卤素过氧化物酶组合物及其用途的制作方法

本公开内容涉及包含卤素过氧化物酶的组合物，以及这种组合物在治疗细菌感染特别是革兰氏阴性细菌感染和内毒素相关病症中的用途。

背景技术：

在整个说明书中对现有技术的任何讨论都不应被认为是承认该现有技术是众所周知的或形成了本领域公知常识的一部分。

细菌毒素通过直接破坏宿主组织并通过调节宿主的免疫系统来促进感染和疾病。有两种类型的细菌毒素，即外毒素和内毒素。外毒素是由细菌分泌的，并且引起多种症状，其取决于分泌外毒素的细菌种类。内毒素(也称为脂多糖(lps))是宿主免疫系统的有效刺激物。它们包含被称为脂质a的毒性脂质成分以及o抗原(或o多糖)和核心寡糖。内毒素存在于革兰氏阴性细菌的外膜中，在其中它们提供结构完整性并保护膜免受化学攻击。当细菌细胞被免疫系统或抗菌剂裂解时，膜的碎片(包括lps)可能被释放到循环系统中，在那里它们可引起败血症和严重的内毒素血症以及一系列相关病况，例如脓毒症、发烧、腹泻、脓毒性休克以及内部器官(例如肾脏、肝脏、肾上腺和肺)的功能丧失。

革兰氏阴性细菌感染难以治疗，因为细菌死亡通常导致内毒素的释放。例如，在抗生素治疗期间，当内毒素从革兰氏阴性螺旋体细菌(例如密螺旋体属(treponema)(梅毒的致病因子)和包柔氏螺旋体属(borrelia)(莱姆病的致病因子))中释放时，发生jarisch-herxheimer反应，这是一种具有类似细菌性脓毒症的体征和症状的病况。

在这种情况下，需要用于治疗细菌感染和内毒素相关病症的组合物和方法。

技术实现要素：

在一个方面，本公开内容提供了一种治疗受试者的败血症的方法，所述方法包括向所述受试者施用包含治疗有效量的卤素过氧化物酶的组合物。

所述卤素过氧化物酶可以是髓过氧化物酶或嗜酸性粒细胞过氧化物酶。

在某些实施方案中，将所述组合物全身性地施用至所述受试者。可以将所述组合物肠胃外施用至所述受试者。优选地，将所述组合物静脉内施用至所述受试者。

所述受试者优选是人。

所述卤素过氧化物酶可以抑制所述受试者中的脂多糖或脂质a的活性。

在某些实施方案中，所述卤素过氧化物酶不涉及有活性的卤素过氧化物酶活性，但是可用于lps或脂质a的结合和抑制。

在某些实施方案中，组合物包含浓度小于约50,000μg/ml的卤素过氧化物酶。优选地，组合物包含浓度小于约1,000μg/ml的卤素过氧化物酶。

所述卤素过氧化物酶优选是髓过氧化物酶。

在某些实施方案中，所述败血症与革兰氏阴性脓毒症、器官功能障碍、急性呼吸窘迫综合征、全身炎症反应综合征或脓毒性休克有关。

在另一方面，本公开内容提供了一种治疗受试者的内毒素血症的方法，所述方法包括向所述受试者施用包含治疗有效量的卤素过氧化物酶的组合物。

所述卤素过氧化物酶可以是髓过氧化物酶或嗜酸性粒细胞过氧化物酶。

在某些实施方案中，将所述组合物全身性地施用至所述受试者。可以将所述组合物肠胃外施用至所述受试者。优选地，将所述组合物静脉内施用至所述受试者。

在某些实施方案中，所述内毒素血症与所述受试者血清中大于约5pg/ml的内毒素浓度有关。所述内毒素血症可与所述受试者血清中大于约20pg/ml的内毒素浓度有关。

所述受试者优选是人。

在某些实施方案中，所述卤素过氧化物酶抑制所述受试者中的脂多糖或脂质a的活性。

在某些实施方案中，所述卤素过氧化物酶不涉及有活性的卤素过氧化物酶活性，但是可用于lps或脂质a的结合和抑制。

在某些实施方案中，所述组合物包含浓度小于约50,000μg/ml的卤素过氧化物酶。优选地，所述组合物包含浓度小于约1,000μg/ml的卤素过氧化物酶。

所述卤素过氧化物酶优选是髓过氧化物酶。

在某些实施方案中，所述内毒素血症与败血症、脓毒症、中毒性休克、发烧、腹泻、脓毒性休克、胃肠炎、肺炎、脑膜炎、心内膜炎、骨髓炎、胆囊炎、胆管炎、脑膜炎、肠热病、志贺氏菌病、多器官功能障碍综合征、腹膜炎、中性粒细胞减少症、尿脓毒症、肝功能障碍、肾功能障碍、胰腺炎、肠漏综合征(leakybowelsyndrome)、脑膜炎球菌血症(menigingococcemia)或全身炎症反应综合征有关。在特定的实施方案中，所述内毒素血症与败血症有关。

在另一方面，本公开内容提供了一种治疗受试者的细菌感染的方法，所述方法包括向所述受试者施用包含治疗有效量的卤素过氧化物酶的组合物。

所述卤素过氧化物酶可以是髓过氧化物酶或嗜酸性粒细胞过氧化物酶。

在某些实施方案中，将所述组合物全身性地施用至所述受试者。可以将所述组合物肠胃外施用至所述受试者。优选地，将所述组合物静脉内施用至所述受试者。

所述受试者优选是人。

在某些实施方案中，所述细菌感染是革兰氏阴性细菌感染。

所述卤素过氧化物酶可以抑制所述受试者中的脂多糖或脂质a的活性。

在某些实施方案中，所述卤素过氧化物酶不涉及有活性的卤素过氧化物酶活性，但是可用于lps或脂质a的结合和抑制。

在某些实施方案中，所述组合物包含浓度小于约50,000μg/ml的的卤素过氧化物酶。优选地，所述组合物包含浓度小于约1,000μg/ml的卤素过氧化物酶。

所述卤素过氧化物酶优选是髓过氧化物酶。

在某些实施方案中，所述细菌感染是由以下细菌引起的：密螺旋体属(treponema)的一些种，包柔氏螺旋体属(borrelia)的一些种，弗氏柠檬酸杆菌(citrobacterfreundii)，塞氏柠檬酸杆菌(citrobactersedlakii)，布氏柠檬酸杆菌(citrobacterbraakii)，魏氏柠檬酸杆菌(citrobacterwerkmanii)，杨氏柠檬酸杆菌(citrobacteryoungae)，无丙二酸柠檬酸杆菌(citrobacteramalonaticus)，阴沟肠杆菌(enterobactercloacae)，生癌肠杆菌(enterobactercancerogenus)，霍氏肠杆菌(enterobacterhormaechei)，阿氏肠杆菌(enterobacterasburiae)，大肠杆菌(escherichiacoli)，弗格森埃希氏菌(escherichiafergusonii)，肺炎克雷伯菌(klebsiellapneumoniae)，奇异变形杆菌(proteusmirabilis)，不动杆菌属(acinetobacter)的一些种，铜绿假单胞菌(pseudomonasaeruginosa)，嗜水气单胞菌(aeromonashydrophila)，多杀巴斯德氏菌(pasteurellamultocida)，鲍氏志贺氏菌(shigellaboydii)，痢疾志贺氏菌(shigelladysenteriae)，弗氏志贺氏菌(shigellaflexneri)，宋内志贺氏菌(shigellasonnei)，猪霍乱沙门氏菌(salmonellacholeraesuis)，猪霍乱沙门氏菌印度亚种(salmonellacholeraesuissubsp.indica)，肠炎沙门氏菌(salmonellaenteritidis)，魏尔肖沙门氏菌(salmonellavirchow)，乙型副伤寒沙门氏菌(salmonellaparatyphib)，鼠伤寒沙门氏菌(salmonellatyphimurium)，甲型副伤寒沙门氏菌(salmonellaparatyphia)，伤寒沙门氏菌(salmonellatyphi)，猪霍乱沙门氏菌亚利桑那亚种(salmonellacholeraesuissubsp.arizonae)，猪霍乱沙门氏菌双亚利桑那亚种(salmonellacholeraesuissubsp.diarizonae)，猪霍乱沙门氏菌豪顿亚种(salmonellacholeraesuissubsp.houtenae)，邦戈沙门氏菌(salmonellabongori)，小肠结肠炎耶尔森氏菌(yersiniaenterocolitica)，弗氏耶尔森氏菌(yersiniafrederiksenii)，鼠疫耶尔森氏菌(yersiniapestis)或假结核耶尔森氏菌(yersiniapseudotuberculosis)。

在另一方面，本公开内容提供了适用于治疗受试者的细菌感染的组合物，所述组合物包含：治疗有效量的卤素过氧化物酶；和药学上可接受的载体，其中所述组合物适用于全身施用至所述受试者。

所述卤素过氧化物酶可以是髓过氧化物酶或嗜酸性粒细胞过氧化物酶。

在某些实施方案中，所述组合物适用于肠胃外施用。优选地，所述组合物适用于静脉内施用和/或局部应用。

在某些实施方案中，所述细菌感染是革兰氏阴性细菌感染。

在某些实施方案中，所述卤素过氧化物酶不涉及有活性的卤素过氧化物酶活性，但是可用于lps或脂质a的结合和抑制。

在某些实施方案中，所述组合物包含浓度小于约50,000μg/ml的卤素过氧化物酶。优选地，所述组合物包含浓度小于约1,000μg/ml的卤素过氧化物酶。

所述受试者优选是人。

优选地，所述卤素过氧化物酶是髓过氧化物酶。

在另一方面，本公开内容提供了一种治疗受试者的革兰氏阴性细菌感染的方法，所述方法包括向所述受试者中的革兰氏阴性细菌感染部位施用一种组合物，所述组合物包含：治疗有效量的卤素过氧化物酶；其中所述卤素过氧化物酶选自髓过氧化物酶和嗜酸性粒细胞过氧化物酶。

所述卤素过氧化物酶可以抑制所述受试者中的脂多糖或脂质a的活性。

在某些实施方案中，所述组合物包含约1μg/ml至约50,000μg/ml的卤素过氧化物酶。

在某些实施方案中，所述组合物包含10μg/ml至5,000μg/ml的卤素过氧化物酶。

在某些实施方案中，所述受试者罹患牙龈、眼睛、耳朵、皮肤、软组织、伤口、阴道区域、腹股沟区域、褥疮或烧伤区域的细菌感染，并且优选所述方法非全身性地用于治疗浅表感染或伤口。

所述卤素过氧化物酶优选是嗜酸性粒细胞过氧化物酶。

所述受试者优选是人。

在另一方面，本公开内容提供了一种治疗受试者的革兰氏阴性细菌感染的方法，所述方法包括向所述受试者中的革兰氏阴性细菌感染部位施用包含治疗有效量的卤素过氧化物酶的第一组合物，其中所述卤素过氧化物酶抑制脂多糖或脂质a的活性；以及向所述受试者中的细菌感染部位施用包含卤素过氧化物酶的底物的第二组合物；其中当与所述第二组合物(即底物)联合时，所述第一组合物的卤素过氧化物酶产生杀微生物剂，例如次氯酸盐和单线态分子氧，以杀死可能存在的革兰氏阴性细菌以及革兰氏阳性细菌、酵母和真菌。

所述卤素过氧化物酶优选是髓过氧化物酶或嗜酸性粒细胞过氧化物酶。

在某些实施方案中，在施用至感染部位之前将所述第一组合物和所述第二组合物混合。

在某些实施方案中，将所述第一组合物和所述第二组合物同时施用至感染部位。

在某些实施方案中，将所述第一组合物和所述第二组合物顺序施用至感染部位。

所述卤素过氧化物酶优选是嗜酸性粒细胞过氧化物酶。

所述受试者优选是人。

附图简要说明

图1.脂多糖(lps)标准物(ng/孔)针对达到最大斜率的时间(秒)的回归图。显示了两个范围的导出方程和测定系数(r²)：0.0012ng至5nglps和0.0012ng至0.625nglps。标准测试一式两份进行。

图2.在5.0ng/孔lps下测量鲎变形细胞溶解物(lal)测定活性的抑制百分比，并针对不同量(mg/孔)的髓过氧化物酶(mpo)作图。实验以一式四份进行，其中描绘了所有数据点。回归方程以r²拟合显示。

图3.使用0.1nglps/孔的lal活性的抑制百分比针对mg/孔的mpo(上方曲线)、嗜酸性粒细胞过氧化物酶(epo)(中间的曲线)和葡萄糖氧化酶(go)(下方曲线)以导出方程和r²拟合作图。

图4.使用导出方程和r²拟合的脂质a标准物针对达到最大斜率的时间(秒)的回归图。在制备脂质a标准物后的2.5、3.75、4.5和5.75小时获得四条曲线。从最上面的曲线开始并向下的曲线顺序为5.75小时、4.5小时、3.75小时和2.5小时。

图5.以2.16μg脂质a/孔测量的显色lal活性的抑制百分比针对以mg/孔为单位的mpo/epo作图。显示了导出的抑制方程和r²拟合。

图6.使用显色lal测定测量的包含4μgmpo和0.8μggo/孔的组合物对lps内毒素活性的抑制百分比。在没有d-葡萄糖(上方的虚线)和具有非限制性浓度(0.2mg/孔)的d-葡萄糖(下方的曲线)的情况下测试组合物。

图7.在第1天腹膜内注射lps后的kaplanmeier存活曲线。

图8.在第1天腹膜内注射lps后的kaplanmeier存活曲线。

发明详述

定义

在本说明书的上下文中，术语“一个”和“一种”在本文中用于指代物品的语法对象的一个或多于一个(即，至少一个)。举例来说，“一个元件”是指一个元件或多于一个元件。

术语“约”应理解为是指+/-10％，优选+/-5％或+/-1％，或更优选+/-0.1％的范围。

术语“同时施用”或“同时给药”或“共施用”等是指包含两种或更多种活性物质的单一组合物的施用，或作为单独的组合物和/或通过单独的途径递送的每种活性物质在足够短的时间内同时地或同时或顺序地进行的施用，其有效结果与当所有这些活性物质作为单一组合物进行施用时所获得的结果相当。“同时”是指活性剂基本上同时并且优选在相同制剂中一起施用。

在本说明书和权利要求书中的术语“包括”、“包含”、“拥有”、“携带”、“含有”或“具有”等以包含性含义使用，即指定存在所陈述的特征但不排除存在其他或另外的特征。

术语“内毒素血症”是指与受试者血清中不希望的内毒素水平相关的病况。如本文所用，内毒素血症可与至少5pm/ml、至少10pg/ml、至少20pg/ml、至少50pg/ml或至少100pg/ml的可检测的内毒素水平相关。

如本文所用，术语“药学上可接受的”是指当施用至受试者时不会引起实质性不良过敏反应或免疫反应的物质。“药学上可接受的载体”包括但不限于溶剂、包衣、分散剂、湿润剂、等渗和吸收延迟剂和崩解剂。

术语“预防”包括病况或病症(包括细菌感染)的风险、发生率和/或严重程度的降低。术语“治疗”和“医治”包括预防性或防治性治疗(其预防和/或减慢目标病理性病况或病症(包括细菌感染)的发展)和治愈性、治疗性或疾病改善治疗，包括治愈、减慢、减轻已诊断的病理性病况或病症的症状和/或阻止其进展；以及治疗处于患有特定病况的风险或怀疑已患有特定病况的患者以及患病或已被诊断罹患疾病或医学病况的患者。术语“治疗”和“医治”并不一定意味着对受试者进行治疗直至完全康复。术语“治疗”和“医治”还指维持和/或促进未罹患特定病况但可能易于发展不健康病况的个体的健康。术语“治疗”和“医治”还旨在包括强化或以其他方式增强一种或多种主要预防或治疗措施。作为非限制性示例，可以由患者、护理人员、医生、护士或另一位医疗保健专业人员执行治疗。

卤素过氧化物酶

卤素过氧化物酶是一类过氧化物酶，其在过氧化氢存在的情况下催化卤化物的氧化。哺乳动物的卤素过氧化物酶包括髓过氧化物酶、嗜酸性粒细胞过氧化物酶和乳过氧化物酶。髓过氧化物酶(mpo)是由中性粒细胞和单核细胞白细胞产生的二聚血红素a糖蛋白。嗜酸性粒细胞过氧化物酶(epo)由嗜酸性白细胞产生并与mpo具有中等同源性(在核苷酸水平上为72.4％，在氨基酸水平上为69.8％)。mpo和epo均显示有效的杀微生物活性。

由于卤素过氧化物酶的选择性结合特性，当目标微生物(例如病原微生物)对卤素过氧化物酶的结合能力大于所需微生物(例如形成正常菌群的一部分的乳酸菌成员)的结合能力时，目标微生物被卤素过氧化物酶选择性地结合，而很少或没有与所需微生物的结合。在这方面，卤素过氧化物酶能够选择性地杀死革兰氏阴性细菌。在存在过氧化物和卤化物的情况下，结合目标的卤素过氧化物酶催化卤化物氧化并促进过氧化物在目标微生物表面上歧化成单线态分子氧(¹o2)。单线态分子氧具有微秒的寿命，和约0.2微米的反应半径。因此，氧化的杀微生物作用可能在某种程度上限于结合卤素过氧化物酶的微生物，而对有益的微生物或宿主细胞几乎没有附带损害。

mpo与广谱的细菌结合，包括所有测试的革兰氏阴性细菌(例如铜绿假单胞菌和大肠杆菌)以及测试的许多革兰氏阳性细菌(例如金黄色葡萄球菌(staphylococcusaureus))。如美国专利号5,888,505、6,294,168和8,945,540中所公开的，mpo能够在过氧化物和卤化物存在的情况下杀死目标微生物，而不会明显损害周围组织和正常菌群。epo也显示出有效的杀微生物活性。

尽管已知mpo和epo的卤化物和过氧化物依赖性杀微生物活性，本发明人令人惊讶地发现mpo和epo能够独立于它们的卤素过氧化物酶的酶活性结合并抑制内毒素活性，包括lps和脂质a活性。如本文所述，抑制不需要次氯酸盐(或次溴酸盐)的过氧化氢依赖性产生，或单线态分子氧的二次产生。因此，本公开内容的组合物可以包含卤素过氧化物酶，其中所述卤素过氧化物酶不涉及有活性的卤素过氧化物酶活性，并且没有产生过氧化物的氧化酶，从而避免了诸如与向受试者施用(特别是全身性地施用)产生过氧化物的氧化酶相关的低血糖的潜在风险。因此，本公开内容提供了用于抑制lps和脂质a活性的组合物和方法，其包括使lps或脂质a与卤素过氧化物酶(例如mpo或epo)接触，其中所述卤素过氧化物酶不涉及有活性的卤素过氧化物酶活性。所述卤素过氧化物酶可以不涉及有活性的卤素过氧化物酶活性，或者可以通过避免其暴露于确定的底物(例如过氧化物或卤化物)或通过修饰卤素过氧化物酶本身而使其酶促失活。例如，卤素过氧化物酶可包含突变，例如氨基酸置换、缺失或添加，这些突变使卤素过氧化物酶酶促失活而不损害其结合和抑制lps或脂质a的能力。

此外，本发明人还令人惊讶地发现，每种卤素过氧化物酶与lps或脂质a之间的相互作用不仅仅受静电结合的控制。如本文所述，mpo的阳离子少于epo(即，更中性)，但是在结合和抑制带阴离子的lps方面可能更有效。mpo的阳离子少于epo，因此特别适合全身施用，并因此适合治疗全身性病况，例如败血症和脓毒症。

组合物

本公开内容提供了适用于治疗细菌感染和内毒素相关病症的组合物。所述组合物包含卤素过氧化物酶，例如mpo或epo，它们能够通过氧化酶驱动的过氧化氢产生和卤素过氧化物酶经由卤素过氧化物酶的酶活性产生次氯酸盐和单线态分子氧而能够产生抗微生物作用。mpo或epo的酶活性还可以导致lps和脂质a抑制，但是这种内毒素抑制不需要产生次氯酸盐或单线态分子氧。另外，本发明人还发现，mpo和epo能够独立于卤素过氧化物酶的酶活性而结合并抑制内毒素活性，包括lps和脂质a活性。因此，当用于抑制lps或脂质a的活性时，本公开内容的组合物可以不产生或基本上不产生单线态分子氧。

本公开内容的组合物可包含约0.05μg/ml或更多的卤素过氧化物酶(例如，mpo或epo)，例如至少约1μg/ml，约2μg/ml，约5μg/ml，约10μg/ml，约20μg/ml，约50μg/ml，约100μg/ml，约500μg/ml或约1,000μg/ml。在一些实施方案中，本公开内容的组合物包含约1μg/ml至约50,000μg/ml的卤素过氧化物酶(例如，mpo或epo)，或约5μg/ml至约10,000μg/ml的卤素过氧化物酶，或约10μg/ml至约5,000μg/ml的卤素过氧化物酶。所述组合物可以包含浓度小于约50,000μg/ml的卤素过氧化物酶，例如小于约20,000μg/ml，小于约10,000μg/ml，小于约5,000μg/ml，小于约1,000μg/ml，小于约500μg/ml，小于100μg/ml或小于约50μg/ml。在其他实施方案中，卤素过氧化物酶(例如，mpo或epo)以约6μg/ml、12μg/ml、25μg/ml、60μg/ml或120μg/ml的浓度存在于组合物中。

在某些实施方案中，本公开内容包括向感染部位施用包含卤素过氧化物酶(例如，mpo或epo)的第一组合物；以及向感染部位施用包含氧化酶的底物的第二组合物。在一些实施方案中，在施用至感染部位之前将所述第一组合物和所述第二组合物混合。在一些实施方案中，将所述第一组合物和所述第二组合物同时施用至感染部位。在一些实施方案中，将所述第一组合物和所述第二组合物顺序施用至感染部位。所述第一组合物和所述第二组合物可以以任何顺序施用。

在某些实施方案中，本公开内容的组合物还包含第二抗微生物剂。所述第二抗微生物剂可有助于杀死目标微生物，其然后释放出内毒素。由这些内毒素引起的损害可以被也存在于组合物中的卤素过氧化物酶(例如，mpo或epo)减弱。在一些实施方案中，所述卤素过氧化物酶可以与所述第二抗微生物剂缀合。在这样的实施方案中，可能缺乏其卤素过氧化物酶的酶活性的卤素过氧化物酶选择性地靶向病原性微生物，例如革兰氏阴性细菌，并因此使其暴露于缀合的第二抗微生物剂。在其他实施方案中，配制卤素过氧化物酶(例如，mpo或epo)和第二抗微生物剂，使得它们同时或顺序施用。合适的抗微生物剂可包括抗微生物肽，抗微生物抗体或其片段，氨基糖苷，多烯，硝基咪唑，利福霉素，杆菌肽，β-内酰胺，头孢菌素，氯霉素，糖肽，大环内酯，林可酰胺，青霉素，喹诺酮，利福平(rifampicin)，四环素，甲氧苄氨嘧啶，磺胺剂，阿莫西林，沃格孟汀(augmentin)，羟氨苄青霉素，氨苄青霉素，阿洛西林，氟氯西林，美洛西林，甲氧西林，头孢氨苄，头孢吡酮(cefazedone)，头孢呋辛，氯碳头孢(loracarbef)，cemetazole，头孢替坦，头孢西丁，环丙沙星，左氧氟沙星，氧氟沙星，强力霉素，米诺环素，庆大霉素，阿米卡星，妥布霉素，克拉霉素，阿奇霉素，红霉素，达托霉素，新霉素，卡那霉素，链霉素，乳酸链球菌素肽，表皮素，高利丹宁(gallidennin)，肉桂霉素，耐久霉素(duramycin)，乳链球菌素481，阿莫西林，阿莫西林/克拉维酸，甲硝唑，克林霉素(clindamycine)，盐酸氯四环素，地美环素(dcmeclocycline)，氧四环素(oxytetracycline)，阿米卡星，奈替米星，头孢羟氨苄，头孢唑林，头孢氨苄，头孢菌素(cephalothin)，头孢匹林(cephapirin)，头孢拉定，头孢克洛，头孢羟唑(cefamandole)，头孢美唑(cefametazole)，头孢尼西(cefonicid)，头孢替坦，头孢西丁，头孢泊肟，头孢罗齐(cefprozil)，头孢呋辛，头孢地尼，头孢克肟，头孢哌酮，头孢噻肟，头孢他啶，头孢布烯(ceftibuten)，头孢唑肟，头孢曲松，头孢吡肟，阿奇霉素，头孢噻肟钠(claforan)，克拉霉素，地红霉素，红霉素，林可霉素，醋竹桃霉素(troleandomycin)，巴氨西林(bacampicillin)，羧苄西林(carbenicillin)，氯唑西林，双氯西林，甲氧西林，美洛西林，萘夫西林，苯唑西林，哌拉西林，替卡西林，西诺沙星(cinoxacin)，环丙沙星，依诺沙星，格雷沙星(grepafloxacin)，左氧氟沙星，洛美沙星，萘啶酸，诺氟沙星，氧氟沙星，司帕沙星，磺胺异噁唑，磺胺西汀(sulfacytine)，磺胺嘧啶，磺胺甲基异噁唑，磺胺异噁唑，氨苯砜(dapson)，氨曲南，杆菌肽，卷曲霉素，氯法齐明，粘菌素甲烷磺酸钠(colistimethate)，粘菌素，环丝氨酸，磷霉素，呋喃唑酮，乌洛托品(methenamine)，呋喃妥因，喷他脒，利福布汀，壮观霉素，替加环素，甲氧苄啶，葡糖醛酸三甲曲沙(trimetrexateglucuronate)，万古霉素，氯己定，碳青霉烯和厄他培南。所述第二抗微生物剂可以选自青霉素，头孢菌素，碳头孢烯，头霉素(cephamycin)，碳青霉烯，单环内酰胺类(monobactams)，氨基糖苷，糖肽，喹诺酮，四环素，大环内酯和氟喹诺酮。

本公开内容的组合物可以进一步包含药学上可接受的载体。在一些实施方案中，将组合物提供在液体载体中。只要载体不显著干扰卤素过氧化物酶的选择性结合能力或酶活性(如果希望酶催化的杀微生物作用)，通常可以将任何液体载体用于此目的。可替代地，可以以固体形式提供组合物，其在液体中溶解时活化。

在优选的实施方案中，本公开内容的组合物适用于全身施用。例如，所述组合物可以被制备为液体，以直接应用于血流。所述组合物可以无菌水溶液的形式使用，其可以含有其他物质，例如，足以使溶液与血液等渗的其他盐或溶质。如果合适的话，水溶液应该适当地缓冲(优选ph为约3至9)。在优选的实施方案中，本文所述的组合物适用于肠胃外施用，例如静脉内施用和/或局部施用。在无菌条件下制备合适的肠胃外组合物可通过本领域技术人员众所周知的标准制药技术容易地完成。适用于肠胃外施用的组合物可以包括水性和非水性无菌注射溶液，其可以包含抗氧化剂、缓冲剂和溶质，从而使制剂与预期受者的血液等渗；以及水性和非水性无菌悬浮液，其可包含悬浮剂和增稠剂。所述组合物可以存在于单位剂量或多剂量容器中，例如密封的安瓿瓶和小瓶中，并且可以在冷冻干燥(冻干)条件下储存，在使用前仅需要立即添加无菌液体载体，例如注射用水。临时注射溶液和悬浮液可以由无菌粉末、颗粒和片剂制备。

用于肠胃外施用的组合物包含水溶液。另外，可以将悬浮液制备成合适的油性注射悬浮液。合适的亲脂性溶剂或媒介物包括脂肪油，例如芝麻油，或合成脂肪酸酯，例如油酸乙酯或甘油三酯。水性注射悬浮液可包含增加悬浮液粘度的物质，例如羧甲基纤维素钠、山梨糖醇或葡聚糖。任选地，悬浮液还可包含合适的稳定剂或增加化合物溶解度的试剂，以允许制备高浓度的溶液。

在某些实施方案中，本公开内容提供了适用于治疗受试者的败血症、内毒素血症、细菌感染或革兰氏阴性细菌感染的组合物，所述组合物包含：治疗有效量的卤素过氧化物酶，例如髓过氧化物酶或嗜酸性粒细胞过氧化物酶；和药学上可接受的载体，其中所述组合物适用于全身施用至所述受试者。

在某些实施方案中，本公开内容提供了适用于治疗受试者的败血症、内毒素血症、细菌感染或革兰氏阴性细菌感染的组合物，所述组合物包含：治疗有效量的卤素过氧化物酶，例如髓过氧化物酶或嗜酸性粒细胞过氧化物酶；和药学上可接受的载体，其中所述组合物适用于肠胃外施用至所述受试者。

在某些实施方案中，本公开内容提供了适用于治疗受试者的败血症、内毒素血症、细菌感染或革兰氏阴性细菌感染的组合物，所述组合物包含：治疗有效量的卤素过氧化物酶，例如髓过氧化物酶或嗜酸性粒细胞过氧化物酶；和药学上可接受的载体，其中所述组合物适用于静脉内施用至所述受试者。

在某些实施方案中，本公开内容提供了适用于治疗受试者的败血症、内毒素血症、细菌感染或革兰氏阴性细菌感染的组合物，所述组合物包含：小于约1,000μg/ml的髓过氧化物酶或嗜酸性粒细胞过氧化物酶；和药学上可接受的载体，其中所述组合物适用于静脉内施用至所述受试者。

在某些实施方案中，本公开内容提供了适用于治疗受试者的革兰氏阴性细菌感染的组合物，所述组合物包含：治疗有效量的髓过氧化物酶或嗜酸性粒细胞过氧化物酶；和药学上可接受的载体，其中所述组合物适用于局部施用至革兰氏阴性细菌感染部位。

在某些实施方案中，本公开内容提供了适用于治疗受试者的革兰氏阴性细菌感染的组合物，所述组合物包含治疗有效量的卤素过氧化物酶和药学上可接受的载体，其中所述卤素过氧化物酶不涉及有活性的卤素过氧化物酶活性，但是可用于lps或脂质a的结合和抑制。

在某些实施方案中，本公开内容提供了适用于治疗受试者的败血症的组合物，所述组合物包含治疗有效量的卤素过氧化物酶和药学上可接受的载体，其中所述卤素过氧化物酶不涉及有活性的卤素过氧化物酶活性，但是可用于lps或脂质a的结合和抑制。

在某些实施方案中，本公开内容提供了适用于治疗受试者的内毒素血症的组合物，所述组合物包含治疗有效量的卤素过氧化物酶和药学上可接受的载体，其中所述卤素过氧化物酶不涉及有活性的卤素过氧化物酶活性，但是可用于lps或脂质a的结合和抑制。

在某些实施方案中，本公开内容提供了适用于治疗受试者的细菌感染的组合物，所述组合物包含治疗有效量的卤素过氧化物酶和药学上可接受的载体，其中所述卤素过氧化物酶不涉及有活性的卤素过氧化物酶活性，但是可用于lps或脂质a的结合和抑制。

本公开内容的组合物可以适用于在允许本公开内容的组合物与微生物感染(例如，皮肤、眼睛、耳朵、嘴、鼻和鼻窦通道、创伤性损伤部位、手术部位等的感染)直接接触的部位局部治疗人或非人哺乳动物受试者中的微生物感染。

在某些实施方案中，组合物经鼻内或通过吸入进行施用(例如，以加压容器、泵、喷雾器或雾化器的气雾喷雾器呈现形式，使用合适的推进剂，例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、氢氟烷烃，例如1,1,1,2-四氟乙烷(hfa134a3或1,1,1,2,3,3,3-七氟丙烷(hfa227ea3)，二氧化碳或其他合适的气体)。在使用加压气雾剂的情况下，可通过提供阀门来确定剂量单位，以递送计量的量。加压容器、泵、喷雾器或雾化器可以包含卤素过氧化物酶的溶液或悬浮液，例如使用乙醇和推进剂的混合物作为溶剂，其可以另外包含润滑剂，例如脱水山梨糖醇三油酸酯。

配制和施用的技术可以在最新版本的“remington’spharmaceuticalsciences,”mackpublishingco.,easton,pa.中找到。合适的途径可以例如包括口服，直肠，经粘膜或肠内施用；肠胃外递送，包括局部施用，肌肉内，皮下，经皮，真皮内，髓内递送(例如注射)，以及鞘内，直接心室内，静脉内，腹膜内，鼻内或眼内递送(例如注射)。对于注射，可以将卤素过氧化物酶配制成水溶液，适当地配制成生理相容的缓冲液，例如hanks溶液，林格氏溶液或生理盐水缓冲液。对于局部施用，在制剂中可以使用适用于要渗透的屏障的渗透剂。这样的渗透剂是本领域公知的。

可替代地，可以使用本领域众所周知的药学上可接受的载体将卤素过氧化物酶配制成适用于口服施用的剂量，例如片剂，丸剂，胶囊剂，液体剂，凝胶剂，糖浆剂，浆剂，悬浮液等。合适的载体可以选自麦芽，明胶，滑石粉，硫酸钙，植物油，合成油，多元醇，藻酸，磷酸盐缓冲溶液，乳化剂，等渗盐水和无热原的水。

方法

本公开内容提供了用于治疗细菌感染和内毒素相关病况的方法。在优选的实施方案中，本公开内容的方法和组合物适用于治疗全身性感染，例如败血症，这是细菌或内毒素进入血流时出现的病况。败血症可以由身体某一部位的感染(例如尿路感染，腹部感染，肺部感染(例如肺炎)或肾脏感染)引发，然后扩散到身体的其他部位。在优选的实施方案中，本公开内容的组合物适用于全身施用，因此不需要直接施用至初始感染部位。与败血症相关的病况包括脓毒症、器官功能障碍、急性呼吸窘迫综合征、全身炎症反应综合征和脓毒性休克。

在某些实施方案中，本公开内容提供了一种治疗受试者的细菌感染的方法，所述方法包括向所述受试者施用包含治疗有效量的如本文所述的卤素过氧化物酶的组合物。细菌感染可以是革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌感染。卤素过氧化物酶的酶促作用杀死革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌，但是在没有酶促作用的情况下，卤素过氧化物酶只能抑制革兰氏阴性菌的内毒素活性。优选地，所述细菌感染是革兰氏阴性细菌感染，例如由密螺旋体属的一些种、包柔氏螺旋体属的一些种、弗氏柠檬酸杆菌、阴沟肠杆菌、大肠杆菌、肺炎克雷伯菌、奇异变形杆菌、不动杆菌属的一些种、铜绿假单胞菌、嗜水气单胞菌或多杀巴斯德氏菌引起的感染。在某些实施方案中，细菌感染是革兰氏阴性细菌感染，例如由肠杆菌科(enterobacteriaceae)的一些种(例如克雷伯菌属(klebsiella)的一些种、肠杆菌属(enterobacter)、志贺氏菌属(shigella)、埃希杆菌属(escherichia)、沙门氏菌属(salmonella)、耶尔森菌属(yersinia)或柠檬酸细菌属(citrobacter))、假单胞菌属(pseudomonas)的一些种、不动杆菌属(acinetobacter)的一些种或其任何组合引起的感染。在其他实施方案中，感染是由以下细菌引起的：肺炎克雷伯菌、生癌肠杆菌、阴沟肠杆菌、霍氏肠杆菌、阿氏肠杆菌、鲍氏志贺氏菌、痢疾志贺氏菌、弗氏志贺氏菌、宋内志贺氏菌、大肠杆菌、弗格森埃希氏菌、猪霍乱沙门氏菌、猪霍乱沙门氏菌印度亚种、肠炎沙门氏菌、魏尔肖沙门氏菌、乙型副伤寒沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、甲型副伤寒沙门氏菌、伤寒沙门氏菌、猪霍乱沙门氏菌亚利桑那亚种、猪霍乱沙门氏菌双亚利桑那亚种、猪霍乱沙门氏菌豪顿亚种、邦戈沙门氏菌、塞氏柠檬酸杆菌、布氏柠檬酸杆菌、魏氏柠檬酸杆菌、弗氏柠檬酸杆菌、杨氏柠檬酸杆菌、无丙二酸柠檬酸杆菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌、弗氏耶尔森氏菌、鼠疫耶尔森氏菌、假结核耶尔森氏菌或其任何组合。另外，本公开内容的组合物可用于杀死革兰氏阳性细菌，例如芽孢杆菌属(bacillus)物种以及梭状芽胞杆菌属(clostridium)物种，以及抑制形成孢子的微生物和真菌(例如曲霉属(aspergillus)物种、镰刀菌属(fusarium)物种和毛癣菌属(trichophyton)物种)的生长或杀死它们。

本文还提供了治疗受试者的内毒素血症的方法，所述方法包括向所述受试者施用包含治疗有效量的如本文所述的卤素过氧化物酶的组合物。所述内毒素血症可能与脓毒症、中毒性休克、发烧、腹泻、脓毒性休克、胃肠炎、肺炎、脑膜炎、心内膜炎、骨髓炎、胆囊炎、胆管炎、脑膜炎、肠热病、志贺氏菌病、多器官功能障碍综合征、腹膜炎、中性粒细胞减少症、尿脓毒症、肝功能障碍、肾功能障碍、胰腺炎、肠漏综合征、脑膜炎球菌血症或全身炎症反应综合征有关。

内毒素血症通常是指与受试者血清中不希望的内毒素水平相关的病况。内毒素血症的早期症状可能包括发烧、发红和肿胀。取决于个体的健康状况、诸如肠低氧或失血性休克等压力的存在、诸如胰腺炎等急性病况，诸如牙周炎等慢性病况、感染的存在和肝功能，内毒素的浓度会而在个体中广泛变化。除此之外，在诸如长时间体育比赛等身体压力后，观察到健康个体具有短暂的轻度内毒素血症(例如，血液内毒素浓度为5至15pg/ml)(camus等人.clin.sci.(lond.)1997.92,415-422；jeukendrup等人.clin.sci.(lond.)2000.98,47-55)。在罹患更严重的内毒素血症病例的患者中，例如罹患脓毒症或脓毒性休克的患者，内毒素水平可能高出几倍(venet等人.intensivecaremed.2000.26,538-544；marshall等人.crit.care.2002.6,289-290)。

罹患内毒素血症的患者往往处于发展相关病况的风险中。例如，罹患内毒素血症的患者患糖尿病的风险增加(pussinen等人.diabet.care.2011.24,392-397)。在治疗此类患者时，可能不希望施用包含葡萄糖氧化酶的制剂，因为这样做可能会触发或加速患者的低血糖症，并且可能是致命的。在这方面，本公开内容的组合物包含卤素过氧化物酶(例如，mpo或epo)，并且适用于治疗内毒素血症。但是，卤素过氧化物酶不需要具有酶活性，以及因此，所述组合物不需要包含葡萄糖或葡萄糖氧化酶。

本公开内容的组合物可用于治疗许多与细菌感染有关的内毒素介导的病症和病况。例如，所述组合物可用于治疗肺炎、尿路感染(uti)、败血症、脑膜炎、腹泻、软组织感染、皮肤感染、菌血症、呼吸系统感染、心内膜炎、腹腔内感染、脓毒性关节炎、骨髓炎、cns感染、眼部感染、胆囊炎、胆管炎、脑膜炎、伤寒、食物中毒、胃肠炎、肠热病、志贺氏菌病、血流感染、腹腔内脓毒症、脑脓肿、脓毒症、关节感染、骨感染、胃肠道感染或伤口感染。

本公开内容的组合物可以通过多种途径施用。优选地，所述组合物是全身施用的，例如通过直接递送到受试者的血流中。在某些实施方案中，所述组合物是肠胃外递送的。肠胃外施用的示例性途径包括但不限于，血管内，囊内，眶内，心内，真皮内，经气管，腹膜内，心室内，脑室内，鞘内，皮下，表皮下，囊下，蛛网膜下腔，脊柱内，硬膜外，胸骨内，颅内，肌内，关节内，动脉内，结节内和静脉内。在一个实例中，将所述组合物通过动脉内途径递送到主动脉、心脏的心房或心室内或递送到血管内，例如通过静脉内途径。在优选的实施方案中，所述组合物腹膜内或静脉内施用。在某些实施方案中，优选的施用途径是局部的，其中将所述组合物施用到特定位置，例如身体的局部区域或身体部位的表面，例如感染部位或伤口。

在某些实施方案中，本公开内容提供了一种治疗人受试者的败血症的方法，所述方法包括向所述受试者施用包含治疗有效量的髓过氧化物酶或嗜酸性粒细胞过氧化物酶的组合物，其中将所述组合物全身性地施用至所述受试者。

在某些实施方案中，本公开内容提供了一种治疗人受试者的败血症的方法，所述方法包括向所述受试者施用包含治疗有效量的髓过氧化物酶或嗜酸性粒细胞过氧化物酶的组合物，其中将所述组合物肠胃外施用至所述受试者。

在某些实施方案中，本公开内容提供了一种治疗人受试者的败血症的方法，所述方法包括向所述受试者施用包含治疗有效量的髓过氧化物酶的组合物，其中将所述组合物静脉内施用至所述受试者。

在某些实施方案中，本公开内容提供了一种治疗人受试者的败血症的方法，所述方法包括向所述受试者施用包含少于约1,000μg/ml的髓过氧化物酶或嗜酸性粒细胞过氧化物酶的组合物，其中将所述组合物静脉内施用至所述受试者。

在某些实施方案中，本公开内容提供了一种治疗人受试者的内毒素血症的方法，所述方法包括向所述受试者施用包含治疗有效量的髓过氧化物酶或嗜酸性粒细胞过氧化物酶的组合物，其中将所述组合物全身性地施用至所述受试者。

在某些实施方案中，本公开内容提供了一种治疗人受试者的内毒素血症的方法，所述方法包括向所述受试者施用包含治疗有效量的髓过氧化物酶或嗜酸性粒细胞过氧化物酶的组合物，其中将所述组合物肠胃外施用至所述受试者。

在某些实施方案中，本公开内容提供了一种治疗人受试者的内毒素血症的方法，所述方法包括向所述受试者施用包含治疗有效量的髓过氧化物酶或嗜酸性粒细胞过氧化物酶的组合物，其中将所述组合物静脉内施用至所述受试者。

在某些实施方案中，本公开内容提供了一种治疗人受试者的内毒素血症的方法，所述方法包括向所述受试者施用包含少于约1,000μg/ml的髓过氧化物酶或嗜酸性粒细胞过氧化物酶的组合物，其中将所述组合物静脉内施用至所述受试者。

在某些实施方案中，本公开内容提供了一种治疗人受试者的细菌感染的方法，所述方法包括向所述受试者施用包含治疗有效量的髓过氧化物酶或嗜酸性粒细胞过氧化物酶的组合物，其中将所述组合物全身性地施用至所述受试者。

在某些实施方案中，本公开内容提供了一种治疗人受试者的细菌感染的方法，所述方法包括向所述受试者施用包含治疗有效量的髓过氧化物酶或嗜酸性粒细胞过氧化物酶的组合物，其中将所述组合物肠胃外施用至所述受试者。

在某些实施方案中，本公开内容提供了一种治疗人受试者的细菌感染的方法，所述方法包括向所述受试者施用包含治疗有效量的髓过氧化物酶或嗜酸性粒细胞过氧化物酶的组合物，其中将所述组合物静脉内施用至所述受试者。

在某些实施方案中，本公开内容提供了一种治疗人受试者的细菌感染的方法，所述方法包括向所述受试者施用一种组合物，所述组合物包含：小于约1,000μg/ml的髓过氧化物酶或嗜酸性粒细胞过氧化物酶，其中将所述组合物静脉内施用至所述受试者。

在某些实施方案中，本公开内容提供了一种治疗人受试者的革兰氏阴性细菌感染的方法，所述方法包括向所述受试者施用包含治疗有效量的髓过氧化物酶或嗜酸性粒细胞过氧化物酶的组合物，其中将所述组合物全身性地施用至所述受试者。

在某些实施方案中，本公开内容提供了一种治疗人受试者的革兰氏阴性细菌感染的方法，所述方法包括向所述受试者施用包含治疗有效量的髓过氧化物酶或嗜酸性粒细胞过氧化物酶的组合物，其中将所述组合物肠胃外施用至所述受试者。

在某些实施方案中，本公开内容提供了一种治疗人受试者的革兰氏阴性细菌感染的方法，所述方法包括向所述受试者施用包含治疗有效量的髓过氧化物酶或嗜酸性粒细胞过氧化物酶的组合物，其中将所述组合物静脉内施用至所述受试者。

在某些实施方案中，本公开内容提供了一种治疗人受试者的细菌感染的方法，所述方法包括向所述受试者施用一种组合物，所述组合物包含：小于约1,000μg/ml的髓过氧化物酶或嗜酸性粒细胞过氧化物酶，其中将所述组合物静脉内施用至所述受试者。

在某些实施方案中，本公开内容提供了一种治疗人受试者的革兰氏阴性细菌感染的方法，所述方法包括向所述受试者中的革兰氏阴性细菌感染部位施用包含治疗有效量的髓过氧化物酶或嗜酸性粒细胞过氧化物酶的组合物。

在某些实施方案中，本公开内容提供了一种治疗受试者的败血症的方法，所述方法包括向所述受试者施用包含治疗有效量的卤素过氧化物酶的组合物，其中所述卤素过氧化物酶不涉及有活性的卤素过氧化物酶活性，但是可用于lps或脂质a的结合和抑制。

在某些实施方案中，本公开内容提供了一种治疗受试者的内毒素血症的方法，所述方法包括向所述受试者施用包含治疗有效量的卤素过氧化物酶的组合物，其中所述卤素过氧化物酶不涉及有活性的卤素过氧化物酶活性，但是可用于lps或脂质a的结合和抑制。

在某些实施方案中，本公开内容提供了一种治疗受试者的细菌感染的方法，所述方法包括向所述受试者施用包含治疗有效量的卤素过氧化物酶的组合物，其中所述卤素过氧化物酶不涉及有活性的卤素过氧化物酶活性，但是可用于lps或脂质a的结合和抑制。

在某些实施方案中，本公开内容提供了一种治疗受试者的革兰氏阴性细菌感染的方法，所述方法包括向所述受试者施用包含治疗有效量的卤素过氧化物酶的组合物，其中所述卤素过氧化物酶不涉及有活性的卤素过氧化物酶活性，但是可用于lps或脂质a的结合和抑制。

在某些实施方案中，本公开内容提供了一种治疗人受试者的革兰氏阴性细菌感染的方法，所述方法包括向所述受试者中的革兰氏阴性细菌感染部位施用包含治疗有效量的髓过氧化物酶或嗜酸性粒细胞过氧化物酶的第一组合物；以及向所述受试者中的细菌感染部位施用包含氧化酶的底物的第二组合物；其中所述第一组合物与所述第二组合物联合作用以杀死微生物并另外地灭活由所述革兰氏阴性细菌产生的脂多糖内毒素。

剂量可以随待治疗病况的类型和严重程度而变化，并且可以包括单剂量或多剂量。可以根据个体需要和施用所述组合物的从业者的专业判断来随时间调整具体的剂量方案。当施用至人受试者时，剂量方案可以根据多种因素而变化，包括感染或病况的类型和严重程度，受试者的年龄，性别，体重或医学病况以及施用途径。在这方面，将要施用的卤素过氧化物酶组合物的精确量可以取决于从业者的判断。

本文所述的组合物可以在数小时、数天、数周或数月的时间内施用，这取决于几个因素，包括感染的严重程度或所治疗的病况，是否认为可能复发等。施用可以是恒定的，例如在几个小时、几天、几周，几个月等时间内持续输注。可替代地，施用可以是间歇性的，例如在几天的时间内每天一次，在几个小时的时间内每小时一次，或认为合适的任何其他时间表。在一些实施方案中，本公开内容的组合物每天一次施用至少一周，例如，每天至少一次持续至少两周，或者每天一次持续至少一个月或更长时间。

实施例

实施例1：鲎变形细胞溶解物测定

使用显色鲎变形细胞溶解物(lal)测定(lalendochrome-k，charlesriverendosafe)对脂多糖(lps)和脂质a进行定量。简而言之，lal测定是一种检测和测量颜色发生的动力学比色测定。lal凝固酶的内毒素激活测量为合成显色底物的酶促(水解)裂解，释放出对硝基苯胺(pna)，其可以通过在微孔板分光光度计中在405nm波长处的吸光度来进行定量。达到最大颜色变化(斜率)时的动力学测量值用于衡量存在的内毒素的活性。测量校准标准物以生成标准曲线和方程式，用于计算测定样品的内毒素活性。样品中存在的内毒素量可以指定为内毒素单位(eu)。

将一系列标准物的内毒素质量/孔相对于达到最大颜色变化的时间(最大斜率，即最大速率)作图(图1)。检测时限为1680秒。lps活性的制造商(sigma-aldrich)规格为3x10⁶eu/mg(即3eu/ng)。对于0.01nglps/孔的标准物，达到最大斜率的时间为1200秒，这个值约等于0.03eu。这与显色lal值测定(charlesriverendosafe)所报告的0.05eu/ml的值达到最大斜率的时间为1400秒一致。

实施例2：卤素过氧化物酶对lps的抑制

将mpo、epo或go与lps或脂质a在37℃下预温育30分钟。预温育后，添加鲎溶解物溶液，并测量达到最大颜色变化(斜率)的秒数。使用lps标准物导出的方程式(图1)，将达到最大斜率的时间转换为等效的lps质量，并根据预期质量的活性(例如，不含酶的内毒素)与实际测量的lps活性(例如具有酶的内毒素)之间的差异计算以百分比表示的抑制率。

如图2所示，mpo明显抑制lps，lps的抑制与mpo质量的自然对数(ln)成比例。1mgmpo抑制5nglps的90.8％(即4.5nglps)的活性。0.01mgmpo抑制5nglps的27.7％(即1.4nglps)的活性。在lps质量保持恒定且mpo质量变化的情况下，lal活性的抑制百分比与mpo质量的对数成比例。随着lps与mpo质量的比率增加，内毒素活性的抑制百分比降低，但是mpo抑制效率增加，例如，0.003mg(3μg)mpo对5nglps产生11.2％(即0.56nglps)的抑制率。

除mpo外，进行类似的抑制测定以确定epo和go的内毒素抑制活性。参考图3，mpo和epo均抑制lps活性，并且对于恒定质量的lps，内毒素活性的抑制与epo和mpo质量的对数成比例。2.5mgmpo和epo对0.1nglps活性分别产生88％和45.1％的抑制率；并且1.25mgmpo和epo分别产生68.1％和0％的抑制率。在测试的浓度范围内，葡萄糖氧化酶不抑制lps。

mpo和更大程度上的epo是阳离子蛋白。因此，静电相互作用可能有助于mpo和epo的结合以及带阴离子lps及其脂质a组分的抑制。然而，尽管mpo的阳离子少于epo，但mpo可以比epo更有效地抑制lps，这一令人惊讶的观察表明每种卤素过氧化物酶与lps之间的相互作用可能不仅仅受静电结合的控制。

实施例3：mpo和epo对脂质a内毒素活性的抑制

脂类a是lps的毒性成分，由两个与磷酸基团连接的葡糖胺单元和通常六个将其锚定在革兰氏阴性细菌外膜的疏水性脂肪酸组成。纯化的脂质a是有毒性的，其内毒素活性可通过lal测定来测量。

使用来自大肠杆菌f583的二磷酰基脂质a(sigmaaldrich，l5399)和上述显色lal测定来测试mpo和epo的抑制作用。脂质a的疏水特性会使水性标准物的制备复杂化。图4中显示的数据说明了在制备后长达5.75小时的以显色lal活性测量的水性脂质a标准物的重现性。使用凝固lal测定，每质量脂质a的内毒素单位活性低于制造商描述的内毒素单位活性(即，≥1×10⁶eu/mg)，并且活性在数小时内显示出可检测的降解。因此，同时运行lps或脂质a标准物，并用于计算每个mpo或epo抑制实验的标准脂质a曲线和方程式。

mpo和epo都能明显抑制脂质a活性，其中mpo比epo更具抑制性(图5)。与lps的情况一样，脂质a抑制与mpo和epo质量的对数成比例。go不会抑制脂质a的内毒素活性。

实施例4：卤素过氧化物酶的酶活性对内毒素抑制的影响

实施例2和实施例3中所描述的实验是在不存在过氧化物或过氧化物生成系统的情况下进行的。因此，实验是在不存在卤素过氧化物酶的酶活性的情况下进行的。为了确定卤素过氧化物酶的酶活性是否影响内毒素抑制程度，在不存在d-葡萄糖(无卤素过氧化物酶活性)和存在d-葡萄糖(高卤素过氧化物酶活性)的情况下，测试了包含4μgmpo和0.8μggo含氯的制剂的lps抑制活性。

在mpo质量保持恒定并且lps质量变化的情况下，内毒素活性的抑制百分比与lps质量的对数成反比；在lps或脂质a保持恒定并且mpo或epo变化时观察到相反的关系(图6)。随着lps与mpo质量比的增加，内毒素活性的抑制百分比降低。具有酶活性和无酶活性的mpo制剂的内毒素抑制活性基本相同。结果表明，卤素过氧化物酶活性不会显著影响内毒素的抑制。

实施例5：卤素过氧化物酶介导的内毒素毒性保护

将体重范围为16.2g至19.7g的实验幼稚、健康的balb/c雌性小鼠分为4个剂量组。每组20只小鼠接受一剂来自大肠杆菌o55:b5的纯化的lps(sigma-aldrichl4524)，其在0.5ml体积的低内毒素试剂水(lrw)中以腹膜内注射。根据《实验动物护理和使用指南》中推荐的准则对动物(包括但不限于所有饲养、居住、环境和喂养条件)进行处理。结果显示在表1中。估计ld90为每只小鼠400μg，即约22mg/kg。

表1.确定致死剂量90(ld90)。

*每组二十只雌性小鼠。

**剂量体积为0.5ml，以单次腹膜内注射递送lps。

***根据组平均体重计算的剂量。

在ld90剂量和两倍ld90剂量下测试了mpo对lps活性的影响。将适当浓度的lps和mpo混合并剧烈涡旋约一分钟。然后将样品在37℃下温育45分钟，并在腹膜内注射之前再次涡旋。

表2.mpo对lps耐受性的影响。

*相比于在阶段1中观察到的毒性确定的ld90的剂量水平

所采用的猪mpo通过反相超高效液相色谱法(rp-uplc)纯度为98.9％，通过分子大小排阻高效液相色谱法(sec-hplc)纯度为100％，并且具有0.79的过氧化酶的纯度值(reinheitszahl)(rz；a430nm/a280nm)。在没有lps的情况下，用500μgmpo处理的动物未显示异常的临床观察或死亡率。在用mpo和lps处理的动物中，与lps相关的死亡率明显降低。1xlps/mpo处理的动物的死亡率为50％，以及2xlps/mpo处理的动物的死亡率为95％。kaplanmeier曲线显示与mpo处理相关的死亡率降低并且死亡时间延迟(图7)。

测试扩展到包括更高剂量的mpo以及表3中列出的epo。相同纯度的mpo以更高的浓度施用。通过反相高效液相色谱法(rp-hplc)，所用的猪epo纯度为99.2％，并且reinheitszahl(rz；a415nm/a280nm)为0.96。

表3.mpo和epo对lps耐受性的影响。

在不存在lps的情况下，用5000μgmpo处理的动物未显示异常的临床观察或死亡率。在不存在lps的情况下，用5000μgepo处理的动物也未显示异常的临床观察，尽管在腹膜内施用的第二天发现两只动物在其笼中死亡，死亡率为10％。在不存在卤素过氧化物酶的情况下，用1xlps(400μg)处理的动物的死亡率为20分之15，或75％(图8)。

当1xlps(400μg)与mpo或epo注射时，与单独的lps相比，与lps相关的临床观察的发生率降低(图8)。在2500μg和5000μg的剂量下，mpo和epo处理的动物中与内毒素相关的死亡率均明显降低。mpo在降低死亡率方面比epo更有效，并且对于mpo和epo两者而言，与2500μg的剂量相比，更高的5000μg的剂量在降低死亡率方面更有效。

本领域技术人员将理解，本公开内容的组合物和方法可以以许多其他形式体现。

权利要求书(按照条约第19条的修改)

1.一种治疗受试者的败血症的方法，所述方法包括向所述受试者施用包含治疗有效量的卤素过氧化物酶的组合物，其中将所述组合物全身性地施用至所述受试者。

2.权利要求1所述的方法，其中所述卤素过氧化物酶是髓过氧化物酶或嗜酸性粒细胞过氧化物酶。

3.权利要求2所述的方法，其中将所述组合物肠胃外施用至所述受试者。

4.权利要求3所述的方法，其中将所述组合物静脉内施用至所述受试者。

5.权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述受试者是人。

6.权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述卤素过氧化物酶抑制所述受试者中脂多糖(lps)或脂质a的活性。

7.权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述卤素过氧化物酶不涉及有活性的卤素过氧化物酶活性，但是可用于脂多糖(lps)或脂质a的结合和抑制。

8.权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述组合物包含浓度小于约50,000μg/ml的卤素过氧化物酶。

9.权利要求8所述的方法，其中所述组合物包含浓度小于约1,000μg/ml的卤素过氧化物酶。

10.权利要求1至9中任一项所述的方法，其中所述卤素过氧化物酶是髓过氧化物酶。

11.权利要求1至10中任一项所述的方法，其中所述败血症与革兰氏阴性脓毒症、器官功能障碍、急性呼吸窘迫综合征、全身炎症反应综合征或脓毒性休克有关。

12.一种治疗受试者的内毒素血症的方法，所述方法包括向所述受试者施用包含治疗有效量的卤素过氧化物酶的组合物，其中将所述组合物全身性地施用至所述受试者。

13.权利要求12所述的方法，其中所述卤素过氧化物酶是髓过氧化物酶或嗜酸性粒细胞过氧化物酶。

14.权利要求13所述的方法，其中将所述组合物肠胃外施用至所述受试者。

15.权利要求14所述的方法，其中将所述组合物静脉内施用至所述受试者。

16.权利要求12至15中任一项所述的方法，其中所述内毒素血症与所述受试者血清中大于约5pg/ml的内毒素浓度有关。

17.权利要求16所述的方法，其中所述内毒素血症与所述受试者血清中大于约20pg/ml的内毒素浓度有关。

18.权利要求13至17中任一项所述的方法，其中所述受试者是人。

19.权利要求13至18中任一项所述的方法，其中所述卤素过氧化物酶抑制所述受试者中的脂多糖(lps)或脂质a的活性。

20.权利要求13至19中任一项所述的方法，其中所述卤素过氧化物酶不涉及有活性的卤素过氧化物酶活性，但是可用于脂多糖(lps)或脂质a的结合和抑制。

21.权利要求13至20中任一项所述的方法，其中所述组合物包含浓度小于约50,000μg/ml的卤素过氧化物酶。

22.权利要求21所述的方法，其中所述组合物包含浓度小于约1,000μg/ml的卤素过氧化物酶。

23.权利要求13至22中任一项所述的方法，其中所述卤素过氧化物酶是髓过氧化物酶。

24.权利要求13至23中任一项所述的方法，其中所述内毒素血症与败血症、脓毒症、中毒性休克、发烧、腹泻、脓毒性休克、胃肠炎、肺炎、脑膜炎、心内膜炎、骨髓炎、胆囊炎、胆管炎、肠热病、志贺氏菌病、多器官功能障碍综合征、腹膜炎、中性粒细胞减少症、尿脓毒症、肝功能障碍、肾功能障碍、胰腺炎、肠漏综合征、脑膜炎球菌血症或全身炎症反应综合征有关。

25.权利要求24所述的方法，其中所述内毒素血症与败血症有关。

26.一种治疗受试者的细菌感染的方法，所述方法包括向所述受试者施用包含治疗有效量的卤素过氧化物酶的组合物，其中将所述组合物全身性地施用至所述受试者。

27.权利要求26所述的方法，其中所述卤素过氧化物酶是髓过氧化物酶或嗜酸性粒细胞过氧化物酶。

28.权利要求26所述的方法，其中将所述组合物肠胃外施用至所述受试者。

29.权利要求28所述的方法，其中将所述组合物静脉内施用至所述受试者。

30.权利要求26至29中任一项所述的方法，其中所述受试者是人。

31.权利要求26至30中任一项所述的方法，其中所述细菌感染是革兰氏阴性细菌感染。

32.权利要求26至31中任一项所述的方法，其中所述卤素过氧化物酶抑制所述受试者中的脂多糖(lps)或脂质a的活性。

33.权利要求26至32中任一项所述的方法，其中所述卤素过氧化物酶不涉及有活性的卤素过氧化物酶活性，但是可用于脂多糖(lps)或脂质a的结合和抑制。

34.权利要求26至33中任一项所述的方法，其中所述组合物包含浓度小于约50,000μg/ml的卤素过氧化物酶。

35.权利要求34所述的方法，其中所述组合物包含浓度小于约1,000μg/ml的卤素过氧化物酶。

36.权利要求26至35中任一项所述的方法，其中所述卤素过氧化物酶是髓过氧化物酶。

37.权利要求26至36中任一项所述的方法，其中所述细菌感染是由以下细菌引起的：密螺旋体属(treponema)的一些种，包柔氏螺旋体属(borrelia)的一些种，弗氏柠檬酸杆菌(citrobacterfreundii)，塞氏柠檬酸杆菌(citrobactersedlakii)，布氏柠檬酸杆菌(citrobacterbraakii)，魏氏柠檬酸杆菌(citrobacterwerkmanii)，杨氏柠檬酸杆菌(citrobacteryoungae)，无丙二酸柠檬酸杆菌(citrobacteramalonaticus)，阴沟肠杆菌(enterobactercloacae)，生癌肠杆菌(enterobactercancerogenus)，霍氏肠杆菌(enterobacterhormaechei)，阿氏肠杆菌(enterobacterasburiae)，大肠杆菌(escherichiacoli)，弗格森埃希氏菌(escherichiafergusonii)，肺炎克雷伯菌(klebsiellapneumoniae)，奇异变形杆菌(proteusmirabilis)，不动杆菌属(acinetobacter)的一些种，铜绿假单胞菌(pseudomonasaeruginosa)，嗜水气单胞菌(aeromonashydrophila)，多杀巴斯德氏菌(pasteurellamultocida)，鲍氏志贺氏菌(shigellaboydii)，痢疾志贺氏菌(shigelladysenteriae)，弗氏志贺氏菌(shigellaflexneri)，宋内志贺氏菌(shigellasonnei)，猪霍乱沙门氏菌(salmonellacholeraesuis)，猪霍乱沙门氏菌印度亚种(salmonellacholeraesuissubsp.indica)，肠炎沙门氏菌(salmonellaenteritidis)，魏尔肖沙门氏菌(salmonellavirchow)，乙型副伤寒沙门氏菌(salmonellaparatyphib)，鼠伤寒沙门氏菌(salmonellatyphimurium)，甲型副伤寒沙门氏菌(salmonellaparatyphia)，伤寒沙门氏菌(salmonellatyphi)，猪霍乱沙门氏菌亚利桑那亚种(salmonellacholeraesuissubsp.arizonae)，猪霍乱沙门氏菌双亚利桑那亚种(salmonellacholeraesuissubsp.diarizonae)，猪霍乱沙门氏菌豪顿亚种(salmonellacholeraesuissubsp.houtenae)，邦戈沙门氏菌(salmonellabongori)，小肠结肠炎耶尔森氏菌(yersiniaenterocolitica)，弗氏耶尔森氏菌(yersiniafrederiksenii)，鼠疫耶尔森氏菌(yersiniapestis)或假结核耶尔森氏菌(yersiniapseudotuberculosis)。

38.一种适用于治疗受试者的革兰氏阴性细菌感染的组合物，所述组合物包含：治疗有效量的卤素过氧化物酶；和药学上可接受的载体，其中所述组合物适用于全身施用至所述受试者。

39.权利要求38所述的组合物，其中所述卤素过氧化物酶是髓过氧化物酶或嗜酸性粒细胞过氧化物酶。

40.权利要求38或权利要求39所述的组合物，其中所述组合物适用于肠胃外施用。

41.权利要求40所述的组合物，其中所述组合物适用于静脉内施用。

42.权利要求38至41中任一项所述的组合物，其中所述卤素过氧化物酶抑制受试者中的脂多糖(lps)或脂质a的活性。

43.权利要求38至42中任一项所述的组合物，其中所述卤素过氧化物酶不涉及有活性的卤素过氧化物酶活性，但是可用于脂多糖(lps)或脂质a的结合和抑制。

44.权利要求38至43中任一项所述的组合物，其中所述组合物包含浓度小于约50,000μg/ml的卤素过氧化物酶。

45.权利要求44所述的组合物，其中所述组合物包含浓度小于约1,000μg/ml的卤素过氧化物酶。

46.权利要求38至45中任一项所述的组合物，其中所述受试者是人。

47.权利要求38至46中任一项所述的组合物，其中所述卤素过氧化物酶是髓过氧化物酶。

48.一种治疗受试者的革兰氏阴性细菌感染的方法，所述方法包括向所述受试者中的革兰氏阴性细菌感染部位施用一种组合物，所述组合物包含：治疗有效量的卤素过氧化物酶；其中所述卤素过氧化物酶选自髓过氧化物酶和嗜酸性粒细胞过氧化物酶，并且不涉及有活性的卤素过氧化物酶活性，但是可用于脂多糖(lps)或脂质a的结合和抑制。

49.权利要求48所述的方法，其中所述卤素过氧化物酶抑制受试者中的脂多糖(lps)或脂质a的活性。

50.权利要求47至49中任一项所述的方法，其中所述组合物包含约1μg/ml至约50,000μg/ml的卤素过氧化物酶。

51.权利要求47或权利要求49所述的方法，其中所述组合物包含10μg/ml至5,000μg/ml的卤素过氧化物酶。

52.权利要求48至51中任一项所述的方法，其中所述受试者罹患牙龈、眼睛、耳朵、皮肤、软组织、伤口、阴道区域、腹股沟区域、褥疮或烧伤区域的细菌感染，并且优选所述方法非全身性地用于治疗浅表感染或伤口。

53.权利要求48至52中任一项所述的方法，其中所述卤素过氧化物酶是嗜酸性粒细胞过氧化物酶。

54.权利要求48至53中任一项所述的方法，其中所述受试者是人。

55.一种治疗受试者的革兰氏阴性细菌感染的方法，所述方法包括向所述受试者中的革兰氏阴性细菌感染部位施用包含治疗有效量的卤素过氧化物酶的第一组合物，其中所述卤素过氧化物酶不涉及有活性的卤素过氧化物酶活性，但是可用于脂多糖(lps)或脂质a的结合和抑制；以及向所述受试者中的细菌感染部位施用包含氧化酶的底物的第二组合物；其中所述第一组合物与所述第二组合物联合作用以杀死微生物并灭活由所述革兰氏阴性细菌产生的脂多糖(lps)内毒素。

56.权利要求55所述的方法，其中所述卤素过氧化物酶是髓过氧化物酶或嗜酸性粒细胞过氧化物酶。

57.权利要求55或权利要求56所述的方法，其中在施用至感染部位之前将所述第一组合物和所述第二组合物混合。

58.权利要求55或权利要求56所述的方法，其中将所述第一组合物和所述第二组合物同时施用至感染部位。

59.权利要求55或权利要求56所述的方法，其中将所述第一组合物和所述第二组合物顺序施用至感染部位。

60.权利要求55至59中任一项所述的方法，其中所述卤素过氧化物酶是嗜酸性粒细胞过氧化物酶。

61.权利要求55至60中任一项所述的方法，其中所述受试者是人。