具有消炎性质的新型蛋白质的制作方法

本发明涉及一种新型蛋白质、其在医学中的用途(特别是其在预防或治疗炎性病状中的用途)以及用于制备所述蛋白质的方法。
背景技术：
：已经报道了被不同地称为免疫球蛋白结合蛋白(bip)或葡萄糖调节蛋白78(grp78)的人类分子伴侣蛋白的消炎性质(corrigallvm、bodman-smithmd、brunstm、cornellh、panayigs，应激蛋白bip刺激人外周血单核细胞表达消炎细胞因子谱并抑制抗原呈递细胞功能：与炎性关节炎治疗的相关性(thestressprotein,bip,stimulateshumanperipheralbloodmononuclearcellstoexpressananti-inflammatorycytokineprofileandtoinhibitantigenpresentingcellfunction:relevancetothetreatmentofinflammatoryarthritis)，《关节炎与风湿病(arthritisrheum)》，2004；50:1167–1171)。细菌表达的重组人蛋白的氨基酸序列不同于天然存在的蛋白质的已知序列(seqidno:5)。bip是驻留在内质网(er)中的一种普遍存在的内源性表达的蛋白质，并且作为细胞内蛋白，是新生多肽正确折叠以及er应激时保护细胞免受累积的误折叠蛋白影响所必需的。因此，bip也被定义为应激蛋白和热休克蛋白70家族成员。在细胞应激期间上调的bip在细胞表面被表达并分泌到细胞外基质中，使得游离bip可以被分泌到患有类风湿性关节炎的患者的滑膜液中(corrigallvm等人，同上)。已经克隆了编码这种原生(天然存在的)bip的基因p78，并且已经表达了重组人蛋白(wo2000/21995)。wo2000/21995公开了bip的新型蛋白质类似物(seq.1和seq.2)及其在治疗炎性疾病中的效用。wo2006/111720公开了相同的两种类似物在治疗和预防骨质流失和吸收中的用途。wo2002/072133公开了bip(特别是来自wo2000/21995的seq.1和seq.2)在治疗或预防不期望的免疫应答中的用途，包含治疗免疫介导的疾病，例如自身免疫性疾病、i型糖尿病、甲状腺炎、多发性硬化症、狼疮、克罗恩氏病、肝炎或与移植器官排斥相关联的不期望的免疫应答。尽管bip类似物(seq.1和seq.2)在多种体内和体外炎症动物模型中表现出结果，但是根据这些模型进行推断以预测在临床中可能发生什么是有问题的，并且仍然存在制造用于向患者施用的具有适当纯度和功效的蛋白质的挑战。bip类似物seq.1和seq.2(从现在开始称为seqidno:1和seqidno:2)是使用细菌细胞生产的，但由于多种原因不适合作为人类施用的临床产品。据报道，seqidno:1上的6x组氨酸标签(用于通过亲和色谱进行蛋白质分离)可以改变蛋白质的物理和功能性质。(santiagofw等人，《来自h1n1的重组血凝素蛋白在在各种蛋白质表达系统中被生产时的抗原和免疫原性性质(antigenicandimmunogenicpropertiesofrecombinanthemagglutininproteinsfromh1n1whenproducedinvariousproteinexpressionsystems)》，《疫苗(vaccine)》，第30卷，第31期，2012年6月29日，第4606-4616页)而用于螯合的金属离子可能在未完全去除的情况下渗入血流。因此，seqidno:1不能在临床上使用。尽管使用细菌细胞作为生产方法比使用转化哺乳动物细胞更容易且更便宜，但是存在的问题是产生的蛋白质没有被糖基化并且可能不具有与哺乳动物等同物相同的折叠。此外，细菌产品中的内毒素负荷仍然很高，并且如果施用于人类，可能会引起不良影响。主要是从产品去除内毒素的技术困难导致了转化哺乳动物细胞蛋白生产的普及度的增加(尽管其成本高昂)。在制造过程期间纯化以去除内毒素在技术上是复杂的、昂贵的且费时的。另外，生产和纯化过程的可扩展性可能是一个问题。因此，需要基于bip的具有消炎和/或免疫调节性质的新型蛋白质，其适合于人类施用，但易于使用可扩展的过程制造并且在治疗中也有效。技术实现要素：这些需要通过本发明的新型蛋白质解决。因此，本发明的一个方面提供了一种分离或重组蛋白，其由根据seqidno:3或seqidno:4的氨基酸序列组成。本发明涉及一种免疫球蛋白结合蛋白(bip)的类似物，seqidno:3，如图4中所示。天然bip的预测氨基酸序列在图1中提供，并且可以在公开可用数据库ncbigenbank中在登记号x87949下找到。天然bip的核苷酸序列在图2中示出。天然氨基酸序列具有附接到n端的信号序列mklslvaamllllsaara。丙氨酸残基之后的信号序列的切割释放了以“eeed…”开始的成熟多肽seqidno:3的氨基酸序列与天然bip的序列不同之处在于n端以序列“raeeed…”而不是“eeed…”开始。这包含天然信号序列的两个c端氨基酸(精氨酸和丙氨酸)。技术人员将没有理由在n端包含ra——活性多肽在谷氨酸残基处以其天然形式开始，并且将理解，如果技术人员正在寻求提供bip的修饰形式，有多种选择，包含在不同位置处切割信号序列，并提供任意数量的突变、增加或缺失。seqidno:4对应于在蛋白质的n端处具有多组氨酸亲和标签(从现在开始称为his标签)的seqidno:3(参见图3)。his标签有助于通过金属离子亲和色谱来纯化蛋白质。seqidno:3还具有相较于wo2000/21995中公开的seqidno:1和seqidno:2的显著差异。如上所讨论，seqidno:1在c端处具有his标签，并且n端以“meed…”开始。seqidno:2对应于seqidno:1，但没有his标签。已经令人惊奇地发现，seqidno:3的蛋白质具有与wo2000/21995和wo2006/111720中报道的那些不同的有效的消炎和免疫调节性质。这些显著差异不是技术人员所预期的。这些性质在此通过相关的体外和体内研究表明。此外，本发明的蛋白质对于在人类中使用是安全的。根据本发明的seqidno:3与wo2000/21995和wo2006/111720的seqidno:1之间的关键功能差异如下：1)与seqidno:1相比，在seqidno:3的存在下，由外周血单核细胞进行的细胞因子tnfα的生产大大减少(参见实例2)；2)seqidno:1引起cd86和hla-dr的下调，而seqidno:3没有表现出hla-dr和cd86表达的显著损失(参见实例3)；3)seqidno:3适合用于人类，并且在临床试验中未发现输注反应或严重的不良药物反应(参见实例4)。相比之下，seqidno:1不适合于施用于人类。4)相对于安慰剂组，seqidno:3使人的crp、vegf和il-8的血清浓度显著降低。这指示，已经通过施用seqidno:3显著减少疾病炎症(参见实例4)5)相对于seqidno:1，seqidno:3导致调节性t细胞上的cd39表达的增加；在临床中，观察到来自对seqidno:3作出应答的患者的调节性t细胞上的cd39表达的显著增加，并且这在输注后维持了12周(参见实例5)；6)seqidno:3抑制破骨细胞分化和吸收活性(参见实例6)；7)有证据指示，seqidno:3没有整体免疫抑制作用，这不同于seqidno:1，其降低了对结核菌素ppd的回忆抗原应答(参见实例7)；8)施用seqidno:3导致在动物模型中皮肤移植物的更长存活(参见实例8)。本发明包含在seqidno:3或seqidno:4中具有一个或多个保守取代的分离或重组蛋白。“保守取代”是其中氨基酸残基被另一个生物学上相似的氨基酸残基(例如，具有相似的侧链)置换的取代。具有相似的侧链的氨基酸残基家族已在本领域中定义，包含碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如，天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性侧链(例如，甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、色氨酸)、β-支链侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香族侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。例如，用苯丙氨酸取代酪氨酸是保守取代。标识不会不良地影响蛋白质功能的保守氨基酸取代的方法是本领域熟知的。在一个优选实施例中，本发明的分离或重组bip蛋白包括的内毒素杂质的量小于50个内毒素单位(eu)/mg蛋白质。在一个优选实施例中，分离或重组蛋白包括的内毒素杂质的量小于25个内毒素单位(eu)/mg蛋白质。在一个优选实施例中，分离或重组蛋白包括的内毒素杂质的量小于2个内毒素单位/mg蛋白质，最优选小于1.5个内毒素单位/mg蛋白质。使用鲎变形细胞溶解物(lal)测试检测内毒素，以检测和定量从革兰氏阴性细菌的外膜提取的细菌内毒素(associatesofcapecod，利物浦，英国)。在内毒素测试中使用的lal试剂的关键组分源自鲎(美洲鲎)的血细胞(变形细胞)。lal测试在《美国药典(unitedstatespharmacopeia)》(第<85>章)中的《细菌内毒素测试(bacterialendotoxinstest)》一章中以及在《欧洲药典(europeanpharmacopoeia)》(第2.6.14章)和《日本药典(japanesepharmacopoeia)》(通用试验，第4.01号)中的等同内容章中进行了描述。与被糖基化的天然蛋白质相反，本发明的蛋白质是非糖基化的或基本上非糖基化的。另一方面，本发明提供了一种分离或重组核酸分子，其编码由根据seqidno:4所述的氨基酸序列组成的重组蛋白。优选地，根据权利要求3所述的分离或重组核酸分子由根据seqidno:8所述的核酸序列组成。另一方面提供了包括如上所限定的核酸分子的重组载体。所述载体可以包括启动子和/或操纵子序列。所述载体可以包括非哺乳动物序列，例如来自细菌或酵母的序列。所述载体可以包括非哺乳动物启动子和/或操纵子序列，例如细菌或酵母启动子和/或操纵子序列。另一方面，本发明提供了一种如上所限定的分离或重组蛋白，其用于医学或兽医学。本发明的蛋白质可以用于人类或非人类动物。又一方面，本发明提供了一种如上所限定的分离或重组蛋白，其用于治疗和/或预防炎性病症。优选地，在没有显著的免疫抑制的情况下实现炎性病状的治疗和/或预防。在一个实施例中，在没有显著的免疫抑制(如通过相对于施用所述蛋白质之前的活性的t淋巴细胞活性所测量)的情况下实现炎性病状的治疗和/或预防。在一个实施例中，不存在t细胞增殖对回忆抗原(例如，结核菌素纯化的蛋白衍生物)或丝裂原(例如，植物血凝素(pha))或抗cd3或抗cd28抗体包被磁珠的显著抑制。在一个优选实施例中，所述炎性病状选自类风湿性关节炎；银屑病性关节炎；幼年特发性关节炎；强直性脊柱炎；器官、皮肤、组织、血液、血清、血浆或细胞移植物排斥；或炎性肠病，例如克罗恩氏病。在一个特别优选实施例中，所述炎性病状选自类风湿性关节炎、银屑病性关节炎或幼年特发性关节炎。在一个实施例中，所述分离或重组蛋白用于治疗或预防骨代谢失调疾病，例如骨质疏松、骨质流失、骨吸收、佩吉特氏病、乳腺癌、骨癌或与癌症相关联的骨质流失。转移性乳腺癌已知与骨质流失相关联(http://www.nationalbreastcancer.org/metastatic-breast-cancer)。另一方面，如上所限定的分离或重组蛋白用于预防假体关节松动。在用于如上所限定的用途的如上所限定的分离或重组蛋白的一个实施例中，所述用途包括以1mg至1g，任选地1mg至500mg，任选地1mg至50mg，任选地1mg至15mg的剂量施用所述蛋白质。所述剂量可以是1mg、5mg或15mg。所述蛋白质可以单剂量或多剂量施用。所述剂量可以以单次静脉内输注施用0.5至3小时，任选地1至2小时，优选1小时。在一个优选实施例中，将1mg、5mg或15mg的剂量向患者施用1小时。在一个替代实施例中，可以向所述患者施用多个剂量，其中每个剂量的施用之间的间隔为至少1小时或至少2小时，或至少一天或至少1周。数字范围包含定义范围的数字，并且本文提供的任何单个值可以用作包含本文提供的其它单个值的范围的端点。例如，一组值(例如，1、2、3、8、9和10)也是1-10、1-8、3-9等数字范围的公开。同样，所公开的范围是所述范围涵盖的每个单个值的公开。例如，所述的范围5-10也是5、6、7、8、9和10的公开。另一方面，本发明提供了一种药物组合物，其包括如任一前述权利要求所限定的分离或重组蛋白以及一种或多种药学上可接受的赋形剂、佐剂或载体。对所述一种或多种药学上可接受的赋形剂、佐剂或载体没有特别限制，并且合适的赋形剂、佐剂或载体是本领域技术人员已知的。可以使用任何合适的施用途径。例如，口服、局部、肠胃外、眼、直肠、阴道、吸入、颊、舌下和鼻内递送途径中的任一种可以是合适的。用于肠胃外施用的药物组合物可能是优选的。本发明的蛋白质和药物组合物可以肠胃外给药，例如静脉内、动脉内、腹膜内、鞘内、心室内、胸骨内、颅内、肌内或皮下，或者它们可以通过输注技术施用。静脉内施用是特别优选的。药物组合物可以包括药学上可接受的载体，例如生理盐水。合适的药物组合物可以包括缓冲剂(例如，乙酸盐、磷酸盐、柠檬酸盐)、表面活性剂(例如，聚山梨酸酯)、稳定剂(例如，人白蛋白、多醇、氨基酸)、防腐剂(例如，苯甲酸钠)和/或其它常规增溶剂或分散剂中的一种或多种。本发明的药物组合物可以是无菌水溶液的形式，其可以含有其它物质，例如足够的盐或葡萄糖以使溶液与血液等渗。如有必要，所述水溶液应适当缓冲(优选ph值为3至9)。无菌条件下的合适的肠胃外调配物的制备通过本领域技术人员熟知的标准制药技术容易地完成。适合于肠胃外施用的药物和药物组合物包含水性和非水性无菌注射溶液，它们可以含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和溶质，从而使调配物与预期受体的血液等渗；以及水性和非水性无菌混悬液，它们可以包含混悬剂和增稠剂。所述药物和组合物可以存在于单位剂量或多剂量容器，例如密封的安瓿瓶和小瓶中，并且可以以冷冻干燥(冻干)条件储存，其仅需要加入无菌液体载体(例如，注射用水)便可立即使用。临时注射溶液和混悬液可以由前述类型的无菌粉末、颗粒和片剂制备。在一个优选实施例中，所述药物组合物包括ph7.2至7.6，最优选ph7.4的磷酸盐缓冲盐水。在一个实施例中，所述药物组合物包括0.9％w/v盐水。在一个实施例中，所述药物组合物包括量为2.0至50.0mg/ml，任选地2.0至10.0mg/ml，优选地量为约5.0mg/ml的分离或重组蛋白。通常，所述药物组合物适合于静脉内施用。另一方面，本发明提供了一种在患者中治疗和/或预防如上所限定的病状的方法，所述方法包括以下步骤：向有需要的患者施用有效量的如上所限定的分离或重组蛋白或如上所限定的药物组合物。诸如“治疗(treat/treatment/treating)”的术语是指治愈、减缓、减轻不期望的生理病状、所诊断的病理病状、疾病或病症的症状和/或阻止其进展的治疗性措施。因此，需要治疗的那些包含已经患有所述病状、疾病或病症的那些。在某些实施例中，如果所述患者表现出例如与病状、疾病或病症相关联的症状的全部、部分或暂时减轻或消除；所述病状、疾病或病症的程度的降低；所述病状、疾病或病症的稳定(即，不恶化)；所述病状、疾病或病症的发作延迟或进展变缓；所述病状、疾病或病症的改善，包含部分或全部缓解；和/或相较于未接受治疗的预期存活而延长存活，则受试者针对所述病状、疾病或病症被成功地“治疗”。“预防(prevent/prevention/preventing)”是指避免和/或减慢了靶向病理病状、疾病或病症的发展的预防性(prophylactic/preventative)措施。因此，需要预防的那些包含易于患有或易患所述病状、疾病或病症的那些。在某些实施例中，如果相较于未经受本发明的方法的患者，所述患者短暂或永久地发展了例如更少的或较不严重的与病状、疾病或病症相关联的症状，或与所述病状、疾病或病症相关联的症状的发作延后，则成功地预防了所述病状、疾病或病症。在一个实施例中，进一步向所述患者施用一种或多种治疗剂，或者在提供所述蛋白质时与一种或多种治疗剂组合施用。在一个优选实施例中，所述治疗剂选自疾病改良剂、止痛剂、消炎剂、免疫治疗剂、抗生素、抗体和类固醇。在一个特定实施例中，所述治疗剂是疾病改良性抗风湿药物(dmard)。另一方面，本发明提供了一种用于制备由根据seqidno:3的氨基酸序列组成的重组蛋白的方法，所述方法包括：a)用如权利要求6所限定的所述重组载体转化微生物；b)培养所述微生物，从而生产seqidno:4的蛋白质；c)裂解所述微生物以释放所述蛋白质；d)用洗涤剂处理所述裂解物以去除内毒素；e)使用固定化金属亲和色谱来分离和纯化所述蛋白质，其中所述固定化金属是钴；和f)使所述纯化蛋白质与二氨基肽酶接触，其中所述二氨基肽酶从所述蛋白质的n端切割所述组氨酸标签；和g)将所述切割蛋白质与所述组氨酸标签分开。优选地，所述微生物是细菌，最优选大肠杆菌。在一个优选实施例中，所述微生物在不含或基本上不含动物源产品的培养基中培养。通常，所述方法包括用洗涤剂处理所述蛋白质以去除内毒素的一个或多个另外的步骤。所述洗涤剂可以是1,1,3,3-(四甲基丁基)苯基-聚乙二醇。作为一个替代方案，可以用精氨酸处理所述蛋白质，以便去除内毒素。上述方法优选地用于生产蛋白质，所述蛋白质具有小于25个内毒素单位/mg蛋白质，任选地具有小于2个内毒素单位/mg蛋白质。洗涤剂或精氨酸的加入实现了内毒素的去除。步骤f)在适合于二氨基肽酶的活性的温度下，优选地在约37℃下进行。通常，步骤g)使用固定化金属亲和色谱来进行，其中所述固定化金属是钴。所述切割his标签结合到柱，并且所述纯化蛋白质从所述柱洗脱。优选地，所述方法不包含多于一个冻融步骤。优选地，所述蛋白质在所述方法的任何阶段均不冷冻。如果需要在所述方法的步骤之间存储所述蛋白质，则将所述蛋白质存储在2至8℃的温度下。在一实施例中，所述方法进一步包括一个或多个过滤、纯化或浓缩步骤。在一个实施例中，所述细胞通过剪切，特别是使用弗氏压碎器来裂解。在另一个实施例中，使用除细菌以外的宿主细胞来生产本发明的蛋白质。在一个实施例中，使用源自酵母、昆虫或真菌的细胞来生产本发明的蛋白质。在一个优选实施例中，使用哺乳动物细胞来生产本发明的蛋白质。附图说明现在将参考以下附图来描述非限制性实例：图1示出了天然bip的氨基酸序列。bip的一级结构由664个氨基酸构成。在n'端，在翻译后变化期间剪切18个氨基酸的前导序列(带下划线)。图2示出了天然bip的核苷酸序列。bip基因为2.5千碱基。图3示出了seqidno:4，其是在纯化期间在切割之前包含n端处的his标签的本发明的蛋白质。图4示出了seqidno:3，其是本发明的蛋白质(不包含his标签)图5a示出了用于克隆天然bip基因的重组载体pqe-2。所使用的载体的示意图示出了组氨酸标签的位点和限制酶的切割位点。图5b示出了克隆到载体pqe-2的ndei/noti位点中的bip序列(seqidno:8)。图6示出了根据本发明的seqidno:4的蛋白质的氨基酸序列与天然蛋白质的氨基酸序列的比对。图7示出了seqidno:1，其是来自wo00/21995的seq1。图8示出了seqidno:2，其是来自wo00/21995的seq2。图9示出了seqidno:7。图10示出了由seqidno:1和seqidno:3诱导的细胞因子生产的比较。在存在所示浓度的seqidno:1(a、b)或seqidno:3(c、d、e和f)的情况下，将外周血单核细胞培养24小时。使用了来自4个健康对者(实心符号)和一个风湿性关节炎患者(空心符号)的pbmc。在24小时时，收集上清液，并通过酶联免疫吸附测定(elisa)定量肿瘤坏死因子(tnf)α和白介素(il)10的生产。e和f示出了与c和d相同的数据，但具有单独的y轴刻度，以允许标识五个待观察的样品。图11示出了来自实验的数据，所述实验使用单独培养或与seqidno:3或seqidno:1一起培养24小时的外周血单核细胞(pbmc)，之后使用荧光染料缀合抗体抗cd80，藻红蛋白抗cd86、异硫氰酸荧光素(fitc)或hla-dr.fitc进行流式细胞术分析。在所有情况下，pbmc样品都被通过活门(livegate)控以仅进入cd14群体。pbmc如下培养：a)未处理；b和e)在存在seqidno:3的情况下；或c)和d)在存在seqidno:1的情况下。seqidno:1表现出cd86的下调以及hla-dr。相反，根据本发明的seqidno:3没有表现出hla-dr和cd86表达的显著缺失。图12示出了seqidno:3对从针对seqidno:3的第一人类临床试验中的患者获取的血清c反应蛋白(crp)水平的影响。示出了三组患者：安慰剂、活性应答者(r)和所有接受seqidno:3的患者。针对安慰剂组、应答组和所有用seqidno:3治疗的患者，测量了输注后2周和12周时的相较于输注前水平的crp血清水平的变化。在12周时，在用seqidno:3治疗的患者中发现crp水平的显著下降。*本患者放弃了其伴随甲氨蝶呤药物治疗，这是违背方案的行为。图13示出了在seqidno:3治疗的患者中的生物标志物水平的变化。通过luminex磁珠技术测量vegf和il-8的血清浓度，并且计算每个患者在2周和12周时的相较于输注前血清浓度的变化。(a)vegf浓度的变化；(b)il-8浓度变化。数据表明，安慰剂组(n＝6)，应答者组(r)[n＝8(2周)和6(12周)]，并且在12周时仍留在研究中的用seqidno:3治疗的总患者组[n＝14(2周)和12(12周)]。浓度范围(所有患者)：vegf，4-195pg/ml；il-8，0.7-19pg/ml。图14示出了调节性t细胞功能效率增加的标志物cd39的表达上调。按以下方式在培养物中建立来自ra患者的外周血单核细胞：未经刺激(空心条)；或用seqidno:1(10μg/ml)(斜线条)或seqidno:3(10μg/ml)(黑色条)。在24小时、48小时或72小时后，从培养物取出细胞，并用一组cd45、cd3、cd4、cd25、cd127和cd39的荧光染料缀合抗体染色。在facscanto流式细胞仪(bdbiosciences)上分析细胞。结果被针对以下表达为平均荧光强度(mfi)：(a)在使用多个活门进入活、cd45+、cd3+、cd4+细胞之后的cd25hi和cd127lo细胞；(b)(a)中cd45+cd3+cd4+cd25hicd127lo群体对cd39的表达。(c)将pbmc(106/ml)在培养物中用seqidno:1(10或0.1μg/ml)或根据本发明的seqidno:3(10或0.1μg/ml)预处理96小时，洗涤并加入新鲜的自体cfse染色t细胞中，并且用抗cd3和抗cd28抗体包被磁珠刺激。预处理t细胞与应答t细胞的比例为1:10。3天后，使用cellquest软件在facscalibur流式细胞仪(bdbiosciences)上分析细胞的cfsemfi降低。在将t细胞与seqidno:1预先温育的情况下，未观察到应答的抑制，但是在细胞与seqidno:3预先温育的情况下，观察到多至30％的应答降低。(d)在ragula临床试验中，监测来自安慰剂和seqidno:3治疗的类风湿性关节炎患者(应答者(r)或无应答者(nr))的全血样品中的treg细胞(活、cd45+cd3+cd4+cd25hicd127lo)上的cd39表达在12周内的变化。结果被表达为在指示时间点处的细胞表面表达相较于输注前的变化％。在单次输注之后，cd39+表达在输注后至少12周内显著升高。图15示出了在不存在或存在seqidno:1(2μg/ml)的条件下培养48小时的m-csf依赖性人破骨细胞前体对cd115/c-fms(a)和rank(b)蛋白水平的表达的流式细胞仪分析的结果。示出了平均荧光强度的代表性样品：虚线，未处理的对照；重实线，rankl激活的对照；浅实线，rankl激活的seqidno:3处理的细胞(n＝4)。(c)在用seqidno:1(2μg/ml)处理鼠m-csf依赖性破骨细胞前体48小时之后的c-fms和rank表达的qpcr分析。数据示出了使用特异性引物并标准化为β-肌动蛋白的重复实验的平均值±sem。*p<0.05。(d)蛋白质印迹分析表明，在不存在或存在seqidno:1(2μg/ml，48小时)的条件下培养的细胞中，人破骨细胞前体中的perk和pp38响应于rankl(10ng/ml)在指示时间内的表达。(e)在含有在不存在或存在seqidno:1(2μg/ml，48小时)的条件下培养的成熟人破骨细胞的培养物中，rankl诱导的perk的表达。(f)蛋白质印迹分析表明，在不存在或存在bip(2μg/ml)的情况下处理的破骨细胞前体和成熟破骨细胞中，转录因子c-fos和nfatc1响应于rankl(10ng/ml)的表达。如所指示，将总erk和p38蛋白以及gapdh用作上样对照。*p<0.01。这表明，seqidno:1下调人破骨细胞前体中的cd115和rank细胞表面表达和下游信号转导。图16示出了seqidno:3在tnfα和rankl刺激之后抑制破骨细胞前体和thp1单核细胞中的nf-κbp65和p52的核转位。在不存在(co)或存在seqidno:3(10μg/ml)(a，b)的情况下，对m-csf依赖性(a)人破骨细胞前体或(b)thp-1细胞进行预处理1小时，然后用tnfα(10ng/ml)刺激10分钟。(c)破骨细胞前体在存在或不存在seqidno:3(10μg/ml)的情况下在有或没有rankl(50ng/ml)的条件下培养4小时。在用dapi复染剂对nf-κbp65(a，b)或p52(c)染色之后，固定细胞并进行流式细胞术、流式细胞术成像或共聚焦显微镜检查。每个图部分右侧的图示出了代表性单个细胞中的p65和p52的核转位的共聚焦图像，表明在seqidno:3处理的细胞中不存在核转位。*p<0.01，n＝3。图17：在用seqidno:3或安慰剂治疗之后，使用所刺激的pbmc培养物来测量患者的免疫应答，以检测对最大刺激、抗cd3和抗cd28抗体包被磁珠(3天培养)(图17a)或对回忆抗原、结核菌素ppd(5天培养)(图17b)的t细胞应答。通过在培养的最后24小时的氚化胸腺嘧啶的摄取来测量激活。图18a示出了鼠皮移植实验的方案和结果的示意图。图18b示出了kaplanmeier图中的存活分析。这表明，seqidno:3使5/6的移植物的存活超出了对照组的存活，其中50％移植物的存活时间比对照小鼠移植物长大约30％。图19示出了第二移植探索性实验的示意图。与被给予修饰树突细胞(dc)的那些动物相比，seqidno:3施用再次导致皮肤移植物的更长的存活。将dc施用与seqidno:3混合没有益处。图20示出了在有和没有seqidno:3的情况下培养的假体周围组织的细胞因子生产。在假体关节松动并且患者完全知情同意的情况下，从在翻修手术期间获取的假体周围组织切下了类似大小的小块。在不存在(对照)或存在seqidno:3(20μg/ml)的情况下将组织培养24-72小时。通过商业酶联免疫吸附测定(elisa)(pharmingen,bd，牛津，英国)对细胞因子肿瘤坏死因子(tnf)α或白介素(il)10进行定量。两个图表明，尽管对照培养物和seqidno:3培养物中的tnfα的量在所有4种培养物中表现出很小的变化，但il-10生产却有所增加。具体实施方式实例实例1：本发明的蛋白质的制备修饰了bip基因，以将his标签置于分子的n端。放置6x组氨酸标签，使得蛋白质在钴柱上进行亲和纯化之后，可以通过二氨基肽酶进行酶消化来将其去除。不使用镍，因为如果残留足够的镍会污染制剂，则镍可能导致过敏反应。使用温度变化和洗涤剂的组合来有效地去除内毒素。产量和纯化通过可去除的his标签系统，产量和蛋白质的纯度都得到了极大的改善。表1：来自细菌沉淀的seqidno:3的产量：表2：seqidno:3的纯度和产量测试结果蛋白质浓度5.45mg/ml内毒素1.51eu/mg蛋白质用于药物物质的无菌过滤的过滤器的过滤器完整性测试3900mbar生物负载无生长比较例：seqidno:7的制备在本发明的蛋白质的开发期间，决定了所述分子必须在c'端具有正确的kdel序列，并且必须没有与蛋白质附接的其它标签。本蛋白质根据本领域技术人员已知的标准重组技术制备。然而，蛋白质太少，纯度太低，并且几乎所有的生物学活性都丧失了。因此，不能使用所述蛋白质。seqidno:7对应于去除了his标签并且恢复了kdel氨基酸序列的seqidno:1(wo00/21995的seq1)，但是相较于wo00/21995的seq1没有其它变化。事实表明，这种蛋白质很难纯化，最终蛋白质纯度<90％，并且内毒素负荷对于临床使用而言过高。这表明，难以提供易于制备、稳定并且具有生物学活性以及适合于施用于人类的天然bip的类似物。准备了四个试验批次，以尝试并改善纯蛋白质的产量、纯度和内毒素污染减少。事实证明，这是不可能的。蛋白质的回收率为约1％，但内毒素水平仍然很高。实例2在图10中提供了由seqidno:3和seqidno:1的蛋白质诱导的tnfα生产的比较。在存在seqidno:1或seqidno:3的条件下，将来自4个健康对照(实心符号)和1个类风湿性关节炎患者(空心符号)的外周血单个核细胞(pbmc)培养24小时。通过elisa检测并定量上清液中生产的细胞因子。与seqidno:1相比，在seqidno:3的存在下，pbmc的tnfα生产大大减少。此外，本发明的蛋白质未不同地增加类风湿性关节炎pbmc的tnfα生产(与健康对照相比)，而seqidno:1的蛋白质似乎诱导rapbmc的更大的tnfα生产(与健康pbmc相比)。tnfα在类风湿性关节炎(ra)的发病机制中的临床意义已得到很好的确立(参见《细胞因子在类风湿性关节炎中的作用：病理生理学和治疗学教育(roleofcytokinesinrheumatoidarthritis:aneducationinpathophysiologyandtherapeutics)》，feldmannm、mainisr，《免疫评论(immunolrev)》，2008年6月；223:7-19)。因此，本发明的蛋白质的重要的正向特征是它不上调tnfα。实例3调节t细胞激活的分子之间的相互作用很复杂，但是由于类风湿性关节炎是一种慢性炎症疾病，因此这些分子及其相对表达很重要。人类白细胞抗原-抗原d相关(hla-dr)是一种由单核细胞、巨噬细胞和树突细胞(通常被称为抗原呈递细胞，其中每一种都具有准备好呈递给cd4+t细胞受体的抗原肽)组成性表达的分子。然而，对于完整的t细胞激活，需要两个信号，一个信号通过hla-dr-t细胞受体连接同时第二信号经由cd86或cd80连接通过cd28。所述第二信号由共刺激分子cd86和/或cd80提供，所述共刺激分子也由抗原呈递细胞表达，最初结合到由cd4t细胞表达的cd28，所述cd4t细胞随后被下调，而ctla-4被上调。t细胞的激活由这些分子的表达调节。cd28向t细胞给出一个正向激活信号，而ctla-4向t细胞给出一个负向信号。ctla-4还以比cd28更大的亲和力结合cd80和cd86，这具有抑制t细胞激活的作用，从而防止了慢性或持续性t细胞激活。这四个分子的相互作用有助于调节免疫应答。因此，值得注意的是，seqidno:1表现出cd86以及hla-dr的下调。这起到了减少t细胞激活的作用，如bip处理的pbmc对回忆抗原(例如，结核菌素ppd)的体外应答的降低所示，但也表明了普遍免疫抑制的可能性，从长远来看，这对临床没有益处(michaeldandel、hansbrendanlehmkuhl、christophknosalla、rolandhetzer，《不同的长期维持免疫抑制治疗策略对心脏移植之后的患者预后的影响(impactofdifferentlong-termmaintenanceimmunosuppressivetherapystrategiesonpatients'outcomeafterhearttransplantation)》，《移植免疫学(transplantimmunology)》，第23卷，第3期，2010年7月，第93-103页)，参见图11d。相反，根据本发明的seqidno:3没有引起hla-dr(图11e)和cd86表达的显著缺失。图11示出了对cd14+细胞的流式细胞术实验的结果。在存在seqidno:3(图11b的情况下，相对于未刺激的细胞(图11a)，cd80的表达增加，并且cd86的表达增加。在存在seqidno:1(图11c)的情况下，相对于未刺激的细胞，cd80的表达增加，但cd86的表达未增加。总之，这表明了两个重要的兴趣点。首先，尽管减少t细胞激活会减少炎症，如在seqidno:1的情况下所示，但从长远来看，免疫系统的普遍抑制对患者没有益处，这导致感染增加等。其次，根据本发明的seqidno:3已经在体内模型中表现出消炎功效。这表明，免疫系统的调节通过bip特异性活性解决了慢性炎症，从而避免了普遍免疫抑制作用。实例4：临床数据在所接受的治疗已失败的活动性ra患者中，来自随机安慰剂对照、剂量递增的双盲i/ii期临床试验的结果表明，本发明的蛋白质是安全的。此外，生物标志物分析表现出相当大的消炎活性以及临床益处(参见kirkhamb、chaabok、hallc、garroodt、mantt、allene等人，《类风湿性关节炎的i/iia期ragula临床试验中的如生物标志物变化所指示的免疫球蛋白结合蛋白的安全性和患者对其的应答(safetyandpatientresponseasindicatedbybiomarkerchangestobindingimmunoglobulinproteininthephasei/iiaragulaclinicaltrialinrheumatoidarthritis)》，《风湿病学(rheumatology)》，2016；55:1993–2000。)将二十四个对一种或多种疾病改良性抗风湿药物(dmard)的治疗无应答的活动性ra患者依次分为三组，将每组八个患者随机分配以接受安慰剂(两个患者)或根据本发明的seqidno:3(六个患者)，剂量为1、5或15mg。患者在1小时内接受单次i.v.输注，并作为住院患者观察过夜。在接下来的12周中，通过针对安全性、功效(das28-esr)和生物标志物分析的随访临床和实验室评估对患者进行监测。安全性没有观察到输液反应或严重的不良药物反应。不良事件平均分布在没有药物相关毒性的安慰剂和活性组之间。血液、肾脏和代谢参数未表现出药物相关毒性。功效疾病活动性评分(das28)已被开发成用于临床试验和实践的动态评估工具以及治疗性应答量度。das28-esr使用以下疾病指标：100mm视觉模拟量表上的关节压痛计数(28个关节)、关节肿胀计数(28个关节)、红细胞沉降率(esr)和患者报告的一般健康状况，参见prevoo,ml等人，《关节炎与风湿病(arthritisrheum)》，1995；38:44-8。主要功效终点是das28-esr应答，根据eular应答标准分为良好、中度和无应答，其中缓解被定义为das28-esr小于2.6(kirkhamb、chaabok、hallc、garroodt、mantt、allene等人，《类风湿性关节炎的i/iia期ragula临床试验中的如生物标志物变化所指示的免疫球蛋白结合蛋白的安全性和患者对其的应答(safetyandpatientresponseasindicatedbybiomarkerchangestobindingimmunoglobulinproteininthephasei/iiaragulaclinicaltrialinrheumatoidarthritis)》，《风湿病学(rheumatology)》，2016；55:1993–2000)。生物学功效终点是crp(图12)、il-8和vegf(图13)的变化，参见下文的进一步讨论。通常使用这些来在类风湿性关节炎治疗的临床药物试验中监测疾病活动性。在临床上，良好的eular应答在用较高剂量的seqidno:3治疗的那些患者中更普遍，其中在接受seqidno:3的三个患者中观察到持续的低das28评分(3至12周)，而作为比较，在接受安慰剂的患者中却没有观察到，但是在所有治疗组中均获得了良好的das28-esr应答。血清vegf和il-8浓度图13示出了通过luminex技术(bio-rad，赫默尔亨普斯特德，英国)测量的在2周或12周时每个患者在存在seqidno:3的情况下的vegf或il-8的血清水平相较于输注前基线的变化。本分析仅包含12周时仍在研究中的患者(图13)。事实证明，crp、vegf和il-8的分析可用于区分接受活性药物(相较于安慰剂)的受试者。与安慰剂和无应答者组相比，对seqidno:3做出应答的患者在2周时表现出crp的显著降低(输注前水平为12.7±1.7，而输注后2周水平为7.1±2.1；p＝0.02)。血清vegf和il-8是临床试验中常用的生物标志物，因为它们分别与滑膜炎和单核细胞浸润的测量密切相关。这些生物标志物的水平的显著变化发生在接受seqidno:3的患者组中。此外，生物标志物不支持安慰剂患者的临床改善。令人惊讶的是，与seqidno:3应答者组(分别为患者71％和83％)相比，在12周时，较少的接受安慰剂的患者表现出血清vegf和il-8的降低(分别为17％和50％)。有趣的是，甚至seqidno:3无应答者组也表现出血清浓度的降低(分别为患者的66％和83％)，这表明了其疾病的病理的改变。总而言之，活性应答患者表现出输注2周后的crp的血清浓度(图12)相较于输注前水平以及vegf和il-8的血清浓度(图13)相较于安慰剂组的显著降低。这指示，所述疾病炎症远小于输注前水平。实例5：seqidno:3上调调节性t细胞上的cd39按以下方式在培养物中建立来自ra患者的外周血单核细胞：未经刺激(空心条)；或用seqidno:1(10μg/ml)(斜线条)或seqidno:3(10μg/ml)(黑色条，图14)。在24小时、48小时或72小时后，从培养物取出细胞，并用一组cd45、cd3、cd4、cd25、cd127和cd39的荧光染料缀合抗体染色。在facscanto流式细胞仪(bdbiosciences)上分析细胞。图14中的结果被针对以下表达为平均荧光强度(mfi)：(a)在使用多个活门进入活、cd45+、cd3+、cd4+细胞之后的cd25hi和cd127lo细胞；(b)(a)中cd45+cd3+cd4+cd25hicd127lo群体上的cd39的表达。(c)将pbmc(106/ml)在培养物中用seqidno:1(10或0.1μg/ml)或根据本发明的seqidno:3(10或0.1μg/ml)预处理96小时，洗涤并加入新鲜的自体cfse染色(细胞质染料羧荧光素二乙酸酯琥珀酰亚胺酯)t细胞中，并且用抗cd3和抗cd28抗体包被磁珠刺激。预处理t细胞与应答t细胞的比例为1:10。3天后，使用cellquest软件在facscalibur上分析细胞的cfsemfi降低。随着细胞增殖，cfse的含量会因每次分裂而降低，而未增殖的细胞会保持高度染色。(d)在临床试验中，监测来自安慰剂和seqidno:3治疗的类风湿性关节炎患者(应答者(r)或无应答者(nr))的全血样品中的treg细胞(活、cd45+cd3+cd4+cd25hicd127lo)上的cd39表达在12周内的变化。结果被表达为在指示时间点处的细胞表面表达相较于输注前的变化％。seqidno:1和根据本发明的seqidno:3之间的体外比较表明，尽管treg数的实际增加很低，因此证实了先前对seqidno:1的研究，但是在直接与seqidno:1比较时，在seqidno:3的情况下存在treg上的cd39表达％的较大差异。有趣的是，在72小时时，来自seqidno:1培养物的treg上的cd39表达低于对照细胞。在临床中，观察到来自对seqidno:3做出应答的患者的treg细胞上的cd39表达的显著增加，并且这在输注后维持了12周。实例6：seqidno:3抑制破骨细胞分化信号转导途径为了研究seqidno:1和seqidno:3抑制破骨细胞生成的潜在机制，我们分析了已知对于破骨细胞分化必不可少的特异性细胞因子信号转导和下游信号转导途径。人外周血源m-csf依赖性破骨细胞前体中的cd115/c-fms和rank(分别为m-csf和rankl的受体)的流式细胞术分析表明，seqidno:3将cd115的表达下调63±16％(抑制范围，43-79％)(图15a)。seqidno:1类似地将rank蛋白表达抑制51±29％(抑制范围，22–90％)(图15b)。在mrna水平上也观察到了c-fms和rank表达的抑制，因为qpcr分析表现出c-fms和rankrna的显著降低(图15c)。为了解决受体表达的降低是否导致对破骨细胞生成细胞因子的应答性降低，我们分析了seqidno:1处理对rankl依赖性mapk信号转导的影响。与未处理的细胞相比，用seqidno:1预处理人pbmc源破骨细胞前体显著地抑制了rankl诱导的erk和p38磷酸化(图15d)。使用m-csf依赖性鼠骨髓源破骨细胞前体获得了相似的结果(数据未示出)。晚期培养物中的rankl应答性的进一步检查类似地表明，在seqidno:1处理之后，rankl诱导的perk水平在富含成熟破骨细胞的培养物中也被减弱(图15e)。接下来，我们研究了seqidno:1对转录因子c-fos和nfatc1的表达的影响，所述转录因子对于破骨细胞分化至关重要，并且位于破骨细胞前体和单核细胞中的rank和tnfα信号转导的下游。将人破骨细胞前体与seqidno:1进行预先温育，大大降低了rankl处理之后的c-fos蛋白的激活(图15f)。当与对照细胞裂解物相比时，c-fos靶基因nfatc1的rankl刺激在用seqidno:1处理的破骨细胞前体中被类似地阻断(图15f)。用seqidno:1处理的成熟破骨细胞培养物还表现出c-fos和nfatc1转录因子的内源性表达的显著降低(图15f)。由于seqidno:1抑制了单核细胞向破骨细胞分化所需的信号转导途径，因此我们研究了seq3是否对nf-kb具有类似的作用，所述nf-kb是驱动炎症的转录因子之一，但rank-rankl需要替代途径来驱动下游分化。成像流式细胞术表明，seqidno:3处理抑制了破骨细胞前体中的tnfα诱导的p65nf-κb的核转位(图16a)。响应于rankl刺激获得了相似的结果(数据未示出)。由于rankl还经由非经典nf-κb途径刺激细胞，因此我们研究了在rankl刺激之后的p52nf-κb的核转位。共聚焦显微镜检查和图像分析表明，尽管rankl刺激了未处理的细胞中的p52的有效核转位，但是这被seqidno:3预处理所抑制(图16b)。这些结果表明，在tnfα和rankl处理之后，seqidno:3阻断单核细胞和破骨细胞前体中的经典和非经典nf-κb信号转导。综上所述，这些数据表明，用seqidno:3处理单核细胞和破骨细胞前体减少了m-csf和rankl诱导的信号转导以及基本破骨细胞转录因子nf-κb、c-fos和nfatc1的激活，从而提供对seqidno:3抑制破骨细胞分化和吸收活性的机制的见解。本数据提供了seqidno:3可以用于治疗骨代谢失调的疾病的证据。实例7在用seqidno:3或安慰剂治疗之后，使用所刺激的pbmc培养物来测量患者的免疫应答，以检测对最大刺激、抗cd3和抗cd28抗体包被磁珠(3天培养)(图17a)或对回忆抗原、结核菌素ppd(5天培养)(图17b)的t细胞应答。通过增殖细胞在培养的最后24小时内对氚化胸腺嘧啶的摄取来测量激活。数据表明，在临床试验的12周内，对丝裂原或回忆抗原的应答无变化。这指示，seqidno:3没有整体免疫抑制作用，这不同于seqidno:1，其已被公开为降低对结核菌素ppd的回忆抗原应答(corrigallvm、bodman-smithmd、brunstm、cornellh、panayigs，《应激蛋白bip刺激人外周血单核细胞表达消炎细胞因子谱并抑制抗原呈递细胞功能：与炎性关节炎的治疗的相关性(thestressprotein,bip,stimulateshumanperipheralbloodmononuclearcellstoexpressananti-inflammatorycytokineprofileandtoinhibitantigenpresentingcellfunction:relevancetothetreatmentofinflammatoryarthritis)》，《关节炎与风湿病(arthritisrheum)》，2004；50:1167–1171)。实例8：移植；皮肤移植物小鼠模型图18示出了鼠皮移植实验的方案和结果的示意图：在移植前八天，向所有受体小鼠施用抗cd8抗体以消耗内源性树突细胞。四组中的每组有6个小鼠。在移植前七天，对照小鼠仅接受媒剂。静脉内施用seqidno:3(20μg/小鼠)。另外两个小组接受来自h2kb匹配小鼠的未成熟或成熟浆细胞样树突细胞。1周后，将来自h2kd错配小鼠的尾巴的小块皮肤移植到受体小鼠的背部。通过kaplanmeier图进行的移植物存活分析表明，seqidno:3使5/6的移植物的存活超出了对照组的存活，其中50％移植物的存活时间比对照小鼠移植物长大约30％。所呈现的数据表明，seqidno:3在皮肤移植物小鼠模型中有效维持了移植物存活，据称所述皮肤移植物小鼠模型非常难以维持移植物存活。还进行了第二移植探索性实验(参见图19)。与被给予修饰树突细胞(dc)的那些动物相比，seqidno:3施用再次导致皮肤移植物的更长的存活。将dc施用与seqidno:3混合没有益处。实例9：假体关节松动在假体松动时，假体关节周围发育的组织，即假体周围组织与在ra期间会发炎的滑膜非常相似。这种组织可能导致假体关节的松动。在翻修手术期间收集假体周围组织(ppt)以进行假体关节置换。将组织切成相等重量的小块，并在存在或不存在seqidno:3的情况下在二十四孔板中的组织培养基(1ml)中培养过夜。在24小时-72小时之间收集培养物上清液，并且通过商业酶联免疫吸附测定(elisa)(pharmingen,bd，牛津，英国)对tnfα促炎性细胞因子或白介素-10消炎细胞因子进行定量。图20示出了尽管本发明的蛋白质对tnfα的生产几乎没有影响，但是il-10显著增加。发明人提供的数据表明，seqidno:3具有显著的消炎作用。这指示，seqidno:3可以用于治疗炎性肠病，例如克罗恩氏病。实例10表4和5总结了本发明的蛋白质、seqidno:1和天然bip之间的物理和功能差异。这清楚地总结了本发明的蛋白质、先前公开的重组bipseqidno:1和天然蛋白质之间的显著差异。表4小鸡胶原蛋白模型改善严重关节炎n＝1；**临床试验中的das28的减少，cia＝胶原诱导的关节炎表5当前第1页12