用于对阿克曼菌进行基因操纵的系统和方法与流程

用于对阿克曼菌进行基因操纵的系统和方法
[0001]
相关申请的交叉引用
[0002]
本申请要求于2018年5月15日提交的美国临时申请第62/671,614号的优先权，所述美国临时申请的内容通过全文引用并入。
[0003]
关于联邦政府资助研究的声明
[0004]
本发明是根据nih授予的联邦授权号5r21dk110496-02在政府支持下进行的。联邦政府享有本发明中的某些权利。


背景技术：

[0005]
本发明的领域涉及对具有改变的表型的肠道微生物进行遗传修饰和选择并且将这些微生物用于治疗疾病。
[0006]
嗜粘蛋白阿克曼菌(akkermansia muciniphilia)是在人肠道粘膜表面上发现的细菌。此细菌使用粘蛋白作为其单一营养来源。所述细菌占成年人肠细菌的1-4％并且是一种栖居在大肠中的细菌。所述细菌是革兰氏阴性、专性、厌氧、非运动性、无芽孢形成的椭圆形真杆菌，所述真杆菌被认为对肠道菌群有益。然而，已发现阿克曼菌属(akkermansia)难以进行分子操纵。阿克曼菌属在生理学上影响肠道微生物组、粘膜和全身免疫以及葡萄糖/脂质代谢的机制尚未十分了解。
[0007]
如此，需要用于产生遗传改变的阿克曼菌属菌株以研究其在肠道菌群中的作用的方法和系统。


技术实现要素：

[0008]
本公开部分地基于发明人对用于使用转座子载体遗传改变阿克曼菌属细菌(akkermansia bacteria)的方法的开发。还提供了遗传改变的阿克曼菌属细菌和改变的阿克曼菌属细菌的文库。在本文所描述和展示的全部内容中提供了本公开的其它方面。
[0009]
在一个方面，本公开提供了一种遗传改变阿克曼菌属细菌的方法，所述方法包括：(a)将seq id no:1的外源转座子载体引入阿克曼菌属以产生多个改变的阿克曼菌属细菌；以及(b)培养所述多个改变的阿克曼菌属以选择已经将所述载体的转座子结合到基因组中的细菌，以产生多个遗传改变的阿克曼菌属细菌。
[0010]
在另一个方面，本公开提供了一种通过所描述的方法产生的遗传改变的阿克曼菌属细菌，其中遗传改变的阿克曼菌属细菌基因组含有所述转座子载体(seq id no:1)的转座子(seq id no:47)。
[0011]
在另一个方面，本公开提供了一种通过将来自seq id no:1的载体的转座子结合到阿克曼菌属细菌中而产生的遗传改变的阿克曼菌属细菌。在一个实例中，转座子是结合到阿克曼菌属基因组中的seq id no:47。
[0012]
在另一个方面，本公开提供了一种改变的阿克曼菌属细菌的文库，所述文库是通过以下产生的：将来自seq id no:1的载体的转座子随机引入阿克曼菌属群体中，以及通过在厌氧条件下在培养基中培养所述细菌来选择所述改变的阿克曼菌属细菌，所述培养基含
有用于选择已经将所述转座子插入到其基因组中的阿克曼菌属的氯霉素。
[0013]
在又另一个方面，本公开提供了一种选择具有性状的改变的遗传调节剂的改变的阿克曼菌属细菌的方法，所述方法包括：(a)将seq id no:1的外源转座子载体引入阿克曼菌属群体，以将转座子随机结合到阿克曼菌属基因组中；(b)培养所述群体阿克曼菌属以选择已经将所述转座子整合到其基因组中以产生多个改变的阿克曼菌属变体的阿克曼菌属；以及(c)通过在选择改变的遗传性状的条件下培养所述阿克曼菌属来选择具有所述改变的遗传调节剂的阿克曼菌属。
[0014]
在另一个方面，本公开提供了一种鉴别阿克曼菌属的性状的新颖遗传调节剂的方法，所述方法包括：(a)将seq id no:1的外源转座子载体结合到阿克曼菌属群体中，以产生将转座子结合到其基因组中的改变的阿克曼菌属群体；(b)在培养基中培养所述阿克曼菌属，所述培养基包括用于选择已经结合了外源转座子的阿克曼菌属的氯霉素；(c)使所述改变的阿克曼菌属暴露于两种不同的条件；以及(d)通过以下进行分析：对由在所述两种不同的条件下生长的所述改变的阿克曼菌属中的转座子破坏的基因进行测序或pcr扩增，以鉴别与所述性状相关的基因。
[0015]
本发明的前述方面和其它方面以及优点将从以下描述中显现。在说明书中，对附图进行了参考，所述附图形成其一部分，并且在附图中通过说明的方式示出了本发明的优选实施例。然而，此类实施例并不一定表示本发明的全部范围，并且因此对权利要求进行参考并且在本文中用于解释本发明的范围。
附图说明
[0016]
图1.阿克曼菌属兼容的转座子载体psam_akk。
[0017]
图2.psam_akk转座子插入阿克曼菌属基因组中。(a)在数轮传代培养转移接合子之后，进行定量pcr以检测质粒主链上bla基因。需要这些传代培养步骤来对大肠杆菌(e.coli)进行反选择，固化质粒并且进行转座。(b)对来自野生型阿克曼菌属和与双氧素标记的转座子特异性探针反应的转座子突变体的hindiii消化的基因组dna进行southern印迹。(c)进行pcr以检测阿克曼菌属特异性16s rdna(akk)、质粒主链(bla)和转座子(cat)内的抗药性标志物。
[0018]
图3.针对粘蛋白利用率所需要的基因进行阵列突变体筛选。(a)用于鉴别在粘蛋白上生长所需要的基因的方法。在缀合之后，tn突变体在具有抗生素选择的板上生长，并且对单独的菌落进行排列并且在96孔板中生长。然后将突变体用于接种含有具有粘蛋白或单糖作为碳源的培养基的板。选择在合成培养基中而非粘蛋白中生长的tn突变体用于进行另外的表型表征和pcr，以鉴别tn插入位置。(b)野生型阿克曼菌属和所选突变体的生长曲线。突变体展现出粘蛋白特异性生长缺陷。
[0019]
图4.使用tn/in-seq在体内进行大规模基因筛选。(a)合并阿克曼菌属tn突变体并且通过口服强饲法将所述突变体用于定殖无菌小鼠。强饲后七天，收集沿肠道的各个位置的内容物并且将其用于dna分离。基于与转座子插入相邻的独特dna序列，使用illumina测序以鉴别输入池和输出池中的突变体的丰度。从池中耗尽的突变体具有破坏定殖所需要的基因的tn插入。(b)7天后在输入强饲和盲肠中鉴别的基因图。基因丰度通过每百万分计数进行标准化，并且每个点表示具有tn插入的基因。(c)7天后在输入强饲和盲肠中鉴别的基
因图。灰色点是tn插入位点，并且彩色点表示在粘蛋白利用率所需要的基因中的tn插入。
[0020]
图5.针对粘蛋白和阿克曼菌属的对小鼠的胃肠道染色的代表性图像。
[0021]
图6.对已利用野生型(wt)阿克曼菌属或突变体amuc-0544阿克曼菌属定殖的小鼠的近端结肠和远端结肠染色的代表性图像。如底行所证实，需要基因amuc-0544以进行远端结肠的定殖。
具体实施方式
[0022]
已经根据一个或多个优选实施例描述了本发明，并且应当理解，除了明确陈述的那些等同物、替代方案、变化和修改之外的许多等同物、替代方案、变化和修改是可能的并且在本发明的范围内。在描述本发明之前，应当理解，本发明不限于所描述的特定方法、方案和试剂，因为这些可能变化。还应理解的是，本文所使用的术语仅是为了描述特定实施例的目的，并非旨在限制本发明的范围，所述范围将仅由所附权利要求限制。
[0023]
除非另外定义，否则本文使用的所有技术术语和科学术语的含义与如本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的含义相同。尽管在本发明的实践或测试中可以使用类似于或等同于本文所述的方法和材料的任何方法和材料，但现在描述优选的方法和材料。为了描述和公开在出版物中报道的可能与本发明结合使用的化学物质、细胞系、载体、动物、仪器、统计分析和方法，本文所提及的所有出版物均通过引用并入本文中。本文中的任何内容均不应被解释为承认本发明无权由于先前发明而早于此类公开内容。
[0024]
本文所使用的冠词“一个和一种(a/an)”是指所述冠词的语法宾语中的一个或多于一个(即，至少一个)语法宾语。举例来说，“要素”意指至少一个要素并且可以包含多于一个要素。
[0025]
通过假设给定值可以“略高于”或“略低于”端点而不会影响期望结果，使用“约”以为数值范围端点提供灵活性。如本文所使用的术语“约”是指所列数值的+/-10％的范围。
[0026]
本文中对术语“包含(including)”、“包括(comprising)”或“具有(having)”和其变化的使用意指涵盖其后列出的要素和其等同物以及另外的要素。叙述为“包含”、“包括”或“具有”某些要素的实施例还被考虑是“基本上由那些特定要素组成”和“由那些特定要素组成”。
[0027]
除非本文中另外指明，否则对本文中值范围的叙述仅旨在用作单独地提及落入所述范围的每个单独值的速记方法，并且每个单独值并入本说明书中，如同在本文中单独地叙述一样。例如，如果将浓度范围陈述为1％到50％，则意图是在本说明书中明确枚举如2％到40％、10％到30％或1％到3％等值。这些仅仅是具体意指的实例，并且所枚举的最低值与最高值之间以及包含最低值和最高值的数值的所有可能组合都被认为在本公开中明确陈述。
[0028]
如本文所使用的，“治疗”、“疗法”和/或“疗法方案”是指响应于由患者表现出的或患者可能易患的疾病、病症或生理病状而进行的临床干预。治疗的目的包含减轻或预防症状，减慢或停止疾病、病症或病状的发展或恶化和/或使疾病、病症或病状缓解。
[0029]
术语“有效量”或“治疗有效量”是指足以实现有益或期望的生物学和/或临床结果的量。
[0030]
如本文所使用的，术语“受试者”和“患者”在本文可互换使用并且是指人和非人动
物两者。在一个优选的实施例中，受试者或患者是人。本公开的术语“非人动物”包含所有脊椎动物，例如哺乳动物和非哺乳动物，如非人灵长类、小鼠、大鼠、绵羊、狗、猫、马、牛、鸡、两栖动物、爬行动物等。在一些实施例中，受试者是小鼠或疾病的小鼠模型。
[0031]
方法
[0032]
本公开部分地提供了用于肠道微生物嗜粘蛋白阿克曼菌和相关物种(包含临床菌株)的突变和表征的材料、系统和方法以及改变的阿克曼菌属的所述材料、系统和方法的用途。
[0033]
本公开提供了用于基因操纵新兴的益生菌嗜粘蛋白阿克曼菌的工具和方法。所述系统和方法允许快速地鉴别与表型性状有关的因子，例如，介导动物定殖的因子，包含介导粘蛋白的分解和与微生物群的其它成员成功竞争的新酶。所述系统允许产生更适合作为慢性炎症的免疫调节剂并且具有增强的特性作为抵抗饮食诱导的肥胖症的保护剂和癌症免疫疗法的加强剂的改变的菌株。
[0034]
发明人已经开发了用于遗传修饰结合到转座子诱变(将来自载体的转座子插入阿克曼菌属基因组)的嗜粘蛋白阿克曼菌、表型分析和pcr或基于测序的突变映射以鉴别在肠中的人微生物组中发现的阿克曼菌属中的新颖遗传调节剂的方法。
[0035]
嗜粘蛋白阿克曼菌是在肠道微生物组中发现的革兰氏阴性、严格厌氧、非运动性、无芽孢形成的椭圆形细菌。在本公开之前，不知道嗜粘蛋白阿克曼菌适合于分子基因操纵。已知嗜粘蛋白阿克曼菌处理粘蛋白，即对胃肠道的内腔保护很重要的糖基化蛋白。
[0036]
胃肠道中的碳水化合物的可用性在塑造微生物群的结构功能以及确定哪些微生物可以生长并且在肠道中定殖方面发挥作用。利用微生物促进健康取决于在肠道内定殖有用的细菌以维持健康菌群的能力。关于肠道细菌对粘蛋白降解的结构要求以及与能够降解和利用粘蛋白和粘蛋白聚糖的菌株相关的酶的有限功能表征，仍然知之甚少。粘蛋白是大的、高度糖基化蛋白。本公开提供了制备改变的阿克曼菌属变体、改变的阿克曼菌属群体的方法，以及改变的阿克曼菌属用于定殖结肠和促进受试者的健康的用途。
[0037]
在一个方面，本公开提供了一种遗传改变阿克曼菌属细菌的方法，所述方法包括：(a)将seq id no:1的外源转座子载体引入阿克曼菌属细菌以产生改变的阿克曼菌属；以及(b)培养改变的阿克曼菌属以选择已经将转座子结合到基因组中的阿克曼菌属。在另一个方面，本公开提供了一种遗传改变阿克曼菌属细菌的方法，所述方法包括：(a)将seq id no:1的外源转座子载体引入阿克曼菌属中以产生包括转座子的多个改变的阿克曼菌属细菌；以及(b)培养所述多个改变的阿克曼菌属以选择已经将转座子结合到基因组中的细菌，以产生多个遗传改变的阿克曼菌属细菌。
[0038]
将seq id no:1的外源转座子载体引入阿克曼菌属中以产生多个改变的阿克曼菌属细菌的方法在本领域是已知的。这些方法通常被称为转座子诱变或转座诱变，并且允许基因转移到宿主生物的染色体上，从而中断或修饰染色体上现存基因的功能并且引起突变。这允许在基因组内诱导单一命中突变的能力，以及通过能够鉴别转座子的相邻序列来鉴别已诱变的基因的能力。seq id no:1的转座子载体已被专门设计用于如实例1所描述的阿克曼菌属。seq id no:1的载体含有经修饰mariner转座子himar1c9，所述转座子具有氯霉素抗性盒(cat)和催化转座所需要的转座酶。载体进一步包括依赖于lamba pir的复制起点并且无法在缺乏pir基因的菌株如阿克曼菌属中复制。
[0039]
转座子载体(seq id no:1)包括转座子(seq id no:1的核酸1078-1145(例如seq id no:47))和转座酶。转座酶是提取转座子并且将其插入阿克曼菌属基因组中所必需的。一旦转座发生，就将转座子(seq id no:47(seq id no:1的核酸1078-1145))插入改变的阿克曼菌属菌株的基因组中。因此，改变的阿克曼菌属菌株/变体包括seq id no:1的转座子。换句话说，改变的阿克曼菌属菌株/变体在所述阿克曼菌属的基因组内包括seq id no:47，但不含有转座子载体主链的其余部分。
[0040]
转座子载体在转座子内含有针对氯霉素(cat)的抗生素抗性基因，所述抗生素抗性基因是在阿克曼菌属中使用所必需的，因为先前的使用红霉素作为抗生素选择的载体在阿克曼菌属中不起作用并且导致自发抗性。
[0041]
将转座子载体引入阿克曼菌属中的一种方法是通过缀合。缀合方法是本领域已知的，并且例如但不限于如实例2中所描述的方法。细菌缀合是遗传物质(例如，seq id no:1的外源转座子载体)在细菌细胞之间通过直接的细胞到细胞的转移。在一个优选的实施例中，将转座子载体从大肠杆菌菌株缀合到阿克曼菌属。缀合的方法包含在37℃下在有氧条件下将携带转座子载体(例如，seq id no:1)的大肠杆菌菌株与阿克曼菌属共培养持续约7-14小时。
[0042]
缀合后，为了对大肠杆菌进行反选择并且允许转座发生，对转移缀合物进行传代培养。合适的传代培养的方法是本领域已知的。例如，如实例2所描述的，在厌氧条件下多次(例如3次)对转移缀合物进行传代培养。这允许从培养物中的其它细菌菌株中选择已将转座子(例如对应于seq id no:1的核酸1078-1145的seq id no:47)结合到其基因组中的改变的阿克曼菌属(变体菌株)。这种传代培养条件是厌氧条件并且包含在包括氯霉素的培养基中的传代培养步骤，所述氯霉素是包含在转座子序列中的抗生素抗性基因。
[0043]
一旦进行传代培养，就产生了在其基因组中包括转座子(包含抗生素抗性基因)的改变的阿克曼菌属群体。这种改变的阿克曼菌属群体可以生长并且用作用于筛选和治疗目的的改变的阿克曼菌属的文库。改变的阿克曼菌属(其突变体)的文库可以用于筛选表型性状。例如，在一个实施例中，文库可以在与表型性状相关的条件下生长并且筛选以鉴别与表型性状相关的基因。
[0044]
改变的阿克曼菌属染色文库还可以用于通过对与插入到基因组中的转座子相邻的基因组序列进行dna测序或pcr分析来表征每种改变的阿克曼菌属菌株。这允许确定哪个基因已通过插入转座子而被改变。
[0045]
在一个实施例中，所述方法进一步包括：在选择性状的条件下培养所述多个遗传改变的阿克曼菌属；以及通过对阿克曼菌属基因组内与转座子相邻的基因进行pcr或测序来鉴别与性状相关的基因。
[0046]
用于鉴别由转座子破坏的基因的dna测序方法是本领域已知的。例如，在一个实施例中，所使用的dna测序方法可以是如以下中描述的inseq/tnseq：goodman等人(《自然实验手册(nat.protoc.)》:6(12):1969-1980(2012),doi:10.1038/nprot2011.417)，所述文献的内容通过全文引用并入。简而言之，插入测序(inseq)是用于使用在其末端处含有mmei位点的经修饰mariner转座子确定混合群体中的转座子突变体的插入位点和丰度，从而允许从插入的转座子在染色体位点16-17bp处进行切割的方法。参见goodman等人摘要。通过线性pcr对邻近转座子的基因组区域进行扩增，并且使用如goodman中所描述的高通量仪器对
邻近转座子的基因组区域进行测序。
[0047]
本公开考虑遗传改变的阿克曼菌属的文库，特别是遗传改变的嗜粘蛋白阿克曼菌的文库。进一步地，由阿克曼菌属的临床菌株(例如，从患者，例如但不限于肥胖患者、患有慢性炎症的患者等中分离的菌株)制备的遗传改变的阿克曼菌属的文库。文库可以用于筛选和培养在表型性状中起作用的改变的阿克曼菌属。
[0048]
在另一个实施例中，本公开提供了一种改变的阿克曼菌属细菌的文库，所述文库是通过以下产生的：将来自seq id no:1的载体的转座子随机引入阿克曼菌属群体中，以及通过在厌氧条件下在培养基中培养所述细菌来选择所述改变的阿克曼菌属细菌，所述培养基含有用于选择已经将所述转座子插入到其基因组中的阿克曼菌属的氯霉素。术语“文库”关于多个改变的阿克曼菌属使用并且可与多个改变的阿克曼菌属细菌互换使用。
[0049]
如本文所使用的，术语“改变的阿克曼菌属”、“改变的阿克曼菌属菌株”、“遗传改变的阿克曼菌属”，“阿克曼菌属的变体”、“tn突变体阿克曼菌属”、“tn突变体”和“突变体阿克曼菌属”可互换使用以指将seq id no:1的转座子载体的转座子结合到其基因组中的经过遗传修饰的阿克曼菌属。如本领域所指出的，tn突变体是指通过插入转座子(tn)制备的突变体菌株。阿克曼菌属可以是属于该属的任何已知的阿克曼菌属，包含但不限于例如，嗜粘蛋白阿克曼菌或与患者分离的临床物种。
[0050]
例如，改变的阿克曼菌属菌株的文库可以用于筛选利用粘蛋白所需要的基因的方法中。在一些实施例中，在有或没有粘蛋白的培养基中培养遗传改变的阿克曼菌属的文库。可以将在没有粘蛋白的情况下生长的文库与在含有粘蛋白的培养基中生长的文库进行基因比较。可以通过如本文详述的测序或pcr分析来确定对在存在粘蛋白的情况下生长的改变的阿克曼菌属中的基因和在不存在粘蛋白的情况下生长的改变的阿克曼菌属中的基因，以及来自所述两个群体的进行比较以鉴别调节粘蛋白利用率的基因进行遗传分析的方法。这在本文的实例3中得到证实。
[0051]
在一些实施例中，可以鉴别在存在粘蛋白的情况下具有有利的生长特性的改变的阿克曼菌属菌株。这些具有有利的生长特性的改变的阿克曼菌属可以用于通过向受试者施用改变的阿克曼菌属而定殖受试者的结肠。
[0052]
向受试者施用改变的阿克曼菌属菌株的合适方法是本领域已知的，并且包含口服、直肠或以维持细菌活力的其它途径施用改变的阿克曼菌属。在一些实施例中，改变的染色可以例如但不限于以允许将菌株递送到肠道的片剂、胶囊、液体等形式口服施用。合适地，可以将改变的菌株调配成允许菌株在被递送到肠道的同时维持活力的组合物。
[0053]
在另一个实施例中，可以针对与肠的稳定定殖相关的表型性状，对改变的阿克曼菌属的文库进行筛选。在一些实施例中，所述方法包括：将所述多个遗传改变的阿克曼菌属引入受试者中，以及(e)通过对在受试者的结肠内生长的改变的细菌中的基因进行遗传分析来检测具有使受试者的肠定殖的生长优势的改变的阿克曼菌属。在一些实施例中，在来自受试者的结肠的样品中获得使受试者的结肠定殖的细菌，从而在适合阿克曼菌属生长的条件(例如在存在用于选择具有转座子的阿克曼菌属的氯霉素的情况下的厌氧条件)下培养样品，并且通过对生长的改变的阿克曼菌属菌株进行测序或pcr分析来鉴别与生长优势相关的基因。合适地，用于确定相关基因的dna测序或pcr方法对转座子具有特异性(例如，使用对外源转座子具有特异性的引物)并且因此允许鉴别如与可以在肠道内生长的任何野
生型细菌相反的具有转座子的遗传改变的阿克曼菌属菌株。在一些实施例中，受试者是小鼠。在一些实施例中，受试者是疾病的小鼠模型(例如，肥胖症小鼠模型等)。
[0054]
本文所描述的方法可以用于筛选其它表型性状的方法。例如，在各种饮食/疾病条件下筛选具有增强定殖的变体的tn/in-seq。这可以通过向受试者喂食特定饮食，以及筛选改变的细菌在特定饮食条件下或免疫状态改变下定殖结肠的能力来完成。这可以鉴别具有具体地分解和利用饮食成分的基因的改变的细菌。
[0055]
在另一个实施例中，本文所描述的方法可以用于筛选涉及表型的基因，所述基因可能影响定殖和与宿主的相互作用，例如生物膜形成、聚集、胶囊产生、iga结合以及对抗菌肽或胆汁盐的抗性。在一些实例中，表型性状可以是例如但不限于氨基酸生物合成、碳水化合物代谢、营养吸收、氧化还原耐受性、粘附、侵袭、生长、繁殖等。性状可以包含对所述细菌的整体生长和存活很重要的基因决定的特性，如定殖宿主肠道的能力。例如，如实例中所证明的，阿克曼菌属生长的一些遗传调节剂包含利用粘蛋白所需要的基因，例如，表1中发现的基因。在表3中发现了对于阿克曼菌属在包含受试者的远端结肠的结肠中生长和定殖所必需的其它基因。本公开不限于这些基因，因为这些基因是可以通过本文所描述的方法来鉴别的实例。
[0056]
在另外的实施例中，可以针对涉及活化宿主信号传导途径的基因对突变体进行筛选，所述宿主信号传导途径例如与肠健康和肥胖症的预防相关的tlr2信号传导途径。例如，在一个实施例中，所述方法涉及筛选通过免疫细胞具有不同水平的tlr2介导的识别的改变的阿克曼菌属菌株，或者在另一个实施例中，所述方法涉及向喂食相同饮食(例如，正常或高脂)的正常受试者和肥胖受试者(例如，正常和肥胖小鼠模型)施用改变的阿克曼菌属以及与非肥胖受试者相比，筛选与肥胖受试者内的细菌相关的基因。
[0057]
在另一个方面，本公开提供了一种选择具有性状的改变的遗传调节剂的改变的阿克曼菌属细菌的方法，所述方法包括：(a)将seq id no:1的外源转座子载体引入阿克曼菌属群体，以将转座子随机结合到阿克曼菌属基因组中；(b)培养所述群体阿克曼菌属以选择已经将所述转座子整合到其基因组中以产生多个改变的阿克曼菌属变体的阿克曼菌属；以及(c)通过在选择改变的遗传性状的条件下培养所述阿克曼菌属来选择具有所述改变的遗传调节剂的阿克曼菌属。在一些方面，步骤(a)包括使所述阿克曼菌属与含有seq id no:1的所述转座子载体的大肠杆菌缀合。在另外的方面，步骤(b)的方法包括在厌氧条件下传代培养所述细菌以在存在氯霉素的情况下选择所述改变的阿克曼菌属变体。确定改变的遗传调节剂的方法可以通过本领域已知的方法来完成，所述方法包含但不限于对邻近转座子要素的基因组进行测序(例如但不限于描述于goodman等人.2011中的inseq/tnseq)或pcr分析。
[0058]
在另一个实施例中，本公开提供了一种鉴别阿克曼菌属性状的新颖遗传调节剂的方法，所述方法包括：(a)将seq id no:1的外源转座子载体结合到阿克曼菌属群体中，以产生将转座子结合到其基因组中的改变的阿克曼菌属群体；(b)在培养基中培养所述阿克曼菌属，所述培养基包括用于选择已经结合了外源转座子的阿克曼菌属的氯霉素；(c)使所述改变的阿克曼菌属暴露于两种不同的条件；以及(d)通过以下进行分析：对由在所述两种不同的条件下生长的所述改变的阿克曼菌属中的转座子破坏的基因进行测序或pcr扩增，以鉴别与所述性状相关的基因。
[0059]
本公开的另一个方面提供了一种系统，所述系统包括使用转座子载体的用于基因操纵阿克曼菌属细菌的发现平台，所述阿克曼菌属包含用于治疗受试者的慢性炎症的益生菌嗜粘蛋白阿克曼菌。
[0060]
在一些方面，基因操纵益生菌嗜粘蛋白阿克曼菌以治疗受试者的饮食诱导的肥胖症。
[0061]
在另一个方面，遗传改变的阿克曼菌属可以用于加强癌症免疫疗法中的免疫检查点抑制剂。这可以通过以下完成：在经历检查点抑制剂疗法的受试者中施用有效量的改变的阿克曼菌属(例如，改变的嗜粘蛋白阿克曼菌)以增强检查点抑制剂的抗癌特性(参见例如，routy等人,《科学(science)》359,91
–
97(2018))。
[0062]
考虑了增强检查点抑制剂疗法的方法。所述方法包括在经历检查点抑制剂疗法的受试者中施用有效量的改变的阿克曼菌属(例如，改变的嗜粘蛋白阿克曼菌)以增强检查点抑制剂的抗癌特性。例如，在一个实施例中，改变的阿克曼菌属(例如，改变的嗜粘蛋白阿克曼菌)可以用于提高基于pd-1的免疫疗法(例如，pd-1抗体(即，派姆单抗(pembrolizumab)、纳武单抗(nivolumab)、西米普利单抗(cemiplimab)等，这些可商购获得)，例如，派姆单抗和抗pd-1抗体，其可从默克公司(merck and co)获得并且描述于美国专利第8952136号、第83545509号、第8900587号中和编号ep2170959中；纳武单抗，即抗pd-1抗体，其可从百时美施贵宝公司(bristol-myers squibb co)获得并且描述于美国专利第7595048号、第8728474号、第9073994号、第9067999号、第8008449号和第8779105号中)的功效。
[0063]
在一个实施例中，考虑了治疗饮食诱导的肥胖症的方法。所述方法包括向受试者施用有效量的改变的阿克曼菌属菌株以治疗饮食诱导的肥胖症。在一个实施例中，改变的阿克曼菌属菌株具有选自表3的改变的基因。
[0064]
在另一个方面，本公开提供了治疗炎性病症的方法，所述方法包括施用有效量的改变的阿克曼菌属菌株以治疗炎性病症。
[0065]
本公开的其它方面提供了使用本文所描述的用于基因操纵新兴的益生菌嗜粘蛋白阿克曼菌的以产生更适合作为慢性炎症的免疫调节剂并且具有作为抵抗饮食诱导的肥胖症的保护剂的增强特性的菌株的系统和方法。
[0066]
本公开还考虑了含有来自seq id no:1的转座子的遗传改变的阿克曼菌属细菌。
[0067]
在另一个方面，本公开考虑了破坏表1中所列的基因中的任何一个基因的遗传改变的阿克曼菌属细菌。这些遗传改变的阿克曼菌属细菌具有在利用粘蛋白的能力方面改变的基因。
[0068]
在另一个实施例中，本公开考虑了具有破坏表2中所列的基因中的任何一个基因的遗传改变的阿克曼菌属细菌。这些遗传改变的阿克曼菌属细菌具有利用粘蛋白所需要的基因。在另一个实施例中，本公开考虑了具有破坏表3中所列的基因中的任何一个基因的遗传改变的阿克曼菌属细菌。这些遗传改变的阿克曼菌属细菌具有在定殖受试者的结肠方面提供生长优势的基因。考虑了使用将表中所列的基因中的一个或多个基因破坏的经考虑的遗传改变的阿克曼菌属细菌中的任何经考虑的遗传改变的阿克曼菌属细菌的方法以用于施用到受试者。
[0069]
在一些实施例中，提供了用于执行本文所描述的方法的试剂盒。所提供的试剂盒可以含有必要的组件，利用所述组件执行上述方法中的一种或多种方法。
[0070]
在一个实施例中，试剂盒包括seq id no:1的载体和用于在细菌内转座的说明书。在一些实施例中，试剂盒包括关于如何分离和改变阿克曼菌属菌株(包含但不限于嗜粘蛋白阿克曼菌或相关物种，包含临床菌株)的说明书。
[0071]
在另一个实施例中，试剂盒包括包含seq id no:1的转座子的改变的嗜粘蛋白阿克曼菌菌株。
[0072]
已经根据一个或多个优选实施例描述了本发明，并且应当理解，除了明确陈述的那些等同物、替代方案、变化和修改之外的许多等同物、替代方案、变化和修改是可能的并且在本发明的范围内。
[0073]
对于本领域的技术人员显而易见的是，在不背离本发明构思的前提下，除了那些已经描述的修改之外，许多另外的修改也是可能的。在解释本公开时，应以与上下文一致的尽可能广泛的方式解释所有术语。术语“包括”的变体应被解释为以非排他性方式指代要素、组件或步骤，因此所引用的要素、组件或步骤可以与未明确引用的其它要素、组件或步骤组合。被称为“包括”某些要素的实施例还被考虑是“基本上由那些要素组成”和“由那些要素组成”。术语“基本上由...组成”和“由...组成”应按照mpep和相关的联邦巡回法院(federal circuit)解释进行解释。过渡短语“基本上由...组成”将权利要求的范围限制为指定的材料或步骤“以及不会实质上影响所要求保护的发明的一个或多个基础和新颖特性的那些材料或步骤”。“由...组成”是不包含权利要求中未指定的任何要素、步骤或成分的封闭式术语。例如，关于序列“由...组成”是指在seq id no中列出的序列并且确实是指可能含有seq id作为其一部分的较大序列。
[0074]
本文提及的所有出版物、专利申请、专利和其它参考通过全文引用并入。在发生冲突的情况下，以包括定义的本说明书为准。另外，所述材料、方法以及实例仅是说明性的并且不旨在是限制性的。
[0075]
本文所提供的系统和方法具有许多来自与人、牲畜和工业环境相关的微生物群落的商业上重要的生物。
[0076]
在考虑以下非限制性实例时，将更充分地理解本发明。
[0077]
实例
[0078]
实例1：用于阿克曼菌属中的经修饰tn诱变载体：psam_akk
[0079]
为了能够对具有改变的表型的基因和改变的细菌进行基因筛选，需要用于使细菌突变的工具。产生先前描述的载体的修改版以在阿克曼菌属中使用。原始的载体psam_bt1被设计用于多形拟杆菌(bacteroides thetaiotaomicron)。载体对具有红霉素抗性基因的经修饰mariner转座子himar1c9和催化转座所需要的转座酶两者进行编码。质粒使用依赖于lamba pir的复制起点并且无法在缺乏pir基因的菌株如阿克曼菌属中复制。
[0080]
为了使psam_bt在阿克曼菌属中兼容使用，将转座子上的原始红霉素抗性标志物(ermg)替换为氯霉素抗性盒(cat)。在阿克曼菌属中初始尝试使用红霉素作为选择标志物未取得成功，并且随着红霉素的生长反复导致自发抗性。然后对转座酶进行密码子优化以在阿克曼菌属中表达。通过连结一系列管家基因以使22 628bp序列用作密码子分析的输入，以生成阿克曼菌属密码子表。himar1c9序列中的稀有密码子被替换为在阿克曼菌属中优先使用的密码子。所得质粒命名为psam_akk(图1，seq id no:1)。发现载体的这些改变对于阿克曼菌属的诱变是必不可少的，并且仅抗性标志物或转座酶的改变不足以发生转座。
类似地，尚未成功使用阿克曼菌属启动子来驱动himar1c9的表达。如此，已特别地制备psam-akk载体以允许嗜粘蛋白阿克曼菌的诱变。
[0081]
实例2：用于诱变和转座子(tn)文库构建的方法
[0082]
通过与大肠杆菌供体菌株缀合来将转座子载体(seq id no:1)引入阿克曼菌属中。阿克曼菌属发酵剂培养物以1:5的比例传代培养在30ml的合成培养基2中并且生长到od600＝0.6-1.0。然后在4℃下以10 000xg在1.5ml管中离心5分钟来收获细胞。同时，使大肠杆菌s17 psam_akk培养物在lb+100ug/ml氨苄青霉素、35ug/ml氯霉素中在37℃下以200rpm有氧培养到光密度(od)od600＝0.4-0.7。为了避免剪切缀合菌毛，将大肠杆菌以2000xg离心3分钟，并且用无菌pbs洗涤一次。在合成培养基中将大肠杆菌和阿克曼菌属沉淀物组合成0.5ml的总体积，并且将悬浮液用于在预先还原的合成培养基板上制备100μl水坑。根据阿克曼菌属菌株，将板在37℃下有氧温育7-14小时。有氧温育对于成功的缀合至关重要。
[0083]
缀合后，将板转移到厌氧室，并且将细胞刮入5ml的pbs和50％甘油的1:1混合物(甘油是任选的，但需要在-80℃下储存培养物)中。为了对大肠杆菌进行反选择并且允许转座发生，将转移接合子传代培养三次。用200μl细胞悬浮液的等分试样接种具有12μg/ml卡那霉素和10μg/ml庆大霉素的3ml合成培养基并且在37℃下厌氧温育48小时。然后如上文所描述的以24小时的间隔将培养物再传代培养两次。这些传代培养步骤是固化质粒并且获得转座子突变体所必需的(图2a)。在第三轮传代培养之后，将100-200μl培养物铺在合成培养基琼脂板上，所述合成培养基琼脂板补充有10μg/ml庆大霉素、12μg/ml卡那霉素和7μg/ml氯霉素并且在37℃下厌氧温育6天。需要这种培养基来抑制残留大肠杆菌的生长。一旦转移接合子已经生长，用移液管尖端挑出单个菌落并且将单个菌落排列到96孔板中，所述板含每孔200μl合成培养基，所述合成培养基具有10μg/ml庆大霉素、12μg/ml卡那霉素和7μg/ml氯霉素并且在37℃下厌氧温育3天。
[0084]
为了确认转座子已插入基因组中，使用β-内酰胺酶基因的pcr测试质粒主链(bla)是否不存在以及转座子(cat)是否存在。最后，对突变体的子集进行southern印迹，以确认tn插入已作为单个插入出现并且出现在基因组的多个位置处(图2b和2c)。
[0085]
实例3：转座子突变体筛选—针对粘蛋白利用率所需要的基因对转座子突变体进行
[0086]
为了筛选粘蛋白利用率所需要的基因，将阵列tn突变体用于接种含有粘蛋白培养基3或合成培养基的重复96孔板。将板在37℃下厌氧温育3天。生长后，使用酶标仪测量od600。选择在合成培养基中生长但不在粘蛋白中生长的突变体进行另外的表征。为了确认初始筛选，通过在酶标仪中进行生长曲线测定对所关注的突变体的粘蛋白生长缺陷进行测试，每60分钟进行测量，持续72小时(图3)。任意pcr用于定位转座子插入位点并且鉴别在粘蛋白上生长所需要的基因。筛选导致鉴别在粘蛋白上生长而不是在单糖上生长特别需要的基因(表1)。
[0087]
表1.鉴别为在粘蛋白上生长所需要的基因
[0088][0089]
实例4：针对肠定殖所需要的基因对转座子突变体进行筛选
[0090]
用于筛选tn突变体的第二种方法是创建大型汇集的文库，以用于转座子插入测序(tn/in-seq)1。此方法通过使大量突变体通过各种条件，并且然后使用下一代测序来测试输入池和输出池中的每种突变体的丰度来鉴别条件必需的基因。在特定条件下存活所需要的基因将从输入池中耗尽。使用tn/in-seq鉴别定殖小鼠肠道所需要的基因。
[0091]
为了创建汇集的文库，将等体积的阵列tn突变体汇集到单个悬浮液中。将细胞悬浮液以1:10的比例稀释到合成培养基中，并且在37℃下厌氧温育36小时(此生长步骤是任选的)。然后将培养物用无菌pbs洗涤一次并浓缩10倍，以获得大约为10
10
cfu/ml的最终浓度。细胞悬浮液用于以约108cfu强饲无菌c57bl/6小鼠。定殖一周之后，对小鼠实施安乐死并且收集盲肠内容物以进行dna分离。然后，遵循goodman等人所描述的方案，利用经修饰引物集以允许在illumina的hiseq 4000平台上进行测序，从而使用dna来制备测序文库。
[0092]
对tn/in-seq数据的分析鉴别肠道的稳定定殖所需要的基因(图4)。定殖所需要的基因包含ii型分泌系统的假定组分、iv型菌毛蛋白和糖基水解酶等(表2)。相反，某些基因的失活导致丰度增加，这表明文库可能潜在地筛选出超定殖变体(表3)。另外，无法在粘蛋白上生长的突变体从群体中急剧耗尽，这证实了粘蛋白上的生长是在体内发生的并且对于阿克曼菌属定殖很重要。
[0093]
表2.在强饲后七天盲肠中丰度下降的情况下的前25个基因的代表性数据。
[0094][0095][0096]
表3.强饲后7天盲肠中的具有增强丰度的基因的代表性数据。
[0097][0098][0099]
表中发现的与ncbi蛋白和基因登录号相关的所有序列均通过全文引用并入并且可以在www.ncbi.nlm.nih.gov/[ncbi.nlm.nih.gov]中发现。阿克曼菌属的基因组序列可以在登录号：nc_010655.1下发现，其内容通过全文引用并入。
[0100]
参考文献
[0101]
1.goodman等人(2011)《自然实验手册》6(12):1969
–
1980
[0102]
2.plovier等人(2017)《自然医学(nature medicine)》23:107
–
113
[0103]
3.derrien等人(2004)《国际系统与进化微生物学杂志(int j syst evol microbiol.)》54:1469-1476
[0104]
这些参考文献针对与在实例中描述的方法有关的具体细节以其整体并入。
[0105]
实例5：阿克曼菌属与胃肠道中的粘蛋白层相互作用
[0106]
从如实例4中所描述的小鼠取出肠样品，切片并且用针对粘蛋白和阿克曼菌属的抗体进行染色。如图5所示，阿克曼菌属与肠道内的粘蛋白层紧密相关。
[0107]
进一步地，还在小鼠中检查野生型阿克曼菌属或突变体amuc_0544的能力。获得近端结肠和远端结肠的切片，切片并且针对粘蛋白或阿克曼菌属进行染色。如图6所证实，虽然wt和突变体阿克曼菌属两者均能够定殖近端结肠，但基因amuc-0544是定殖小鼠的远端结肠所必需的。
[0108]
序列表
[0109]
呈文本格式的序列表与本申请同时提交，并且作为提交的申请的一部分以其整体并入。