共轭低聚电解质作为抗菌剂的制作方法

共轭低聚电解质作为抗菌剂
发明领域
[0001]
本发明涉及共轭低聚电解质及其作为针对广谱感染原包括细菌、真菌和病毒的抗菌剂的用途，以及包含所述化合物的组合物。


背景技术：

[0002]
在本说明书中对先前公开的文本的列举或讨论不应视为承认该文本是现有技术的一部分或是公知常识。
[0003]
难以治疗的多重耐药性病原体的出现和传播是世界医疗系统、研究团体、临床医生、政府机构和广大普通民众极为关注的问题。这种全球性威胁目前由为数不多的新兴药物来应对，并因此引起了对新类抗菌剂的迫切需要。鉴于此，世界卫生组织(who)保存了急需新抗生素或抗菌剂的细菌清单。制定这份清单旨在指导和促进新抗生素的研究和开发，这是who为解决日益增长的全球性抗菌药物耐药性所做努力的一部分。
[0004]
一类抗菌药物是抗菌肽(amp)，其被认为是用于治疗多重耐药性细菌的有前途的候选药物。然而，只有少数amp经过了临床批准，且这在很大程度上是由于其制备成本高以及其化学、蛋白水解和物理稳定性不理想。另外，amp的结构复杂性使其转化为药物具有挑战性。
[0005]
另一方面，已经开发了合成的插入膜的amp模拟物，其在克服某些限制的同时捕获了amp的一些基本功能。这些的实例包括芳基酰胺低聚物、聚降冰片烯、聚甲基丙烯酸酯和被称为共轭低聚电解质(conjugated oligoelectrolyte，coe)的一类新兴化合物。典型地，coe包含疏水性共轭主链结构和末端极性侧基，并且具有可能是通过插入并破坏微生物膜从而抑制微生物生长的潜能。
[0006]
鉴于以上，仍然需要新的抗菌剂，其对于广谱的微生物展示出高抗菌活性且同时对于哺乳动物细胞呈现低毒性，并且其大量生产是容易且廉价的。这样的抗菌剂有可能用作用于细菌感染的药物产品，或者可以有利地掺入用于个人护理和/或卫生产品的清洁剂或化妆品剂(诸如皂、洗涤剂和洗发剂)以及杀生物剂中。


技术实现要素：

[0007]
本发明的方面和实施方式在以下编号的条款中提供。
[0008]
1.式i的化合物：
[0009][0010]
其中：
[0011]
n是0至4；
[0012]
m在每次出现时独立地表示1至12；
[0013]
p和q在每次出现时独立地表示0至4；
[0014]
r1在每次出现时独立地表示c
1-12
烷基基团、
–
(ch2)
o-nr1’
r2’
基团或
–
(ch2)
o
’-n
+
r1’
r2’
r3’
基团，后一基团的电荷被x-平衡；
[0015]
r1’
、r2、r3、r2’
和r3’
各自独立地是c
1-12
烷基基团；
[0016]
o和o’是1至12；
[0017]
r4至r9在每次出现时独立地表示：
[0018]
(a)h；
[0019]
(b)卤素；
[0020]
(c)cn；
[0021]
(d)c
1-6
烷基、c
2-6
烯基、c
2-6
炔基(其中后三个基团是未取代的或由选自以下的一种或多种取代基取代的：f、cl、br(例如cl、f，诸如f)、硝基、cn、c
1-6
烷基、c
2-6
烯基、c
2-6
炔基(其中后三个基团是未取代的或由选自以下的一种或多种取代基取代的：oh、
═
o、f、cl、br(例如cl、f，诸如f)、c
1-4
烷基和c
1-4
烷氧基)、cy1(其中cy1基团是未取代的或由选自以下的一种或多种取代基取代的：f、cl、br(例如cl、f，诸如f)、硝基、cn、c
1-6
烷基、c
2-6
烯基、c
2-6
炔基(其中后三个基团是任选地由选自以下的一种或多种取代基取代的：oh、
═
o、f、cl、br(例如cl、f，诸如f)、c
1-4
烷基和c
1-4
烷氧基)、or
12a
、s(o)
r
r
12b
、s(o)2nr
12c
r
12d
、nr
12e
s(o)2r
12f
、nr
12g
r
12h
、芳基和het1)；
[0022]
(e)cy2(其中cy2基团是未取代的或由选自以下的一种或多种取代基取代的：f、cl、br(例如cl、f，诸如f)、硝基、cn、c
1-6
烷基、c
2-6
烯基、c
2-6
炔基(其中后三个基团是任选地由选自以下的一种或多种取代基取代的：oh、
═
o、f、cl、br(例如cl、f，诸如f)、c
1-4
烷基和c
1-4
烷氧基)、or
13a
、s(o)
r
r
13b
、s(o)2nr
13c
r
13d
、nr
13e
s(o)2r
13f
、nr
13g
r
13h
、芳基和het2)，
[0023]
(f)het
a
(其中het
a
基团是未取代的或由选自以下的一种或多种取代基取代的：卤素、硝基，cn、c
1-6
烷基、c
2-6
烯基、c
2-6
炔基(其中后三个基团是任选地由选自以下的一种或多种取代基取代的：oh、
═
o、f、cl、br(例如cl、f，诸如f)、c
1-4
烷基和c
1-4
烷氧基)、or
14a
、s(o)
r
r
14b
、s(o)2nr
14c
r
14d
、nr
14e
s(o)2r
14f
、nr
14g
r
14h
、芳基和het3)；
[0024]
(g)or
15a
；
[0025]
(h)s(o)
r
r
15b
；
[0026]
(i)s(o)2nr
15c
r
15d
；
[0027]
(j)nr
15e
s(o)2r
15f
；以及
[0028]
(k)nr
15g
r
15h
；
[0029]
r
10
和r
11
在每次出现时独立地表示：
[0030]
(i)h；
[0031]
(ii)f、cl或br；
[0032]
(iii)cn；
[0033]
(iv)c
1-6
烷基、c
2-6
烯基、c
2-6
炔基(其中后三个基团是未取代的或由选自以下的一种或多种取代基取代的：f、cl、br(例如cl、f，诸如f)、硝基、cn、c
1-6
烷基、c
2-6
烯基、c
2-6
炔基(其中后三个基团是未取代的或由选自以下的一种或多种取代基取代的：oh、
═
o、f、cl、br(例如cl、f，诸如f)、c
1-4
烷基和c
1-4
烷氧基)、cy1’
(其中cy1’
基团是未取代的或由选自以下的一种或多种取代基取代的：f、cl、br(例如cl、f，诸如f)、硝基、cn、c
1-6
烷基、c
2-6
烯基、c
2-6
炔基(其中后三个基团是任选地由选自以下的一种或多种取代基取代的：oh、
═
o、f、cl、br(例如cl、f，诸如f)、c
1-4
烷基和c
1-4
烷氧基)、or
12a’、s(o)
r
r
12b’、s(o)2nr
12c’r
12d’、nr
12e’s(o)2r
12f’、nr
12g’r
12h’、芳基和het1’
)；
[0034]
(v)cy2’
(其中cy2’
基团是未取代的或由选自以下的一种或多种取代基取代的：f、cl、br(例如cl、f，诸如f)、硝基、cn、c
1-6
烷基、c
2-6
烯基、c
2-6
炔基(其中后三个基团是任选地由选自以下的一种或多种取代基取代的：oh、
═
o、f、cl、br(例如cl、f，诸如f)、c
1-4
烷基和c
1-4
烷氧基)、or
13a’、s(o)
r
r
13b’、s(o)2nr
13c’r
13d’、nr
13e’s(o)2r
13f’、nr
13g’r
13h’、芳基和het2’
)，
[0035]
(vi)het
a’(其中het
a’基团是未取代的或由选自以下的一种或多种取代基取代的：卤素、硝基、cn、c
1-6
烷基、c
2-6
烯基、c
2-6
炔基(其中后三个基团是任选地由选自以下的一种或多种取代基取代的：oh、
═
o、f、cl、br(例如cl、f，诸如f)、c
1-4
烷基和c
1-4
烷氧基)、or
14a’、s(o)
r
r
14b’、s(o)2nr
14c’r
14d’、nr
14e’s(o)2r
14f’、nr
14g’r
14h’、芳基和het3’
)；
[0036]
(vii)or
15a’；
[0037]
(viii)s(o)
r
r
15b’；
[0038]
(ix)s(o)2nr
15c’r
15d’；
[0039]
(x)nr
15e’s(o)2r
15f’；
[0040]
(xi)nr
15g’r
15h’，
[0041]
r
12a
至r
12h
、r
13a
至r
13h
、r
14a
至r
14h
、r
15a
至r
15h
、r
12a’至r
12h’、r
13a’至r
13h’、r
14a’至r
14h’、r
15a’至r
15h’在每次出现时独立地表示h、c
1-6
烷基、c
2-6
烯基、c
2-6
炔基(其中后三个基团是任选地由选自以下的一种或多种取代基取代的：f、cl、br(例如cl、f，诸如f)、硝基、＝o、c(o)oc
1-4
烷基、cn、c
1-6
烷基、c
2-6
烯基、c
2-6
炔基、c
3-6
环烷基(其中后三个基团是任选地由选自以下的一种或多种取代基取代的：oh、
═
o、f、cl、br(例如cl、f，诸如f)、c
1-4
烷基和c
1-4
烷氧基)、or
16a
、s(o)
r
r
16b
、s(o)2nr
16c
r
16d
、nr
16e
s(o)2r
16f
、nr
16g
r
16h
、芳基和het4)、c
3-10
环烷基或c
4-10
环烯基(其中后两个基团是任选地由选自以下的一种或多种取代基取代的：f、cl、br(例如cl、f，诸如f)、oh、
═
o、c
1-6
烷基和c
1-6
烷氧基)或het
b
；
[0042]
r
16a
至r
16h
在每次出现时独立地表示h、c
1-4
烷基、c
2-4
烯基、c
2-4
炔基，其中后三个基团是任选地由选自以下的一种或多种取代基取代的：f、cl、br(例如cl、f，诸如f)、硝基、cn、
c
1-4
烷基、c
2-4
烯基、c
2-4
炔基(其中后三个基团是任选地由选自以下的一种或多种取代基取代的：oh、
═
o、f、cl、br(例如cl、f，诸如f)、c
1-4
烷基和c
1-4
烷氧基)、c
3-6
环烷基或c
4-6
环烯基(其中后两个基团是任选地由选自以下的一种或多种取代基取代的：f、cl、br(例如cl、f，诸如f)、oh、
═
o、c
1-4
烷基和c
1-4
烷氧基)，
[0043]
het1至het4、het1’
至het3’
、het
a
、het
b
和het
a’独立地表示包含选自o、s和n的一种或多种杂原子的4-至14-元杂环基团，其中杂环基团可以包括一个、两个或三个环，并且可以由选自以下的一种或多种取代基取代：＝o或更特别地卤素、c
1-6
烷基，其中后一基团是任选地由选自以下的一种或多种取代基取代的：f、cl、br(例如cl、f，诸如f)、-or
17a
、-nr
17b
r
17c
、-c(o)or
17d
和-c(o)nr
17e
r
17f
；
[0044]
r
17a
至r
17f
在每次出现时独立地表示h、c
1-4
烷基、c
2-4
烯基、c
2-4
炔基，其中后三个基团是任选地由选自以下的一种或多种取代基取代的：f、cl、br(例如cl、f，诸如f)、硝基、cn、c
1-4
烷基、c
2-4
烯基、c
2-4
炔基(其中后三个基团是任选地由选自以下的一种或多种取代基取代的：oh、
═
o、f、cl、br(例如cl、f，诸如f)、c
1-4
烷基和c
1-4
烷氧基)、c
3-6
环烷基或c
4-6
环烯基(其中后两个基团是任选地由选自以下的一种或多种取代基取代的：f、cl、br(例如cl、f，诸如f)、oh、
═
o、c
1-4
烷基和c
1-4
烷氧基)，
[0045]
cy1、cy2、cy1’
和cy2’
在每次出现时独立地表示3-至10-元芳香族、完全饱和或部分不饱和碳环；
[0046]
r各自独立地表示0、1或2；并且
[0047]
x-各自是药学上可接受的阴离子，
[0048]
或其药学上可接受的盐和溶剂化物。
[0049]
2.根据条款1所述的化合物，其中，p和q是0并且r6至r
11
中的每一个是h。
[0050]
3.根据条款1或条款2所述的化合物，其中，
[0051]
n是0或1；和/或
[0052]
m是4至8。
[0053]
4.根据前述条款中任一项所述的化合物，其中，当存在时，o为2至4，诸如2。
[0054]
5.根据前述条款中任一项所述的化合物，其中，当存在时，o’是2至4，诸如2。
[0055]
6.根据前述条款中任一项所述的化合物，其中，r1至r3中的每一个是甲基。
[0056]
7.根据条款1至5中任一项所述的化合物，其中，r1是
–
(ch2)
o-nr1’
r2’
或
–
(ch2)
o
’-n
+
r1’
r2’
r3’
基团，任选地其中，r2和r3是甲基。
[0057]
8.根据条款1至5和7中任一项所述的化合物，其中，r1是
–
(ch2)
o
’-n
+
r1’
r2’
r3’
基团。
[0058]
9.根据条款1至5以及7至8中任一项所述的化合物，其中，当r1是
–
(ch2)
o-nr1’
r2’
基团或
–
(ch2)
o
’-n
+
r1’
r2’
r3’
基团时，r1’
、r2’
和r3’
各自是c1至c4烷基，诸如甲基基团。
[0059]
10.根据条款1至5以及7至9中任一项所述的化合物，其中，
[0060]
n是0或1；
[0061]
m是4、6或8；
[0062]
r1各自是
–
(ch2)
o-nr1’
r2’
基团或
–
(ch2)
o
’-n
+
r1’
r2’
r3’
基团，后一基团的电荷被x-平衡；
[0063]
r1’
、r2、r3、r2’
和r3’
各自独立地是c
1-4
烷基基团；并且
[0064]
o和o’是2至3。
[0065]
11.根据前述条款中任一项所述的化合物，其中，所述式i的化合物选自由以下组成的组：
[0066]
coe-d4
[0067][0068]
coe-d6
[0069][0070]
coe-d8
[0071][0072]
coe-t4
[0073][0074]
coe-t6
[0075][0076]
coe-d42n
[0077]
[0078]
coe-d62n
[0079][0080]
coe-d82n
[0081][0082]
coe-t42n
[0083][0084]
coe-t62n
[0085][0086]
coe-d42
[0087][0088]
coe-d62
[0089]
[0090]
coe-d82
[0091][0092]
coe-t42
[0093]
和
[0094]
coe-t62
[0095][0096]
12.根据条款11所述的化合物，其中，所述式i的化合物选自由以下组成的组：
[0097]
coe-t4
[0098][0099]
coe-t6
[0100][0101]
coe-d42n
[0102][0103]
coe-d62n
[0104][0105]
coe-d82n
[0106][0107]
coe-t42n
[0108][0109]
coe-t62n
[0110][0111]
coe-d42
[0112][0113]
coe-d62
[0114][0115]
coe-d82
[0116][0117]
coe-t42
[0118]
和
[0119]
coe-t62
[0120][0121]
13.根据条款12所述的化合物，其中，所述式i的化合物选自由以下组成的组：
[0122]
coe-d42n
[0123][0124]
coe-d62n
[0125]
[0126]
coe-d82n
[0127][0128]
coe-t42n
[0129][0130]
coe-t62n
[0131][0132]
coe-d42
[0133][0134]
coe-d62
[0135][0136]
coe-d82
[0137]
[0138]
coe-t42
[0139]
和
[0140]
coe-t62
[0141][0142]
14.根据条款13所述的化合物，其中，所述式i的化合物选自由以下组成的组：
[0143]
coe-d42
[0144][0145]
coe-d62
[0146][0147]
coe-d82
[0148][0149]
coe-t42
[0150]
和
[0151]
coe-t62
[0152][0153]
15.根据条款1至10中任一项所述的化合物，其中，x-各自是选自由以下组成的组的卤根：br-、cl-、f-和i-，任选地其中，x-各自是i-。
[0154]
16.一种药物制剂，包括如条款1至15中任一项所限定的式i的化合物以及药学上可接受的佐剂、稀释剂或载体中的一种或多种。
[0155]
17.如条款1至15中任一项所限定的式i的化合物或其溶剂化物或者如条款16中所限定的药物制剂用于医药的用途。
[0156]
18.如条款1至15中任一项所限定的式i的化合物或者其盐或溶剂化物或者如条款16中所限定的药物制剂用于制备治疗感染的药物的用途，任选地其中，所述感染是微生物感染。
[0157]
19.一种治疗感染的方法，所述方法包括以下步骤：向有此需要的受试者给药治疗有效量的如条款1至15中任一项所限定的式i的化合物或者其盐或溶剂化物或者如条款16中所限定的药物制剂，任选地其中，所述感染是微生物感染。
[0158]
20.如条款1至15中任一项所限定的式i的化合物或者其盐或溶剂化物或者如条款16中所限定的药物制剂用于感染治疗的用途，任选地其中，所述感染是微生物感染。
[0159]
21.根据条款18所述的用途、根据条款19所述的方法或根据条款20所述用途的所述化合物,其中，所述式i的化合物选自由以下组成的组：
[0160]
coe-d62
[0161]
和
[0162]
coe-d82
[0163][0164]
22.一种在易于形成生物膜的系统中从固体基质上去除生物膜或防止生物膜在固体基质上积聚，或杀死、抑制或分散栖息于所述生物膜的微生物的方法，所述生物膜由至少一种微生物形成，所述方法包括以下步骤：使所述系统与有效量的如条款1至15中任一项所限定的式i的化合物或者其盐或溶剂化物或者包括式i的化合物的组合物接触以去除所述生物膜或防止所述生物膜的形成。
[0165]
23.一种化妆品或清洁制剂，包括如条款1至15中任一项所限定的式i的化合物以及适合用于化妆品或清洁制剂的佐剂、稀释剂或载体中的一种或多种。
附图说明
[0166]
图1a和1b描绘了本发明的共轭低聚电解质(coe)的分子结构。
[0167]
图2描绘了以下的合成：(a)coe-d4、coe-d6和coe-d8；和(b)coe-d62n和coe-d82n。
[0168]
图3描绘了coe-d4、coe-d6和coe-d8在以下中的归一化吸收(实线)和光致发光发射(虚线)光谱：(a)pbs；和(b)dmso。在最大激发波长处收集荧光信号(即pbs溶液为324nm，以及dmso溶液为332nm)。
[0169]
图4描绘了：(a)通过动态光散射(dls)测量的coe-d4(高浓度)的尺寸分布图；(b)在dls测量期间，pbs溶液中各种coe的相应的相关曲线；以及(c)在pbs溶液中coe-d4的dls测量期间浓度依赖性推导的计数率。
[0170]
图5描绘了本发明的coe的抗菌功效：(a)coe-d4、coe-d6和coe-d8抗大肠杆菌(e.coli)k12、大肠杆菌uti89和粪肠球菌(e.faecalis)og1rf的mic值；以及(b)coe-d62n和coe-d82n(与万古霉素相比)抗大肠杆菌k12、金黄色葡萄球菌(s.aureus)25923和mrsa baa-40的mic值。
[0171]
图6描绘了：(a-c)sem图像；以及(d-f)分别用pbs中的32μg/ml的coe-d4、coe-d6和coe-d8处理后的大肠杆菌k12的荧光图像。底部的灰度值曲线表示荧光强度，并且描绘出各自显微图中的白线。
[0172]
图7描绘了用不同浓度的以下处理后的单层囊泡的dsc曲线(以1℃min-1
的速率获得)：(a)coe-d8；(b)coe-d6；和(c)coe-d4。
[0173]
图8描绘了以下的吸收光谱：(a)coe-d4、(b)coe-d6、(c)coe-d8于pbs中(10μg ml-1
)，与从用大肠杆菌k12细胞处理2小时并且在室温(25℃)离心后的样本中获得的上清液相比。
[0174]
图9描绘了以下的吸收光谱：(a)coe-d4、(b)coe-d6、(c)coe-d8于pbs中(10μg ml-1
)，与从用大肠杆菌k12细胞处理2小时并且在4℃(低于膜相变温度)离心后的样本中获得的上清液相比。
[0175]
图10描绘了在用32μg/ml的以下处理后分别使用tl相通道或dapi染料通道在同一位置观察到的大肠杆菌k12细胞的明场(左)和荧光(右)显微图像：在pbs中的(a)coe-d4；
(b)coe-d6；和(c)coe-d8。
[0176]
图11描绘了：(a)coe-d62n、coe-d82n和万古霉素抗mrsa baa-40的时间-杀灭(time-kill)测定；以及(b)在进行了17天的耐药性进化实验中，coe-d62n和coe-d82n对于mrsa baa-40的mic。
[0177]
图12描绘了用以下处理的重组人表皮皮肤模型(接种有金黄色葡萄球菌)的荧光显微图：(c)coe-d62n；和(d)coe-d82n。图12a和b分别示出了阴性和阳性对照。
[0178]
图13描绘了coe-d62n和coe-d82n的溶血特性与浓度的关系图。
具体实施方式
[0179]
因此，根据本发明的第一方面，提供了式i的化合物：
[0180][0181]
其中：
[0182]
n是0至4；
[0183]
m在每次出现时独立地表示1至12；
[0184]
p和q在每次出现时独立地表示0至4；
[0185]
r1在每次出现时独立地表示c
1-12
烷基基团、
–
(ch2)
o-nr1’
r2’
基团或
–
(ch2)
o
’-n
+
r1’
r2’
r3’
基团，后一基团的电荷被x-平衡；
[0186]
r1’
、r2、r3、r2’
和r3’
各自独立地是c
1-12
烷基基团；
[0187]
o和o’是1至12；
[0188]
r4至r9中的每一个在每次出现时独立地表示：
[0189]
(a)h；
[0190]
(b)卤素；
[0191]
(c)cn；
[0192]
(d)c
1-6
烷基、c
2-6
烯基、c
2-6
炔基(其中后三个基团是未取代的或由选自以下的一种或多种取代基取代的：f、cl、br(例如cl、f，诸如f)、硝基、cn、c
1-6
烷基、c
2-6
烯基、c
2-6
炔基(其中后三个基团是未取代的或由选自以下的一种或多种取代基取代的：oh、
═
o、f、cl、br(例如cl、f，诸如f)、c
1-4
烷基和c
1-4
烷氧基)、cy1(其中cy1基团是未取代的或由选自以下的一种或多种取代基取代的：f、cl、br(例如cl、f，诸如f)、硝基、cn、c
1-6
烷基、c
2-6
烯基、c
2-6
炔基(其中后三个基团是任选地由选自以下的一种或多种取代基取代的：oh、
═
o、f、cl、br(例如cl、f，诸如f)、c
1-4
烷基和c
1-4
烷氧基)、or
12a
、s(o)
r
r
12b
、s(o)2nr
12c
r
12d
、nr
12e
s(o)2r
12f
、nr
12g
r
12h
、
芳基和het1)；
[0193]
(e)cy2(其中cy2基团是未取代的或由选自以下的一种或多种取代基取代的：f、cl、br(例如cl、f，诸如f)、硝基、cn、c
1-6
烷基、c
2-6
烯基、c
2-6
炔基(其中后三个基团是任选地由选自以下的一种或多种取代基取代的：oh、
═
o、f、cl、br(例如cl、f，诸如f)、c
1-4
烷基和c
1-4
烷氧基)、or
13a
、s(o)
r
r
13b
、s(o)2nr
13c
r
13d
、nr
13e
s(o)2r
13f
、nr
13g
r
13h
、芳基和het2)，
[0194]
(f)het
a
(其中het
a
基团是未取代的或由选自以下的一种或多种取代基取代的：卤素、硝基，cn、c
1-6
烷基、c
2-6
烯基、c
2-6
炔基(其中后三个基团是任选地由选自以下的一种或多种取代基取代的：oh、
═
o、f、cl、br(例如cl、f，诸如f)、c
1-4
烷基和c
1-4
烷氧基)、or
14a
、s(o)
r
r
14b
、s(o)2nr
14c
r
14d
、nr
14e
s(o)2r
14f
、nr
14g
r
14h
、芳基和het3)；
[0195]
(g)or
15a
；
[0196]
(h)s(o)
r
r
15b
；
[0197]
(i)s(o)2nr
15c
r
15d
；
[0198]
(j)nr
15e
s(o)2r
15f
；以及
[0199]
(k)nr
15g
r
15h
；
[0200]
r
10
和r
11
在每次出现时独立地表示：
[0201]
(i)h；
[0202]
(ii)f、cl或br(例如cl、f，诸如f)；
[0203]
(iii)cn；
[0204]
(iv)c
1-6
烷基、c
2-6
烯基、c
2-6
炔基(其中后三个基团是未取代的或由选自以下的一种或多种取代基取代的：f、cl、br(例如cl、f，诸如f)、硝基、cn、c
1-6
烷基、c
2-6
烯基、c
2-6
炔基(其中后三个基团是未取代的或由选自以下的一种或多种取代基取代的：oh、
═
o、f、cl、br(例如cl、f，诸如f)、c
1-4
烷基和c
1-4
烷氧基)、cy1’
(其中cy1’
基团是未取代的或由选自以下的一种或多种取代基取代的：f、cl、br(例如cl、f，诸如f)、硝基、cn、c
1-6
烷基、c
2-6
烯基、c
2-6
炔基(其中后三个基团是任选地由选自以下的一种或多种取代基取代的：oh、
═
o、f、cl、br(例如cl、f，诸如f)、c
1-4
烷基和c
1-4
烷氧基)、or
12a’、s(o)
r
r
12b’、s(o)2nr
12c’r
12d’、nr
12e’s(o)2r
12f’、nr
12g’r
12h’、芳基和het1’
)；
[0205]
(v)cy2’
(其中cy2’
基团是未取代的或由选自以下的一种或多种取代基取代的：f、cl、br(例如cl、f，诸如f)、硝基、cn、c
1-6
烷基、c
2-6
烯基、c
2-6
炔基(其中后三个基团是任选地由选自以下的一种或多种取代基取代的：oh、
═
o、f、cl、br(例如cl、f，诸如f)、c
1-4
烷基和c
1-4
烷氧基)、or
13a’、s(o)
r
r
13b’、s(o)2nr
13c’r
13d’、nr
13e’s(o)2r
13f’、nr
13g’r
13h’、芳基和het2’
)，
[0206]
(vi)het
a’(其中het
a’基团是未取代的或由选自以下的一种或多种取代基取代的：卤素、硝基、cn、c
1-6
烷基、c
2-6
烯基、c
2-6
炔基(其中后三个基团是任选地由选自以下的一种或多种取代基取代的：oh、
═
o、f、cl、br(例如cl、f，诸如f)、c
1-4
烷基和c
1-4
烷氧基)、or
14a’、s(o)
r
r
14b’、s(o)2nr
14c’r
14d’、nr
14e’s(o)2r
14f’、nr
14g’r
14h’、芳基和het3’
)；
[0207]
(vii)or
15a’；
[0208]
(viii)s(o)
r
r
15b’；
[0209]
(ix)s(o)2nr
15c’r
15d’；
[0210]
(x)nr
15e’s(o)2r
15f’；
[0211]
(xi)nr
15g’r
15h’，
[0212]
r
12a
至r
12h
、r
13a
至r
13h
、r
14a
至r
14h
、r
15a
至r
15h
、r
12a’至r
12h’、r
13a’至r
13h’、r
14a’至r
14h’、r
15a’至r
15h’在每次出现时独立地表示h、c
1-6
烷基、c
2-6
烯基、c
2-6
炔基(其中后三个基团是任选地由选自以下的一种或多种取代基取代的：f、cl、br(例如cl、f，诸如f)、硝基、＝o、c(o)oc
1-4
烷基、cn、c
1-6
烷基、c
2-6
烯基、c
2-6
炔基、c
3-6
环烷基(其中后三个基团是任选地由选自以下的一种或多种取代基取代的：oh、
═
o、f、cl、br(例如cl、f，诸如f)、c
1-4
烷基和c
1-4
烷氧基)、or
16a
、s(o)
r
r
16b
、s(o)2nr
16c
r
16d
、nr
16e
s(o)2r
16f
、nr
16g
r
16h
、芳基和het4)、c
3-10
环烷基或c
4-10
环烯基(其中后两个基团是任选地由选自以下的一种或多种取代基取代的：f、cl、br(例如cl、f，诸如f)、oh、
═
o、c
1-6
烷基和c
1-6
烷氧基)或het
b
；
[0213]
r
16a
至r
16h
在每次出现时独立地表示h、c
1-4
烷基、c
2-4
烯基、c
2-4
炔基，其中后三个基团是任选地由选自以下的一种或多种取代基取代的：f、cl、br(例如cl、f，诸如f)、硝基、cn、c
1-4
烷基、c
2-4
烯基、c
2-4
炔基(其中后三个基团是任选地由选自以下的一种或多种取代基取代的：oh、
═
o、f、cl、br(例如cl、f，诸如f)、c
1-4
烷基和c
1-4
烷氧基)、c
3-6
环烷基或c
4-6
环烯基(其中后两个基团是任选地由选自以下的一种或多种取代基取代的：f、cl、br(例如cl、f，诸如f)、oh、
═
o、c
1-4
烷基和c
1-4
烷氧基)，
[0214]
het1至het4、het1’
至het3’
、het
a
、het
b
和het
a’独立地表示包含选自o、s和n的一种或多种杂原子的4-至14-元杂环基团，其中杂环基团可以包括一个、两个或三个环，并且可以由选自以下的一种或多种取代基取代：＝o或更特别地卤素、c
1-6
烷基，其中后一基团是任选地由选自以下的一种或多种取代基取代的：f、cl、br(例如cl、f，诸如f)、-or
17a
、-nr
17b
r
17c
、-c(o)or
17d
和-c(o)nr
17e
r
17f
；
[0215]
r
17a
至r
17f
在每次出现时独立地表示h、c
1-4
烷基、c
2-4
烯基、c
2-4
炔基，其中后三个基团是任选地由选自以下的一种或多种取代基取代的：f、cl、br(例如cl、f，诸如f)、硝基、cn、c
1-4
烷基、c
2-4
烯基、c
2-4
炔基(其中后三个基团是任选地由选自以下的一种或多种取代基取代的：oh、
═
o、f、cl、br(例如cl、f，诸如f)、c
1-4
烷基和c
1-4
烷氧基)、c
3-6
环烷基或c
4-6
环烯基(其中后两个基团是任选地由选自以下的一种或多种取代基取代的：f、cl、br(例如cl、f，诸如f)、oh、
═
o、c
1-4
烷基和c
1-4
烷氧基)，
[0216]
cy1、cy2、cy1’
和cy2’
在每次出现时独立地表示3-至10-元芳香族、完全饱和或部分不饱和碳环；
[0217]
r各自独立地表示0、1或2；并且
[0218]
x-各自是药学上可接受的阴离子，
[0219]
或其药学上可接受的溶剂化物。
[0220]
在本文的实施方式中，单词“包括”可以被解释为需要所提及的特征，但是不限制其他特征的存在。可替代地，词语“包括”也可以涉及以下情形，其中仅所列出的组成/特征是旨在存在的(例如，词语“包括”可以用短语“由
……
组成”或“基本上由
……
组成”替换)。明确地设想了较广泛和较狭义的解释两者均可适用于本发明的所有方面和实施方式。换句话说，词语“包括”及其同义词可以用短语“由
……
组成”或短语“基本上由
……
组成”或其同义词替换，反之亦然。
[0221]
本文(在本发明的任何方面或实施方式中)对式i的化合物的提及包括对此类化合物本身、此类化合物的互变异构体以及此类化合物的药学上可接受的盐或溶剂化物或药学功能衍生物的提及。
[0222]
可以提及的药学上可接受的阴离子包括衍生自酸加成盐的阴离子。在本发明中，盐可以通过用于形成化合物的反应简单地形成(例如，使用烷基卤化物以形成季铵物种)。盐也可以通过例如使用合适的离子交换树脂将盐形式的式i的化合物的反荷离子与另一反荷离子交换来制备。
[0223]
可以在溶剂存在下或在所得盐不溶于其中的介质中形成盐，随后使用标准技术(例如真空、通过冷冻干燥或通过过滤)去除所述溶剂或所述介质。
[0224]
可用于本文的药学上可接受的盐的实例包括衍生自无机酸和有机酸的酸加成盐。
[0225]
酸加成盐的实例包括用以下形成的酸加成盐：乙酸、2,2-二氯乙酸、己二酸、藻酸、芳基磺酸(例如苯磺酸、萘-2-磺酸、萘-1,5-二磺酸和对甲苯磺酸)、抗坏血酸(例如l-抗坏血酸)、l-天冬氨酸、苯甲酸、4-乙酰胺基苯甲酸、丁酸、(+)樟脑酸、樟脑-磺酸、(+)-(1s)-樟脑-10-磺酸、癸酸、己酸、辛酸、肉桂酸、柠檬酸、环己烷氨基磺酸、十二烷基硫酸、乙烷-1,2-二磺酸、乙磺酸、2-羟基乙磺酸、甲酸、富马酸、半乳糖二酸、龙胆酸、葡庚糖酸、葡糖酸(例如d-葡糖酸)、葡糖醛酸(例如d-葡糖醛酸)、谷氨酸(例如l-谷氨酸)、α-氧代戊二酸、乙醇酸、马尿酸、氢溴酸、盐酸、氢碘酸、羟乙基磺酸、乳酸(例如(+)-l-乳酸和(
±
)-dl-乳酸)、乳糖酸、马来酸、苹果酸(例如(-)-l-苹果酸)、丙二酸、(
±
)-dl-扁桃酸、偏磷酸、甲磺酸、1-羟基-2-萘甲酸、烟酸、硝酸、油酸、乳清酸、草酸、棕榈酸、扑酸、磷酸、丙酸、l-焦谷氨酸、水杨酸、4-氨基-水杨酸、癸二酸、硬脂酸、琥珀酸、硫酸、单宁酸、酒石酸(例如(+)-l-酒石酸)、硫氰酸、十一烯酸和戊酸。
[0226]
盐的特别的实例是衍生自无机酸诸如氢碘酸、盐酸、氢溴酸、磷酸、偏磷酸、硝酸和硫酸；衍生自有机酸诸如酒石酸、乙酸、柠檬酸、苹果酸、乳酸、富马酸、苯甲酸、乙醇酸、葡糖酸、琥珀酸、芳基磺酸的盐。
[0227]
如应当理解的，以式i的化合物形成的盐只能利用以上提及的酸的阴离子部分。
[0228]
如本文应当理解的，式i的化合物固有地以盐形式存在，其还可以包括溶剂化物。因此，当本文中提及式i的化合物的“药学上可接受的盐”时，其旨在是指包括能够形成盐的一种或多种其他官能团(例如氨基基团等)的式i的化合物。如上文所述，这些额外的官能团可以与合适的酸加成盐形成药学上可接受的盐。
[0229]
如上所提及，式i还包括化合物的任何溶剂化物及其盐。优选的溶剂化物是通过将无毒的药学上可接受的溶剂(以下称为溶剂化溶剂)的分子掺入本发明的化合物的固态结构(例如晶体结构)中而形成的溶剂化物。此类溶剂的实例包括水、醇(诸如乙醇、异丙醇和丁醇)和二甲亚砜。溶剂化物可以通过用溶剂或含有溶剂化溶剂的溶剂混合物使本发明的化合物重结晶来制备。在任何给定的情况下，可以通过使用众所周知的和标准的技术诸如热重分析(tga)、差示扫描量热法(dsc)和x射线晶体学对化合物的晶体进行分析来确定溶剂化物是否已经形成。
[0230]
溶剂化物可以是化学计量的或非化学计量的溶剂化物。特别优选的溶剂化物是水合物，并且水合物的实例包括半水合物、一水合物和二水合物。
[0231]
对于溶剂化物以及用于制备和表征它们的方法的更详细讨论，参见bryn et al.，solid-state chemistry of drugs，second edition，published by ssci，inc of west lafayette，in，usa，1999，isbn 0-967-06710-3。
[0232]
为了简洁起见，式i的化合物以及这类化合物的药学上可接受的盐和溶剂化物在
下文中统称为“式i的化合物”。
[0233]
式i的化合物可包含双键，并且可因此作为围绕各个单独双键的e(异侧)和z(同侧)几何异构体存在。所有这类异构体及其混合物都包括在本发明的范围内。
[0234]
式i的化合物可作为区域异构体存在并且还可展现出互变异构现象。所有互变异构形式及其混合物均包括在本发明的范围内。
[0235]
式i的化合物可包含一个或多个不对称碳原子，并且可因此展现出光学和/或非对映异构现象。非对映异构体可使用常规技术例如色谱法或分步结晶来分离。各种立体异构体可以通过使用常规的例如分步结晶或hplc技术分离化合物的外消旋或其他混合物来分离。可替代地，期望的光学异构体可通过使适当的光学活性起始材料在不会引起外消旋或差向异构的条件下反应来制得(即
‘
手性池’法)，通过使适当的起始材料与可以随后在合适的阶段通过衍生化(即，拆分，包括动态拆分)除去的
‘
手性助剂’(例如与同手性酸)反应，接着通过常规手段诸如色谱法分离非对映异构衍生物来制得，或通过与适当的手性试剂或手性催化剂均在技术人员已知的条件下反应来制得。所有立体异构体及其混合物均包括在本发明的范围内。
[0236]
除非另外说明，否则术语“烷基”指的是非支链或支链的、环状的、饱和或不饱和的(如此形成，例如，烯基或炔基)烃基自由基，其可以是取代的或未取代的(具有例如一个或多个卤素原子)。当术语“烷基”是指非环状基团时，其优选地为c
1-10
烷基，更优选地为c
1-6
烷基(诸如乙基、丙基(例如正丙基或异丙基))、丁基(例如支链或非支链丁基)、戊基或更优选地甲基)。当术语“烷基”是环状基团时(其可以是指定基团“环烷基”的情况)，其优选地为c
3-12
环烷基，并且更优选地为c
5-10
(例如c
5-7
)环烷基。
[0237]
除非另有说明，否则术语“亚烷基”是指非支链或支链的c
1-10
(例如c
1-6
)亚烷基，并且优选地c
1-3
亚烷基，诸如亚戊基、亚丁基(支链或非支链)，优选地为亚丙基(正亚丙基或异亚丙基)、亚乙基，或更优选地为亚甲基(即-ch
2-)。
[0238]
当在本文中使用时，术语“卤素”包括对氟、氯、溴和碘的提及。
[0239]
除非另有说明，否则当在本文中使用时，术语“芳基”包括c
6-14
(诸如c
6-10
)芳基基团。此类基团可以是单环、二环或三环的，并且具有在6与14之间的环碳原子，其中至少一个环是芳香族的。芳基基团的附接点可以经由环体系的任何原子。然而，当芳基基团是二环或三环的时，它们经由芳香族环连接到分子的其余部分上。c
6-14
芳基基团包括苯基、萘基等，诸如1,2,3,4-四氢萘基、茚满基、茚基和芴基。可以提及的本发明的实施方式包括其中芳基是苯基的那些。
[0240]
杂环(het1至het4、het1’
至het3’
、het
a
、het
b
和het
a’)基团在特征上可以是完全饱和、部分不饱和、全芳香族或部分芳香族的。可以提及的het1至het4、het1’
至het3’
、het
a
、het
b
和het
a’基团的值包括吖啶基、1-氮杂双环[2.2.2]辛烷基、氮杂环丁烷基、苯并咪唑基、苯并异噻唑基、苯并异噁唑基、苯并二氧杂环己烷基(benzodioxanyl)、苯并二氧杂环庚烷基(benzodioxepanyl)、苯并二氧杂基(benzodioxepinyl)、苯并二氧杂环戊烯基、苯并呋喃基、苯并呋咱基、苯并[c]异噁唑烷基、苯并吗啉基、2,1,3-苯并噁二唑基、苯并噁嗪基(包括3,4-二氢-2h-1,4-苯并噁嗪基)、苯并噁唑烷基、苯并噁唑基、苯并吡唑基、苯并[e]嘧啶、2,1,3-苯并噻二唑基、苯并噻唑基、苯并噻吩基、苯并三唑基、咔唑基、苯并二氢吡喃基、苯并吡喃基(chromenyl)、噌啉基、2,3-二氢苯并咪唑基、2,3-二氢苯并[6]呋喃基、1,3-二氢苯
并[c]呋喃基、1,3-二氢-2,1-苯并异噁唑基、2,3-二氢吡咯并[2,3-b]吡啶基、二噁烷基、呋喃基、呋咱基、六氢嘧啶基、乙内酰脲基、咪唑基、咪唑并[1,2-a]吡啶基、咪唑并[2,3-b]噻唑基、吲唑基、吲哚啉基、吲哚基、异苯并呋喃基、异苯并二氢吡喃基、异吲哚啉基、异吲哚基、异喹啉基、异噻唑基(isothiaziolyl)、异硫代苯并二氢吡喃基、异噁唑烷基、异噁唑基、马来酰亚胺基、吗啉基、萘并[1,2-b]呋喃基、萘啶基(包括1,6-萘啶基或特别地1,5-萘啶基和1,8-萘啶基)、噁二唑基、1,2-或1,3-噁嗪烷基(oxazinanyl)、噁唑基、氧杂环丁烷基、吩嗪基、吩噻嗪基、酞嗪基、哌嗪基、哌啶基、蝶啶基、嘌呤基、吡喃基、吡嗪基、吡唑基、哒嗪基、吡啶基、嘧啶基、吡咯烷酮基、吡咯烷基、吡咯啉基、吡咯并[2,3-b]吡啶基、吡咯并[5,1-b]吡啶基、吡咯并[2,3-c]吡啶基、吡咯基、喹唑啉基、喹啉基、喹嗪基、喹喔啉基、环丁砜基、3-环丁烯砜基(3-sulfolenyl)、4,5,6,7-四氢苯并咪唑基、4,5,6,7-四氢苯并吡唑基、5,6,7,8-四氢苯并[e]嘧啶、四氢呋喃基、四氢异喹啉基(包括1,2,3,4-四氢异喹啉基和5,6,7,8-四氢异喹啉基)、四氢吡喃基、3,4,5,6-四氢吡啶基、1,2,3,4-四氢嘧啶基、3,4,5,6-四氢嘧啶基、四氢喹啉基(包括1,2,3,4-四氢喹啉基和5,6,7,8-四氢喹啉基)、四唑基、噻二唑基、噻唑烷基、噻唑基、噻吩基、噻吩并[5,1-c]吡啶基、硫代苯并二氢吡喃基、硫代乙氧苯基、三唑基、1,3,4-三唑并[2,3-b]嘧啶基、呫吨基等。可以提及的(het1至het8(例如het1至het7)和het
a
至het
c
的特别的值包括来自以上列表的4-至10-元杂环基团。进一步的，可以提及的(het1至het8(例如het1至het7)和het
a
至het
c
的值包括来自以上列表的5-和8-元(例如5-至6-元)杂环基团。
[0241]
在适当的情况下，杂环(het1至het4、het1’
至het3’
、het
a
、het
b
和het
a’)基团上的取代基可以位于包括杂原子的环系统中的任何原子上。杂环(het1至het4、het1’
至het3’
、het
a
、het
b
和het
a’)基团的附接点可以经由包括(在适当的情况下)杂原子(诸如氮原子)的环体系中的任何原子，或者可作为环体系的一部分存在的任何稠合碳环上的原子。杂环(het1至het4、het1’
至het3’
、het
a
、het
b
和het
a’)基团也可以呈n-或s-氧化形式。
[0242]
为了避免疑问，在其中式i的化合物中两个或更多个取代基的相同性可以是相同的情况下，各个取代基的实际相同性不以任何方式相互依赖。
[0243]
可以提及的本发明的实施方式包括与式i的化合物有关的那些实施方式，其中：
[0244]
(i)r4至r9在每次出现时独立地表示：
[0245]
(ia)h；
[0246]
(ib)br、cl、f；
[0247]
(ic)c
1-4
烷基，其是未取代的或由选自以下的一种或多种取代基取代的：f、cl、br(例如cl、f，诸如f)、硝基、cn、c
1-3
烷基(其中后一基团是未取代的或由选自以下的一种或多种取代基取代的：oh、
═
o、f、cl、br(例如cl、f，诸如f)、c
1-4
烷基和c
1-4
烷氧基)、cy1(其中cy1基团是未取代的或由选自以下的一种或多种取代基取代的：f、cl、br(例如cl、f，诸如f)、cn、c
1-3
烷基(其中后一基团是未取代的或由选自以下的一种或多种取代基取代的：oh、
═
o、f、cl、br(例如cl、f，诸如f)、c
1-4
烷基和c
1-4
烷氧基)、or
12a
、nr
12g
r
12h
、芳基和het1)；
[0248]
(id)cy2(其中cy2基团是未取代的或由选自以下的一种或多种取代基取代的：f、cl、br(例如cl、f，诸如f)、cn、c
1-3
烷基、c
1-3
烷基(其中后一基团是任选地由选自以下的一种或多种取代基取代的：oh、
═
o、f、cl、br(例如cl、f，诸如f)、c
1-4
烷基和c
1-4
烷氧基)、or
13a
、nr
13g
r
13
、芳基和het2)；
[0249]
(ie)het
a
(其中het
a
基团是未取代的或由选自以下的一种或多种取代基取代的：卤素、硝基、cn、c
1-3
烷基(其中后一基团是任选地由选自以下的一种或多种取代基取代的：oh、
═
o、卤素、c
1-4
烷基和c
1-4
烷氧基)、or
14a
、nr
14g
r
14h
、芳基和het3)；
[0250]
(if)or
15a
；或
[0251]
(ig)nr
15g
r
15h
，
[0252]
(例如，其中r4至r9在每次出现时独立地表示：
[0253]
(ia)h；
[0254]
(ib)br、cl、f；
[0255]
(ic)c
1-4
烷基，其是未取代的或由选自以下的一种或多种取代基取代的：f、cl、br(例如cl、f、诸如f)、c
1-3
烷基(其中后一基团是未取代的或由选自以下的一种或多种取代基取代的：oh、
═
o、f、cl、br(例如cl、f、诸如f)、c
1-4
烷基和c
1-4
烷氧基)、or
12a
和nr
12g
r
12h
)；
[0256]
(id)or
15a
；或
[0257]
(ie)nr
15g
r
15h
，
[0258]
诸如r4至r9在每次出现时表示h)；
[0259]
(ii)r
10
和r
11
在每次出现时独立地表示：
[0260]
(ai)h；
[0261]
(bi)br、cl、f；
[0262]
(ci)c
1-4
烷基，其是未取代的或由选自以下的一种或多种取代基取代的：f、cl、br(例如cl、f，诸如f)、硝基、cn、c
1-3
烷基(其中后一基团是未取代的或由选自以下的一种或多种取代基取代的：oh、
═
o、f、cl、br(例如cl、f，诸如f)、c
1-4
烷基和c
1-4
烷氧基)、cy1’
(其中cy1’
基团是未取代的或由选自以下的一种或多种取代基取代的：f、cl、br(例如cl、f，诸如f)、cn、c
1-3
烷基(其中后一基团是未取代的或由选自以下的一种或多种取代基取代的：oh、
═
o、f、cl、br(例如cl、f，诸如f)、c
1-4
烷基和c
1-4
烷氧基)、or
12a’、nr
12g’r
12h’、芳基和het1’
)；
[0263]
(di)cy2’
(其中cy2’
基团是未取代的或由选自以下的一种或多种取代基取代的：f、cl、br(例如cl、f，诸如f)、cn、c
1-3
烷基(其中后一基团是任选地由选自以下的一种或多种取代基取代的：oh、
═
o、f、cl、br(例如cl、f，诸如f)、c
1-4
烷基和c
1-4
烷氧基)、or
13a’、nr
13g’r
13h’、芳基和het2’
)；
[0264]
(ei)het
a’(其中het
a’基团是未取代的或由选自以下的一种或多种取代基取代的：卤素、硝基、cn、c
1-3
烷基(其中后一基团是任选地由选自以下的一种或多种取代基取代的：oh、
═
o、卤素、c
1-4
烷基和c
1-4
烷氧基)、or
14a’、nr
14g’r
14h’、芳基和het3’
)；
[0265]
(fi)or
15a’；或
[0266]
(gi)nr
15g’r
15h’，
[0267]
(例如，其中r
10
和r
11
在每次出现时独立地表示：
[0268]
(a)h；
[0269]
(b)br、cl、f；
[0270]
(c)c
1-4
烷基，其是未取代的或由选自以下的一种或多种取代基取代的：f、cl、br(例如cl、f、诸如f)、c
1-3
烷基(其中后一基团是未取代的或由选自以下的一种或多种取代基取代的：oh、
═
o、f、cl、br(例如cl、f、诸如f)、c
1-4
烷基和c
1-4
烷氧基)、or
12a’和nr
12g’r
12h’)；
[0271]
(d)or
15a’；或
[0272]
(e)nr
15g’r
15h’，
[0273]
诸如r
10
和r
11
在每次出现时表示h)。
[0274]
在其中本文列出了取代基f、cl和br的本发明的实施方式中，cl以及更特别地f可以是优选的。即，术语“f、cl或br”在其每次出现时可以由“cl、f”或更特别地由“f”替代。
[0275]
在本文可提及的本发明的特别的实施方式中，p和q是0，并且r6至r
11
中的每一个可以是h。
[0276]
在可提及的本发明的又进一步的实施方式中，包括与式i的化合物有关的那些，其中：
[0277]
(aa)n是0或1；
[0278]
(ab)m是4至8；
[0279]
(ac)当存在时，o是2至4，诸如2；
[0280]
(ad)当存在时，o’是2至4，诸如2；
[0281]
(ae)x-是选自由以下组成的组的卤根：br-、cl-、f-和i-，任选地其中，x-各自是i-。
[0282]
在本发明的又进一步的实施方式中：
[0283]
(aa)r1至r3中的每一个是甲基；
[0284]
(ab)r1是
–
(ch2)
o-nr1’
r2或
–
(ch2)
o
’-n
+
r1’
r2’
r3’
基团，并且r2和r3是c
1-12
烷基基团，诸如甲基基团；或
[0285]
(ac)r1是
–
(ch2)
o
’-n
+
r1’
r2’
r3’
基团，并且r2和r3均是甲基基团。
[0286]
在本发明的实施方式中，当r1是
–
(ch2)
o-nr1’
r2’
基团或
–
(ch2)
o
’-n
+
r1’
r2’
r3’
基团时，r1’
、r2’
和r3’
各自可以是c1至c4烷基基团，诸如甲基基团。
[0287]
在本文可公开的本发明的特别的实施方式中，式i的化合物可以是以下化合物，其中：
[0288]
n是0或1；
[0289]
m是4、6或8；
[0290]
r1各自是
–
(ch2)
o-nr1’
r2’
基团或
–
(ch2)
o
’-n
+
r1’
r2’
r3’
基团，后一基团的电荷被x-平衡；
[0291]
r1’
、r2、r3、r2’
和r3’
各自独立地是c
1-4
烷基基团；并且
[0292]
o和o’是2至3。
[0293]
在本文可公开的本发明的特别的实施方式中，式i的化合物可以是以下化合物，其中：
[0294]
p和q是0；
[0295]
n是0或1；
[0296]
m是4、6或8；
[0297]
r1各自是
–
(ch2)
o-nr1’
r2’
基团或
–
(ch2)
o
’-n
+
r1’
r2’
r3’
基团，后一基团的电荷被x-平衡；
[0298]
r1’
、r2、r3、r2’
和r3’
各自独立地是c
1-4
烷基基团；
[0299]
r6至r
11
中的每一个是h；并且
[0300]
o和o’是2至3。
[0301]
在如上所述的本发明的某些实施方式中，式i的化合物可以是式ia的化合物：
[0302][0303]
如应当理解的，可以根据上述本发明的任何实施方式来定义n、m、x-以及r1至r3。
[0304]
在本发明的实施方式中，式i的化合物可以是以下化合物，其中：
[0305]
当n是0并且m是4至8时，则r1是
–
(ch2)
o-nr1’
r2’
基团或
–
(ch2)
o
’-n
+
r1’
r2’
r3’
基团；和/或
[0306]
当n是0并且m是1至12时，则r1是
–
(ch2)
o-nr1’
r2’
基团或
–
(ch2)
o
’-n
+
r1’
r2’
r3’
基团；和/或
[0307]
式i的化合物不是coe-d4、doe-d6或coe-d8。
[0308]
可以提及的本发明的实施方式包括在其中式i的化合物是选自下列的化合物的那些：
[0309]
coe-d4
[0310][0311]
coe-d6
[0312][0313]
coe-d8
[0314][0315]
coe-t4
[0316][0317]
coe-t6
[0318][0319]
coe-d42n
[0320][0321]
coe-d62n
[0322][0323]
coe-d82n
[0324][0325]
coe-t42n
[0326]
[0327]
coe-t62n
[0328][0329]
coe-d42
[0330][0331]
coe-d62
[0332][0333]
coe-d82
[0334][0335]
coe-t42
[0336]
和
[0337]
coe-t62
[0338][0339]
可以提及的本发明的实施方式包括在其中式i的化合物是选自下列的化合物的那些：
[0340]
coe-t4
[0341][0342]
coe-t6
[0343][0344]
coe-d42n
[0345][0346]
coe-d62n
[0347][0348]
coe-d82n
[0349][0350]
coe-t42n
[0351][0352]
coe-t62n
[0353][0354]
coe-d42
[0355][0356]
coe-d62
[0357][0358]
coe-d82
[0359][0360]
coe-t42
[0361]
和
[0362]
coe-t62
[0363][0364]
在可以提及的本发明的又进一步的实施方式中，包括在其中式i的化合物是选自下列的化合物的那些：
[0365]
coe-d42n
[0366][0367]
coe-d62n
[0368][0369]
coe-d82n
[0370][0371]
coe-t42n
[0372][0373]
coe-t62n
[0374][0375]
coe-d42
[0376][0377]
coe-d62
[0378][0379]
coe-d82
[0380][0381]
coe-t42
[0382]
和
[0383]
coe-t62
[0384][0385]
例如，式i的化合物可以选自由以下组成的组：
[0386]
coe-d42
[0387][0388]
coe-d62
[0389][0390]
coe-d82
[0391][0392]
coe-t42
[0393]
和
[0394]
coe-t62
[0395][0396]
以上提供的式i的特定化合物示出为显示碘离子是抗衡离子。应当理解的是，抗衡离子可以选自任何合适形式的x-，诸如氯离子、溴离子和氟离子以及碘离子。然而，在本文可以提及的本发明的实施方式中，碘离子可以是优选的抗衡离子。
[0397]
为了避免疑问，在上下文允许的情况下，本文提及式i的化合物包括对式i和ia的任何化合物的提及。进一步地，对式i或ia的任何化合物的提及包括对此类化合物本身、此类化合物的互变异构体以及此类化合物的药学上可接受的盐或溶剂化物或药学功能衍生物的提及。
[0398]
在可以提及的本发明的进一步的实施方式中，包括其中式i的化合物被同位素标记的那些。然而，在可以提及的本发明的其他特别的实施方式中，包括其中式i的化合物没有被同位素标记的那些。
[0399]
当在本文中使用时，术语“同位素标记”包括指代式i的化合物，其中在化合物中一个或多个位置处存在非天然同位素(或同位素的非天然分布)。本领域技术人员将理解，本文中提及“化合物中一个或多个位置”是指式i的化合物的一个或多个原子。因此，术语“同位素标记”包括指代同位素富集于化合物中一个或多个位置处的式i的化合物。
[0400]
式i的化合物的同位素标记或富集可以是用氢、碳、氮、氧、硫、氟、氯、溴和/或碘中的任一种的放射性或非放射性同位素。在该方面可以提及的特别的同位素包括2h、3h、
11
c、
13
c、
14
c、
13
n、
15
n、
15
o、
17
o、
18
o、
35
s、
18
f、
37
ci、
77
br、
82
br和
125
l)。
[0401]
当式i的化合物用放射性或非放射性同位素标记或富集时，可以提及的式i的化合物包括其中化合物中的至少一个原子显示出同位素分布的那些，其中所讨论的原子的放射性或非放射性同位素以超过该放射性或非放射性同位素的天然水平的至少10％(例如10％至5000％，特别地50％至1000％，并且更特别地100％至500％)的水平存在。
[0402]
式i的化合物可以用于医药中。当用于医药中时，式i的化合物可以作为药物制剂提供，其包括如上定义的式i的化合物以及药学上可接受的佐剂、稀释剂或载体中的一种或多种。
[0403]
本发明的上述方面中的式i的化合物可以在医药治疗的方法中使用。因此，根据本
epidermidis)、模仿葡萄球菌(staphylococcus simulans)、猫葡萄球菌(staphylococcus felis)、木糖葡萄球菌(staphylococcus xylosus)、产色葡萄球菌(staphylococcus chromogenes)、沃氏葡萄球菌(staphylococcus warneri)、溶血性葡萄球菌(staphylococcus haemolyticus)、松鼠葡萄球菌(staphylococcus sciuri)、腐生葡萄球菌(staphylococcus saprophyticus)、人葡萄球菌(staphylococcus hominis)、山羊葡萄球菌(staphylococcus caprae)、科氏葡萄球菌科氏亚种(staphylococcus cohnii subsp.cohnii)、科氏葡萄球菌解脲亚种(staphylococcus cohnii subsp.urealyticus)、头状葡萄球菌头状亚种(staphylococcus capitis subsp.capitis)、头状葡萄球菌解脲亚种(staphylococcus capitis subsp.urealyticus)、猪葡萄球菌(staphylococcus hyicus))；
[0417]
凝固酶阳性葡萄球菌(例如，金黄色葡萄球菌(staphylococcus aureus)、伪中间型葡萄球菌(staphylococcus pseudintermedius)、海豚葡萄球菌(staphylococcus delphini)、施氏葡萄球菌凝集亚种(staphylococcus schleiferi subsp.coagulans)和金黄色葡萄球菌厌氧亚种(staphylococcus aureus subsp.anaerobius))；
[0418]
链球菌细菌(例如，乳房链球菌(streptococcus uberis)、无乳链球菌(streptococcus agalactiae)、停乳链球菌(streptococcus dysgalactiae)、化脓性链球菌(streptococcus pyogenes)、牛链球菌(streptococcus bovis)、马链球菌兽疫亚种(streptococcus equi subsp.zooepidemicus)和马肠链球菌(streptococcus equinus))；
[0419]
芽孢杆菌细菌(例如，黑色素芽孢杆菌(bacillus melaninogenicus)、短小芽孢杆菌(bacillus pumilus)、地衣芽孢杆菌(bacillus licheniformis)、蜡样芽孢杆菌(bacillus cereus)、枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)和炭疽芽孢杆菌(bacillus anthracis))；
[0420]
肠球菌细菌(例如，屎肠球菌(enterococcus faecium)、粪肠球菌(enterococcus faecalis)和耐久肠球菌(enterococcus durans))；
[0421]
李斯特菌细菌(例如，单核细胞增多性李斯特菌(listeria monocytogenes))；
[0422]
厌氧细菌(例如，产气荚膜梭菌(clostridium perfringens)、牛放线菌(actinomyces bovis)、痤疮丙酸杆菌(propionibacterium acnes)、颗粒丙酸杆菌(propionibacterium granulosum)、真细菌(eubacterium)、细球菌(peptococcus indolicus)和厌氧消化链球菌(peptostreptococcus anaerobius))；
[0423]
支原体细菌(例如，牛支原体(mycoplasma bovis))；
[0424]
马拉色菌属(malassezia genus)的真菌。
[0425]
式i的化合物可以特别有效地抗eskape病原体中的一种或多种(肠杆菌科(enterobacteriaceca)包括大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌(p.aeruginosa)、鲍曼不动杆菌(acinetobacter baumanii)、肺炎克雷伯菌(kleibsiella pneumoniae))。这类eskape病原体可以包括那些正式指定的eskape病原体和密切相关的物种，诸如大肠杆菌的尿路致病性菌株(uti89)、临床衍生的粪肠球菌菌株(og1rf)和金黄色葡萄球菌的耐药性菌株(mrsa baa-40)。式i的化合物还显示出具有抗一系列革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌的活性，包括who优先病原体列表上的那些。
[0426]
本文中可能引起病毒感染的病毒原的实例包括但不限于表达宿主衍生的磷脂的
包膜病毒。本文可提及的特定实例包括但不限于：
[0427]
dna病毒诸如疱疹病毒、痘病毒、嗜肝dna病毒和rna病毒(例如黄病毒、披膜病毒、冠状病毒、丁型肝炎病毒、正黏病毒、副黏病毒、弹状病毒、布尼亚病毒、丝状病毒和逆转录病毒诸如慢病毒)。
[0428]
在本发明的优选的实施方式中，式i的化合物可以是抗菌剂。
[0429]
应当理解，许多微生物感染可通过生物膜的形成而延长或加剧。生物膜是微生物的聚集体，在其中细菌细胞与其他生物膜成员和/或表面紧密结合。生物膜中存在的粘附细胞通常嵌入在微生物产生的基质中，该基质为细胞外聚合物质，可以在有生命或无生命的表面上形成，并且代表了自然、工业和医院环境中微生物生命的流行模式。生物膜响应于许多因素而形成，这些因素可包括细胞识别表面上的特异性或非特异性附着位点、营养诱因、群落驱动的信号，或者在一些情况下，通过将浮游细胞暴露于低于抑制浓度的抗生素中。如果不进行处理，那么处于浮游状态的细菌细胞(个体细胞)可能会形成生物膜，并且生物膜的个体成员可能会从生物膜分散到浮游相中，并可能随后存在于不同的生物膜中。
[0430]
已知生物膜和浮游细胞涉及体内的很多种微生物感染。在其中涉及生物膜的感染过程包括常见问题诸如尿路感染、导管感染、中耳感染、牙菌斑形成、牙龈炎、接触镜涂膜(coating contact lenses)、心内膜炎和囊性纤维化肺中的感染。生物膜还可以在植入装置诸如导管、人工心脏瓣膜、骨置换假体和宫内节育器的惰性表面上形成。细菌生物膜还可能损害皮肤创伤愈合，并降低愈合或治疗感染的皮肤创伤时的局部抗菌效率。
[0431]
应当理解，许多细菌可以形成生物膜。例如，铜绿假单胞菌已知会形成生物膜，并且是新兴的医院感染和囊性纤维化肺感染中的重要机会病原体和致病原。牙菌斑是牙齿表面上的生物膜，并且由细菌细胞(主要是变形链球菌(streptococcus mutans)和血链球菌(streptococcus sanguis))、唾液聚合物和细菌细胞外产物组成。已知军团杆菌(legionella)细菌会在某些条件下在生物膜中生长，其中它们不受消毒剂的伤害。淋病奈瑟球菌(neisseria gonorrhoeae)是人类独有的病原体，已证明其在玻璃表面和人细胞上形成生物膜。形成生物膜的其他类型的细菌包括金黄色葡萄球菌和肠球菌。
[0432]
由于生物膜中的微生物所提供的特性，生物膜典型地不易受到抗生素、抗菌剂和杀生物剂的影响。在一些情况下，生物膜中的细菌对于抗菌化学治疗的耐药性(即，不易受到影响)可以是浮游状态中的相同生物体的最高4000倍。最低抑菌浓度(mic)描述了抑制生物膜形成所必需的递送至浮游微生物的活性剂的量。与之相对，最低生物膜清除浓度(mbec)描述了抑制或清除生物膜生长所必需的递送至生物膜的活性剂的最低浓度。在这些量中可以看到的差异说明，在标准治疗浓度下，形成生物膜的微生物更不易受到抗菌剂的影响。
[0433]
令人惊讶地发现，本文公开的式i的化合物不仅对浮游生长的微生物具有活性，而且还对本质上包裹在生物膜内的微生物具有活性。因此，本申请中对微生物感染的治疗的提及也明确地旨在涵盖对有此治疗需要的受试者中涉及生物膜的微生物感染的治疗。
[0434]
式i的化合物可以通过任何合适的途径给药，但是可以特别地通过以下给药：口服、静脉内、肌内、皮肤，皮下，经粘膜(例如舌下或颊)、直肠、经皮、鼻、肺(例如气管或支气管)、局部、通过任何其他肠胃外途径、以药学上可接受的剂型的包括该化合物的药物制剂的形式。可以提及的特别的给药方式包括口服、静脉内、皮肤、皮下、鼻、肌内或腹膜内给药。
[0435]
式i的化合物通常将与药学上可接受的佐剂、稀释剂或载体混合作为药物制剂给药，可以适当考虑预期的给药途径和标准药物实践来选择它们。这样的药学上可接受的载体对于活性化合物可以是化学惰性的，并且在使用条件下可没有有害的副作用或毒性。合适的药物制剂可以在例如remington the science and practice of pharmacy,19th ed.,mack printing company,easton,pennsylvania(1995)中找到。对于肠胃外给药，可以应用肠胃外可接受的水性溶液，其不含热原并且具有必需的ph、等渗性和稳定性。合适的溶液是技术人员众所周知的，文献中描述有许多方法。药物递送方法的简要综述也可以在例如langer,science(1990)249,1527中找到。
[0436]
另外，合适的制剂的制备可以通过技术人员使用常规技术和/或根据标准和/或公认的药物实践来常规地实现。
[0437]
在根据本发明使用的任何药物制剂中，式i的化合物的量将取决于多种因素，诸如待治疗的病症的严重程度，待治疗的具体患者，以及所应用的一种或多种化合物。无论如何，制剂中式i的化合物的量都可以由技术人员常规地确定。
[0438]
例如，固体口服组合物诸如片剂或胶囊剂可以包含1至99％(w/w)的活性成分、0至99％的(w/w)稀释剂或填充剂、0至20％(w/w)的崩解剂、0至5％(w/w)的润滑剂、0至5％(w/w)的助流剂、0至50％(w/w)的制粒剂或粘合剂、0至5％(w/w)的抗氧化剂以及0至5％(w/w)的色素。控制释放片剂可以额外包含0至90％(w/w)的控制释放聚合物。
[0439]
肠胃外制剂(诸如用于注射的溶液或悬浮液或者用于输注的溶液)可以包含1至50％(w/w)的活性成分；以及50％(w/w)至99％(w/w)的液体或半固体载体或媒介物(例如溶剂诸如水)；以及0-20％(w/w)的一种或多种其他赋形剂，诸如缓冲剂、抗氧化剂、悬浮稳定剂、张力调节剂和防腐剂。
[0440]
根据待治疗的疾患和患者以及给药途径，式i的化合物可以以不同的治疗有效剂量向有此需要的患者给药。
[0441]
然而，在本发明的上下文中，向哺乳动物特别是人给药的剂量应足以在合理的时间框架内在哺乳动物中产生治疗响应。本领域技术人员将认识到，确切剂量和组合物以及最适当的递送方案的选择还将尤其受到以下的影响：制剂的药理特性，所治疗病症的性质和严重程度，以及接受者的身体状况和精神敏度，以及特定化合物的效能，待治疗患者的年龄、状况、体重、性别和响应，以及疾病的阶段/严重程度。
[0442]
给药可以是连续的或间歇的(例如通过弹丸注射)。剂量还可以通过给药的时间和频率来确定。在口服或肠胃外给药的情况下，剂量可以为每天约0.01mg至约1000mg式i的化合物。
[0443]
无论如何，执业医生或其他技术人员都将能够常规地确定最适合个体患者的实际剂量。上述剂量是平均情况的示例；当然，可以存在个别情况，其中更高或更低的剂量范围是应得的，并且这些都在本发明的范围内。
[0444]
本文描述的本发明的各方面(例如上述化合物、组合、方法和用途)可具有以下优点：在本文所描述的病症的治疗中，与用于那些病症或其他情况的治疗中的现有技术中已知的类似化合物、组合、方法(治疗)或用途相比，本发明的各方面对于医师和/或患者更方便、更有效、毒性更低、选择性更好、活性范围更宽、更强效、产生更小的副作用或可能具有其他有用的药理特性。
[0445]
例如，基于如实施例7中所示的其他coe化合物，式i的化合物对哺乳动物细胞的毒性出乎意料地低于所预期的毒性。同时，这类化合物对广谱微生物具有优异的抗菌功效(如实施例3中示出的)，并且能够比常规抗生素更快地清除微生物，并且这些微生物几乎没有或根本没有对这种化合物产生耐药性的倾向(如实施例6中示出的)。
[0446]
其他式i的化合物可以根据本领域技术人员众所周知的技术制备，例如，如下文实施例部分中所描述的。
[0447]
取代基，诸如式i的最终化合物(或其前体和其他相关的中间体)中的r2，在下文所述的方法之后或期间，可以通过本领域技术人员众所周知的方法进行一次或多次修饰。这类方法的实例包括取代、还原(例如，在合适的以及如果必要化学选择性的还原剂诸如libh4或nabh4存在下的羰基键还原)、氧化、烷化、酰化、水解、酯化和醚化。在反应顺序期间的任何时间，前体基团可以改变为不同的这类基团或式i中定义的基团。
[0448]
可以使用常规技术(例如，重结晶、柱色谱、制备型hplc等)从它们的反应混合物中分离出本发明的化合物。
[0449]
在下文描述的方法中，可能需要通过保护基团来保护中间体化合物的官能团。
[0450]
官能团的保护和去保护可以在上述方案中的反应之前或之后进行。
[0451]
可以根据本领域技术人员众所周知的以及如下文所描述的技术去除保护基团。例如，可以使用标准的去保护技术将下文描述的被保护的化合物/中间体化学转化为未被保护的化合物。
[0452]
所涉及的化学的类型将决定保护基团是否需要和其类型，以及用于完成合成的顺序。
[0453]
保护基团的使用在“protective groups in organic chemistry”，由j w f mcomie编辑，plenum press(1973)和“protective groups in organic synthesis”，第3版，t.w.greene&p.g.m.wutz,wiley-interscience(1999)中有完整描述。
[0454]
如本文所用，术语“官能团”，在未保护的官能团的情况下，意指羟基-、硫醇-、氨基官能、羧酸，以及在受保护的官能团的情况下，意指低级烷氧基、n-、o-、s-乙酰基、羧酸酯。
[0455]
式i的化合物可用于从有此需要的任何表面上去除生物膜。因此，本文还公开了在易于形成生物膜的系统中从固体基质上去除生物膜或防止生物膜在固体基质上积聚，或杀死、抑制或分散栖息于所述生物膜的微生物的方法，所述生物膜由至少一种微生物形成，所述方法包括以下步骤：使所述系统与有效量的如上文所限定的式i的化合物或其溶剂化物或者包括式i的化合物的组合物接触以去除所述生物膜或防止所述生物膜的形成。
[0456]
上面的方法明确地旨在涉及离体用途。这类用途包括但不限于控制在可能遭受腐蚀的表面上，用于水处理的膜(例如，反渗透水膜)上，以及其中可能形成生物膜并且需要去除生物膜以使所述装置能够被有效地灭菌以用于初始使用和再使用的医疗装置表面上的生物膜的形成。
[0457]
式i的化合物还可用于多种其他应用中。这些包括：
[0458]
(ba)作为添加剂用于工业过程，例如在油气生产中以保护基础设施和产品免受微生物活动的负面后果(例如腐蚀或油酸化)；
[0459]
(bb)作为工业产品(诸如石油馏分)的添加剂，以保护产品和相关基础设施(例如燃料箱)免受(ba)中所述的后果；
[0460]
(bc)作为添加剂添加至：油漆和其他涂料；以及聚合物共混物。
[0461]
所得产品可以包括抗菌膜(诸如食品包装中)、配件(诸如新生儿保育箱上使用的管配件)和纺织品(例如，诸如在鞋或摩托车头盔中的防止异味的纺织品)，以及由掺入该添加剂的聚合材料制成的医疗装置(例如，抗菌导管和隐形眼镜)。
[0462]
当用作添加剂时，式i的化合物可以单独提供或与合适的佐剂、稀释剂或载体组合作为制剂提供。为了避免疑问，本发明还涉及当将式i的化合物用作添加剂时获得的所得产物。当用作添加剂时，所得产物或制剂中式i的化合物的量可以为产物或制剂的0.00001wt％至99wt％，诸如0.0001wt％至10wt％。
[0463]
式i的化合物还可用于化妆品或清洁目的。因此，本文还公开了化妆品或清洁制剂，包括如上定义的式i的化合物和一种或多种适用于化妆品或清洁制剂的佐剂、稀释剂或载体。
[0464]
当用于化妆品目的时，式i的化合物可以用于去除微生物，以便预防头皮屑、痤疮(或至少皮脂斑)和牙龈炎。当用于形成清洁组合物时，式i的化合物可有助于对有此需要的表面(例如，从浮游状态中的微生物或作为生物膜)进行灭菌。
[0465]
鉴于以上，式i的化合物可以用作个人护理制剂中的抗菌活性成分，例如洗发剂、沐浴添加剂、护发产品、液体和固体皂(基于合成表面活性剂以及饱和和/或不饱和脂肪酸的盐)、洗剂和乳膏，以及其他水性溶液或醇溶液，例如用于皮肤的清洁溶液。
[0466]
因此，还提供了包括本发明的聚合物或共聚物和表面活性剂的抗菌和/或抗真菌洗涤剂组合物。应当理解，该组合物还可以包含额外的化妆品可相容载体和/或佐剂。所述组合物可以特别是洗发剂的形式或者固体或液体皂的形式，尽管也可以考虑如上所描述的其他组合物(例如，其他护发产品、洗剂和乳膏等)。
[0467]
洗涤剂组合物可以包括按重量计0.01至15％，诸如按重量计0.5至10％的本发明的聚合物或共聚物。应当理解，超过一种本发明的聚合物和共聚物可以形成洗涤剂组合物的一部分。
[0468]
取决于洗涤剂组合物的形式，除本发明的聚合物或共聚物外，它将包括进一步的成分，例如螯合剂、着色剂、芳香油、增稠或固化(稠度调节)剂、润肤剂、uv吸收剂、皮肤保护剂、抗氧化剂、改善机械性能的添加剂诸如二羧酸和/或c
14-c
22
脂肪酸的al、zn、ca和mg盐，以及任选的防腐剂。
[0469]
洗涤剂组合物可以配制成油包水或水包油乳液、醇的或包含醇的制剂、离子或非离子两亲性脂质的囊泡状分散体如凝胶、固体棒或气雾制剂。
[0470]
作为油包水或水包油乳液，洗涤剂组合物可以包括5至50wt％的油相，5至20wt％的乳化剂和30至90wt％的水。油相可以包含适用于化妆品制剂的任何油，例如一种或多种烃油、蜡、天然油、硅油、脂肪酸酯或脂肪醇。优选的一元醇或多元醇是乙醇、异丙醇、丙二醇、己二醇、甘油和山梨糖醇。
[0471]
洗涤剂组合物可以以各种各样的制剂提供。合适的组合物的实例包括但不限于皮肤护理制剂(例如，片剂形式或液体皂形式的皮肤洗涤和清洁制剂、无皂洗涤剂或洗涤糊剂)、沐浴制剂(例如，液体组合物诸如泡沫浴、乳制剂、淋浴制剂或固体浴制剂)、剃须制剂(例如，剃须皂、泡沫剃须乳膏、非泡沫剃须乳膏、泡沫和凝胶、用于干剃须的剃须前制剂、剃须后或剃须之后的洗剂)、化妆品头发护理制剂(例如，洗发水和调理剂形式的洗发制剂，护
发制剂，例如预处理制剂、生发水、定型乳膏、定型凝胶、润发油、护发素、护理包、密集头发护理，头发结构化制剂，例如用于烫发(热烫、温和烫、冷烫)的烫发制剂、头发拉直制剂、液体头发定型制剂、泡沫、发胶，漂白制剂，例如过氧化氢溶液、亮发洗发水、漂白乳膏、漂白粉、漂白糊剂或油，临时的、半永久或永久染发剂，包含自氧化染料的制剂或天然染发剂诸如指甲花或甘菊)。
[0472]
抗菌皂可以具有例如以下组成：
[0473]
按重量计0.01至5％的式i的化合物；
[0474]
按重量计0.3至1％的二氧化钛；
[0475]
按重量计1至10％的硬脂酸；和
[0476]
其余为皂基，例如牛油脂肪酸和椰子油脂肪酸或甘油的钠盐。
[0477]
洗发水可以具有例如以下组成：
[0478]
按重量计0.01至5％的式i的化合物；
[0479]
按重量计12.0％的月桂醇聚醚-2-硫酸钠(sodium laureth-2-sulfate)；
[0480]
按重量计4.0％的椰油酰胺丙基甜菜碱；
[0481]
按重量计3.0％的nacl；和
[0482]
水至100wt％。
[0483]
应当理解，本文公开的药学上可接受的组合物还可适合用作鼓励促进集约化农业的增长。还特别考虑了在该领域中的用途。这样的制剂可以类似于上述用于医药用途的那些制剂。
[0484]
现在将描述体现本发明某些方面的非限制性实例。
[0485]
实施例
[0486]
材料和仪器
[0487]
对羟基苯甲醛、四氯化钛、锌粉、无水四氢呋喃(thf)、三甲胺在甲醇中的溶液、1,4-二碘丁烷、1,6-二碘己烷、1,8-二碘辛烷、无水碳酸钾和其他试剂购自商业来源(fisher scientific、sigma-aldrich和tci化学品)并且按原样使用。
[0488]1h和
13
c nmr光谱是在室温或325k下的氘代氯仿或dmso中在bruker av 300光谱仪上测量的。化学位移以相对于内部四甲基硅烷(tms)标准的δ值(ppm)报告。质谱是在使用esi离子源并去除了液相色谱柱的agilent 6530lcms上测量的。在shimadzu uv-3600分光光度计上记录紫外可见吸收光谱。在fluoromax-3荧光光谱仪上测量光致发光光谱。通过在coe溶液的最大吸收处激发来收集荧光信号。使用nano dsc仪器(ta instruments)测量囊泡溶液的差示扫描量热曲线。动态光散射(dls)测量是使用malvern nano-zs粒度仪进行的。
[0489]
通用方法
[0490]
最低抑菌浓度的确定
[0491]
使用微量肉汤稀释法确定每个coe分子各自的最低抑菌浓度(mic)。简而言之，将coe经由2倍稀释系列稀释在96孔板中的100μl的用于大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的muller hinton肉汤(mhb)或用于粪肠球菌的脑心浸液肉汤(bhi)中以获得期望的最终浓度。随后，向每个孔中接种100μl的在用于大肠杆菌的mhb或用于粪肠球菌的bhi中的1x 106个菌落形成单位(cfu)ml-1
的各自微生物，以获得5x 105cfu ml-1
的接种密度。然后将板在37℃下振荡
(200rpm)温育18小时。通过在18小时温育期的开始和结束时比较600nm处的最终光密度与阳性和阴性生长对照将mic值确定为其中微生物生长被完全抑制的最低coe浓度。结果一式三份获得。
[0492]
细胞摄取实验
[0493]
coe-d4、coe-d6和coe-d8的相对膜亲和力是使用吸收光谱法由细胞所摄取的量估计的。在大肠杆菌k12培养物在37℃的mhb中生长后，将细胞通过离心(6000rpm，5min)收获，并且用pbs溶液洗涤两次(ph＝7.2)。随后将细胞重悬于pbs中，并且将密度调节至od＝1.0。此后，将5ml的该细胞悬浮液与等体积的20μg/ml的coe在pbs中的溶液混合，以获得10μg/ml的最终浓度(一式三份)。在室温和振荡(200rpm)下暴露于coe 2小时后，通过离心去除细胞，并且收集上清液用于吸光度扫描以定量上清液中的剩余coe。通过比较上清液与相应的对照coe溶液(即，10μg/ml在pbs中)的吸光度来估计摄取量。在较低温度下的摄取测量的程序与上述程序类似，但是在4℃而不是室温下进行暴露于coe和离心。
[0494]
sem表征
[0495]
大肠杆菌k-12根据上述程序(在摄取测量中)生长、收集和洗涤。将coe溶液(在pbs中)添加至大肠杆菌k12的pbs悬浮液(od
600
＝1.0)中，以获得32μg/ml的最终coe浓度。在室温下在振荡(200rpm)下温育2小时后，立即将微生物用2.5％戊二醛溶液在4℃下固定过夜。将10μl固定的细菌悬浮液点滴到sem导电糊上，并且置于空气中干燥。用一系列浓度越来越高的乙醇溶液(20％-100％)对细菌样本进行脱水。干燥过夜后，用铂涂覆样本并且用fesem(jeol jsm-6700f)成像以表征样本的形态。
[0496]
落射荧光显微镜
[0497]
大肠杆菌k-12根据上述程序(在摄取测量中)生长、收集和洗涤。将coe溶液(在pbs中)添加至大肠杆菌k12的pbs悬浮液(od
600
＝1.0)中，以获得32μg/ml的最终coe浓度。在室温下在振荡(200rpm)下温育2小时后，将一滴悬浮液置于带有盖玻片(#1.5，0.17mm厚)的显微镜载玻片上，并且使用具有油浸镜头的plan-apochromat 100x/1.4相衬的倒置宽视野落射荧光显微镜
[0498]
(carl zeiss axio observer z1倒置显微镜)成像。通过使用dapi染料通道(滤光片组49dapi，激发峰在365nm处以及发射在445/50nm处)收集coe的荧光信号来观察荧光显微镜图像。使用相衬透射光技术(具有油浸镜头的plan-apochromat 100x/1.4相衬)在完全相同的位置获得细胞的明场图像。在相同的条件下，用相匹配的照射频率和曝光时间获得了通过不同coe处理的细胞图像。
[0499]
反式-二苯乙烯-4,4'-二醇(2)的合成
[0500]
反式-二苯乙烯-4,4'-二醇(2)如报告的方法(r.baskin,et al.,bioorg.med.chem.lett.2012,22,1402-1407)中所描述的经由mcmurry偶联合成。
[0501]1h nmr(300mhz,dmso-d6)δ9.47(s,2h),7.35(d,j＝8.6hz,4h),6.89(s,2h),6.74(d,j＝8.6hz,4h)。
[0502]
小单层囊泡的制备
[0503]
pope(1-棕榈酰基-2-油酰基-磷脂酰乙醇胺)和popg(1-棕榈酰基-2-油酰基-磷脂酰甘油)从avanti polar lipids购买作为氯仿原料。将pope和popg以摩尔比为85:15混合，并且在温和的氮气流下干燥。将获得的脂质饼进一步干燥过夜，以获得薄的脂质膜。通过添
加25mm tris、150mm nacl ph 7.5至浓度为4.3mg/ml，随后在45℃下使用磁力搅拌器在约300rpm的恒定搅拌下温育2小时，以进行干燥膜的再水化。为了制备单层囊泡，将囊泡悬浮液在45℃下通过100nm孔的聚碳酸酯膜反复挤出(21次)。将挤出的囊泡样本保持在4℃直至进一步使用。在dsc测量之前，将囊泡溶液用缓冲液(25mm tris，150mm nacl，ph 7.5)或coe溶液(25mm tris，150mm nacl，ph 7.5)稀释至0.86mg/ml。
[0504]
实施例1本发明的共轭低聚电解质的合成(coe-d4、coe-d6、coe-d8、coe-d62n和coe-d82n)
[0505]
合成了本发明的一系列coe化合物，并且它们的分子结构如图1a和1b所示出。这些coe在疏水性共轭主链(亚苯基亚乙烯基)、烷基链长以及胺和铵基团数目方面在结构上有所不同。
[0506]
例如，以下描述了本发明某些实施方式(coe-d4、coe-d6和coe-d8)的合成路线(图2a)，合成从起始原料反式-二苯乙烯-4,4
’-
二醇(2)开始(根据以上通用方法合成)。应当理解，反应条件和合成方法可以相应地调整以生产本发明的coe。例如，coe-d62n和coe-d82n也可以类似地从2(图2b)开始很容易地合成。
[0507]
在用于合成coe-d4、coe-d6和coe-d8的典型反应中，在芳基醚形成步骤中应用过量的α,ω-二碘代烷烃以最小化低聚反应。将中性前体从氯仿中沉淀至丙酮中，并且通过用丙酮洗涤进一步纯化。通过将末端烷基碘基团与三甲胺季铵化，随后在真空下去除溶剂，获得目标coe化合物。与肽合成相比，简单的合成和纯化步骤是有利的，证明了低成本生产的潜力。中间体和产物通过nmr波谱法和质谱法表征。合成的特定细节描述如下。
[0508]
经由化合物3合成coe-d4
[0509]
(e)-1,2-双(4-(4-碘代丁氧基)苯基)乙烷(3)的合成
[0510]
将化合物2(0.12g，0.565mmol，1当量)、无水碳酸钾(0.39g，2.83mmol，5当量)和1,4-二碘丁烷(3.5g，11.3mmol，20当量)添加至两颈圆底烧瓶中，并且用ar吹扫。随后，将50ml丙酮注入到混合物中，并且随后在回流下搅拌36小时。冷却至室温后，将反应混合物倒入100ml水中，并用200ml加热的氯仿(～55℃)萃取。透明有机相经na2so4干燥，并然后通过使用旋转蒸发仪蒸发去除有机溶剂。通过将20ml丙酮添加至混合物中获得沉淀物，并且将沉淀物通过过滤除去，并然后通过用丙酮洗涤纯化。将沉淀物真空干燥并获得最终产物为白色固体(273mg，84％产率)。
[0511]1h nmr(300mhz,325k,氯仿-d)δ7.41(d,j＝8.4hz,4h),6.92(s,2h),6.87(d,j＝8.4hz,4h),4.08
–
3.96(m,4h),3.33
–
3.22(m,4h),2.12
–
1.99(m,4h),1.97
–
1.85(m,4h)。
[0512]
13
c nmr(75mhz,325k,cdcl3)δ158.8,131.2,127.8,126.8,115.3,67.3,30.7,30.7,6.3。
[0513]
coe-d4的合成
[0514]
在ar气氛下向单颈圆底烧瓶中加入化合物3(130mg，0.226mmol)和thf(10ml)，并且加热至55℃以溶解化合物3。将大量过量的三甲胺在甲醇中的溶液(5ml，3.2m)添加至该混合物中。将所得溶液在55℃下搅拌24小时。经由旋转蒸发除去溶剂，并且真空干燥。获得最终产物为灰白色固体(149mg，95％产率)。
[0515]1h nmr(300mhz,dmso-d6)δ7.50(d,j＝8.8hz,4h),7.04(s,2h),6.95(d,j＝8.8hz,4h),4.11
–
3.99(m,4h),3.43
–
3.34(m,4h),3.07(s,18h),1.93
–
1.80(m,4h),1.80
–
1.68(m,
4h)。
[0516]
13
c nmr(75mhz,dmso-d6)δ158.7,131.0,128.3,126.7,115.6,67.6,65.9,53.1,26.5,20.2。
[0517]
ms(esi)m/z：[m-2i]
2+
计算值(calcd.)220.2；实验值(found)220.2。
[0518]
经由化合物4合成coe-d6
[0519]
(e)-1,2-双(4-((6-碘代己基)氧基)苯基)乙烷(4)的合成
[0520]
根据如上对于化合物3所述的程序合成化合物4。获得最终产物为白色固体(254mg，87％产率)。
[0521]1h nmr(300mhz,325k,氯仿-d)δ7.40(d,j＝8.7hz,4h),6.92(s,2h),6.87(d,j＝8.7hz,4h),4.06
–
3.94(m,4h),3.28
–
3.17(m,4h),1.96
–
1.74(m,8h),1.59
–
1.45(m,8h)。
[0522]
13
c nmr(75mhz,325k,cdcl3)δ159.0,131.0,127.8,126.7,115.3,68.4,33.9,30.7,29.5,25.5,6.8。
[0523]
coe-d6的合成
[0524]
化合物4用于如上对于coe-d4的合成所述的相同的季铵化反应。获得产物coe-d6为灰白色固体(122mg，93％产率)。
[0525]1h nmr(300mhz,dmso-d6)δ7.48(d,j＝8.8hz,4h),7.02(s,2h),6.92(d,j＝8.8hz,4h),4.04
–
3.95(m,4h),3.32
–
3.24(m,4h),3.05(s,18h),1.82
–
1.64(m,8h),1.56
–
1.41(m,4h),1.41
–
1.28(m,4h)。
[0526]
13
c nmr(75mhz,dmso-d6)δ158.9,130.8,128.3,126.6,115.5,68.2,66.2,53.1,29.3,26.4,26.0,22.9。
[0527]
ms(esi)m/z:[m-2i]
2+
计算值248.2；实验值248.2。
[0528]
经由化合物5合成coe-d8
[0529]
(e)-1,2-双(4-((8-碘代辛基)氧基)苯基)乙烯(5)的合成
[0530]
根据如上对于化合物3所述的程序合成化合物5。获得最终产物为白色固体(244mg，87％产率)。
[0531]1h nmr(300mhz,325k,氯仿-d)δ7.40(d,j＝8.8hz,4h),6.91(s,2h),6.87(d,j＝8.8hz,4h),4.04
–
3.94(m,4h),3.26
–
3.14(m,4h),1.92
–
1.73(m,8h),1.55
–
1.33(m,16h)。
[0532]
13
c nmr(75mhz,325k,cdcl3)δ159.1,131.0,127.8,126.7,115.3,68.5,34.0,30.8,29.7,29.5,28.8,26.4,7.1。
[0533]
coe-d8的合成
[0534]
化合物5用于如上对于coe-d4的合成所述的相同的季铵化反应。获得产物coe-d8为灰白色固体(137mg，90％产率)。
[0535]1h nmr(300mhz,dmso-d6)δ7.48(d,j＝8.9hz,4h),7.02(s,2h),6.91(d,j＝8.8hz,4h),4.03
–
3.93(m,4h),3.31
–
3.22(m,4h),3.04(s,18h),1.79
–
1.60(m,8h),1.49
–
1.22(m,16h)。
[0536]
13
c nmr(75mhz,dmso-d6)δ159.0,130.8,128.3,126.6,115.5,68.3,66.2,53.1,29.6,29.4,29.4,26.6,26.3,22.9。
[0537]
ms(esi)m/z:[m-2i]
2+
计算值276.2；实验值276.2。
[0538]
实施例2 coe-d4、coe-d6和coe-d8的表征
[0539]
本发明的合成后的coe通过动态光散射，紫外/可见吸收、光致发光光谱来表征。
[0540]
在磷酸盐缓冲盐水(pbs)和dmso溶液中获得了coe-d4、coe-d6和coe-d8的归一化紫外/可见吸收和光致发光光谱(图3a和b)。如预期的，这三个coe在λ＝324nm处显示出类似的吸收最大值，因为它们包含相同的光敏共轭二苯乙烯核。吸收系数随烷基间隔基长度的增加而略有降低(coe-d4为2.9x 104m-1
cm-1
，coe-d6为2.6x 104m-1
cm-1
，以及coe-d8为2.4x 104m-1
cm-1
)。三种coe分子的发射曲线基本相同。在其最大吸收(λ＝324nm)处激发后，coe-d4发射曲线在λ＝374nm处显示最大值。观察到coe-d6和coe-d8的光谱略有红移，具有的发射最大值分别在λ＝381和380nm处。相对于色氨酸作为标准品确定的coe-d4、coe-d6和coe-d8的荧光量子效率在5
–
6％的范围内。动态光散射(dls)分析表明，在实验相关的浓度下，coe-d4没有明显的coe聚集(图4a)。pbs溶液中coe的相关曲线和coe-d4的浓度依赖性推导的计数率分别如图4b和c中所示出。coe-d6和coe-d8的较低溶解度排除了待进行的类似的浓度依赖性测量。这些结果表明，当coe以实验浓度(低于20μg/ml)使用时，没有大的聚集体；mic附近的浓度不足以促进coe的大聚集体的形成。
[0541]
表1a中汇总了coe-d4、coe-d6和coe-d8在pbs中的光学特性、溶解度和大肠杆菌摄取，同时表1b中汇总了它们在dmso中的光学特性。表1c示出了coe-t4和coe-t6的光学特性。
[0542]
还计算了coe-d4、coe-d6和coe-d8的疏水性和分子长度，并汇总在表2中。保持这三种coe的低电荷密度以降低水溶解度，从而使平衡向膜嵌入移动，同时将logp保持在临床可接受的范围内(logp≤5)。由于亚苯基亚乙烯基序列长度是二苯乙烯核，因此通过控制将二苯乙烯片段连接至两个末端铵基团的烷基链的长度，从-c4h
8-(c4)至-c8h
16-(c8)，来调节coe-d4、coe-d6和coe-d8的分子长度和相对疏水性。分子模拟表明，coe-d4的完全延伸的分子长度为2.6nm，coe-d6的为3.1nm，以及coe-d8的为3.6nm(表2)。
[0543]
表1a pbs中coe-d4、coe-d6和coe-d8的紫外-可见和pl光谱、溶解度和摄取的汇总。
[0544][0545]
表1b dmso中coe-d4、coe-d6和coe-d8的紫外-可见和pl光谱的汇总。在最大吸收峰处测量摩尔消光系数。
[0546]
化合物coe-d4coe-d6coe-d8分子量(g/mol)694.48750.59806.70λ
abs
(nm)332332332λ
em
(nm)379380380
ε(x 104m-1
cm-1
)3.4
±
0.23.3
±
0.13.5
±
0.2
[0547]
表1c pbs中coe-t4和coe-t6的紫外-可见和pl光谱、溶解度的汇总。
[0548][0549]
表2分别使用gaussview和molinspiration软件模拟的coe-d4、coe-d6和coe-d8的分子长度、logp数据。
[0550]
化合物coe-d4coe-d6coe-d8长度(nm)694.48750.59806.70logp-2.2-0.181.8
[0551]
实施例3合成后的coe对各种细菌和真菌的抗菌作用
[0552]
在各种细菌和真菌上研究了本发明的合成后的coe以确定它们的抗菌作用。最初的研究是在具有确定的coe的最低抑菌浓度(mic)的细菌菌株上进行的。然后在各种细菌和真菌上进行coe的单剂量的后续研究，以比较它们对这些微生物的抑制程度。
[0553]
初步研究
[0554]
使用如上文通用方法中所描述的微量肉汤稀释法确定coe-d4、coe-d6和coe-d8抗参照菌株大肠杆菌k12、致病大肠杆菌uti89和革兰氏阳性病原体粪肠球菌og1rf的mic值。coe-d4、coe-d6和coe-d8对于大肠杆菌k12的mic分别确定为128、16和4μg ml-1
(图5a)。对于所有三种细菌，都观察到抗菌活性随烷基链长度的增加而显著增加。观察到尿路病原体大肠杆菌ut189总是比大肠杆菌k12具有更大的耐受性。这并不奇怪，因为这两种生物体在它们所表达的荚膜多糖上有所不同，已知荚膜多糖会阻碍抗菌剂的摄取并降低它们的效力(m.a.campos,et al.,infect.immun.2004,72,7107
–
7114)。包括α2-8连接的唾液酸的k型衣壳由ut189分泌，并且已知是该生物体的重要毒力因子(c.whitfield,et al.,mol.microbiol.1999,31,1307
–
1319；g.g.anderson,et al.,infect.immun.2010,78,963
–
975)。
[0555]
观察到coe-d8的活性比先前报道的coe诸如coe1-3py的活性更好，与47μg ml-1
(coe1-3py)相比具有4μg ml-1
(coe-d8)的mic。此外，coe-d8的mic与存在的靶向细胞被膜的抗菌剂的mic相当。例如，确定了黏菌素抗多重耐药的革兰氏阴性细菌(大体上)的mic为≤4μg ml-1
(m.e.falagas,et al.,clin.infect.dis.2005,40,1333-1341)，并且在脑心浸液培养基中抗粪肠球菌的革兰氏阳性特异性抗菌达托霉素的mic为约3μg ml-1
(t.t.tran,et al.,mbio 2013,4,e00281-00213)。
[0556]
有趣的是，coe-d8抗革兰氏阴性大肠杆菌和革兰氏阳性生物体粪肠球菌同样有效(mic＝4μg ml-1
)。这一有前景的属性是特别重要的，因为这两种生物体经常在尿路感染中
同时出现(d.keogh,et al.,cell host microbe2016,20,493-503)。还测试了剩余coe的抗菌作用，并且它们抗大肠杆菌k12的结果汇总在下表3中。
[0557]
表3本发明的coe抗大肠杆菌k12的抗菌活性。
[0558][0559]
与万古霉素相比较，还测试了coe-d62n和coe-d82n在革兰氏阳性金黄色葡萄球菌25923和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(mrsa baa-40)上的抗菌作用(图5b)。观察到，对于所有三种细菌菌株，特别是对于金黄色葡萄球菌(mrsa)的耐药性菌株，coe-d62n和coe-d82n展示出比万古霉素更低的mic。
[0560]
后续研究
[0561]
在后续研究中，测试了合成后的coe在如表4所列出的更广谱的细菌和真菌上的抗菌活性。
[0562]
表4在这些研究中使用的细菌和真菌的列表
[0563][0564]
方法
[0565]
细菌样本的数据收集
[0566]
使用tecan m1000 pro单色仪读板器通过测量在600nm(od
600
)处的吸光度来确定细菌生长的抑制。相对于由在相同板中温育的阴性对照(仅培养基)和阳性对照(无抑制剂的细菌)确定的参照生长，计算每个孔的生长抑制。将单剂量的32μg/ml的coe(终浓度)用于每个测试。
[0567]
真菌样本的数据收集
[0568]
通过测量在530nm(od
530
)处的吸光度来确定白色念珠菌的生长抑制，同时通过在添加刃天青(resazurin)(终浓度为0.001wt.％)并在35℃下温育额外的2小时后，测量在600至570nm(od
600-570
)之间的吸光度的差来确定新生隐球菌的生长抑制。使用biotek synergy htx读板器测量吸光度。相对于作为参照的在相同的板上由阴性对照(仅培养基)和阳性对照(无抑制剂的细菌)确定的生长，计算每个孔的相对生长抑制。单剂量的32μg/ml的coe(终浓度)用于每个测试。
[0569]
计算生长抑制百分比
[0570]
基于由阴性对照(仅培养基)和阳性对照(无抑制剂的细菌/真菌培养基)确定的参照孔中的生长，计算个体样本的生长抑制百分比。负抑制值表明与参照生长(仅细菌/真菌，设置为0％抑制)相比生长速率(或od
600
)更高。所有细菌和真菌的生长速率可在-/+10％之间变化，这在所报告的细菌/真菌生长的正态分布之内。通过修改的z评分(z-score)可识别出任何显著的差异(或异常值(outlier)/命中值(hit))，并且通过抑制值和z评分的组合来
选择活性化合物。
[0571]
z评分分析
[0572]
进行z评分分析以研究样本中的异常值或命中值。使用修改的z评分方法基于样本总数计算z评分，该方法考虑了可能的偏斜样本总数。修改的方法使用中位数和mad(中位数平均偏差)代替平均值和标准偏差，以及比例因子(iglewicz,b.&hoaglin,d.c.volume 16:how to detect and handle outliers.the asqc basic reference in quality control:statistical techniques,1993)。计算修改的z评分值的公式如下：
[0573][0574]
其中，m(i)表示修改的z评分值；
[0575]
x
i
表示样本值；
[0576]
表示中位数；和
[0577]
mad表示中位数绝对偏差。
[0578]
m(i)值>|2.5|(绝对)会将该样本分类为异常值或命中值。对于任何一个重复样本(在不同的板上n＝2),活性样本表示为具有抑制值等于或大于80％，并且绝对z评分大于|2.5|的化合物。部分活性样本表示为具有抑制值从50％至<80％，或绝对z评分低于|2.5|的化合物。最后，非活性样本表示为具有抑制值低于50％和/或绝对z评分低于|2.5|的化合物。
[0579]
质量控制
[0580]
所有筛选实验均进行两次重复(n＝2)，两次重复在不同的测定板上进行，但都来自单次铺板并且在单次筛选实验(微生物温育)中进行。z'因子和标准抗生素对照在不同浓度(>mic和<mic)下的值被用作个体板的质量控制。z'因子可以源自如下：
[0581][0582]
其中，sd表示标准偏差。
[0583]
如果z'因子>0.4并且抗生素标准品在最高和最低浓度下分别是活性和无活性的，则该板通过了质量控制。
[0584]
结果和讨论
[0585]
在下表5中示出了coe在各种细菌和真菌上的后续研究的结果。
[0586]
表5本发明的coe(32μg/ml)对各种细菌和真菌的抗菌功效的汇总。
[0587][0588]1表示该化合物已被选择进行进一步剂量响应研究和命中确认的生物体类别(革兰氏阴性、革兰氏阳性和真菌)的数目。该选择包括所有活性的以及化合物结果模糊不清需要确认活性或无活性的。
[0589]2表示该化合物已被证明对其有活性的生物体类别(革兰氏阴性、革兰氏阳性和真菌)的数目；0＝无活性。
[0590]3金黄色葡萄球菌革兰氏阳性细菌(mrsa)
[0591]4肺炎克雷伯菌革兰氏阳性细菌(mdr)
[0592]5大肠杆菌革兰氏阴性细菌(fda对照)
[0593]6鲍曼不动杆菌革兰氏阴性细菌(模式株)
[0594]7铜绿假单胞菌革兰氏阴性细菌(模式株)
[0595]8白色念珠菌酵母(clsi参照)
[0596]9新生隐球菌变种格鲁比酵母(模式株)
[0597]
10
活性化合物(抑制％≥80％)，部分活性化合物(抑制％由50％至<80％)，以及非活性化合物(抑制％<50％)分别表示为“a”、“pa”和“na”。
[0598]
实施例4coe对大肠杆菌k12的作用机制
[0599]
建立了coe-d4、coe-d6和coe-d8的抗菌活性，对coe与细菌膜相互作用的作用机制进行了更详细的研究。这经由对处理的大肠杆菌k12或单层囊泡样本的扫描电子显微镜、落射荧光成像和差示扫描量热法进行。通过吸收光谱法表征coe到大肠杆菌k12中的摄取。
[0600]
通过扫描电子显微镜(sem)表征处理的大肠杆菌k12
[0601]
通过sem表征coe处理的细胞。用32μg ml-1
的每种coe处理大肠杆菌k12(od＝0.5)。对于用coe-d4处理的组，观察到具有光滑外表面的特征性杆状细胞(图6a)。相比之下，用coe-d6或coe-d8处理细菌后，细菌的形态以凹陷和膜破裂为特征(图6b和c)。这与coe插入会破坏膜完整性的构想是一致的，并且coe-d8的这种作用强度更大。
[0602]
通过差示扫描量热法(dsc)表征处理的单层囊泡
[0603]
根据通用方法“小单层囊泡的制备”，制备由1-棕榈酰基-2-油酰基磷脂酰乙醇胺(pope)和1-棕榈酰基-2-油酰基磷脂酰甘油(popg)以85:15的摩尔比组成的单层囊泡，并将其用作通用细菌模型膜(g.j.gabriel,et al.,mater.sci.eng.r 2007,57,28
–
64)。
[0604]
当进行dsc时，用8μg ml-1
的coe-d8温育后，主要的凝胶-至-液体-结晶转变峰变宽(图7a)。对于coe-d6，需要更高的浓度(16μg ml-1
)以改变初始迹线(图7b)。相比之下，对于浓度最高达32μg ml-1
的coe-d4，没有观察到明显变化(图7c)。层状相的协同转变的扰动反映了不同程度的膜嵌入。该观察结果与溶解度和烷基链长密切相关(表1a)。由于其较低的水溶解度，coe-d8可能更容易分配到脂质双层的疏水域中，从而导致在囊泡中观察到的相变减弱。因此，dsc数据表明coe-d4、coe-d6和coe-d8的抗菌活性可能反映了它们在与细胞膜相互作用中的差异。
[0605]
通过吸收光谱法表征处理的大肠杆菌k12
[0606]
通过吸收光谱法测量coe的分子结构对相对膜亲和力的作用，其由被大肠杆菌k12摄取的量来估计(图8a-c)。这些实验使用用10μg ml-1
的各种coe温育了2小时的细胞悬浮液(od＝0.5)。通过离心去除细胞，并且由光吸收谱确定未复合的coe的量。最长的分子coe-d8在细菌中获得最高的摄取(72％)。相比之下，仅吸收了3％的coe-d4，而coe-d6的吸收为16％(表1a)。
[0607]
在4℃(低于膜相变温度)下进行了平行实验，并且结果表明coe优先地在室温下嵌入膜中(图9a-c)。由于在较低温度下细胞膜流动性降低，coe-d4的摄取降低至约1％，coe-d6的摄取降低至5％，以及coe-d8的摄取降低至34％。细胞摄取的大幅降低表明大多数coe被并入细菌中，而不仅仅是在膜表面上的物理粘附(诸如静电相互作用)。
[0608]
通过落射荧光成像表征处理的大肠杆菌k12
[0609]
通过在λ＝365nm处激发并在λ＝445/50nm处收集发射，获得了coe处理的大肠杆菌k12细胞的落射荧光图像。用coe-d8处理的大肠杆菌k12具有相对于背景的最高荧光强度，而coe-d4处理的细胞显示出模糊的图像(图6d和f)。用coe-d6处理的细胞显示出中等的荧光强度(图6e)，该荧光强度可以在灰度值曲线中清楚地看到(图6d-f的底部)。用32μg/ml的coe处理的大肠杆菌k12的明场和荧光图像如图10所示出。
[0610]
落射荧光显微镜结果与摄取测量一致，为差异膜积累提供了有力的证据。该结果也与mic结果一致(即，最低mic值与最大结合度有关)。coe-d4、coe-d6和coe-d8的不同细胞摄取可能是由coe的疏水性和溶解度的差异引起的。最短的分子coe-d4是亲水性的且高度溶于水，并因此具有较低的驱动力用于分配到脂质膜中。对于最长的分子coe-d8，由于其增加的疏水性，与膜的结合是更有利的。
[0611]
另一个可能的解释是coe和脂质双层之间的尺寸不匹配(e.strandberg,et al.,biochim.biophys.acta biomembr.2012,1818,1242
–
1249)。coe-d4的长度为约2.6nm，并且它比脂质双层的厚度(约4nm)更短。因此，与coe-d8(约3.6nm)并入相比，coe-d4并入可能需要脂质双层的更大的构象重排。coe和膜之间的高度尺寸不匹配将导致更大的膜破坏，然而，细胞摄取限制了coe-d4的抗菌活性。有趣地注意到，coe-d8的细胞亲和力是coe-d4的细胞亲和力的30倍大，而在大肠杆菌k12上的coe-d8和coe-d4的mic值分别为4μg ml-1
和128μg ml-1
(图5)。假设当od＝0.5、[coe]＝10μg ml-1
(表1a)时在mic浓度下有相似的摄取百分比
(u％)，则mic
eff
定义为mic x u％。mic
eff
反映了如由亲和力的差异所调节的与细胞相互作用的分子数目。尽管mic
eff
的测定存在不确定性，但获得了coe-d4的值为3.8μg ml-1
，coe-d6的值为2.6μg ml-1
，以及coe-d8的值为2.9μg ml-1
。这些值彼此接近，从而揭示了基于每插入的分子设计具有更高抗菌活性的coe的机会。
[0612]
coe的溶解度与细胞摄取和mic的关系
[0613]
基于coe的溶解度，似乎溶解度与细胞摄取和抗菌作用(mic值)之间没有明显的相关性。从获得的coe-d4、coe-d6和coe-d8的mic值中可以观察到，coe-d6具有240μg/ml的水溶解度，针对参照菌株大肠杆菌k12具有16μg/ml的mic值。另一方面，二氨基乙基类似物coe-d62n获得的水溶解度大于4000μg/ml，并且在相同条件下获得甚至更高的8μg/ml的mic。
[0614]
尽管可以理解，更高的细胞摄取可能是更好的抗菌功效的重要因素。但这不适用于二氨基烷基coe类似物。例如，coe-d62n具有的对大肠杆菌k12的细胞摄取为11
±
2％，但在相同条件下，其对应物coe-d82n获得的摄取率为76
±
3％。然而，这两个coe显示出相同的抗大肠杆菌k12的mic值，为8μg/ml。
[0615]
另外，似乎coe的溶解度可能不一定与细胞摄取相关。例如，coe-t4具有210μg/ml的水溶解度，基于大肠杆菌k12的细胞摄取率为75
±
5％。另一方面，其二氨基乙基类似物coe-t42具有大于1000μg/ml的更好的水溶解度，但在相同条件下具有82
±
5％的更好的摄取。
[0616]
实施例5 coe相比于各种常规抗生素的抗生物膜活性
[0617]
由于对抗菌剂的耐药性增加以及普遍的抵抗，由细菌形成生物膜对公共健康构成了严重的问题。清除它们的关键步骤是首先分散生物膜结构，并且使细菌暴露于抗菌剂。这样，与各种常规抗生素相比，测试了本发明的两种coe(coe-t42和coe-t62)的抗生物膜活性。
[0618]
抗生物膜方案的实验程序
[0619]
铜绿假单胞菌(pao1)在luria-bertani(lb)肉汤中在37℃振荡(200rpm)下生长16-18小时。将过夜培养物在m9gc培养基(补充有葡萄糖和酪蛋白氨基酸的m9培养基)中稀释至1:200，并将200μl稀释的培养物添加至mbec板(innovotech，加拿大)的每个孔中。在37℃振荡(200rpm)下温育5小时后，在mbec板的桩钉(peg)上形成了生物膜。然后将桩钉用1
×
磷酸盐缓冲盐水(pbs)溶液(每个孔200μl)冲洗，并且暴露于coe在m9gc培养基中的两倍稀释系列(每个孔200μl)。将攻击板(challenge plate)在37℃振荡(200rpm)下温育1小时，并然后使用200μl pbs洗涤桩钉，然后浸入180μl 0.1wt％的结晶紫水性溶液中。在室温下温育15分钟后，用pbs冲洗桩钉两次，并转移至每个孔中包含200μl无水乙醇的板中15分钟。通过测量在550nm处的结晶紫/乙醇溶液的吸收来定量生物膜质量。最低生物膜分散浓度(mbdc)值确定为附着在桩钉上的生物膜被完全分散时的最低coe浓度。结果重复三次。
[0620]
结果和讨论
[0621]
观察到一些coe呈现出抗生物膜特性，如表6所示出。在相同的测试条件下，coe-t62可以以8μg/ml分散铜绿假单胞菌生物膜，类似于“最后手段”抗生素黏菌素(4μg/ml)，而coe-t42可以以16μg/ml的更高浓度分散生物膜。值得注意的是，coe-t62的生产成本比由多粘类芽孢杆菌(paenibacillus polymyxa)的某些菌株生产黏菌素的生产成本低得多。
[0622]
如应当理解的，这些有效分散生物膜的coe可以与有效抗浮游细菌细胞的那些(实施例3中)一起使用，以进一步增强coe的抗菌功效。
[0623]
表6与其他常规抗生素相比，coe-t42和coe-t62的抗生物膜活性
[0624][0625]
实施例6 coe-d62n和coe-d82n的抗菌功效(时间-杀灭测定)、细菌耐药性诱导作用和皮肤模型研究
[0626]
为了研究本发明的coe的抗菌功效和细菌耐药性诱导，进行了coe-d62n和coe-d82n在耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(mrsa baa-40)上的时间-杀灭测定和耐药性进化实验。另外，还使用接种了mrsa baa-40的皮肤模型研究了coe的功效。
[0627]
实验程序
[0628]
时间-杀灭测定
[0629]
将mrsa baa-40的稳定期培养物在新鲜mhb中稀释至2x 108cfu/ml。然后将500μl此悬浮液与另一500μl的包含两倍期望最终浓度的coe和万古霉素(32μg/ml)的mhb混合。将管在37℃在200rpm振荡下温育。在各种时间点取出等分试样并在pbs中连续稀释，然后铺板在mhb板上以计数cfu/ml。
[0630]
耐药性进化实验
[0631]
为了评价coe诱导耐药性的倾向，在包含100倍稀释的稳定期培养物与浓度增加的coe的mhb培养基中，对mrsabaa-40进行连续传代。在37℃下温育24小时后，确定了初始mic，使用显示1/2mic的孔中细菌悬浮液生成接种物用于当天的测定。连续传代持续超过17天，以确保不会发生进一步的耐药性。
[0632]
结果和讨论
[0633]
从如图11a所示出的时间-杀灭测定中，观察到coe-d62n和coe-d82n两者降低mrsa baa-40的生存力都比万古霉素快得多。特别地，coe-d82n能够在2小时内将mrsa的生存力降低至接近最小值。这证明coe-d62n和coe-d82n具有比商业抗生素如万古霉素更高的抗菌功效。
[0634]
另外，coe-d62n和coe-d82n两者均显示出引起细菌中耐药性的低倾向，如在各个
coe存在下连续传代17天显示的(图11b)。观察到，从第5天开始，coe-d62n和coe-d82n各自的mic都保持相对恒定，这表明mrsa baa-40对coe的耐药性没有发展。
[0635]
使用在cnt基本培养基(来自cellntec)中的永生化人角质形成细胞(250,000nterts)在聚合物膜插入物(0.5cm2表面积)上于多孔板中培养重组人表皮(rhe)48小时，然后在排气(air lifting)之前将它们转移至cnt 3d基本培养基24小时。此后每48小时更换一次培养基，并且rhe生长至少7天。在形成rhe的分层后，将标准的金黄色葡萄球菌接种物添加至rhe中(阴性对照除外)，然后添加10x金黄色葡萄球菌的mic的coe。观察到，与未用coe处理的相比，用coe-d62n和coe-d82n处理的模型表现出完整的皮肤结构(图12)。这证明，coe对于消除mrsa baa-40以及该细菌对皮肤的不利影响是有效的，并且即使当以10x金黄色葡萄球菌的mic施用时，也不会有来自coe的不利影响。
[0636]
实施例7 coe-d62n、coe-t42和coe-t62对哺乳动物细胞的毒性
[0637]
为了使化合物安全用作抗菌剂，还必须证明它对哺乳动物细胞的低毒性。因此，使用溶血测定对本发明选择的coe(coe-d62n、coe-t42和coe-t62)进行毒性研究。
[0638]
溶血测定
[0639]
将从健康供体(29岁，男性)收集的1ml哺乳动物血与9mlpbs混合，并且以1,000rpm离心5min。收集红细胞团，并随后用pbs洗涤三次，并且稀释至最终浓度为5％v/v。将各种coe溶解于pbs中，并且在96孔微量板上连续稀释两倍。在每个孔中将50μl红细胞储备液与50μlcoe溶液混合，并且在37℃在振荡下温育1小时。将微量板以1,000rpm离心10分钟，然后将80μl上清液等分试样转移至新的96孔微量板中，并用另一80μl的pbs稀释。通过使用96孔板分光光度计测量在540nm处的吸光度来计算溶血活性。能够完全裂解红细胞的triton x-100(0.1％于pbs中)被用作阳性对照，而pbs被用作阴性对照。使用以下公式计算溶血百分比：
[0640][0641]
其中，o
p
是coe处理的样本的吸光度，o
b
是阴性对照的吸光度，以及o
t
是阳性对照的吸光度。
[0642]
结果和讨论
[0643]
可以使用导致人红细胞的50％裂解的浓度(hc
50
)与mic值之间的比率来量化coe对细菌或哺乳动物细胞的选择性。
[0644]
从coe-d62n、coe-t42和coe-t62的初步溶血研究中观察到，这些coe对红细胞呈现期望的无毒性或低毒性，具有高于16384μg/ml的hc
50
(表7)。因此，这些coe的hc
50
与mic(抗大肠杆菌k12)之间的比率被确定为高于1000，表明了coe靶向细菌细胞的膜超过红细胞的优异选择性。coe-d62n和coe-d82n的溶血特性随浓度变化的比较如图13所示出。
[0645]
另外，coe呈现出甚至更高的抗金黄色葡萄球菌25923的抗菌功效，因此进一步将hc
50
/mic比率增加到4000以上。值得注意的是，观察到coe-d62n对红细胞无毒，并且显示出抗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(mrsa baa-40)的有效抗菌活性，具有1μg/ml的mic值。这些发现证明了coe作为高效和低毒性抗菌剂的潜在应用。还对coe-d62n进行了进一步测试，并且显示出高水溶解度(>200μm)，对hepg2细胞的低毒性(ic
50
>30μm)，小鼠中良好的肝内在清除率，以及人体中良好的内在清除率。
[0646]
表7coe对红细胞和细菌细胞的膜选择性(hc
50
、mic和hc
50
/mic值)。
[0647]