白包含通过与异源二聚体fc多肽的第一fc结构域是n端融合的可变长度连接子与il-15蛋白融合的il-15rα(寿司)蛋白，和与异源二聚体fc多肽的第二fc结构域的n端融合的抗pd-1抗体的可变重链(vh)。分别转染(例如引入)抗pd-1抗体的相应的可变轻链(vl)，并与融合到异源二聚体fc多肽的vh形成抗pd-1fab(参见“scil-15/rαxfab”形式和图65d)。在一些情况下，靶向pd-1的il-15/rα-fc融合蛋白选自xenp22022、xenp25849、xenp24535、xenp24536、xenp25850和xenp25937。

在一些实施方案中，靶向pd-1的il-15/rα-fc融合蛋白包含与异源二聚体fc多肽的第一fc结构域的n端融合的抗pd-1抗体的可变重链(vh)，和il-15rα(寿司)蛋白，该蛋白与异源二聚体fc的第二fc结构域的n端融合。可以分别转染抗pd-1抗体的相应的可变轻链(vl)，并与融合到异源二聚体fc多肽的vh形成fab。可以分别转染(例如引入)il-15蛋白，并与异源二聚体fc多肽融合的il-15rα(寿司)蛋白形成非共价il-15/rα复合物(见“fabxncil-15/rα”形式和图65e)。在某些情况下，靶向pd-1的il-15/rα-fc融合蛋白选自xenp22112。

在一些实施方案中，靶向pd-1的il-15/rα-fc融合蛋白包含与异源二聚体fc多肽的第一fc结构域的n端融合的抗pd-1抗体的可变重链(vh)，和il-15rα(寿司)蛋白，该蛋白包含一个或多个与异源二聚体fc的第二fc结构域的n端融合的工程化的半胱氨酸取代。可以分别转染(例如引入)抗pd-1抗体的相应的可变轻链(vl)，并与融合到异源二聚体fc多肽的vh形成fab。可以分别转染(例如引入)包含一个或多个工程化半胱氨酸取代的il-15蛋白，并且il-15/rα复合物通过和与异二聚体fc多肽融合的il-15rα(寿司)蛋白的二硫键形成(参见“dsil-15/rαxfab”形式和图65f)。在一些情况下，靶向pd-1的il-15/rα-fc融合蛋白选自xenp22641。

在某些实施方案中，靶向pd-1的il-15/rα-fc融合蛋白包含与异源二聚体fc多肽的第一fc结构域的n端融合的抗pd-1抗体的第一可变重链(vh)、与异二聚体fc多肽的第二fc结构域的n端融合的抗pd-1抗体的第二可变重链(vh)、以及il-15rα(寿司)蛋白，该蛋白与异源二聚体fc区的第一fc结构域或第二fc结构域的c端融合。可以转染(例如引入)抗pd-1抗体的相应可变轻链(vl)以形成具有抗pd-1抗体的第一可变重链(vh)的第一fab和具有异源二聚体fc多肽的抗pd-1抗体的第二可变重链(vh)的第二fab。可以分别转染(例如引入)il-15蛋白，并与异源二聚体fc多肽融合的il-15rα(寿司)蛋白形成非共价il-15/rα复合物(见“mabxncil-15/rα”形式和图65h)。在一些情况下，靶向pd-1的il-15/rα-fc融合蛋白选自xenp22642和xenp22643。

在某些实施方案中，靶向pd-1的il-15/rα-fc融合蛋白包含与异源二聚体fc多肽的第一fc结构域的n端融合的抗pd-1抗体的第一可变重链(vh)、与异二聚体fc多肽的第二fc结构域的n端融合的抗pd-1抗体的第二可变重链(vh)、以及il-15rα(寿司)蛋白，该蛋白包含一个或多个工程改造的半胱氨酸取代，该取代与异源二聚体fc区的第一fc结构域或第二fc结构域的c端融合。可以转染(例如引入)抗pd-1抗体的相应可变轻链(vl)以形成具有抗pd-1抗体的第一可变重链(vh)的第一fab和具有异源二聚体fc多肽的抗pd-1抗体的第二可变重链(vh)的第二fab。可以分别转染(例如引入)包含一个或多个工程化半胱氨酸取代的il-15蛋白，并且il-15/rα复合物通过和与异二聚体fc多肽融合的il-15rα(寿司)蛋白的二硫键形成(参见“mabxdsil-15/rα”形式和图65h)。在一些情况下，靶向pd-1的il-15/rα-fc融合蛋白选自xenp22644和xenp22645。

还提供了编码本文所述的靶向pd-1的il-15/rα-fc融合蛋白的核酸组合物。在一些情况下，表达载体包含一种或多种本文所述的核酸组合物。在一些实施方案中，提供了包含本文概述的一种或两种表达载体的宿主细胞。

本文提供了可用作靶向pd-1的il-15/rα-fc融合蛋白的pd-1靶向臂的pd-1抗原结合结构域(pd-1adb)或抗pd-1抗体的示例性实施方案(参见例如实施例1)。

本文提供了靶向pd-1的il-15/rα-fc融合蛋白，其具有il-15蛋白的一个或多个工程化氨基酸取代。在一些实施方案中，靶向pd-1的il-15/rα-fc融合蛋白在il-15/rα界面上还包括一个或多个工程化的半胱氨酸修饰(参见例如实施例2)。此类靶向pd-1的il-15/rα-fc融合蛋白可诱导或促进免疫细胞的增殖，包括nk细胞、cd8⁺t细胞和cd4⁺t细胞。值得注意的是，在il-15fc侧没有连接子(例如，仅铰链区)的含有il-15/rα-fc的融合蛋白表现出较弱的增殖活性。

本文提供了靶向pd-1的il-15/rα-fc融合蛋白，其具有较低的效力、增加的药代动力学和/或延长的血清半衰期。与亲本构建体相比，本文所述的靶向pd-1的il-15/rα-fc融合蛋白经工程改造以降低其效力(参见实施例2，以及附图，例如但不限于图44a-44c、45a-45d、47a-47b、51a-51c、52、53a-53c等)。在一些实施方案中，将一个或多个氨基酸取代引入il-15/rα复合物中和/或异源二聚体fc融合蛋白的fc结构域中。在一些实施方案中，与对照构建体(例如，亲本构建体)相比，具有降低的效力的靶向pd-1的il-15/rα-fc融合蛋白具有显著更长的血清半衰期。在某些实施方案中，血清半衰期增加了1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍、25倍或更多。

本文提供了与经工程化可降低效力的对照scil-15/rα-fc异二聚体fc融合蛋白和抗pd-1抗体的联合疗法相比，在动物模型(例如，人pbmc移植的nsg小鼠)中增强gvhd的靶向pd-1的il-15/rα-fc融合蛋白。与il-15和pd-1阻断剂的组合相比，示例性靶向pd-1的il-15/rα-fc融合蛋白的施用产生了更大的作用。

本文所述的靶向pd-1的il-15/rα-fc融合蛋白可在免疫细胞中诱导stat5磷酸化，所述免疫细胞包括但不限于活化的淋巴细胞、活化的t细胞(例如，活化的cd4+t细胞和活化的cd8+细胞)和活化的肿瘤浸润淋巴细胞。

在一些实施方案中，靶向pd-1的il-15/rα异源二聚体fc融合蛋白选自xenp22022、xenp25849、xenp24535、xenp24536、xenp25850和xenp25937。在某些实施方案中，靶向pd-1的il-15/rα-fc融合蛋白选自xenp25850和xenp25937。

在一些方面，本文提供了药物组合物，其包含选自xenp22022、xenp25849、xenp24535、xenp24536、xenp25850和xenp25937的靶向pd-1的il-15/rα异源二聚体fc融合蛋白；和药学上可接受的载体。在一些实施方案中，靶向pd-1的il-15/rα异源二聚体fc融合蛋白选自xenp25850和xenp25937。

在其他方面，本文提供了药物组合物，其包含本文所述的靶向pd-1的il-15/rα异源二聚体fc融合蛋白中的任一种和药学上可接受的载体。

在一些方面，本文提供了一种在有需要的患者中治疗癌症的方法，包括施用治疗有效量的本文所述的任何一种靶向pd-1的il-15rα异二聚体fc融合蛋白或本文所述的任一种药物组合物至所述患者。

在一些实施方案中，该方法还包括施用治疗有效量的检查点阻断抗体。在一些实施方案中，检查点阻断抗体选自抗pd-1抗体、抗pd-l1抗体、抗tim3抗体、抗tigit抗体、抗lag3抗体和抗ctla-4抗体。在某些实施方案中，抗pd-1抗体是纳武单抗、派姆单抗或匹地珠单抗。在特定实施方案中，抗pd-l1抗体是阿特珠单抗、阿维鲁单抗或杜巴单抗。

x.本发明的核酸

本发明进一步提供了编码本发明的靶向pd-1的il-15/rα异源二聚体fc融合蛋白的核酸组合物(或者，在单体fc结构域蛋白的情况下，也提供编码那些的核酸)。

如所属领域技术人员将理解，核酸组合物将取决于靶向pd-1的il-15/rα-fc异源二聚体融合蛋白的形式。因此，例如，当形式需要三个氨基酸序列时，可以将三个核酸序列并入一个或多个表达载体中以用于表达。类似地，一些形式仅需要两个核酸；再次，它们可以被放入一个或两个表达载体中。

如本领域已知的，对本发明的成分进行编码的核酸可以并入到如本领域已知并且取决于用于产生本发明的靶向pd-1的il-15/rαfc融合蛋白的宿主细胞的表达载体中。通常，核酸可操作地连接到任何数量的调节元件(启动子、复制起点、可选择标记、核糖体结合位点、诱导剂等)。表达载体可以是染色体外或整合载体。

随后使本发明的核酸和/或表达载体在任何数目的不同类型的如所属领域中熟知的宿主细胞(包含哺乳动物、细菌、酵母、昆虫和/或真菌细胞)中转化，在许多实施方案中，适用哺乳动物细胞(例如cho细胞)。

在一些实施方案中，如果取决于格式适用的话，对每个单体或靶向pd-1的il-15/rα-fc融合蛋白的组分进行编码的核酸通常在不同或相同的启动子对照条件下各自包含在单个表达载体内。在特别用于本发明的实施方案中，这两个或这三个核酸中的每个核酸包含在不同表达载体上。

通过孵育包括如本领域众所周知的一个或多个表达载体的宿主细胞来制备本发明的靶向pd-1的il-15/rα异源二聚体fc融合蛋白。一旦产生，就进行传统的融合蛋白或抗体纯化步骤，包含离子交换色谱法步骤。如本文所讨论，使两种单体的pi相差至少0.5可以允许通过离子交换色谱或等电聚焦或对等电点敏感的其它方法进行分离。也就是说，包含改变每个单体的等电点(pi)的pi取代使得每个单体具有不同的pi并且异源二聚体也具有不同的pi，从而促进异源二聚体的等电纯化(例如，阴离子交换柱、阳离子交换柱)。这些取代还有助于确定和监测纯化后任何污染的同源二聚体(例如，ief凝胶、cief和分析iex柱)。

xi.靶向pd-1的il-15/rα-fc融合蛋白的生物学和生化功能

通常，以本文所述的多种方式，将本发明的靶向pd-1的il-15/rα-fc异二聚体fc融合蛋白施用于患有癌症的患者，并评估功效。因此，虽然可以进行标准的功效分析，如癌症负荷、肿瘤大小、转移的存在或程度的评估等，但也可以基于免疫状态评估来评定免疫肿瘤学治疗。这可以通过多种方式完成，包括体外和体内分析。举例来说，可以与“旧式(oldfashioned)”测量一起评估免疫状态变化(例如，在ipi处理后icos+cd4+t细胞的存在)，“旧式”测量如肿瘤负荷、大小、浸润性、ln参与、转移等。因此，可以评估以下中的任一个或全部：pvrig对cd4⁺t细胞活化或增殖、cd8⁺t(ctl)细胞活化或增殖、cd8⁺t细胞介导的细胞毒性活性和/或ctl介导的细胞耗竭、nk细胞活性和nk介导的细胞耗竭的抑制作用；pvrig对treg细胞分化和增殖和treg或骨髓来源的抑制细胞(mdsc)介导的免疫抑制或免疫耐受的增强作用；和/或pvrig对通过免疫细胞产生的促炎性细胞因子的影响，例如通过t细胞或其它免疫细胞产生的il-2、ifn-γ或tnf-α。

在一些实施方案中，通过使用例如cfse稀释法、免疫效应细胞的ki67细胞内染色以及³h-胸苷并入法评估免疫细胞增殖来评定治疗。

在一些实施方案中，通过评估基因表达的增加或活化相关标志物的蛋白质含量的增加来评定处理，所述标志物包括以下中的一个或多个：cd25、cd69、cd137、icos、pd1、gitr、ox40以及通过cd107a的表面表达测量的细胞脱粒。

通常，如本领域已知的那样进行基因表达分析。

一般来说，还如本领域中已知类似地进行蛋白表达测量。

在一些实施方案中，通过评估众多细胞参数来评定通过目标细胞活力检测测量的细胞毒性活性，从而评定处理，所述细胞参数，如酶活性(包含蛋白酶活性)、细胞膜渗透性、细胞粘附、atp产生、辅酶产生以及核苷酸吸收活性。这些分析的具体实例包括但不限于台盼蓝(trypanblue)或pi染色、⁵¹cr或³⁵s释放法、ldh活性、mtt和/或wst分析、钙黄绿素-am分析、基于发光的分析以及其它分析。

在一些实施方案中，通过评定由细胞因子产生测量的t细胞活性，使用细胞因子，使用众所周知的技术，细胞内测量孵育物上清液来评定治疗，所述细胞因子包括但不限于：ifnγ、tnfα、gm-csf、il2、il6、il4、il5、il10、il13。

因此，可以使用评估以下中的一个或多个的分析来评定治疗：(i)免疫反应的增加；(ii)αβ和/或γδt细胞活化的增加；(iii)细胞毒性t细胞活性的增加；(iv)nk和/或nkt细胞活性的增加；(v)αβ和/或γδt细胞抑制的缓解；(vi)促炎性细胞因子分泌的增加；(vii)il-2分泌的增加；(viii)干扰素γ产生的增加；(ix)th1反应的增加；(x)th2反应的减少；(xi)减少或消除调节性t细胞(treg)中的至少一种的细胞数量和/或活性。

a.测量功效的测定

在一些实施方案中，使用如本领域已知的混合淋巴细胞反应(mlr)分析来评定t细胞活化。活性增加指示免疫刺激活性。适当的活性增加概述如下。

在一个实施方案中，信号传导通路分析测量免疫反应的增加或减少，如例如通过不同因子的磷酸化或去磷酸化或通过测量其它翻译后修饰所测量。活性增加指示免疫刺激活性。适当的活性增加概述如下。

在一个实施方案中，信号传导途径分析测量αβ和/或γδt细胞活化的增加或减少，如例如通过细胞因子分泌或通过增殖或通过如例如cd137、cd107a、pd-1等活化标志物的表达变化所测量。活性增加指示免疫刺激活性。适当的活性增加概述如下。

在一个实施方案中，信号传导通路分析测量细胞毒性t细胞活性的增加或减少，如例如通过直接杀伤靶细胞(例如癌细胞)或通过细胞因子分泌或通过增殖或通过如例如cd137、cd107a、pd-1等活化标志物的表达变化所测量。活性增加指示免疫刺激活性。适当的活性增加概述如下。

在一个实施方案中，信号传导途径分析测量nk和/或nkt细胞活性的增加或减少，如通过直接杀伤靶细胞(例如癌细胞)或通过细胞因子分泌或通过如例如cd107a等活化标志物的表达变化所测量。活性增加指示免疫刺激活性。适当的活性增加概述如下。

在一个实施方案中，信号传导通路分析测量αβ和/或γδt细胞抑制的增加或减少，如例如通过细胞因子分泌或通过增殖或通过如例如cd137、cd107a、pd-1等活化标志物的表达变化所测量。活性增加指示免疫刺激活性。适当的活性增加概述如下。

在一个实施方案中，信号传导途径分析测量促炎性细胞因子分泌的增加或减少，如例如通过elisa或通过luminex或通过基于珠粒的多重方法或通过细胞内染色和facs分析或通过alispot等所测量。活性增加指示免疫刺激活性。适当的活性增加概述如下。

在一个实施方案中，信号传导途径分析测量il-2分泌的增加或减少，如例如通过elisa或通过luminex或通过基于珠粒的多重方法或通过细胞内染色和facs分析或通过alispot等所测量。活性增加指示免疫刺激活性。适当的活性增加概述如下。

在一个实施方案中，信号传导途径分析测量干扰素γ产生的增加或减少，如例如通过elisa或通过luminex或通过基于珠粒的多重方法或通过细胞内染色和facs分析或通过alispot等所测量。活性增加指示免疫刺激活性。适当的活性增加概述如下。

在一个实施方案中，信号传导途径分析测量th1反应的增加或减少，如例如通过细胞因子分泌或通过活化标志物的表达变化所测量。活性增加指示免疫刺激活性。适当的活性增加概述如下。

在一个实施方案中，信号传导途径分析测量th2反应的增加或减少，如例如通过细胞因子分泌或通过活化标志物的表达变化所测量。活性增加指示免疫刺激活性。适当的活性增加概述如下。

在一个实施方案中，信号传导途径分析测量调节性t细胞(treg)中的至少一种的细胞数量和/或活性的增加或减少，如例如通过流式细胞术或通过ihc所测量。反应减少指示免疫刺激活性。如下所概述，适当的减少与增加相同。

在一个实施方案中，信号传导途径分析测量m2巨噬细胞细胞数量的增加或减少，如例如通过流式细胞术或通过ihc所测量。反应减少指示免疫刺激活性。如下所概述，适当的减少与增加相同。

在一个实施方案中，信号传导途径分析测量m2巨噬细胞促肿瘤发生活性的增加或减少，如例如通过细胞因子分泌或通过活化标志物的表达变化所测量。反应减少指示免疫刺激活性。如下所概述，适当的减少与增加相同。

在一个实施方案中，信号传导途径分析测量n2嗜中性粒细胞增量的增加或减少，如例如通过流式细胞术或通过ihc所测量。反应减少指示免疫刺激活性。如下所概述，适当的减少与增加相同。

在一个实施方案中，信号传导途径分析测量n2嗜中性粒细胞促肿瘤发生活性的增加或减少，如例如通过细胞因子分泌或通过活化标志物的表达变化所测量。反应减少指示免疫刺激活性。如下所概述，适当的减少与增加相同。

在一个实施方案中，信号传导通路分析测量t细胞活化抑制的增加或减少，如例如通过细胞因子分泌或通过增殖或通过如例如cd137、cd107a、pd1等活化标志物的表达变化所测量。活性增加指示免疫刺激活性。适当的活性增加概述如下。

在一个实施方案中，信号传导通路分析测量ctl活化抑制的增加或减少，如例如通过直接杀伤靶细胞(例如癌细胞)或通过细胞因子分泌或通过增殖或通过如例如cd137、cd107a、pd1等活化标志物的表达变化所测量。活性增加指示免疫刺激活性。适当的活性增加概述如下。

在一个实施方案中，信号传导途径分析测量αβ和/或γδt细胞耗竭的增加或减少，如例如通过活化标志物的表达变化所测量。反应减少指示免疫刺激活性。如下所概述，适当的减少与增加相同。

在一个实施方案中，信号传导通路分析测量αβ和/或γδt细胞反应的增加或减少，如例如通过细胞因子分泌或通过增殖或通过如例如cd137、cd107a、pd1等活化标志物的表达变化所测量。活性增加指示免疫刺激活性。适当的活性增加概述如下。

在一个实施方案中，信号传导途径分析测量抗原特异性记忆反应的刺激的增加或减少，如例如通过细胞因子分泌或通过增殖或通过如例如cd45ra、ccr7等活化标志物的表达变化所测量。活性增加指示免疫刺激活性。适当的活性增加概述如下。

在一个实施方案中，信号传导途径分析测量癌细胞的细胞凋亡或裂解的增加或减少，如例如通过细胞毒性分析(如例如mtt、cr释放、calcineam)或通过基于流式细胞仪的分析(如例如cfse稀释或碘化丙啶染色等)所测量。活性增加指示免疫刺激活性。适当的活性增加概述如下。

在一个实施方案中，信号传导途径分析测量对癌细胞的细胞毒性或细胞抑制作用的刺激的增加或减少，如例如通过细胞毒性分析(如例如mtt、cr释放、calcineam)或通过基于流式细胞仪的分析(如例如cfse稀释或碘化丙啶染色等)所测量。活性增加指示免疫刺激活性。适当的活性增加概述如下。

在一个实施方案中，信号传导途径分析测量癌细胞的直接杀伤的增加或减少，如例如通过细胞毒性分析(如例如mtt、cr释放、calcineam)或通过基于流式细胞仪的分析(如例如cfse稀释或碘化丙啶染色等)所测量。活性增加指示免疫刺激活性。适当的活性增加概述如下。

在一个实施方案中，信号传导途径分析测量th17活性的增加或减小，如例如通过细胞因子分泌或通过增殖或通过活化标志物的表达变化所测量。活性增加指示免疫刺激活性。适当的活性增加概述如下。

在一个实施方案中，信号传导途径分析测量补体依赖性细胞毒性和/或抗体依赖性细胞介导的细胞毒性的诱导的增加或减少，如例如通过细胞毒性分析(如例如mtt、cr释放、calcineam)或通过基于流式细胞仪的分析(如例如cfse稀释或碘化丙啶染色等)所测量。活性增加指示免疫刺激活性。适当的活性增加概述如下。

在一个实施方案中，例如通过直接杀伤靶细胞(例如癌细胞)或通过细胞因子分泌或通过增殖或活化标志物(例如cd137、cd107a、pd1等)的表达变化来测量t细胞活化。对于t细胞，增殖、细胞表面活化标志物(例如cd25、cd69、cd137、pd1)、细胞毒性(杀伤靶细胞的能力)和细胞因子产生(例如il-2、il-4、il-6、ifnγ、tnf-a、il-10、il-17a)的增加将指示免疫调节，这将符合癌细胞的杀伤增强。

在一个实施方案中，例如通过直接杀死靶细胞(例如癌细胞)或通过细胞因子分泌或通过活化标志物(例如cd107a等)的表达变化来测量nk细胞活化。对于nk细胞，增殖、细胞毒性(杀死靶细胞并增加cd107a、颗粒酶和穿孔素表达的能力)、细胞因子产生(例如ifnγ和tnf)和细胞表面受体表达(例如cd25)的增加将指示免疫调节，这将符合癌细胞的杀伤增强。

在一个实施方案中，例如通过细胞因子分泌或通过增殖或通过活化标志物的表达变化来测量γδt细胞活化。

在一个实施方案中，例如通过细胞因子分泌或通过活化标志物的表达变化来测量th1细胞活化。

相比参考样品或对照样品例如不含本发明的抗pvrig抗体的测试样品中的信号，活性或反应的适当增加(或如上所述适当减少)是10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或98％至99％的增加。类似地，与参考或对照样品相比，增加至少一倍、两倍、三倍、四倍或五倍显示功效。

xii.检查点阻断抗体

在一些实施方案中，将本文所述的本发明的靶向pd-1的il-15/rα-fc融合蛋白与其他治疗剂组合，所述其他治疗剂包括检查点阻断抗体，例如但不限于pd-1抑制剂、tim3抑制剂、ctla4抑制剂、pd-l1抑制剂、tigit抑制剂、lag3抑制剂或其组合。

a.抗pd1抗体

在一些实施方案中，本文所述的靶向pd-1的il-15/rα-fc融合蛋白可以与检查点阻断抗体例如抗pd-1抗体联合施用给患有癌症的受试者。在某些情况下，抗pd-1抗体包括xenp13432(一种基于纳武单抗的二价抗pd-1mab，期具有消融的效应子功能；xenp13432的氨基酸序列如图86所示)。在其他情况下，抗pd-1抗体包括xenp25951(基于来自xenp25850的pd-1靶向臂的单价抗pd-1fab-fc；图87描绘了xenp25951的氨基酸序列。

示例性的非限制性抗pd-1抗体分子公开于2015年7月30日公开的标题为“pd-1的抗体分子及其用途”的us2015/0210769中，其通过引用整体并入本文。

在一个实施方案中，抗pd-1抗体分子包括至少一个或两个重链可变结构域(任选地包括恒定区)、至少一个或两个轻链可变结构域(任选地包括恒定区)或两者，包含bap049-克隆-a、bap049-克隆-b、bap049-克隆-c、bap049-克隆-d或bap049-克隆-e的氨基酸序列；或如us2015/0210769的表1中所述，或由表1中的核苷酸序列编码；或与任何上述序列基本相同的序列(例如，至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高的同一性)。抗pd-1抗体分子任选地包含来自重链、轻链或两者的前导序列，如us2015/0210769的表4中所示；或与其基本相同的序列。

在另一个实施方案中，抗pd-1抗体分子包括来自本文所述抗体的重链可变区和/或轻链可变区的至少一个、两个或三个互补决定区(cdr)，例如，抗体选自bap049-hum01、bap049-hum02、bap049-hum03、bap049-hum04、bap049-hum05、bap049-hum06、bap049-hum07、bap049-hum08、bap049-hum09、bap049-hum10、bap049-hum11、bap049-hum12、bap049-hum13、bap049-hum14、bap049-hum15、bap049-hum16、bap049-克隆-a、bap049-克隆-b、bap049-克隆-c、bap049-克隆-d或bap049-克隆-e的任一种；或如表1中所述，或由表1中的核苷酸序列编码；或与任何上述序列基本相同的序列(例如，至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高的同一性)。

在又一个实施方案中，抗pd-1抗体分子包含来自重链可变区的至少一个、两个或三个cdr(或统称所有cdr)，所述重链可变区包含us2015/0210769的表1中所示的氨基酸序列，或由表1中所示的核苷酸序列编码。在一个实施方案中，相对于表1中所示的氨基酸序列或由表1所示的核苷酸序列编码，一个或多个cdr(或全部所有cdr)具有一、二、三、四、五、六个或更多个改变，例如氨基酸取代或缺失。

在又一个实施方案中，抗pd-1抗体分子包含来自轻链可变区的至少一个、两个或三个cdr(或统称所有cdr)，所述轻链可变区包含us2015/0210769的表1中所示的氨基酸序列，或由表1中所示的核苷酸序列编码。在一个实施方案中，相对于表1中所示的氨基酸序列或由表1所示的核苷酸序列编码，一个或多个cdr(或全部所有cdr)具有一、二、三、四、五、六个或更多个改变，例如氨基酸取代或缺失。在某些实施方案中，抗pd-1抗体分子在轻链cdr中包括取代，例如在轻链的cdr1、cdr2和/或cdr3中的一个或多个取代。在一个实施方案中，抗pd-1抗体分子在轻链可变区的102位的轻链cdr3中包括取代，例如在根据表1的轻可变区的102位的半胱氨酸取代为酪氨酸或半胱氨酸取代为丝氨酸残基(例如，对于鼠或嵌合的、未修饰的，为seqidno：16或24；或对于修饰的序列，为seqidno：34、42、46、54、58、62、66、70、74、或78的任一个)。

在又一个实施方案中，抗pd-1抗体分子包含来自重和轻链可变区的至少一个、两个、三个、四个、五个或六个cdr(或统称所有cdr)，所述重和轻链可变区包含us2015/0210769的表1中所示的氨基酸序列，或由表1中所示的核苷酸序列编码。在一个实施方案中，相对于表1中所示的氨基酸序列或由表1的核苷酸序列编码，一个或多个cdr(或全部所有cdr)具有一、二、三、四、五、六个或更多个改变，例如氨基酸取代或缺失。

在一个实施方案中，抗pd-1抗体分子包括：

(a)重链可变区(vh)，其包含seqidno：4的vhcdr1氨基酸序列，seqidno：5的vhcdr2氨基酸序列和seqidno：3的vhcdr3氨基酸序列；和轻链可变区(vl)，其包含seqidno：13的vlcdr1氨基酸序列，seqidno：14的vlcdr2氨基酸序列和seqidno：33的vlcdr3氨基酸序列，各自公开于us2015/0210769的表1中；

(b)vh，其包含选自seqidno：1的vhcdr1氨基酸序列；seqidno：2的vhcdr2氨基酸序列；seqidno：3的vhcdr3氨基酸序列；以及vl，其包含seqidno：10的vlcdr1氨基酸序列，seqidno：11的vlcdr2氨基酸序列和seqidno：32的vlcdr3氨基酸序列，其各自公开于us2015/0210769的表1中；

(c)vh，其包含seqidno：224的vhcdr1氨基酸序列，seqidno：5的vhcdr2氨基酸序列和seqidno：3的vhcdr3氨基酸序列；以及vl，其包含seqidno：13的vlcdr1氨基酸序列，seqidno：14的vlcdr2氨基酸序列和seqidno：33的vlcdr3氨基酸序列，各自公开于us2015/0210769的表1中；或者

(d)vh，其包含seqidno：224的vhcdr1氨基酸序列，seqidno：2的vhcdr2氨基酸序列和seqidno：3的vhcdr3氨基酸序列；以及vl，其包含seqidno：10的vlcdr1氨基酸序列，seqidno：11的vlcdr2氨基酸序列和seqidno：32的vlcdr3氨基酸序列，各自公开于us2015/0210769的表1中。

在另一个实施方案中，抗pd-1抗体分子包含(i)重链可变区(vh)，其包含选自seqidno：1、seqidno：4或seqidno：224的vhcdr1氨基酸序列；seqidno：2或seqidno：5的vhcdr2氨基酸序列；和seqidno：3的vhcdr3氨基酸序列；和(ii)轻链可变区(vl)，其包含seqidno：10或seqidno：13的vlcdr1氨基酸序列，seqidno：11或seqidno：14的vlcdr2氨基酸序列，和seqidno：32或seqidno：33的vlcdr3氨基酸序列，各自公开在us2015/0210769的表1中。

在其他实施方案中，pd-1抑制剂是选自纳武单抗、派姆单抗或匹地珠单抗的抗pd-1抗体。

在一些实施方案中，抗pd-1抗体是纳武单抗。纳武单抗的替代名称包括mdx-1106、mdx-1106-04、ono-4538或bms-936558。在一些实施方案中，抗pd-1抗体是纳武单抗(cas注册号：946414-94-4)。纳武单抗是一种完全人源的igg4单克隆抗体，可特异性阻断pd1。在us8,008,449和wo2006/121168中公开了纳武单抗(克隆5c4)和特异性结合pd1的其他人单克隆抗体。在一个实施方案中，pd-1的抑制剂是纳武单抗，并具有本文公开的序列(或与其基本相同或相似的序列，例如，与指定序列至少85％、90％、95％相同或更高的序列)。在一些实施方案中，抗pd-1抗体是派姆单抗。派姆单抗(也被称为帕姆单抗、mk-3475、mk03475、sch-900475或merck)是人源化的igg4单克隆抗体，其结合pd-1。派姆单抗和其他人源化抗pd-1抗体公开于hamid,o.等人(2013)newenglandjournalofmedicine369(2):134–44、us8,354,509和wo2009/114335中。

在一个实施方案中，pd-1的抑制剂是派姆单抗，其公开于例如us8,354,509和wo2009/114335中，并具有本文公开的序列(或与其基本相同或相似的序列，例如，与指定序列至少85％、90％、95％相同或更高的序列)。

在一些实施方案中，抗pd-1抗体是匹地珠单抗。匹地珠单抗(ct-011；curetech)是与pd1结合的人源化igg1k单克隆抗体。匹地珠单抗和其他人源化抗pd-1单克隆抗体在us8,747,847和wo2009/101611中公开。

其他抗pd1抗体包括amp514(amplimmune)等等，例如us8,609,089、us2010028330和/或us20120114649中公开的抗pd1抗体。

在一些实施方案中，pd-1抑制剂是免疫粘附素，例如，包含与恒定区(例如，免疫球蛋白序列的fc区)融合的pd-l1或pd-l2的细胞外或pd-1结合部分的免疫粘附素。在一些实施方案中，pd-1抑制剂是amp-224(b7-dcig；amplimmune；例如，公开于wo2010/027827和wo2011/066342中)，其是阻断pd-1和b7-h1之间相互作用的pd-l2fc融合可溶性受体。

在一些实施方案中，抗pd-1抗体可以与本发明的靶向pd-1的il-15/rα-fc融合蛋白组合使用。有几种抗pd-1抗体，包括但不限于两种目前已获得fda批准的抗体派姆单抗和纳武单抗，以及目前正在临床测试中的抗体，包括但不限于替雷利珠单抗(tislelizumab)、sym021、regn2810(rengeneron研发)、jnj-63723283(jandj研发)、shr-1210、匹地珠单抗、amp-224、medio680、pdr001和ct-001，以及liu等人在j.hemat.&oncol.(2017)10:136中列出的其他抗体，其中的抗体明确通过引用并入。

在一些实施方案中，本文所述的靶向pd-1的il-15/rα-fc融合蛋白可以与pd-1抑制剂(例如，抗pd-1抗体)组合使用。在某些实施方案中，本文所述的靶向pd-1的il-15/rα-fc融合蛋白(例如，xenp25937和xenp25850)与抗pd-1抗体组合施用。

b.抗tim3抗体

示例性的非限制性抗tim-3抗体分子公开于2015年8月6日公开的标题为“tim-3的抗体分子及其用途”的美国2015/0218274中，其通过引用整体并入本文。

在一个实施方案中，抗tim-3抗体分子包括至少一个或两个重链可变结构域(任选地包括恒定区)、至少一个或两个轻链可变结构域(任选地包括恒定区)或两者，其包含abtim3、abtim3-hum01、abtim3-hum02、abtim3-hum03、abtim3-hum04、abtim3-hum05、abtim3-hum06、abtim3-hum07、abtim3-hum08、abtim3-hum09、abtim3-hum10、abtim3-hum11、abtim3-hum12、abtim3-hum13、abtim3-hum14、abtim3-hum15、abtim3-hum16、abtim3-hum17、abtim3-hum18、abtim3-hum19、abtim3-hum20、abtim3-hum21、abtim3-hum22、abtim3-hum23的氨基酸序列；或如us2015/0218274的表1-4中所述；或由表1-4中的核苷酸序列编码；或与任何上述序列基本相同的序列(例如，至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高的同一性)。抗tim-3抗体分子任选地包含来自重链、轻链或两者的前导序列，如us2015/0218274中所示；或与其基本相同的序列。

在另一个实施方案中，抗tim-3抗体分子包括来自本文所述抗体的重链可变区和/或轻链可变区的至少一个、两个或三个互补决定区(cdr)，例如选自以下任一种的抗体：abtim3、abtim3-hum01、abtim3-hum02、abtim3-hum03、abtim3-hum04、abtim3-hum05、abtim3-hum06、abtim3-hum07、abtim3-hum08、abtim3-hum09、abtim3-hum10、abtim3-hum11、abtim3-hum12、abtim3-hum13、abtim3-hum14、abtim3-hum15、abtim3-hum16、abtim3-hum17、abtim3-hum18、abtim3-hum19、abtim3-hum20、abtim3-hum21、abtim3-hum22、abtim3-hum23的氨基酸序列；或如us2015/0218274的表1-4中所述；或由表1-4中的核苷酸序列编码；或与任何上述序列基本相同的序列(例如，至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高的同一性)。

在又一个实施方案中，抗tim-3抗体分子包含来自重链可变区的至少一个、两个或三个cdr(或统称所有cdr)，所述重链可变区包含us2015/0218274的表1-4中所示的氨基酸序列，或由表1-4中所示的核苷酸序列编码。在一个实施方案中，相对于表1-4中所示的氨基酸序列或由表1-4所示的核苷酸序列编码，一个或多个cdr(或全部所有cdr)具有一、二、三、四、五、六个或更多个改变，例如氨基酸取代或缺失。

在又一个实施方案中，抗tim-3抗体分子包含来自轻链可变区的至少一个、两个或三个cdr(或统称所有cdr)，所述轻链可变区包含us2015/0218274的表1-4中所示的氨基酸序列，或由表1-4中所示的核苷酸序列编码。在一个实施方案中，相对于表1-4中所示的氨基酸序列或由表1-4所示的核苷酸序列编码，一个或多个cdr(或全部所有cdr)具有一、二、三、四、五、六个或更多个改变，例如氨基酸取代或缺失。在某些实施方案中，抗tim-3抗体分子在轻链cdr中包括取代，例如在轻链的cdr1、cdr2和/或cdr3中的一个或多个取代。

在又一个实施方案中，抗tim-3抗体分子包含来自重和轻链可变区的至少一个、两个、三个、四个、五个或六个cdr(或统称所有cdr)，所述重和轻链可变区包含us2015/0218274的表1-4中所示的氨基酸序列，或由表1-4中所示的核苷酸序列编码。在一个实施方案中，相对于表1-4中所示的氨基酸序列或由表1-4所示的核苷酸序列编码，一个或多个cdr(或全部所有cdr)具有一、二、三、四、五、六个或更多个改变，例如氨基酸取代或缺失。

在一个实施方案中，抗tim-3抗体分子包括：

(a)重链可变区(vh)，其包含选自seqidno：9的vhcdr1氨基酸序列，seqidno：10的vhcdr2氨基酸序列和seqidno：5的vhcdr3氨基酸序列；和轻链可变区(vl)，其包含seqidno：12的vlcdr1氨基酸序列，seqidno：13的vlcdr2氨基酸序列和seqidno：14的vlcdr3氨基酸序列，各自公开于us2015/0218274的表1-4中；

(b)vh，其包含选自seqidno：3的vhcdr1氨基酸序列；seqidno：4的vhcdr2氨基酸序列；seqidno：5的vhcdr3氨基酸序列；以及vl，其包含seqidno：6的vlcdr1氨基酸序列，seqidno：7的vlcdr2氨基酸序列和seqidno：8的vlcdr3氨基酸序列，其各自公开于us2015/0218274的表1-4中；

(c)vh，其包含选自seqidno：9的vhcdr1氨基酸序列；seqidno：25的vhcdr2氨基酸序列；seqidno：5的vhcdr3氨基酸序列；以及vl，其包含seqidno：12的vlcdr1氨基酸序列，seqidno：13的vlcdr2氨基酸序列和seqidno：14的vlcdr3氨基酸序列，其各自公开于us2015/0218274的表1-4中；

(d)vh，其包含选自seqidno：3的vhcdr1氨基酸序列；seqidno：24的vhcdr2氨基酸序列；seqidno：5的vhcdr3氨基酸序列；以及vl，其包含seqidno：6的vlcdr1氨基酸序列，seqidno：7的vlcdr2氨基酸序列和seqidno：8的vlcdr3氨基酸序列，其各自公开于us2015/0218274的表1-4中；

(e)vh，其包含选自seqidno：9的vhcdr1氨基酸序列；seqidno：31的vhcdr2氨基酸序列；seqidno：5的vhcdr3氨基酸序列；以及vl，其包含seqidno：12的vlcdr1氨基酸序列，seqidno：13的vlcdr2氨基酸序列和seqidno：14的vlcdr3氨基酸序列，其各自公开于us2015/0218274的表1-4中；或

(f)vh，其包含选自seqidno：3的vhcdr1氨基酸序列；seqidno：30的vhcdr2氨基酸序列；seqidno：5的vhcdr3氨基酸序列；以及vl，其包含seqidno：6的vlcdr1氨基酸序列，seqidno：7的vlcdr2氨基酸序列和seqidno：8的vlcdr3氨基酸序列，其各自公开于us2015/0218274的表1-4中。

示例性的抗tim-3抗体在美国专利号：8,552,156、wo2011/155607、ep2581113和美国公开号：2014/044728中公开。

在一些实施方案中，抗tim-3抗体可以与本发明的靶向pd-1的il-15/rα-fc融合蛋白组合使用。在临床开发中有几种tim-3抗体，包括但不限于mbg453和tsr-022。

在一些实施方案中，本文所述的靶向pd-1的il-15/rα-fc融合蛋白可以与tim-3抑制剂(例如，抗tim3抗体)组合使用。在某些实施方案中，本文所述的靶向pd-1的il-15/rα-fc融合蛋白(例如，xenp25937和xenp25850)与抗tim3抗体组合施用。

c.抗ctla4抗体

示例性抗ctla4抗体包括替西木单抗(tremelimumab)(可从pfizer获得的igg2单克隆抗体，前称ticilimumab，cp-675,206)；和dim(ctla-4抗体，也称为mdx-010，cas编号477202-00-9)。其他示例性的抗ctla-4抗体公开于例如美国专利5,811,097。

在一个实施方案中，抗ctla4抗体是伊匹单抗，其公开于例如us5,811,097、us7,605,238、wo00/32231和wo97/20574中，并具有本文公开的序列(或与其基本相同或相似的序列，例如，与指定序列至少85％、90％、95％相同或更高的序列)。

在一个实施方案中，抗ctla4抗体是替西木单抗，例如在us6,682,736和wo00/37504中公开，并具有本文公开的序列(或与其基本相同或相似的序列，例如，与指定序列至少85％、90％、95％相同或更高的序列)。

在一些实施方案中，抗ctla-4抗体可以与本发明的靶向pd-1的il-15/rα-fc融合蛋白组合使用。因此，用于本文概述的联合疗法的合适的抗ctla-4抗体包括但不限于一种当前fda批准的抗体依匹单抗，以及另外几种正在开发中的抗体，包括cp-675,206和agen-1884。

在一些实施方案中，本文所述的靶向pd-1的il-15/rα-fc融合蛋白可以与ctla-4抑制剂(例如，抗ctla-4抗体)组合使用。在某些实施方案中，本文所述的靶向pd-1的il-15/rα-fc融合蛋白(例如，xenp25937和xenp25850)与抗ctla-4抗体组合施用。

d.抗pd-l1抗体

示例性的非限制性抗pd-l1抗体分子公开于2016年4月21日公开的标题为“pd-l1的抗体分子及其用途”的us2016/0108123中，其通过引用整体并入本文。

在一个实施方案中，抗pd-l1抗体分子包含至少一个或两个重链可变结构域(任选地包括恒定区)、至少一个或两个轻链可变结构域(任选地包括恒定区)或两者，其包含bap058-hum01、bap058-hum02、bap058-hum03、bap058-hum04、bap058-hum05、bap058-hum06、bap058-hum07、bap058-hum08、bap058-hum09、bap058-hum10、bap058-hum11、bap058-hum12、bap058-hum13、bap058-hum14、bap058-hum15、bap058-hum16、bap058-hum17、bap058-克隆-k、bap058-克隆-l、bap058-克隆-m、bap058-克隆-n或bap058-克隆-o的任一种的氨基酸序列；或如us2016/0108123的表1中所述，或由表1中的核苷酸序列编码；或与任何上述序列基本相同的序列(例如，至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高的同一性)。

在又一个实施方案中，抗pd-l1抗体分子包括来自本文所述抗体的重链可变区和/或轻链可变区的至少一个、两个或三个互补决定区(cdr)，例如，抗体选自bap058-hum01、bap058-hum02、bap058-hum03、bap058-hum04、bap058-hum05、bap058-hum06、bap058-hum07、bap058-hum08、bap058-hum09、bap058-hum10、bap058-hum11、bap058-hum12、bap058-hum13、bap058-hum14、bap058-hum15、bap058-hum16、bap058-hum17、bap058-clone-k、bap058-克隆-l、bap058-克隆-m、bap058-克隆-n或bap058-克隆-o的任一个；或如us2016/0108123的表1中所述，或由表1中的核苷酸序列编码；或与任何上述序列基本相同的序列(例如，至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高的同一性)。

在又一个实施方案中，抗pd-l1抗体分子包含来自重链可变区的至少一个、两个或三个cdr(或统称所有cdr)，所述重链可变区包含us2016/0108123的表1中所示的氨基酸序列，或由表1中所示的核苷酸序列编码。在一个实施方案中，相对于表1中所示的氨基酸序列或由表1所示的核苷酸序列编码，一个或多个cdr(或全部所有cdr)具有一、二、三、四、五、六个或更多个改变，例如氨基酸取代或缺失。

在又一个实施方案中，抗pd-l1抗体分子包含来自轻链可变区的至少一个、两个或三个cdr(或统称所有cdr)，所述轻链可变区包含us2016/0108123的表1中所示的氨基酸序列，或由表1中所示的核苷酸序列编码。在一个实施方案中，相对于表1中所示的氨基酸序列或由表1所示的核苷酸序列编码，一个或多个cdr(或全部所有cdr)具有一、二、三、四、五、六个或更多个改变，例如氨基酸取代或缺失。在某些实施方案中，抗pd-l1抗体分子在轻链cdr中包括取代，例如在轻链的cdr1、cdr2和/或cdr3中的一个或多个取代。

在又一个实施方案中，抗pd-l1抗体分子包含来自重和轻链可变区的至少一个、两个、三个、四个、五个或六个cdr(或统称所有cdr)，所述重和轻链可变区包含us2016/0108123的表1中所示的氨基酸序列，或由表1中所示的核苷酸序列编码。在一个实施方案中，相对于表1中所示的氨基酸序列或由表1所示的核苷酸序列编码，一个或多个cdr(或全部所有cdr)具有一、二、三、四、五、六个或更多个改变，例如氨基酸取代或缺失。

在一个实施方案中，抗pd-l1抗体分子包括：

(i)重链可变区(vh)，其包括选自seqidno：1、seqidno：4或seqidno：195的vhcdr1氨基酸序列；seqidno：2的vhcdr2氨基酸序列；seqidno：3的vhcdr3氨基酸序列，其各自在us2016/0108123的表1中公开；和

(ii)轻链可变区(vl)，其包含seqidno：9的vlcdr1氨基酸序列、seqidno：10的vlcdr2氨基酸序列和seqidno：11的vlcdr3氨基酸序列，其各自在us2016/0108123的表1中公开。

在另一个实施方案中，抗pd-l1抗体分子包括：

(i)重链可变区(vh)，其包括选自seqidno：1、seqidno：4或seqidno：195的vhcdr1氨基酸序列；seqidno：5的vhcdr2氨基酸序列；seqidno：3的vhcdr3氨基酸序列，其各自在us2016/0108123的表1中公开；和

(ii)轻链可变区(vl)，其包含seqidno：12的vlcdr1氨基酸序列、seqidno：13的vlcdr2氨基酸序列和seqidno：14的vlcdr3氨基酸序列，其各自在us2016/0108123的表1中公开。

在一个实施方案中，抗pd-l1抗体分子包含seqidno：1的vhcdr1氨基酸序列。在另一个实施方案中，抗pd-l1抗体分子包含seqidno：4的vhcdr1氨基酸序列。在又一个实施方案中，抗pd-l1抗体分子包含seqidno：195的vhcdr1氨基酸序列，每个在us2016/0108123的表1中公开。

在一些实施方案中，pd-l1抑制剂是抗体分子。在一些实施方案中，抗pd-l1抑制剂选自yw243.55.s70、mpdl3280a、medi-4736、msb-0010718c、mdx-1105、阿特珠单抗、杜巴单抗、阿维鲁单抗或bms936559。

在一些实施方案中，抗pd-l1抗体是阿特珠单抗。阿特珠单抗(也称为mpdl3280a和roche)是与pd-l1结合的单克隆抗体。阿特珠单抗和其他人源化抗pd-l1抗体在us8,217,149中公开，并具有本文公开的序列(或与其基本相同或相似的序列，例如，与指定序列至少85％、90％、95％相同或更高的序列)。

在一些实施方案中，抗pd-l1抗体是阿维鲁单抗。阿维鲁单抗(也称为a09-246-2；merckserono)是与pd-l1结合的单克隆抗体。阿维鲁单抗和其他人源化抗pd-l1抗体在us9,324,298和wo2013/079174中公开，并具有本文公开的序列(或与其基本相同或相似的序列，例如，与指定序列至少85％、90％、95％相同或更高的序列)。

在一些实施方案中，抗pd-l1抗体是德瓦鲁单抗(durvalumab)。德瓦鲁单抗(也称为medi4736；astrazeneca)是与pd-l1结合的单克隆抗体。德瓦鲁单抗和其他人源化抗pd-l1抗体在us8,779,108中公开，并具有本文公开的序列(或与其基本相同或相似的序列，例如，与指定序列至少85％、90％、95％相同或更高的序列)。

在一些实施方案中，抗pd-l1抗体是bms-936559。bms-936559(也称为mdx-1105；bms)是与pd-l1结合的单克隆抗体。bms-936559和其他人源化抗pd-l1抗体在us7,943,743和wo2007005874中公开，并具有本文公开的序列(或与其基本相同或相似的序列，例如，与指定序列至少85％、90％、95％相同或更高的序列)。

在一些实施方案中，抗pd-l1抗体可以与本发明的靶向pd-1的il-15/rα-fc融合蛋白组合使用。有几种抗pd-l1抗体，包括三种目前已被fda批准的抗体阿特珠单抗、阿维鲁单抗、德瓦鲁单抗以及目前在临床测试中的抗体，包括但不限于ly33000054和cs1001，以及liu等人在j.hemat.&oncol.(2017)10:136中列出的其他抗体，其中的抗体明确通过引用并入。

在一些实施方案中，本文所述的靶向pd-1的il-15/rα-fc融合蛋白可以与pd-l1抑制剂(例如，抗pd-l1抗体)组合使用。在某些实施方案中，本文所述的靶向pd-1的il-15/rα-fc融合蛋白(例如，xenp25937和xenp25850)与抗pd-l1抗体组合施用。

在一些实施方案中，本文所述的靶向pd-1的il-15/rα-fc融合蛋白可以与pd-l1或pd-l2抑制剂(例如，抗pd-l1抗体)组合使用。

e.抗tigit抗体

在一些实施方案中，抗tigit抗体是omp-313m32。omp-313m32(oncomedpharmaceuticals)是与tigit结合的单克隆抗体。us20160376365和wo2016191643中公开了omp-313m32和其他人源化抗tigit抗体，并具有本文公开的序列(或与其基本相同或相似的序列，例如，与指定序列至少85％、90％、95％相同或更高的序列)。

在一些实施方案中，抗tigit抗体是bms-986207。bms-986207(也称为ono-4686；bristol-myerssquibb)是与tigit结合的单克隆抗体。bms-986207和其他人源化抗tigit抗体在us20160176963和wo2016106302中公开，并具有本文公开的序列(或与其基本相同或相似的序列，例如，与指定序列至少85％、90％、95％相同或更高的序列)。

在一些实施方案中，抗tigit抗体是mtig7192。mtig7192(genentech)是与tigit结合的单克隆抗体。mtig7192和其他人源化抗tigit抗体在us2017088613、wo2017053748和wo2016011264中公开，并具有本文公开的序列(或与其基本相同或相似的序列，例如，与指定序列至少85％、90％、95％相同或更高的序列)。

在一些实施方案中，抗tigit抗体可以与本发明的靶向pd-1的il-15/rα-fc融合蛋白组合使用。有几种tigit抗体正在临床开发中，bms-986207、omp-313m32和mtig7192a。

在一些实施方案中，本文所述的靶向pd-1的il-15/rα-fc融合蛋白可以与tigit抑制剂(例如，抗tigit抗体)组合使用。在某些实施方案中，本文所述的靶向pd-1的il-15/rα-fc融合蛋白(例如，xenp25937和xenp25850)与抗tigit抗体组合施用。

f.抗lag-3抗体

示例性的非限制性抗lag-3抗体分子公开于2015年9月17日公开的标题为“lag-3的抗体分子及其用途”的us2015/0259420中，其通过引用整体并入本文。

在一个实施方案中，抗lag-3抗体分子包含至少一个或两个重链可变结构域(任选地包括恒定区)、至少一个或两个轻链可变结构域(任选地包括恒定区)或两者，其包含bap050-hum01、bap050-hum02、bap050-hum03、bap050-hum04、bap050-hum05、bap050-hum06、bap050-hum07、bap050-hum08、bap050-hum09、bap050-hum10、bap050-hum11、bap050-hum12、bap050-hum13、bap050-hum14、bap050-hum15、bap050-hum16、bap050-hum17、bap050-hum18、bap050-hum19、bap050-hum20、hubap050(ser)(如bap050-hum01-ser、bap050-hum02-ser、bap050-hum03-ser、bap050-hum04-ser、bap050-hum05-ser、bap050-hum06-ser、bap050-hum07-ser、bap050-hum08-ser、bap050-hum09-ser、bap050-hum10-ser、bap050-hum11-ser、bap050-hum12-ser、bap050-hum13-ser、bap050-hum14-ser、bap050-hum15-ser、bap050-hum18-ser、bap050-hum19-ser或bap050-hum20-ser)、bap050-克隆-f、bap050-克隆-g、bap050-克隆-h、bap050-克隆-i或bap050-克隆-j的任一种的氨基酸序列；或如us2015/0259420的表1中所述，或由表1中的核苷酸序列编码；或与任何上述序列基本相同的序列(例如，至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高的同一性)。

在又一个实施方案中，抗lag-3抗体分子包括来自本文所述抗体的重链可变区和/或轻链可变区的至少一个、两个或三个互补决定区(cdr)，例如，抗体选自bap050-hum01、bap050-hum02、bap050-hum03、bap050-hum04、bap050-hum05、bap050-hum06、bap050-hum07、bap050-hum08、bap050-hum09、bap050-hum10、bap050-hum11、bap050-hum12、bap050-hum13、bap050-hum14、bap050-hum15、bap050-hum16、bap050-hum17、bap050-hum18、bap050-hum19、bap050-hum20、hubap050(ser)(如bap050-hum01-ser、bap050-hum02-ser、bap050-hum03-ser、bap050-hum04-ser、bap050-hum05-ser、bap050-hum06-ser、bap050-hum07-ser、bap050-hum08-ser、bap050-hum09-ser、bap050-hum10-ser、bap050-hum11-ser、bap050-hum12-ser、bap050-hum13-ser、bap050-hum14-ser、bap050-hum15-ser、bap050-hum18-ser、bap050-hum19-ser或bap050-hum20-ser)、bap050-克隆-f、bap050-克隆-g、bap050-克隆-h、bap050-克隆-i或bap050-克隆-j的任一种；或如us2015/0259420的表1中所述，或由表1中的核苷酸序列编码；或与任何上述序列基本相同的序列(例如，至少80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、99％或更高的同一性)。

在又一个实施方案中，抗lag-3抗体分子包含来自重链可变区的至少一个、两个或三个cdr(或统称所有cdr)，所述重链可变区包含us2015/0259420的表1中所示的氨基酸序列，或由表1中所示的核苷酸序列编码。在一个实施方案中，相对于表1中所示的氨基酸序列或由表1所示的核苷酸序列编码，一个或多个cdr(或全部所有cdr)具有一、二、三、四、五、六个或更多个改变，例如氨基酸取代或缺失。

在又一个实施方案中，抗lag-3抗体分子包含来自轻链可变区的至少一个、两个或三个cdr(或统称所有cdr)，所述轻链可变区包含us2015/0259420的表1中所示的氨基酸序列，或由表1中所示的核苷酸序列编码。在一个实施方案中，相对于表1中所示的氨基酸序列或由表1所示的核苷酸序列编码，一个或多个cdr(或全部所有cdr)具有一、二、三、四、五、六个或更多个改变，例如氨基酸取代或缺失。在某些实施方案中，抗pd-l1抗体分子在轻链cdr中包括取代，例如在轻链的cdr1、cdr2和/或cdr3中的一个或多个取代。

在又一个实施方案中，抗lag-3抗体分子包含来自重和轻链可变区的至少一个、两个、三个、四个、五个或六个cdr(或统称所有cdr)，所述重和轻链可变区包含us2015/0259420的表1中所示的氨基酸序列，或由表1中所示的核苷酸序列编码。在一个实施方案中，相对于表1中所示的氨基酸序列或由表1所示的核苷酸序列编码，一个或多个cdr(或全部所有cdr)具有一、二、三、四、五、六个或更多个改变，例如氨基酸取代或缺失。

在一个实施方案中，抗lag-3抗体分子包括：

(i)重链可变区(vh)，其包括选自seqidno：1、seqidno：4或seqidno：286的vhcdr1氨基酸序列；seqidno：2的vhcdr2氨基酸序列；seqidno：3的vhcdr3氨基酸序列，其各自在us2015/0259420的表1中公开；和

(ii)轻链可变区(vl)，其包含seqidno：10的vlcdr1氨基酸序列、seqidno：11的vlcdr2氨基酸序列和seqidno：12的vlcdr3氨基酸序列，其各自在us2015/0259420的表1中公开。

在另一个实施方案中，抗lag-3抗体分子包括：

(i)重链可变区(vh)，其包括选自seqidno：1、seqidno：4或seqidno：286的vhcdr1氨基酸序列；seqidno：5的vhcdr2氨基酸序列；seqidno：3的vhcdr3氨基酸序列，其各自在us2015/0259420的表1中公开；和

(ii)轻链可变区(vl)，其包含seqidno：13的vlcdr1氨基酸序列、seqidno：14的vlcdr2氨基酸序列和seqidno：15的vlcdr3氨基酸序列，其各自在us2015/0259420的表1中公开。

在一个实施方案中，抗lag-3抗体分子包含seqidno：1的vhcdr1氨基酸序列。在另一个实施方案中，抗lag-3抗体分子包含seqidno：4的vhcdr1氨基酸序列。在又一个实施方案中，抗lag-3抗体分子包含seqidno：286的vhcdr1氨基酸序列，其各自公开于us2015/0259420的表1中。

在一些实施方案中，抗lag-3抗体是bms-986016。bms-986016(也称为bms986016；bristol-myerssquibb)是与lag-3结合的单克隆抗体。bms-986016和其他人源化的抗lag-3抗体公开于us2011/0150892、wo2010/019570和wo2014/008218。

在一些实施方案中，抗lag3抗体是lag525。lag525(也称为imp701；诺华公司)是与lag3结合的单克隆抗体。lag525和其他人源化抗lag3抗体在us9,244,059和wo2008132601中公开，并具有本文公开的序列(或与其基本相同或相似的序列，例如，与指定序列至少85％、90％、95％相同或更高的序列)。

其他示例性抗lag-3抗体公开于如us2011150892和us2018066054中。

在一些实施方案中，抗lag-3抗体可以与本发明的靶向pd-1的il-15/rα-fc融合蛋白组合使用。在临床开发中有几种抗lag-3抗体，包括regeneron的regn3767、和tsr-033(tesaro)。

在一些实施方案中，本文所述的靶向pd-1的il-15/rα-fc融合蛋白可以与lag-抑制剂(例如，抗lag-3抗体)组合使用。在某些实施方案中，本文所述的靶向pd-1的il-15/rα-fc融合蛋白(例如，xenp25937和xenp25850)与抗lag3抗体组合施用。

xiii.联合疗法

在一些方面，本文所述的靶向pd-1的il-15/rα-fc融合蛋白与另一种治疗剂组合施用。如本文所用，“组合”施用是指在受试者患有疾病的过程中向受试者递送两种(或更多种)不同的治疗，例如，在诊断出受试者患有该疾病之后且在该疾病已治愈或消除或因其他原因停止治疗之前进行两种或更多种治疗。在一些实施方案中，当开始第二种递送时，一种治疗的递送仍在进行中，因此在施用方面存在重叠。在本文中有时将其称为“同时”或“并发递送”。在其他实施方案中，一种治疗的递送在另一种治疗的递送开始之前结束。在任一种情况的一些实施方案中，由于联合施用，治疗更有效。例如，第二种治疗更有效，例如，与第二种治疗在不使用第一种治疗的情况下施用相比，第二种治疗在更少的第二种治疗下可以看到相同的效果，或者第二种治疗在更大程度上减轻了症状，或对于第一种治疗看到类似的情况。在一些实施方案中，递送使得症状或与病症有关的其他参数的减少大于在不存在另一种治疗的情况下递送一种治疗所观察到的减少。两种治疗的效果可以是部分累加、完全累加或大于累加。递送可以使得当递送第二种时仍然可以检测到递送的第一种治疗的效果。

本文所述的靶向pd-1的il-15/rα-fc融合蛋白(例如但不限于xenp25937和xenp25850)和至少一种另外的治疗剂可以同时以相同或分开的组合物或顺序施用。对于顺序施用，可以首先施用本文所述的靶向pd-1的il-15/rα-fc融合蛋白，然后可以施用另外的药剂，或者可以颠倒施用顺序。

本文所述的靶向pd-1的il-15/rα-fc融合蛋白和/或其他治疗剂、程序或方式可在活性病症期间或缓解或较不活性疾病期间内施用。靶向pd-1的il-15/rα-fc融合蛋白可以在其他治疗之前、与治疗同时、在治疗之后或在疾病缓解期间施用。

组合使用时，靶向pd-1的il-15/rα-fc融合蛋白(例如但不限于xenp25937和xenp25850)和其他药剂(例如第二种或第三种药剂)或全部可以以低于或等于单独使用(例如，作为单一治疗)的每种药剂的量或剂量的量或剂量施用。在一些实施方案中，靶向pd-1的il-15/rα-fc融合蛋白、其他药剂(例如，第二或第三药剂)或全部的施用量或剂量比单独使用(例如，作为单一治疗)的每种药剂的量或剂量低(例如至少20％、至少30％、至少40％或至少50％)。在其他实施方案中，靶向pd-1的il-15/rα-fc融合蛋白、其他药剂(例如，第二或第三药剂)或全部的导致期望效果(例如癌症治疗)的量或剂量比单独使用(例如，作为单一治疗)的每种药剂的实现相同治疗效果所需的量或剂量低(例如低至少20％、至少30％、至少40％或至少50％)。

在进一步方面，本文所述的靶向pd-1的il-15/rα-fc融合蛋白(例如但不限于xenp25937和xenp25850)可用于与以下联合的治疗方案中：化学疗法，放射，免疫抑制剂例如环孢菌素、硫唑嘌呤、甲氨蝶呤、霉酚酸酯和fk506，针对检查点抑制剂的抗体，或其他免疫消融剂例如campath，其他抗体疗法，癌得星(cytoxan)，氟达拉滨，环孢菌素，fk506，雷帕霉素，霉酚酸，类固醇，fr90165，细胞因子，和照射，肽疫苗，如izumoto等人2008jneurosurg108：963-971所述的。

在某些情况下，本发明的化合物与其他治疗剂例如其他抗癌剂、抗过敏剂、抗恶心剂(或止吐药)、止痛药、细胞保护剂及其组合结合。

在一个实施方案中，本文所述的靶向pd-1的il-15/rα-fc融合蛋白(例如但不限于xenp25937和xenp25850)可以与化学治疗剂组合使用。示例性化学治疗剂包括蒽环类(例如，阿达比星、柔红霉素、阿霉素(例如，脂质体阿霉素))，蒽二酮衍生物(例如，米托蒽醌)，长春花生物碱(例如，长春碱、长春新碱、长春地辛、长春瑞滨)，烷基化剂(例如，环磷酰胺、达卡巴嗪、美法仑、异环磷酰胺、替莫唑胺)，免疫细胞抗体(例如，阿仑单抗、吉妥珠单抗、利妥昔单抗、奥法木单抗、托西莫单抗、brentuximab)，抗代谢药(包括，例如叶酸拮抗剂、阿糖胞苷、嘧啶类似物、嘌呤类似物和腺苷脱氨酶抑制剂(例如氟达拉滨))，mtor抑制剂，tnfr糖皮质激素诱导的tnfr相关蛋白(gitr)激动剂，蛋白酶体抑制剂(例如阿克拉霉素a、胶体毒素或硼替佐米)，免疫调节剂例如沙利度胺或沙利度胺衍生物(如来那度胺)，激酶抑制剂例如依鲁替尼(如imbruvica)，皮质类固醇(如地塞米松、泼尼松)和cvp(环磷酰胺、长春新碱和泼尼松的组合)，含或不含依托泊苷(例如vp-16)的chop(环磷酰胺、羟基柔红霉素、(长春新碱)和泼尼松的组合)，环磷酰胺和喷妥他汀的组合，苯丁酸氮芥和泼尼松的组合，氟达拉滨和环磷酰胺的组合，或另一种药剂，如盐酸氮芥(例如mustargen)，阿霉素甲氨蝶呤，奥沙利铂或阿糖胞苷(ara-c)。

考虑用于联合疗法的一般化学治疗剂包括阿那曲唑比卡鲁胺硫酸博来霉素白消安白消安注射液卡培他滨n4-戊氧羰基5-脱氧5-氟胞苷，卡铂卡莫司汀苯丁酸氮芥顺铂克拉屈滨环磷酰胺(或)，阿糖胞苷，胞嘧啶阿拉伯糖苷阿糖胞苷脂质体注射液达卡巴嗪放线菌素(actinomycind、cosmegan)，盐酸柔红霉素柠檬酸柔红霉素脂质体注射液地塞米松，多西他赛盐酸阿霉素依托泊苷磷酸氟达拉滨5-氟尿嘧啶氟他胺替扎西他滨，吉西他滨(二氟脱氧胞苷)，羟基脲依达比星异环磷酰胺伊立替康l-天冬酰胺酶亚叶酸钙，美法仑6-巯基嘌呤甲氨蝶呤米托蒽醌mylotarg，紫杉醇phoenix(yttrium90/mx-dtpa)，喷妥他汀，带有卡莫司汀植入物的聚苯丙生20柠檬酸他莫昔芬替尼泊苷6-硫鸟嘌呤，硫替太帕，替拉帕明注射用盐酸托泊替康长春碱长春新碱和长春瑞滨

xiv.治疗

一旦制备，通过治疗癌症，通常通过与本发明的异源二聚体fc融合蛋白的结合促进t细胞活化(例如不再抑制t细胞)，本发明的组合物可用于许多肿瘤学应用。

因此，本发明的靶向pd-1的il-15/rα-fc融合蛋白组合物可用于治疗这些癌症。

a.用于体内施用的靶向pd-1的il-15/rα-fc融合蛋白组合物

通过将具有期望纯度的抗体与可选的药学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂(如remington'spharmaceuticalsciences第16版，osol,a.ed.[1980]概述的)混合来以冻干制剂或水溶液的形式制备根据本发明使用的抗体的制剂用于储存。可接受的载体、缓冲剂、赋形剂或稳定剂在所用剂量和浓度下对接受者无毒，并且包括缓冲剂，例如磷酸盐、柠檬酸盐和其它有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和蛋氨酸；防腐剂(例如十八烷基二甲基苯甲基氯化铵；六甲基氯化铵；苯扎氯铵、苄索氯铵；苯酚、丁醇或苄醇；对羟基苯甲酸烷基酯，如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，例如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，例如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，例如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，例如edta；糖，例如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨糖醇；成盐抗衡离子，例如钠；金属配合物(例如锌-蛋白质配合物)；和/或非离子表面活性剂，例如tween^tm、pluronics^tm或聚乙二醇(peg)。

b.施用方式

本发明的本文公开的靶向pd-1的il-15/rα-fc融合蛋白和化疗剂根据已知的方法，如静脉内施用(作为推注(bolus)或通过在一段时间内连续输注)向受试者施用。

c.治疗方式

在本发明的方法中，疗法用于提供关于疾病或病况的阳性治疗反应。“阳性治疗反应”旨在改善疾病或病况，和/或改善与疾病或病况相关的症状。举例来说，阳性治疗反应是指疾病中的一种或多种以下改善：(1)肿瘤细胞数量的减少；(2)肿瘤细胞死亡增加；(3)抑制肿瘤细胞存活；(5)肿瘤生长的抑制(即，在某种程度上减慢，优选停止)；(6)提高患者生存率；(7)与疾病或病况相关的一种或多种症状有所缓解。

在任何给定疾病或病况中的阳性治疗反应可以通过对所述疾病或病况特异的标准化反应标准来确定。可以使用筛选技术，例如磁共振成像(mri)扫描、x射线照相术、计算机断层摄影术(ct)扫描、骨扫描成像、内窥镜检查和肿瘤活检取样，包括骨髓穿刺(bma)和对循环中的肿瘤细胞计数来评定针对肿瘤形态(即总体肿瘤负荷、肿瘤大小等)变化的肿瘤应答。

除了这些阳性治疗反应之外，接受疗法的个体可以经历改善与疾病相关的症状的有益效果。

根据本发明的治疗包括所用药物的“治疗有效量”。“治疗有效量”是指在必要的剂量和时间段内有效实现期望治疗结果的量。

治疗有效量可根据诸如疾病状态、年龄、性别和个体体重等因素以及药物在个体中引发期望反应的能力而变化。治疗有效量也是其中抗体或抗体部分的任何毒性或有害作用超过治疗有益效果的量。

用于肿瘤治疗的“治疗有效量”还可以通过其稳定疾病进展的能力来测量。可以在预测人肿瘤中功效的动物模型系统中评估化合物抑制癌症的能力。

取代性地，通过熟练的从业者已知的体外测试，组合物的这种特性可以通过检验化合物抑制肿瘤生长或诱导凋亡的能力来评估。治疗有效量的治疗化合物可以减小肿瘤大小，或以其他方式改善受试者的症状。本领域普通技术人员将能够基于诸如受试者的大小、受试者症状的严重性和所选择的特定组合物或给药途径等因素来确定这样的量。

调整剂量方案以提供最佳的所期望反应(例如，治疗反应)。举例来说，可以施用单次推注，可以随时间施用几个分开的剂量，或者可以根据治疗情况的紧急程度按比例减少或增加剂量。肠胃外组合物可以单位剂型配制，以便于施用和使剂量均匀。如本文所用的单位剂型是指适合作为待治疗个体的单位剂量的物理离散单元；每个单元含有预定量的活性化合物，其经过计算可与所期我的药物载体一起产生所期望的治疗效果。

本发明的单位剂型的规格由以下各项指定并且直接取决于以下各项：(a)活性化合物的独特特征和欲实现的特定治疗效果；和(b)混配这类活性化合物用于治疗个体敏感性在所属领域中固有的限制。

用于本发明的靶向pd-1的il-15/rα-fc融合蛋白的有效剂量和剂量方案取决于待治疗的疾病或病状并且可以由本领域的技术人员确定。

用于本发明的治疗有效量的靶向pd-1的il-15/rα-fc融合蛋白的示例性非限制性范围是约0.1-100mg/kg。

所有引用的参考文献以全文引用的方式明确地并入本文中。

尽管以上为了说明的目的描述本发明的特定实施方案，但是所属领域技术人员将理解，在不脱离所附权利要求中描述的本发明的情况下，可以进行细节的许多变化。

实施例

以下提供实施例以说明本发明。这些实施例不意味着将本发明限制于任何特定的应用或操作理论。对于本发明中所论述的所有恒定区位置，根据如kabat中的eu编号(kabat(kabat等,1991,sequencesofproteinsofimmunologicalinterest,第5版,unitedstatespublichealthservice,nationalinstitutesofhealth,bethesda，其以引用的方式整体并入本文中)。抗体领域中的技术人员将了解这个规约由以下组成：免疫球蛋白序列的特定区域的非顺序编号，其对免疫球蛋白家族中的保守位置实现标准化的称呼。因此，由eu索引定义的任何给定免疫球蛋白的位置不一定对应于其顺序序列。

在美国公开2015/0307629、2014/0288275和wo2014/145806中概述了一般和具体的科学技术，所有这些技术都通过引用明确地并入本文，特别是其中概述的技术。通过引用将2016年11月1日提交的美国专利系列第62,416,087号的实施例1和2以其整体明确地并入，包括相应的附图。

xv.实施例1：抗pd-1abd

a.1a：说明性抗pd-1abd

结合pd-1的抗原结合结构域的实例描述于wo2017/218707中，其通过引用并入本文，例如，图14中描绘了其可变结构域的说明性序列。图15中描绘了可在本发明的靶向pd-1的il-15/rα-fc融合蛋白中使用的pd-1abd的其他非限制性实例。

b.1b：抗pd-1克隆1c11的产生

1.1b(a)：抗pd-1杂交瘤的产生和筛选

为了开发本发明的靶向pd-1的il-15/rα-fc融合蛋白的另外的pd-1靶向臂，首先通过immunopreciseantibodiesltd.通过其标准方法和快速引发方法通过杂交瘤技术产生单克隆抗体。对于标准方法，将抗原注射到3种balb/c小鼠中。在处死杂交瘤产生之前7到10天，经免疫小鼠接受抗原增强。在抗原上通过elisa评估抗体效价且选择最佳反应小鼠进行融合。在融合前4天给出最终抗原增强。合并来自小鼠的淋巴细胞，随后与sp2/0骨髓瘤细胞融合。使细胞在hat选择性单步克隆培养基上生长10到12天，此时准备好融合瘤进行筛选。对于快速初免方法，将抗原注射到3种balb/c小鼠中。在19天之后，合并来自所有小鼠的淋巴细胞，随后与sp2/0骨髓瘤细胞融合。使细胞在hat选择性单步克隆培养基上生长10到12天，此时准备好融合瘤进行筛选。所使用的抗原是人类pd-1(hupd-1-mfc)的小鼠fc融合体、食蟹猴pd-1(cynopd-1-mfc)的小鼠fc融合体、his标记的人类pd-1(hupd-1-his)、his标记的食蟹猴pd-1(食蟹猴pd-1-his)或其混合物。

使如上文所述产生的抗pd-1融合瘤克隆使用octet，基于生物膜干涉法(bli)的方法经历两轮筛选。octet的实验步骤通常包括以下各者：固定(将配体或测试物捕获到生物传感器上)；缔合(将涂覆有配体或测试物的生物传感器浸渍到含有对应测试物或配体的连续稀释液的孔中)；和解离(将生物传感器返回到含有缓冲液的孔中)以便确定测试物的亲和力。含有单独缓冲液的参考孔还包括于数据处理期间的背景校正的方法

对于第一轮，使用抗小鼠fc(amc)生物传感器捕获浸渍到500nm二价人类和食蟹猴pd-1-fc-his中的克隆。对于第二轮，将在第一轮中对于人类和食蟹猴pd-1两者鉴别为阳性的克隆捕获到amc生物传感器上且浸渍到500nm单价人类和食蟹猴pd-1-his中。

2.1b(b)：克隆1c11的表征

实施例1b(a)中鉴定的一个杂交瘤克隆是克隆1c11。通过基因合成产生编码杂交瘤克隆1c11的vh和vl的dna，并使用标准分子生物学技术亚克隆到含有人igg1恒定区的表达载体ptt5中，其具有e233p/l234v/l235a/g236del/s267k取代，以产生xenp21575，其序列为如图16所示。

1b(b)(i)：用克隆1c11阻断pd-l1

t细胞活化需要阻断检查点受体/配体相互作用。在细胞结合测定中研究了xenp21575的阻断能力。将经转染以表达pd-1的hek293t细胞用xenp21575以及对照抗体培育。在培育之后，添加pd-l1的鼠类fc融合体并且使其培育。用抗鼠类igg二级抗体检测pd-l1-mfc与hek293t细胞的结合，其数据描绘于图17中。

1b(b)(ii)：克隆1c11的t细胞表面结合

在经seb刺激pbmc分析中测量抗pd-1克隆1c11与t细胞的结合。葡萄球菌肠毒素b(seb)为以类似于经由t细胞受体(tcr)活化所实现的方式引起t细胞活化和增殖的超抗原，包括例如pd-1的检查点受体的表达。用100ng/ml刺激人类pbmc持续3天。在刺激之后，将pbmc用所指示浓度的所指示测试物在4℃下培育30分钟。将pbmc用抗cd3-fitc(ucht1)和人类免疫球蛋白κ轻链的apc标记的抗体染色。如apcmfi指示在fitc+细胞上测试物与t细胞的结合描绘于图18中。

1b(b)(iii)：克隆1c11的t细胞活化

如通过细胞激素分泌所指示，在经seb刺激pbmc分析中研究通过克隆1c11的t细胞活化。用500ng/mlseb刺激人类pbmc持续2天。随后在培养基中洗涤细胞两次且用500ng/mlseb与所指示量的所指示测试物组合刺激24小时。然后通过细胞测定上清液的il-2和ifnγ，其数据如图19a-19b所示。

3.1b(c)：克隆1c11的人源化

使用字符串内容优化人源化克隆1c11(参见例如2010年2月2日颁布的美国专利第7,657,380号)。通过基因合成产生编码重链和轻链的dna并且使用标准分子生物学技术亚克隆到表达载体ptt5中。在图20a-20c中描绘了二价抗体形式的克隆1c11的说明性人源化变异体的序列。

如实施例1b(a)中一般描述的，使用octet测定xenp22553的亲和力。确切地说，使用抗人类fc(ahc)生物传感器捕获具有浸渍到多浓度组胺酸标记的pd-1中的测试物。亲和力结果和对应的传感器图描绘于图21中。

xvi.实施例2：il-15/rα-fc

a.2a：工程化il-15rα-fc融合蛋白

为了解决il-15/il-15rα异源二聚体的短半衰期，我们生成了il-15/il-15rα(寿司)复合物作为fc融合体(此处称为il-15/rα-fc融合蛋白质)，旨在促进生产和促进fcrn介导的复合物循环和延长半衰期。

通过标准基因合成构建编码il-15或il-15rα寿司结构域的质粒，然后亚克隆到含有fc融合配偶体的ptt5表达载体中(例如，如图8a-图8f所示的恒定区)。图22a-图22g中描绘说明性il-15/rα-fc融合蛋白形式的卡通示意图。

il-15/rα-异源fc形式的说明性蛋白质(图22a)包括xenp20818和xenp21475，其序列描绘于图23中。scil-15/rα-fc形式的说明性蛋白(图22b)是xenp21478，其序列描绘于图24中。ncil-15/rα-fc形式的说明性蛋白质(图22c)包括xenp21479、xenp22366和xenp24348，其序列描绘于图25a-25b中。二价ncil-15/rα-fc形式的说明性蛋白质(图22d)是xenp21978，其序列描绘于图26中。图27中描绘二价scil-15/rα-fc形式的说明性蛋白质的序列(图22e)。fc-ncil-15/rα形式的说明性蛋白(图22f)是xenp22637，其序列描绘于图28中。fc-scil-15/rα形式的说明性蛋白质的序列(图22g)描绘于图29中。

通过在hek293e细胞中瞬时转染产生蛋白质，并且通过两步纯化方法纯化，所述纯化方法包含蛋白a色谱(gehealthcare)和阴离子交换色谱(hitrapq5ml柱，具有5-40％梯度的50mmtrisph8.5和50mmtrisph8.5，具有1mnacl)。

在细胞增殖分析中测试如上所述的各种形式的il-15/rα-fc融合蛋白。用指定浓度的测试物处理人类pbmc。处理4天后，pbmc用抗cd8-fitc(rpa-t8)、抗cd4-percp/cy5.5(okt4)、抗cd27-pe(m-t271)、抗cd56-bv421(5.1h11)、抗cd16-bv421(3g8)和抗cd45ra-bv605(hi100)染色以便对以下细胞类型进行门控：cd4+t细胞、cd8+t细胞和nk细胞(cd56+/cd16+)。ki67是与细胞增殖严格相关的蛋白质，并且使用抗ki67-apc(ki-67)和foxp3/转录因子染色缓冲液组(马萨诸塞州沃尔瑟姆的赛默飞世尔科技(thermofisherscientific,waltham,mass.))进行细胞内ki67的染色。使用facs测量ki67对上述细胞类型的百分比(描绘于图30a-30c和31a-31c)。各种il-15/rα-fc融合蛋白诱导cd8+t细胞和nk细胞的强烈增殖。值得注意的是，增殖活性的差异取决于il-15-fc侧的连接子长度。特别地，没有连接子(仅铰链)的构建体，包括xenp21471，xenp21474和xenp21475，表现出较弱的增殖活性。

b.2b：具有工程化二硫键的il-15/rα-fc融合蛋白

为了进一步提高稳定性并延长il-15/rα-fc融合蛋白的半衰期，我们将二硫键设计到il-15/rα界面。通过检查il-15/rα复合物的晶体结构，以及使用molecularoperatingenvironment(moe；chemicalcomputinggroup，montreal，quebec，canada)软件建模，我们预测il-15/rα界面处的残基可以用半胱氨酸取代以形成共价二硫键，如图32所示。另外，在il-15rα中的寿司结构域后多达三个氨基酸被添加到il-15rα(寿司)的c端，作为工程化的半胱氨酸的骨架(其说明性序列在图33中描绘)。图34和图35中分别描绘用半胱氨酸工程化的说明性il-15和il-15rα(寿司)变体的序列。

通过标准基因合成构筑编码il-15或il-15rα(寿司)的质粒，然后亚克隆到含有fc融合搭配物(例如，如图11a-11c中描绘的恒定区)的ptt5表达载体中。通过标准诱变技术将如上所述鉴定的残基被半胱氨酸取代。图36a-图36d中描绘具有工程化二硫键的il-15/rα-fc融合蛋白的卡通示意图。

dsil-15/rα-异源fc形式的说明性蛋白质(图36a)包括xenp22013、xenp22014、xenp22015和xenp22017，其序列描绘于37a-37b中。dsil-15/rα-fc形式的说明性蛋白质(图36b)包括xenp22357、xenp22358、xenp22359、xenp22684和xenp22361，其序列描绘于图38a-38b中。dsil-15/rα-fc形式的说明性蛋白质(图36c)包括xenp22634、xenp22635和xenp22636，其序列描绘于图39中。fc-dsil-15/rα形式的说明性蛋白质(图36d)包括xenp22639和xenp22640，其序列描绘于图40中。

通过在hek293e细胞中瞬时转染产生蛋白质，并且通过两步纯化方法纯化，所述纯化方法包含蛋白a色谱(gehealthcare)和阴离子交换色谱(hitrapq5ml柱，具有5-40％梯度的50mmtrisph8.5和50mmtrisph8.5，具有1mnacl)。

在纯化蛋白质后，通过毛细管等电聚焦(cef)表征其纯度和均一性。使用labchipgxiitouchht(perkinelmer,waltham,mass.)，使用proteinexpressassaylabchip和proteinexpressassayreagentkit，使用制造商的说明书进行cef。样品一式两份进行，一次在还原条件下(用二硫苏糖醇)，另一次在非还原条件下。正如变性非还原性cef所示，正确形成了许多二硫键，其中与没有工程化二硫键的对照相比，可以看到共价复合物的较大分子量(图41)。

然后在细胞增殖分析中测试蛋白质。将il-15/rα-fc融合蛋白(具有或不具有工程化的二硫键)或对照与pbmc一起培育4天。孵育后，pbmc用抗cd4-percp/cy5.5(rpa-t4)、抗cd8-fitc(rpa-t8)、抗cd45ra-bv510(hi100)、抗cd16-bv421(3g8)、抗cd56-bv421(hcd56)、抗cd27-pe(o323)和抗ki67-apc(ki-67)染色以标记各种细胞群并通过facs分析，如实施例2a中一般描述的。图42a-42c中描绘如ki67表达所指示的nk细胞、cd4+t细胞和cd8+t细胞的增殖。每种il-15/rα-fc融合蛋白和il-15对照都诱导nk细胞、cd8+t细胞和cd4+t细胞的强烈增殖。

c.2c：为降低效能并且增加pk和半衰期而工程化的il-15/rα-fc融合蛋白

为了进一步改善pk并延长半衰期，我们推断降低il-15的效力会降低抗原沉降，从而增加半衰期。通过检查il-15:il-2rβ和il-15：常见γ链界面的晶体结构，以及通过使用moe软件建模，我们预测这些界面处的残基可被取代以降低效力。图43描绘了il-15：受体复合物的结构模型，其显示了预测残基的位置，其中我们设计了等排取代(以降低免疫原性的风险)。图44a-图44c中描绘了针对降低效力而工程化的说明性il-15变体的序列。

通过标准基因合成构筑编码il-15或il-15rα(寿司)的质粒，然后亚克隆到含有fc融合搭配物(例如，如图11中描绘的恒定区)的ptt5表达载体中。通过标准诱变技并入如上所述鉴定的取代。图45a-图45d中描绘为效能降低而工程化的“il-15/rα-异源fc”形式的说明性il-15/rα-fc融合蛋白的序列。图46a-46c中描绘为效能降低而工程化的“scil-15/rα-fc”形式的说明性il-15/rα-fc融合蛋白的序列。图47a-图47b中描绘为效能降低而工程化的“ncil-15/rα-fc”形式的说明性il-15/rα-fc融合蛋白的序列。图48中描绘为效能降低而工程化的说明性ncil-15/rα异源二聚体的序列。图49中描绘为效能降低而工程化的“二价ncil-15/rα-fc”形式的说明性il-15/rα-fc融合蛋白的序列。图50中描绘为效能降低而工程化的“dsil-15/rα-fc”形式的说明性il-15/rα-fc融合蛋白的序列。通过在hek293e细胞中瞬时转染产生蛋白质，并且通过两步纯化方法纯化，所述纯化方法包含蛋白a色谱(gehealthcare)和阴离子交换色谱(hitrapq5ml柱，具有5-40％梯度的50mmtrisph8.5和50mmtrisph8.5，具有1mnacl)。

d.2c(a)：为降低的效力而工程化的变体il-15/rα-fc融合蛋白的体外活性

在许多细胞增殖分析中测试变体il-15/rα-fc融合蛋白。

在第一次细胞增殖分析中，将il-15/rα-fc融合蛋白(具有或不具有工程化取代)或对照与pbmc一起培育4天。培育后，pbmc用抗cd4-evolve605(sk-3)、抗cd8-percp/cy5.5(rpa-t8)、抗cd45ra-apc/cy7(hi100)、抗cd16-efluor450(cb16)、抗cd56-efluor450(tuly56)、抗cd3-fitc(okt3)和抗ki67-apc(ki-67)染色以标记各种细胞群并且通过facs分析，如实施例2a一般性描述。图51a-图51c和52中描绘如ki67表达所指示的nk细胞、cd8+t细胞和cd4+t细胞的增殖。大多数il-15/rα-fc融合蛋白诱导每个细胞群的增殖；然而，活性根据特定的工程化取代而变化。

在第二次细胞增殖分析中，将il-15/rα-fc融合蛋白(具有或不具有工程化取代)与pbmc一起培育3天。培育后，pbmc用抗cd3-fitc(okt3)、抗cd4-evolve604(sk-3)、抗cd8-percp/cy5.5(rpa-t8)、抗cd16-efluor450(cb16)、抗cd56-efluor450(tuly56)、抗cd27-pe(o323)、抗cd45ra-apc/cy7(hi100)和抗ki67-apc(20raj1)抗体染色以标记各种细胞群。图53a-53c和54a-54c描述了通过facs的与xenp22821孵育后各种细胞群的选择。首先基于侧向散射(ssc)和前向散射(fsc)对淋巴细胞进行门控(图53a)。然后基于cd3表达门控淋巴细胞(图53b)。基于cd16表达进一步门控cd3表达阴性的细胞以鉴定nk细胞(cd16+)(图53c)。基于cd4和cd8表达进一步门控cd3+t细胞以鉴定cd4+t细胞、cd8+t细胞和γδt细胞(cd3+cd4-cd8-)(图54a)。如图54b-图54c所示，将cd4+和cd8+t细胞门控以表达cd45ra。最后，基于ki67表达的百分比确定各种细胞群的增殖，并且数据显示在图56a-图56d中。nk和cd8+t细胞比cd4+t细胞对il-15/rα-fc融合蛋白更敏感，并且如上所述，增殖活性根据特定的工程化取代而变化。图56d显示各种il-15/rα-fc融合蛋白相对于对照xenp20818的ec50倍数变化。图55a和b进一步描绘在pben与xenp22821一起培育之前和之后，通过针对cd69和cd25(t细胞活化标记物)的表达进行门控，用il-15/rα-fc融合蛋白处理后淋巴细胞的活化。

在第三个实验中，在37℃下将额外变体il-15/rα-fc融合蛋白与人类pbmc一起培育3天。培育后，pbmc用抗cd3-fitc(okt3)、抗cd4-sb600(sk-3)、抗cd8-percp/cy5.5(rpa-t8)、抗cd45ra-apc/cy7(hi100)、抗cd16-efluor450(cb16)、抗cd25-pe(m-a251)和抗ki67-apc(ki-67)染色以标记各种细胞群并且通过facs分析，如实施例2a中所述。图57a-图57d中描绘如ki67表达所指示的cd8+(cd45ra-)t细胞、cd4+(cd45ra-)t细胞、γδt细胞和nk细胞的增殖。

在第四个实验中，将人类pbmc与指定浓度的额外il-15/rα-fc变体一起培育3天。孵育后，pbmc用抗cd3-fitc(okt3)，抗cd4(sb600)，抗cd8-percp/cy5.5(rpa-t8)，抗cd16-efluor450(cb16)，抗cd25染色。-pe(m-a251)，抗-cd45ra-apc/cy7(hi100)和抗-ki67-apc(ki67)，并如实施例2a中一般描述的通过facs分析。处理后cd8+t细胞、cd4+t细胞和nk细胞上ki67的百分比描绘于图58a-图58c中。

在第五个实验中，将变体il-15/rα-fc融合蛋白与人pbmc在37℃下孵育3天。培育后，细胞用抗cd3-pe(okt3)、抗cd4-fitc(rpa-t4)、抗cd8α-bv510(sk1)、抗cd8β-apc(2st8.5h7)、抗cd16-bv421(3g8)、抗cd25-percp/cy5.5(m-a251)、抗cd45ra-apc/cy7(hi100)、抗cd56-bv605(ncam16.2)和抗ki67-pe/cy7(ki-67)染色并且通过facs分析，如实施例2a中一般描述。图59a-图59e中描绘cd8+t细胞、cd4+t细胞、γδt细胞和nk细胞上ki67的百分比。

在第六个实验中，将变体il-15/rα-fc融合蛋白与人pbmc在37℃下孵育3天。培育后，细胞用抗cd3-pe(okt3)、抗cd4-fitc(rpa-t4)、抗cd8α-bv510(sk1)、抗cd8β-apc(sidi8bee)、抗cd16-bv421(3g8)、抗cd25-percp/cy5.5(m-a251)、抗cd45ra-apc/cy7(hi100)、抗cd56-bv605(ncam16.2)和抗ki67-pe/cy7(ki-67)染色并且通过facs分析，如实施例2a中一般描述。图60a-图60e中描绘cd8+t细胞、cd4+t细胞、γδt细胞和nk细胞上ki67的百分比。

在第七个实验中，在37℃下将变体il-15/rα-fc融合蛋白与指定浓度的人类pbmc一起培育3天。培育后，pbmc用抗cd3-pe(okt3)、抗cd4-fitc(rpa-t4)、抗cd8-apc(rpa-t8)、抗cd16-bv605(3g8)、抗cd25-percp/cy5.5(m-a251)、抗cd45ra-apc/fire750(hi100)和抗ki67-pe/cy7(ki-67)染色，并且通过facs分析，如实施例2a中一般描述的。图61a-61d中描绘cd8+t细胞、cd4+t细胞、γδt细胞和nk(cd16+)细胞上的ki67百分比。数据显示，ncil-15/rα-fc融合蛋白xenp21479是cd8+t细胞、cd4+t细胞、nk(cd16+)细胞和γδt细胞增殖中最有效的诱导物。每种scil-15/rα-fc融合蛋白在诱导增殖方面都不如xenp21479有效，但差异取决于连接子长度以及特定的工程化取代。

在第八个实验中，在37℃下将变体il-15/rα-fc融合蛋白与指定浓度的人类pbmc一起培育3天。培育后，pbmc用抗cd3-pe(okt3)、抗cd4-fitc(rpa-t4)、抗cd8-apc(rpa-t8)、抗cd16-bv605(3g8)、抗cd25-percp/cy5.5(m-a251)、抗cd45ra-apc/fire750(hi100)和抗ki67-pe/cy7(ki-67)染色，并且通过facs分析，如实施例2a中一般描述的。图62a-62d中分别描绘cd8+t细胞、cd4+t细胞、γδt细胞和nk(cd16+)细胞上的ki67百分比。如上所述，数据显示ncil-15/rα-fc融合蛋白xenp21479是cd8+t细胞、cd4+t细胞、nk(cd16+)细胞和γδt细胞增殖中最有效的诱导物。值得注意的是，与野生型(xenp21479)相比，将q108e取代引入ncil-15/rα-fc形式(xenp24349)显著降低其增殖活性。

e.2c(b)：为效能降低而工程化的il-15/rα-fc融合蛋白的pk

为了研究为效能降低而工程化的il-15/rα-fc融合蛋白是否具有改善的半衰期和pk，我们在c57bl/6小鼠的pk研究中检查了这些变体。在第0天，通过iv-tv向两组小鼠(每组测试物5只小鼠)给药0.1mg/kg指定的测试物。在给药后60分钟收集血清，然后在第2天、第4天和第7天收集血清用于第1组，并且在第1、3和8天用于第2组。在夹心elisa中使用抗il-15和抗il-15rα抗体测定il-15/rα-fc融合蛋白的血清含量。结果如图63所示。图64描绘测试品的效能与半衰期之间的相关性。效能降低的变体显示出显著更长的半衰期。值得注意的是，与野生型对照xenp20818的0.5天相比，半衰期延长到近9天(参见xenp22821和xenp22822)。

xvii.实施例3：靶向pd-1的il-15/rα-fc融合蛋白

a.3a：靶向pd-1的il-15/rα-fc融合蛋白的产生和物理表征

通过标准基因合成构建编码il-15、il-15rα寿司结构域或抗pd-1可变区的质粒，然后亚克隆到含有fc融合搭配物(例如，如图12中描绘的恒定区)的ptt5表达载体中。说明性靶向pd-1的il-15/rα-fc融合蛋白的卡通示意图显示在图65a-图65k中。

“scil-15/rα×scfv”形式(图65a)包含通过可变长度的连接子与il-15融合的il-15rα(寿司)(称为“scil-15/rα”)，其随后与异源二聚体fc区的n端融合，scfv与异源二聚体fc的另一侧融合。图66中描绘了该形式的示例性蛋白质的序列。

“scfv×ncil-15/rα”形式(图65b)包含与异源二聚体fc区的n端融合的scfv，il-15rα(寿司)与异源二聚体fc的另一侧融合，同时单独转染il-15以使得形成非共价il-15/rα复合物。图67中描绘了该形式的示例性蛋白质的序列。

“scfv×dsil-15/rα”形式(图65c)与“scfv×ncil-15/rα”形式相同，但其中由于工程化的半胱氨酸，il-15rα(寿司)和il-15共价连接。图68中描绘了该形式的示例性蛋白质的序列。

“scil-15/rαxfab”形式(图65d)包含通过可变长度的连接子与il-15融合的il-15rα(寿司)(称为“scil-15/rα”)，其随后与异源二聚体fc区的n端融合，可变重链(vh)与异源二聚体fc的另一侧融合，同时单独转染相应轻链以形成具有vh的fab。图69a-图69d中描绘了该形式的示例性蛋白质的序列。

“ncil-15/rα×fab”形式(图65e)包含与异源二聚体fc区的n端融合的vh，il-15rα(寿司)与异源二聚体fc的另一侧融合，同时单独转染相应轻链以形成具有vh的fab，并且同时单独转染il-15以使得形成非共价il-15/rα复合物。图70中描绘了该形式的示例性蛋白质的序列。

“dsil-15/rα×fab”形式(图65f)与“ncil-15/rα×fab”形式相同，但其中由于工程化的半胱氨酸，il-15rα(寿司)和il-15共价连接。图71中描绘了该形式的示例性蛋白质的序列。

“mab-scil-15/rα”形式(图65g)包含与第一和第二异源二聚体fc的n端融合的vh，il-15与随后与异源二聚体fc区中的一个的c端进一步融合的il-15rα(寿司)融合，同时单独转染相应轻链以形成具有vh的fab。图72中描绘了该形式的示例性蛋白质的序列。

“mab-ncil-15/rα”形式(图65h)包含与第一和第二异源二聚体fc的n端融合的vh，il-15rα(寿司)与异源二聚体fc区中的一个的c端融合，同时单独转染相应轻链以形成具有vh的fab，并且同时单独转染il-15以使得形成非共价il-15/rα复合物。图73中描绘了该形式的示例性蛋白质的序列。

“mab-dsil-15/rα”形式(图65i)与“mab-ncil-15/rα”形式相同，但其中由于工程化的半胱氨酸，il-15rα(寿司)和il-15共价连接。图74中描绘了该形式的示例性蛋白质的序列。

“中心-il-15/rα”形式(图65j)包含以重组方式与随后与异源二聚体fc的一侧进一步融合的il-15的n端融合的vh和以重组方式与随后与异源二聚体fc的另一侧进一步融合的il-15rα(寿司)的n端融合的vh，同时单独转染相应轻链以形成具有vh的fab。图75中描绘了该形式的示例性蛋白质的序列。

“中心-scil-15/rα”形式(图65k)包含与il-15rα(寿司)的n端融合的vh和与异源二聚体fc的另一侧融合的vh，所述il-15rα(寿司)与随后与异源二聚体fc的一侧进一步融合的il-15融合，同时单独转染相应轻链以形成具有vh的fab。图76中描绘了该形式的示例性靶向pd-1的il-15/rα-fc蛋白的序列。

通过尺寸排阻色谱法(sec)和毛细管等电聚焦(cef)表征靶向pd-1的il-15/rα-fc融合蛋白的纯度和均质性。

使用sec分析蛋白质以测量它们的大小(即流体动力学体积)并确定纯化样品的天然样行为。该分析在agilent1200高效液相色谱(hplc)系统上进行。使用1xpbs，ph7.4作为流动相在4℃下以1.0ml/min将样品注射到superdex^tm20010/300gl色谱柱(gehealthcarelifesciences)上，持续25分钟，uv检测波长为280nm。使用agilentopenlab色谱数据系统(cds)chemstation版本aic版本c.01.07进行分析。图77b中显示了il-15/rαxscfv形式的示例性靶向pd-1的il-15/rα-fc融合蛋白xenp21480的色谱图。

使用labchipgxiitouchht(perkinelmer，waltham，ma)，使用proteinexpressassaylabchip和proteinexpressassayreagentkit，使用制造商的说明书，通过cef电泳分析蛋白质。样品一式两份进行，一次在还原条件下(用二硫苏糖醇)，另一次在非还原条件下。xenp21480的凝胶图像显示在图77c中。

如实施例1b(a)中一般描述的，使用octet进行il-2rβ和pd-1的异二聚体fc融合蛋白的亲和筛选。在第一个筛选中，使用抗人fc(ahc)生物传感器捕获测试物品，然后浸入多种浓度的il-2rβ(r&dsystems,minneapolis,minn.)或组氨酸标记的pd-1，用于kd测定。xenp21480的亲和力结果和相应的传感图如图77d-图77e所示。在第二个筛选中，使用his1k生物传感器捕获组氨酸标记的il-2rβ：常见γ链复合物-fc融合体或组氨酸标记的pd-1-fc融合体，然后浸入2个不同批次的xenp25850，其传感图描绘在图78a-图78b中。

使用差示扫描荧光法(dsf)评估异二聚体fc融合蛋白的稳定性。使用bio-radcfx连接实时pcr检测系统进行dsf实验。将蛋白质与sypro橙色荧光染料混合且在pbs中稀释到0.2mg/ml。sypro橙色的最终浓度为10x。在25℃下孵育初始10分钟后，使用1℃/min的加热速率将蛋白质从25℃加热至95℃。每30秒进行一次荧光测量。使用仪器软件计算解链温度(tm)。xenp21480的稳定性结果和相应的熔解曲线描绘于图77f中。

b.3b：靶向pd-1的il-15/rα-fc融合蛋白在细胞增殖测定中的活性

在细胞增殖测定中测试说明性靶向pd-1的il-15/rα-fc融合蛋白xenp21480和对照。用指定浓度的测试物处理人类pbmc。处理4天后，pbmc用抗cd8-fitc(rpa-t8)、抗cd4-percp/cy5.5(okt4)、抗cd27-pe(m-t271)、抗cd56-bv421(5.1h11)、抗cd16-bv421(3g8)和抗cd45ra-bv605(hi100)染色以便对以下细胞类型进行门控：cd4+t细胞、cd8+t细胞和nk细胞(cd56+/cd16+)。ki67是与细胞增殖严格相关的蛋白质，并且使用抗ki67-apc(ki-67)和foxp3/转录因子染色缓冲液组(马萨诸塞州沃尔瑟姆的赛默飞世尔科技(thermofisherscientific,waltham,mass.))进行细胞内ki67的染色。使用facs测量ki67对上述细胞类型的百分比(描绘于图79a-79c)。

c.3c：在seb刺激的pbmc测定中靶向pd-1的il-15/rα-fc融合蛋白的活性

用10ng/ml的seb与20μg/ml的靶向pd-1的il-15/rα-fc融合蛋白或对照联合刺激来自多个供体的人pbmc72小时。处理后，收集上清液并分析il-2，其数据如图80所示。

d.3d：靶向pd-1的il-15/rα-fc融合蛋白增强了人pbmc植入的nsg小鼠中的植入和疾病活性

说明性的靶向pd-1的il-15/rα-fc融合蛋白在nsg(nod-scid-γ)免疫缺陷小鼠中进行的移植物抗宿主病(gvhd)模型中进行了评估。当向nsg小鼠注射人类pbmc时，人类pbmc发展出针对小鼠细胞的自身免疫应答。用人pbmc注射nsg小鼠，然后用靶向pd-1的il-15/rα-fc融合蛋白注射进行治疗增殖了移植的t细胞并增强了植入。

在第一项研究中，在第-8天通过iv-osp将1000万个人类pbmc植入nsg小鼠中，然后在第0天用指定浓度的指定测试物给药。在第4、7和11天测量ifnγ水平和人cd45⁺淋巴细胞、cd8⁺t细胞和cd4+t细胞计数。图81描绘了在第4、7和11天小鼠血清中的ifnγ水平。图82a-图82c分别描绘了第4,7和11天的cd8+t细胞计数。图83a-图83c分别描绘了第4,7和11天的cd4+t细胞计数。图84a-图84c分别描绘了在第4、7和11天的cd45+细胞计数。还在第4天、第7天和第11天测量小鼠的体重，并将其描绘为图85a-图85c中初始体重的百分比。

在第二项研究中，在第-7天通过iv-osp将1000万人类pbmc移植到nsg小鼠中，然后在第0和19天以指定浓度给予以下测试物：xenp16432(二价抗pd-1mab，具有基于纳武单抗的消融效应子功能；图86中所示的序列；3.0mg/kg)，xenp24050(0.61mg/kg)，xenp25951(基于xenp25850的pd-1靶向臂的单价抗pd-1fab-fc；图87中所示的顺序；0.82mg/kg)，xenp24050与xenp25951的组合(分别为0.61和0.82mg/kg)和xenp25850(1.0mg/kg)。在第4、7和11天测量细胞计数，并且分别在图88-图91中描绘了cd45+细胞、cd3+细胞、cd4+细胞和cd8+细胞的细胞计数。数据显示，到第7天，靶向pd-1的il-15/rα-fc融合蛋白增加了cd45+、cd3+、cd4+和cd8+细胞计数，表明gvhd增强。值得注意，与结合xenp25951的xenp24050相比，xenp25850增强gvhd的程度要大得多，这表明增强的gvhd归因于il-15/rα-fc融合蛋白的pd-1靶向作用，而不仅仅是il-15和pd-1阻断的联合作用。

e.3e：本发明的靶向pd-1的il-15/rα-fc融合蛋白优先扩增活化的淋巴细胞

在细胞因子与其受体结合后，与受体缔合的janus激酶(jak)使stat蛋白磷酸化，然后所述stat蛋白转运到细胞核中以调节进一步的下游过程。因此，stat蛋白(特别是stat5，其包括stat5a和stat5b)的磷酸化是由il-15与其受体结合触发的最早的信号事件之一。因此，研究了靶向pd-1的il-15/rα-fc融合蛋白在各种细胞类型中诱导stat5磷酸化的能力。

对于该实验，使用新鲜的和活化的pbmc。通过用100ng/ml平板结合的抗cd3(okt3)刺激新鲜的pbmc2天来制备用作肿瘤环境中活化淋巴细胞替代物的活化pbmc。在37℃下将新鲜的和活化的pbmc与以下测试品在指定浓度下一起培育15分钟：xenp20818(wtil-15/rα-fc)、xenp24050(说明性的效力降低的il-15/rα-fc)和xenp25850(说明性的靶向pd-1的il-15/rα-fc融合蛋白)。为了在培育后门控各种细胞群，在室温下pbmc用抗cd3-buv395(ucht1)、抗cd4-bv605(rpa-t4)和抗cd8-alexa700(sk1)染色30-45分钟。洗涤细胞，并且与预冷(-20℃)90％甲醇一起培育20-60分钟。甲醇培育后，再次洗涤细胞，并且用抗cd25-bv421(m-a251)、抗cd45ra-bv510(hi100)和抗pstat5-alexa647(py687)染色以标记各种细胞群和stat5磷酸化。图92a-图92h中描绘了描绘诱导各种cd8+和cd4+t细胞群上的stat5磷酸化的数据。值得注意，数据显示，靶向pd-1的il-15/rα-fc融合蛋白(xenp25850)表现出激活的pbmc对t细胞的增强作用(由于pd-1表达增加)，同时保持了最低限度，并且在某些情况下与等效的非靶向降低效力的il-15/rα-fc融合蛋白(xenp24050)相比，降低了新鲜pbmc对t细胞的作用。这表明，在临床情况下，靶向pd-1的il-15/rα-fc融合蛋白将对肿瘤环境中具有较高pd-1表达的活化的肿瘤浸润淋巴细胞具有选择性。

xviii.实施例4：具有调整的pd-1亲和力的靶向pd-1的il-15/rα-fc融合蛋白

a.4a：亲和力工程化pd-1靶向臂

接下来，我们寻求优化pd-1靶向臂的亲和力。我们在以下背景下基于抗pd-1克隆1c11人源化变体h3l3(如在xenp22553中)的可变区生成了变体文库：scfvs(在图93a-图93t中描述了的序列)的背景下、二价mab(其序列描绘于图94a-图94ap)的背景下、以及可变重链和可变轻链(其序列分别描绘于图95a-图95j和图96a-图96f)的背景下。

为了确定scfv文库的变体的亲和力，来自scfv的可变区被格式化为具有e233p/l234v/l235a/g236del/s267k取代的二价igg1形式的fab。通过基因合成产生编码重链和轻链的dna且使用标准分子生物学技术将其克隆到含有igg1恒定区的ptt5表达载体中，且瞬时转染到hek293e细胞中。使用octet进行上清液的亲和力筛选。抗人类fc(ahc)生物传感器用于捕获每个上清液的1:2稀释液到2.0nm的密度，并且浸渍到pd-1-his中用于kd确定。亲和力结果描绘于图图97a-图97q中。

如上所述，还使用octet在许多实验中对来自二价mab库的变体进行了亲和力筛选，其结果如图98-图104所描绘。

如上所述，还在使用octet的几个实验中进行了基于以二价igg1格式格式化的可变重链和可变轻链变体的组合的变体亲和力筛选，其结果在图105a-图105e和图106中描绘。

还使用基于表面等离振子共振(spr)的技术biacore确定了所选1c11变体(以及基于纳武单抗(xenp16432)和派姆单抗(xenp21461)的对照mab)的亲和力筛选。biacore的实验步骤通常包括以下各者：固定(将配体捕获到传感器芯片上)；缔合(使各种浓度的分析物在传感器芯片上流动)；和解离(使缓冲液在传感器芯片上流动)以便确定测试物的亲和力。具有单独缓冲液的参考流还包括于数据处理期间的背景校正的方法中。使用1:1结合模型通过分析经处理数据，得到结合亲和力和动力学速率常数。确切地说，将抗pd-1mab捕获到蛋白质a传感器芯片上，且随后使多浓度经组氨酸标记的人类pd-1或经组氨酸标记的食蟹猴pd-1在传感器芯片上流动。所得解离常数(kd)描绘于图107中。

最后，我们研究了亲和力优化的1c11变体的t细胞表面结合。在经seb刺激pbmc分析中测量亲和力优化的1c11变体与t细胞的结合。用500ng/mlseb刺激人类pbmc持续3天。在刺激之后，将pbmc用所指示浓度的所指示测试物培育30分钟。将pbmc用抗cd3-fitc(ucht1)和a647标记的抗体染色。如a647mfi所指示，在fitc+细胞上测试物与t细胞的结合描绘于图108中。

b.4b：靶向pd-1的il-15/rα-fc融合蛋白的活性与pd-1亲和力相关

我们设计并生产了示例性的靶向pd-1的il-15/rα-fc融合蛋白，包括如实施例3a中一般所述的亲和力改造的pd-1靶向臂，其序列在图109a-图109d中描绘，并研究其活性。

人pbmc用500ng/ml的板结合的抗cd3(okt3)刺激48小时，然后用cfse标记并用以下测试物在37℃温育4天：xenp25850(基于1c11_h3l3的靶向pd-1的il-15/rα-fc融合蛋白)；xenp29159(基于亲和力成熟的1c11_h3.329_l3.220的靶向pd-1的il-15/rα-fc融合蛋白)；xenp24306(具有d30n/e64q/n65dil-15变体的对照非靶向il-15(d30n/e64q/n65d)/rα-fc融合蛋白)；和xenp26007(具有n4d/n65dil-15变体的对照靶向rsv的il-15/rα-fc融合蛋白)。使用以下抗体对细胞进行染色：抗lag-3-pe(3ds223h)、抗cd8-percp-cy5.5(sk1)、抗cd3-pe-cy7(okt3)、抗cd45ro-apc-fire750(uchl1)、抗hla-dr-alexa700(l243)、抗cd16-bv605(3g6)、抗cd56-bv605(hcd56)、抗cd25-bv711(m-a251)、抗cd45ra-bv785(hi100)、抗cd4-buv395(sk3)和zombieaqua-bv510，并通过流动分析各种细胞群体。

我们基于cfse稀释(zombieaqua以排除死细胞)研究了各种t细胞和nk细胞群体的增殖，其数据显示在图110a-图110b、图111a-图111b、图112a-图112b、图113a-图113b、图114a-图114b、图115a-图115b。数据显示，与未靶向的il-15(d30n/e64q/n65d)/rα-fc融合蛋白(以及对照靶向rsv的il-15/rα-fc融合蛋白)相比，靶向pd-1的il-15/rα-fc融合蛋白在诱导cd4⁺t细胞增殖方面更有效得多。值得注意的是，靶向pd-1的il-15/rα-fc融合蛋白优先靶向记忆t细胞，这表明，在临床情况下，靶向pd-1的il-15/rα-fc融合蛋白将对肿瘤环境中活化的肿瘤浸润淋巴细胞具有选择性。

我们还研究了基于cd25(晚期t细胞激活标记)和hla-dr(另一种激活标记)表达的各种t细胞群体的激活，其数据描述在图116a-图116d、图117a-图117d和图118a-图118d中。数据显示，与非靶向的il-15(d30n/e64q/n65d)/rα-fc融合蛋白(以及对照靶向rsv的il-15/rα-fc融合蛋白)相比，靶向pd-1的il-15/rα-fc融合蛋白通常表现出更强的诱导各种t细胞群体活化的作用。

总体而言，数据表明靶向pd-1的il-15/rα-fc融合蛋白的活性与pd-1亲和力相关例如，如图110a-110d所示，xenp29159(具有亲和力增强的pd-1靶向臂)比xenp25850更有效地诱导cd8+和cd4+t细胞的增殖。

xix.实施例5：具有调整的il-15效力的靶向pd-1的il-15/rα-fc融合蛋白

a.5a：il-15(d30n/n65d)变体

在研究带有xtend的il-15-fc效能变体的药代动力学的研究中，食蟹猕猴接受了各种浓度的第一单次静脉内(i.v.)剂量的xenp22853(带有xtend的wtil-15/rα-异源fc；序列如图119所示)，xenp24306(带有xtend的il-15(d30n/e64q/n65d)/rα-异源fc；序列如图122所示)，xenp24113(带有xtend的il-15(n4d/n65d)/rα-异源fc；序列如图120所示)和xenp24294(带有xtend的scil-15(n4d/n65d)/rα-fc；序列如图121所示)。

图123描绘了第一剂量后随时间变化的测试物的血清浓度。如预期的那样，在xtend取代之外并入功效变体(如xenp24306和xenp24113中)大大改善了il-15-fc融合蛋白的药代动力学(与xenp22583相比)。然而，出乎意料的是，与xenp24306相比，il-15/rα-异源fc融合蛋白xenp24113和scil-15/rα-fc融合蛋白xenp24294(其具有相同的il-15(n4d/n65d)功效变体)显示出降低的药代动力学。这表明降低的药代动力学是由于特定的il-15功效变体而不是il-15-fc融合蛋白的格式。先前的发现表明具有il-15(n4d/n65d)变体的il-15-fc融合蛋白比具有il-15(d30n/e64q/n65d)变体的il-15-fc融合蛋白具有更高的体外效能，尽管根据这种先前的发现预期xenp24113和xenp24294的药代动力学会降低，但是药代动力学的下降出乎意料地与药效的增加不成比例。因此，我们试图确定在本发明的靶向lag-3的il-15-fc融合蛋白中使用的替代性il-15功效变体。

我们注意到il-15(n4d/n65d)在负责与cd122结合的il-15界面上有两个取代基，而il-15(d30n/e64q/n65d)在il-15：cd122界面上有两个取代基(e64q和n65d)；并且在il-15界面上的一个取代基(d30n)负责与cd132的结合。因此，我们认为il-15：cd132界面处的修饰可有助于xenp24306观察到的优异药代动力学。值得注意的是，我们发现包含il-15(n4d/n65d)变体和il-15(d30n/n65d)变体的scil-15/rα-fc融合蛋白如图125所示显示出非常相似的体外功效。鉴于以上内容，我们构思了包括il-15(d30n/n65d)变体的示例性靶向pd-1的il-15-fc融合蛋白，其序列在图126a-图126d中示出。我们还产生了具有il-15(d30n/n65d)变体的对照靶向rsv的il-15/rα-fc融合蛋白xenp29481，其序列如图129a-图129b所示。

b.5b：il-15(d30n/e64q/n65d)变体

尽管将靶向pd-1的il-15/rα-fc融合蛋白设计为旨在通过靶向pd-1的臂而靶向肿瘤环境，但细胞因子部分仍能够在到达肿瘤部位之前进行信号传导，并可能会导致全身毒性。因此，我们寻求通过构建具有il-15(d30n/e64q/n65d)变体的靶向pd-1的il-15/rα-fc融合蛋白进一步降低il-15的功效，如实施例2c和图125所示，其活性大大降低。图127a-图127d中描述了包含il-15(d30n/e64q/n65d)变体的示例性靶向pd-1的il-15/rα-fc融合蛋白的序列。另外，我们构建了xenp30432，它是一种包含il-15(d30n/e64q/n65d)变体的靶向rsv的il-15/rα-fc融合蛋白(序列如图129a-图129b所示)，以用作替代物来研究包含il-15(d30n/e64q/n65d)变体的靶向pd-1的il-15/rα-fc融合蛋白在肿瘤环境之外的行为。