用于结合CD38的肽配体的制作方法

本发明涉及作为cd38的高亲和力结合剂的肽配体。本发明还包括包含与一个或多个效应物和/或官能团缀合的所述肽的药物缀合物，包含所述肽配体和药物缀合物的药物组合物，以及所述肽配体和药物缀合物在预防、抑制或治疗cd38介导的疾病或病症中的用途。具体地，本发明涉及这种类型的肽配体，其具有用于在肽和支架分子之间形成两个或更多个键的新型化学结构。
背景技术：
：不同的研究团队先前曾通过在肽的半胱氨酸残基与支架分子的合适官能团之间形成两个或多个硫醚键，将肽束缚在支架部分上。例如，在wo2004/077062和wo2006/078161中公开了通过将含半胱氨酸的肽连接至分子支架例如三(溴甲基)苯来产生候选药物化合物的方法。利用半胱氨酸硫醇产生共价硫醚键以实现环化的优点在于它们的选择性和双正交反应性。含硫醇的线性肽可与硫醇反应性支架化合物例如1,3,5三溴甲基苯(tbmb)环化以形成双环肽，所得产物在苄基位置上包含三个硫醚。线性肽与tbmb形成具有硫醚键的环状双环肽的整体反应示于图1中。需要一种将肽偶联到支架部分以形成环状肽结构的替代化学方式，其采用硫醚部分的合适替代物，从而实现与不同肽的相容性、物化性质的改变(如改善的溶解度)、生物分布的改变和其他优点。wo2011/018227描述了用于改变第一肽配体或第一组肽配体(其中每个肽配体包含至少两个由环序列隔开的与分子支架共价连接的反应基团，所述分子支架与所述反应基团形成共价键)的构象以产生第二肽配体或第二组肽配体的方法，所述方法包括从所述第一衍生物或第一组衍生物的肽和支架组装所述第二衍生物或第二组衍生物，加上以下步骤之一：(a)改变至少一个反应基团；或(b)改变分子支架的性质；或(c)改变至少一个反应基团与分子支架之间的键；或(a)、(b)或(c)的任意组合。我们早先于2017年12月20日提交的未决申请pct/ep2017/083953和pct/ep2017/083954描述了双环肽，其中与支架分子连接的一个或多个硫醚键已被烷基氨基键取代。cd38是带有长c-端胞外域和短n-端胞质域的45kdii型跨膜糖蛋白。cd38蛋白是双功能胞外酶，其可催化nad+转化成环adp-核糖(cadpr)并且还将cadpr水解为adp-核糖。在个体发育过程中，cd38出现在cd34+定向干细胞和淋巴样、红系和髓样细胞的谱系定型祖细胞上。cd38表达主要在淋巴谱系中持续存在，并且在t细胞和b细胞发育的不同阶段具有不同的表达水平。cd38在许多造血系统恶性肿瘤中和源自各种造血系统恶性肿瘤的细胞系中上调，所述造血系统恶性肿瘤包括非霍奇金氏淋巴瘤(nhl)、伯基特淋巴瘤(bl)、多发性骨髓瘤(mm)、b慢性淋巴细胞性白血病(b-cll)、b和t急性淋巴细胞性白血病(all)、t细胞淋巴瘤(tcl)、急性髓样白血病(aml)、毛细胞白血病(hcl)、霍奇金氏淋巴瘤(hl)和慢性髓样白血病(cml)。另一方面，造血系统中大多数的原始多能干细胞是cd38-。cd38在造血系统恶性肿瘤中的表达及其与疾病进展的相关性使得cd38成为抗体疗法的引人注目的靶标。据报道，cd38参与ca2+动员(morra等人(1998)fasebj.12；581-592；zilber等人(2000)procnatlacadsciusa97,2840-2845)，并参与淋巴和髓样细胞或细胞系中通过多种信号分子的酪氨酸磷酸化进行的信号转导，所述信号分子包括磷脂酶c-γ、zap-70、syk和c-cbl(funaro等人(1993)eurjimmunol23,2407-2411；morra等人(1998),同上；funaro等人(1990)jimmunol145,2390-2396；zubiaur等人(1997)jimmunol159,193-205；deaglio等人(2003)blood102,2146-2155；todisco等人(2000)blood95,535-542；konopleva等人(1998)jimmunol161,4702-4708；zilber等人(2000)procnatlacadsciusa97,2840-2845；kitanaka等人(1997)jimmunol159,184-192；kitanaka等人(1999)jimmunol162,1952-1958；mallone等人(2001)intimmunol13,397-409)。根据以上观察结果，cd38被提出是淋巴和髓样细胞在正常发育期间成熟和活化的重要信号分子。cd38在信号转导和造血作用中的确切作用仍不清楚，特别是因为大部分这些信号转导研究一直使用异位过表达cd38的细胞系和抗-cd38单克隆抗体(其为非生理状态的配体)。因为cd38蛋白具有产生cadpr(一种能诱导ca2+动员的分子)的酶促活性(lee等人(1989)jbiolchem264,1608-1615；lee和aarhus(1991)cellregul2,203-209)，因此已提议单克隆抗体连接cd38能够通过提高cadpr产出而在淋巴细胞中激发ca2+动员和信号转导(lee等人(1997)advexpmedbiol419,411-419)。与该设想相反，cd38蛋白的截短和点突变分析显示，其胞质尾部和其酶促活性对于抗cd38抗体所介导的信号传导均不是必须的(kitanaka等人(1999)jimmunol162,1952-1958；lund等人(1999)jimmunol162,2693-2702；hoshino等人(1997)jimmunol158,741-747)。cd38功能的最佳证据来自于cd38-/-敲除小鼠，该小鼠在其先天免疫中具有缺陷，且由于树突状细胞迀移缺陷引起t细胞依赖性体液应答降低(partida-sanchez等人(2004)immunity20,279-291；partida-sanchez等人(2001)natmed7,1209-1216)。然而，不清楚cd38在小鼠中的功能是否与cd38在人中的功能一致，因为cd38在造血过程中的表达模式在人和小鼠之间有显著不同：a)与人中的不成熟祖干细胞不同，小鼠中的类似祖干细胞表达高水平的cd38(randall等人(1996)blood87,4057-4067；dagher等人(1998)biolbloodmarrowtransplant4,69-74)，b)尽管在人b细胞发育过程中，在生发中心b细胞和浆细胞中发现了高水平的cd38表达(uckun(1990)blood76,1908-1923；kumagai等人(1995)jexpmed181,1101-1110)，但在小鼠中，cd38在相应细胞中的表达水平较低(oliver等人(1997)jimmunol158,1108-1115；ridderstad和tarlinton(1998)jimmunol160,4688-4695)。在文献中已描述了若干种抗人cd38抗体，其对各种肿瘤细胞和细胞系具有不同的增殖特性。例如，在来自mm患者或正常个体的外周血单个核效应细胞存在的情况下，具有小鼠fab和人igg1fc的嵌合okt10抗体介导非常有效地针对淋巴细胞的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(adcc)(stevenson等人(1991)blood77,1071-1079)。cdr移植的人源化版本抗cd38抗体at13/5已经显示具有针对cd38阳性细胞系具有有效的adcc活性(美国专利申请no.09/797,941)。人单克隆抗cd38抗体已经显示通过adcc和/或补体依赖性细胞毒性(cdc)介导对cd38阳性细胞系的体外杀伤，并延迟携带mm细胞系rpmi-8226(wo2005/103083)的scid小鼠中的肿瘤生长。另一方面，若干种抗cd38抗体、ib4、sun-4b7和okt10而非ib6、at1或at2诱导正常个体的外周血单个核细胞(pbmc)增殖(ausiello等人(2000)tissueantigens56,539-547)。现有技术中的一些抗体已经显示能够在cd38+b细胞中激发凋亡。然而，这些抗体仅在存在基质细胞或基质细胞衍生的细胞因子的情况下才能发挥这样的作用。拮抗性抗cd38抗体(ib4)已被报道防止人生发中心(gc)b细胞的凋亡(zupo等人(1994)eurjimmunol24,1218-1222)，并诱导kg-1和hl-60aml细胞的增殖(konopleva等人(1998)jimmunol161,4702-4708)，但诱导jurkatt成淋巴细胞的凋亡(morra等人(1998)fasebj12,581-592)。另一种抗cd38抗体t16诱导不成熟淋巴细胞和来自all患者的白血病成淋巴细胞的凋亡(kumagai等人(1995)jexpmed181,1101-1110)，以及来自aml患者的白血病成髓细胞的凋亡(todisco等人(2000)blood95,535-542)，但t16仅在存在基质细胞或基质细胞衍生的细胞因子(il-7、il-3、干细胞因子)的情况下诱导凋亡。我们早先于2018年1月15日提交的未决申请gb1800610.6描述了对il-17具有高结合亲和力的双环肽配体。这些申请进一步描述了肽配体与治疗剂的缀合物，具体是与细胞毒性剂的缀合物。技术实现要素：本发明的发明人已发现，通过烷基氨基键取代对cd38具有亲和力的环状肽中的硫醚键，得到显示出与全部使用硫醚键制备的相应缀合物相似的cd38亲和力的环状肽缀合物。预期用烷基氨基键取代硫醚键将使根据本发明的缀合物有改善的溶解度和/或改善的氧化稳定性。因此，在第一方面，本发明提供cd38特异性的肽配体，其包含多肽和分子支架，所述多肽包含三个选自半胱氨酸、l-2,3-二氨基丙酸(dap)、n-β-烷基-l-2,3-二氨基丙酸(n-alkdap)和n-β-卤代烷基-l-2,3-二氨基丙酸(n-halkdap)的残基，条件是所述三个残基中的至少一个选自dap、n-alkdap或n-halkdap，所述三个残基被至少两个环序列隔开，肽通过多肽的dap或n-alkdap或n-halkdap残基经共价烷基氨基键以及通过多肽的半胱氨酸残基(当所述三个残基包括半胱氨酸时)经硫醚键与支架连接，从而在分子支架上形成两个多肽环。合适地，肽配体包括选自以下的氨基酸序列：ci-x1-cii-x2-ciii其中：ci、cii和ciii独立地为半胱氨酸、l-2,3-二氨基丙酸(dap)、n-β-烷基-l-2,3-二氨基丙酸(n-alkdap)或n-β-卤代烷基-l-2,3-二氨基丙酸(n-halkdap)，条件是ci、cii和ciii中的至少一个是dap、n-alkdap或n-halkdap；且x1和x2表示半胱氨酸、dap、n-alkdap或n-halkdap残基之间的氨基酸序列，其中x1和x2各自独立地为3-9个氨基酸残基的环序列。根据本发明的各种具体肽配体的氨基酸序列在所附权利要求中限定。可以看出，本发明的衍生物包含通过至少一个烷基氨基键(与n-halkdap残基的dap或n-alkdap键合)和至多两个硫醚键(与半胱氨酸键合)与支架偶联的肽环。n-alkdap和n-halkdap中的前缀“alkyl”(“烷基”)是指具有1-4个碳原子的烷基，优选甲基。前缀“卤代”在此上下文中以其正常含义使用，表示具有一个或多个(合适地为一个)氟代、氯代、溴代或碘代取代基的烷基。当存在半胱氨酸时，硫醚键在形成环肽期间提供锚，如下文进一步解释的。在这些实施方案中，硫醚键合适地是双环肽缀合物的中心键，即在肽序列中，形成肽中的烷基氨基键的两个残基与形成硫醚键的半胱氨酸残基隔开并位于其两侧。在这些优选的实施方案中，环状肽结构因此是具有中心硫醚键和两个外周烷基氨基键的双环肽缀合物。在替代实施方案中，硫醚键位于肽的n-末端或c-末端，中心键和另一末端键选自dap、n-alkdap或n-halkdap。在本发明的实施方案中，ci、cii和ciii中的所有三个可以为dap或n-alkdap或n-halkdap。在这些实施方案中，本发明的肽配体合适地是具有中心烷基氨基键和两个外周烷基氨基键的双环缀合物，该肽形成共用中心烷基氨基键的两个环。在这些和其他实施方案中，ci、cii和ciii合适地选自n-alkdap或n-halkdap，最合适地为n-alkdap，因为与烷基化dap的反应动力学良好。合适地，本发明的肽配体是人、小鼠和狗cd38的高亲和力结合物，尤其合适地为人cd38的高亲和力结合物。合适地，与cd38的结合亲和力ki小于约1000nm，小于约500nm，小于约100nm，小于约50nm，或小于约25nm。在本说明书的上下文中的结合亲和力是指通过下述方法测定的结合亲和力。合适地，支架包含(杂)芳香族或(杂)脂环族部分，尤其是下文进一步定义的tbmb或tata。在其他方面，本发明提供药物缀合物，其包含与一个或多个效应物和/或官能团(如细胞毒性剂或金属螯合剂)缀合的本发明的肽配体。合适地，缀合物具有通过可断裂键(如二硫键或缬氨酸-瓜氨酸键)与肽配体连接的细胞毒性剂。合适地，细胞毒性剂选自dm1或mmae。根据本发明的其他方面，提供一种药物组合物，其包含与一种或多种药学上可接受的赋形剂组合的如本文定义的肽配体或药物缀合物。根据本发明的其他方面，提供如本文定义的肽配体或药物缀合物用于预防、抑制或治疗由cd38介导的疾病或病症。附图说明图1显示表现出特异性结合cd38的参考双环肽配体的示意性结构；图2显示根据本发明的第一双环肽配体的示意性结构；图3显示根据本发明的第二双环肽配体的示意性结构；图4显示根据本发明的第三双环肽配体的示意性结构。图5显示根据本发明的第四双环肽配体的示意性结构；图6显示根据本发明的第五双环肽配体的示意性结构；图7显示根据本发明的第六双环肽配体的示意性结构；图8显示根据本发明的第七双环肽配体的示意性结构。具体实施方式除非另外定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语具有与本领域(如肽化学、细胞培养和噬菌体展示、核酸化学和生物化学领域)普通技术人员通常理解的含义相同的含义。使用标准技术用于分子生物学、遗传学和生物化学方法(参见sambrook等人，molecularcloning:alaboratorymanual，第3版，2001，coldspringharborlaboratorypress，coldspringharbor，ny；ausubel等人，shortprotocolsinmolecularbiology(1999)第4版，johnwiley&sons，inc.)，其并入本文以作参考。本发明提供如权利要求1所述的环状肽结构，其包含夹在(subtendedbetween)分子支架上三个键之间的两个肽环，中心键是两个环共有的。中心键是与肽的半胱氨酸残基形成的硫醚键，或者是与肽的dap或n-alkdap或n-halkdap残基形成的烷基氨基键。两个外侧键合适地是与肽的dap或n-alkdap或n-halkdap残基形成的烷基氨基键，或者外侧键之一可以是与肽的半胱氨酸残基形成的硫醚键。在一个实施方案中，本发明的肽配体与鼠、狗、食蟹猴和人cd38完全交叉反应。合适地，当通过本文所述的方法确定时，对人cd38的结合亲和力ki小于约1000nm、小于约500nm、小于约250nm、小于约100nm、或小于约50nm。根据本发明的各种具体肽配体的氨基酸序列在所附权利要求中限定。当提及本发明的双环肽化合物内的氨基酸残基位置时，因为不变，故将半胱氨酸/dap残基(ci、cii和ciii)从编号中省略，因此，代表性双环化合物内的氨基酸残基编号如下提及：-ci-l1-d2-h3-m4-e5-cii-r6-g7-d8-m9-d10-ciii-合适地，肽可以与tbmb(1,3,5-三(溴甲基)苯)或1,1',1”-(1,3,5-三嗪烷-1,3,5-三基)三丙-2-烯-1-酮(tata)环化，并产生三取代的结构。与tbmb和tata的环化发生在ci、cii和ciii。应理解，如本文所定义的肽配体的修饰衍生物也在本发明的范围内。这种合适的修饰衍生物的示例包括选自以下的一种或多种修饰：n-末端和/或c-末端修饰；用一个或多个非天然氨基酸残基取代一个或多个氨基酸残基(例如用一个或多个电子等排或等电子氨基酸取代一个或多个极性氨基酸残基；用其他非天然电子等排或等电子氨基酸取代一个或多个非极性氨基酸残基)；添加间隔基团；用一个或多个抗氧化氨基酸残基取代一个或多个氧化敏感氨基酸残基；用丙氨酸取代一个或多个氨基酸残基，用一个或多个d-氨基酸残基取代一个或多个l-氨基酸残基；双环肽配体内的一个或多个酰胺键的n-烷基化；用替代键取代一个或多个肽键；肽骨架长度修饰；用另一化学基团取代一个或多个氨基酸残基的α-碳上的氢，用适当的胺、硫醇、羧酸和苯酚反应试剂修饰氨基酸(如半胱氨酸、赖氨酸、谷氨酸/天冬氨酸和酪氨酸)，以官能化所述氨基酸，和引入或取代带来适于官能化的正交反应性的氨基酸，例如带有叠氮基或炔基的氨基酸，其分别允许用带有炔或叠氮的部分进行官能化。在一个实施方案中，修饰的衍生物包含n-末端和/或c-末端修饰。在其他实施方案中，其中修饰的衍生物包含利用合适的氨基反应性化学的n-末端修饰，和/或利用合适的羧基反应性化学的c-末端修饰。在其他实施方案中，所述n-末端或c-末端修饰包括添加效应基团，包括但不限于细胞毒性剂、放射性螯合剂或发色团。在一实施方案中，n-末端修饰包括添加分子间隔基团，其促进效应基团的缀合和双环肽对其靶标的效力的保留。间隔基团合适地是含有约5至约30个氨基酸的寡肽基团，如ala、g-sar10-a或bala-sar10-a基团。在一个实施方案中，间隔基团选自bala-sar10-a。就本说明书的目的而言，将双环核心序列的n-末端或c-末端延伸部分添加到序列的左侧或右侧，以连字符隔开。例如，n-末端βala-sar10-ala尾部将表示为：βala-sar10-a-(seqidno：x)在一个实施方案中，修饰的衍生物包括用一个或多个非天然氨基酸残基取代一个或多个氨基酸残基。在此实施方案中，可以选择具有电子等排/等电子侧链的非天然氨基酸，其既不被降解蛋白酶识别，也不对靶效力具有任何不利影响。或者，可以使用具有受限制的氨基酸侧链的非天然氨基酸，使得附近肽键的蛋白水解在构象上和空间上受阻。具体地，这些涉及脯氨酸类似物、庞大的侧链、c□-二取代的衍生物(例如，氨基异丁酸、aib)和环氨基酸，简单的衍生物是氨基-环丙基羧酸。在其他实施方案中，非天然氨基酸残基选自：1-萘基丙氨酸；2-萘基丙氨酸；环己基甘氨酸，苯基甘氨酸；叔丁基甘氨酸；3,4-二氯苯基丙氨酸；环己基甘氨酸；和高苯基丙氨酸。在再其他的实施方案中，非天然氨基酸残基选自：1-萘基丙氨酸；2-萘基丙氨酸和3,4-二氯苯基丙氨酸。与未修饰的野生型序列相比，这些取代使亲和力增强。在再其他的实施方案中，非天然氨基酸残基选自：1-萘基丙氨酸。与野生型相比，这种取代提供最大水平的亲和力增强(大于7倍)。在一个实施方案中，修饰的衍生物包括用一个或多个抗氧化氨基酸残基取代一个或多个氧化敏感氨基酸残基。在其他实施方案中，修饰的衍生物包括用萘基丙氨酸或丙氨酸残基取代色氨酸残基。该实施方案提供了改善所得的双环肽配体的药物稳定性谱的优点。在一个实施方案中，修饰的衍生物包括用一个或多个疏水氨基酸残基取代一个或多个带电荷的氨基酸残基。在一个替代实施方案中，修饰的衍生物包括用一个或多个带电荷的氨基酸残基取代一个或多个疏水氨基酸残基。带电荷与疏水氨基酸残基的正确平衡是双环肽配体的重要特征。例如，疏水氨基酸残基影响血浆蛋白结合的程度，从而影响血浆中游离的可用部分浓度，而带电荷的氨基酸残基(具体是精氨酸)可影响肽与细胞表面上的磷脂膜的相互作用。这两者组合可以影响肽药物的半衰期、分布体积和暴露，并且可以根据临床终点进行定制。此外，带电荷氨基酸残基与疏水氨基酸残基的正确组合和数量可以减少注射部位的刺激(如果肽药物已皮下施用)。在一个实施方案中，修饰的衍生物包括用一个或多个d-氨基酸残基取代一个或多个l-氨基酸残基。据信该实施方案通过空间位阻以及通过d-氨基酸使□-转角构象稳定的倾向来增加蛋白水解稳定性(tugyi等人(2005)pnas,102(2),413–418)。在本文定义的所有肽序列中，一个或多个酪氨酸残基可以被苯丙氨酸取代。已经发现，这在碱催化的肽与支架分子偶联期间改善双环肽产物的产率。在一个实施方案中，修饰的衍生物包括去除任意氨基酸残基和用丙氨酸取代。该实施方案提供了去除潜在的蛋白水解攻击位点的优点。应注意，上述每个修饰用于有意地改善肽的效力或稳定性。可以通过以下机制实现基于修饰的进一步的效力改善：-引入疏水部分，其利用疏水效应并降低解离速率，从而获得更高的亲和力；-引入带电荷的基团，其利用长程离子相互作用，导致更快的结合速率和更高的亲和力(参见例如schreiber等人,rapid,electrostaticallyassistedassociationofproteins(1996),naturestruct.biol.3,427-31)；和-向肽中引入额外的限制，例如通过正确地限制氨基酸的侧链使得在靶标结合时熵的损失最小，限制骨架的扭转角使得在靶标结合时熵的损失最小，以及出于同样的原因在分子中出引入额外的环化。(综述参见gentilucci等人,curr.pharmaceuticaldesign,(2010),16,3185-203,和nestor等人,curr.medicinalchem(2009),16,4399-418)。本发明包括所有药学上可接受的(放射性)同位素标记的本发明化合物，即其中一个或多个原子被具有相同原子序数但原子质量或质量数不同于通常在自然界中发现的原子质量或质量数的原子取代的化合物，和其中附接金属螯合基团(称为“效应物”)能够保持相关的(放射性)同位素的化合物，以及其中某些官能团被相关的(放射性)同位素或同位素标记的官能团共价取代的化合物。适合包含在本发明化合物中的同位素的示例包括氢的同位素，如2h(d)和3h(t)；碳，如11c，13c和14c；氯，如36cl；氟，如18f；碘，如123i，125i和131i；氮，如13n和15n；氧，如15o，17o和18o；磷，如32p；硫，如35s；铜，如64cu；镓，如67ga或68ga；钇，如90y和镥，如177lu；以及铋，如213bi。某些同位素标记的本发明化合物，例如引入放射性同位素的那些化合物，可用于药物和/或底物组织分布研究，并用于临床评估患病组织(如肿瘤和其他部位)上cd38靶标的存在和/或不存在。本发明的化合物还可具有有价值的诊断性质，在于它们可用于检测或鉴定标记化合物与其他分子、肽、蛋白质、酶或受体之间复合物的形成。检测或鉴定方法可以使用经标记试剂标记的化合物，标记试剂如放射性同位素、酶、荧光物质、发光物质(例如鲁米诺、鲁米诺衍生物、荧光素、水母发光蛋白和荧光素酶)等。鉴于其易于引入且有现成的检测手段，放射性同位素氚(即3h(t))和碳-14(即14c)特别适用于此目的。用较重的同位素如氘(即2h(d))取代可以提供某些治疗优势，这是由于更高的代谢稳定性，例如体内半衰期增加或剂量需求减少，因此在某些情况下可能是优选的。用正电子发射同位素(如11c、18f、15o和13n)取代可用于正电子发射断层扫描(pet)研究以检查靶标占有率。将同位素引入金属螯合效应基团(如64cu、67ga、68ga和177lu)中，可用于采用pet或spect成像使肿瘤特异性抗原可视化。将同位素引入金属螯合效应基团，如但不限于90y、177lu和213bi，可以提供靶向放射疗法的选择，其中具有金属螯合剂的本发明化合物将治疗性放射性核素递送至靶蛋白和作用部位。通常可以通过本领域技术人员已知的常规技术或通过与所附实施例中描述的那些类似的方法，使用适当的同位素标记的试剂代替先前使用的未标记试剂来制备同位素标记的本发明化合物。在本文的上下文中，特异性是指配体与其同源靶标(排除与靶标相似的实体)结合或以其他方式相互作用的能力。例如，特异性可以指配体抑制人酶相互作用、但不抑制来自不同物种的同源酶的能力。使用本文所述的方法，可以调节特异性，即增加或降低特异性，以使配体或多或少地能够与预期靶标的同源物或旁系同源物相互作用。特异性并不旨在与活性、亲和力(affinity)或亲合力(avidity)同义，并且配体对其靶标的作用效力(例如，结合亲和力或抑制水平)不一定与其特异性相关。如本文所用的结合活性是指从结合测定法获得的定量结合测量，例如如本文所述的。因此，结合活性是指在给定的靶标浓度下结合的肽配体的量。多特异性是结合两个或更多靶标的能力。通常，由于其构象特性，结合肽能够结合单个靶标，如抗体情况下的表位。然而，可以开发可结合两个或更多个靶标的肽；例如，如上所述的本领域已知的双特异性抗体。在本发明中，肽配体能够结合两个或更多个靶标，因此是多特异性的。适当地，其结合两个靶标，是双特异性的。结合可以是独立的，这意味着肽上对靶标的结合位点在结构上不受靶标中的一个或另一个结合的阻碍。在这种情况下，两个靶标可以独立地结合。更一般地，预期一个靶标的结合将至少部分地阻碍另一个靶标的结合。双特异性配体和具有包括两个相关靶标的特异性的配体之间存在根本区别。在第一种情况下，配体对两个靶标独立地具有特异性，并且以特定方式与每个靶标相互作用。例如，配体中的第一环可以与第一靶标结合，第二环可以与第二靶标结合。在第二种情况下，配体是非特异性的，因为它不区分两个靶标，例如与两个靶标共有的靶标表位相互作用。在本发明的上下文中，对例如靶标和直系同源物具有活性的配体可能是双特异性配体。然而，在一个实施方案中，配体不是双特异性的，但具有不太精确的特异性，使得其结合靶标和一种或多种直系同源物。通常，由于缺乏对双特异性的选择压力，未针对靶标及其直系同源物进行选择的配体不太可能是双特异性的。在提供定制的结合表面方面，双环肽中的环长度可能是决定性的，使得可以获得良好的靶标和直系同源物交叉反应性，同时保持对较不相关的同源物的高选择性。如果配体是真正的双特异性的，在一个实施方案中，配体靶特异性中的至少一种在所选择的配体中是常见的，并且该特异性的水平可以通过本文公开的方法调节。不需要共有第二或更多特异性，并且不需要是本文所述程序的主题。本发明的肽配体化合物包括与分子支架共价结合的肽、基本上由其组成或由其组成。术语“支架”或“分子支架”在本文中是指如下的化学部分，其在本发明化合物中以烷基氨基键和硫醚键(当存在半胱氨酸时)与肽键合。术语“支架分子”或“分子支架分子”在本文中是指如下的分子，其能够与肽或肽配体反应，以形成具有烷基氨基的、在某些实施方案中还具有硫醚键的本发明衍生物。因此，除了在支架部分中分子相应的反应基团(如离去基团)被与肽键合的烷基氨基和硫醚键取代以外，支架分子具有与支架部分相同的结构。在实施方案中，支架是芳香族分子支架，即包含(杂)芳基的支架。如本文所用，“(杂)芳基”意指包括芳环，例如，4至12元的芳环，如苯环。这些芳环可任选地含有一个或多个杂原子(例如n、o、s和p中的一个或多个)，如噻吩基环、吡啶基环和呋喃基环。芳环可任选被取代。“(杂)芳基”还意在包括与一个或多个其他芳环或非芳环稠合的芳环。例如，出于本申请的目的，萘基、吲哚基、噻吩并噻吩基、二噻吩并噻吩基和5,6,7,8-四氢-2-萘基(各自可任选被取代)是芳基。如上所述，芳环可以是任选取代的。合适的取代基包括烷基(可任选被取代)、其他芳基(其本身可被取代)、杂环(饱和或不饱和)、烷氧基(其意在包括芳氧基(例如，苯氧基)、羟基、醛基、硝基、胺基(例如，未取代的、或被芳基或烷基单-或二-取代)、羧酸基团、羧酸衍生物(例如羧酸酯、酰胺等)、卤素原子(例如，cl、br和i)等。合适地，支架包含三取代的(杂)芳香族或(杂)脂环族部分，例如三-亚甲基取代的(杂)芳香族或(杂)脂环族部分。(杂)芳香族或(杂)脂环族部分合适地是六元环结构，优选三取代的，使得支架具有3倍对称轴。在实施方案中，支架是三-亚甲基(杂)芳基部分，例如1,3,5-三亚甲基苯部分。在这些实施方案中，相应的支架分子合适地在亚甲基碳上具有离去基团。然后亚甲基形成如本文所定义的烷基氨基键的r1部分。在这些亚甲基取代的(杂)芳香族化合物中，芳环的电子可以在亲核取代期间使过渡态稳定。因此，例如，苄基卤化物对亲核取代的反应性比未与(杂)芳香族基团连接的烷基卤化物的反应性高100-1000倍。在这些实施方案中，支架和支架分子具有通式：其中lg代表如下文针对支架分子进一步描述的离去基团，或lg(包括形成烷基氨基的r1部分的相邻亚甲基)代表连接至本发明缀合物中的肽的烷基氨基键。在实施方案中，上述基团lg可以是卤素，例如但不限于溴原子，在这种情况下，支架分子是1,3,5-三(溴甲基)苯(tbmb)。另一种合适的分子支架分子是2,4,6-三(溴甲基)均三甲苯。其与1,3,5-三(溴甲基)苯相似，但另外含有三个与苯环连接的甲基。在该支架的情况下，额外的甲基可以与肽形成进一步的接触，因此增加了额外的结构限制。因此，与1,3,5-三(溴甲基)苯相比，实现了不同的多样性范围。用于形成通过亲核取代与肽反应的支架的另一优选分子是1,3,5-三(溴乙酰氨基)苯(tbab)：在其他实施方案中，支架是非芳香族分子支架，例如包含(杂)脂环族基团的支架。如本文所用，“(杂)脂环族”是指同环或杂环的饱和环。环可以是未取代的，或者可以被一个或多个取代基取代。取代基可以是饱和的或不饱和的、芳香族的或非芳香族的，合适的取代基的示例包括上面讨论的与烷基和芳基上的取代基有关的取代基。此外，两个或更多个环取代基可以组合形成另一个环，因此如本文所用，“环”意指包括稠环系统。在这些实施方案中，脂环族支架优选为1,1',1”-(1,3,5-三嗪烷-1,3,5-三基)三丙-2-烯-1-酮(tata)。在其他实施方案中，分子支架可具有四面体几何结构，使得编码肽的四个官能团与分子支架的反应产生不超过两种产物异构体。其他几何结构也是可能的；实际上，几乎无限数量的支架几何结构是可能的，导致肽配体多样化有更大可能性。用于形成本发明配体的肽包含dap或n-alkdap或n-halkdap残基，用于形成键合至支架的烷基氨基键。二氨基丙酸的结构与现有技术中已被用于与支架形成硫醚键的半胱氨酸的结构类似，且与其电子等排，其中半胱氨酸的末端-sh基团被-nh2取代：术语“烷基氨基”在本文中以其正常化学意义使用，表示由键合至两个碳原子的nh或n(r3)组成的键，其中碳原子独立地选自烷基、亚烷基或芳基碳原子，且r3为烷基。合适地，本发明的烷基氨基键包含与两个饱和碳原子键合的nh部分，最合适地是亚甲基(-ch2-)碳原子。本发明的烷基氨基键具有通式：s–r1–n(r3)–r2–p其中：s代表支架核心，例如(杂)芳香族或(杂)脂环族环，如下面进一步解释的；r1是c1至c3亚烷基，合适地是亚甲基或亚乙基，最合适地是亚甲基(ch2)；r2是dap或n-alkdap侧链的亚甲基；r3是h或c1-4烷基，c1-4烷基包括支链烷基和环烷基，例如甲基，其中任何烷基任选地被卤代；且p代表肽骨架，即上述键的r2部分与肽骨架中同dap或n-alkdap或n-halkdap残基的羧基碳相邻的碳原子连接。本发明的某些双环肽配体具有许多有利的性质，使得它们能够被认为是用于注射、吸入、鼻、眼、口或局部施用的合适的药物样分子。这些有利的特性包括：-物种交叉反应性。这是临床前药效学和药代动力学评估的典型要求；-蛋白酶稳定性。双环肽配体理想地应展示出对血浆蛋白酶、上皮(“膜锚定”)蛋白酶、胃和肠蛋白酶、肺表面蛋白酶、细胞内蛋白酶等的稳定性。应在不同物种之间保持蛋白酶稳定性，以便可以在动物模型中开发双环先导候选物，并有信心对人类施用；-理想的溶解度曲线。这是带电荷的亲水残基与疏水残基的比例和分子内/分子间h键的函数，其对于配制和吸收目的是重要的；和-循环中的最佳血浆半衰期。根据临床适应症和治疗方案，可能需要在急性疾病管理环境中开发双环肽用于短期暴露，或开发在循环中具有增强保留的双环肽，从而对于更慢性的疾病状态的管理是最佳的。驱动理想的血浆半衰期的其他因素是为了最大治疗效率而要求持续暴露，与由于药剂持续暴露引起的伴随毒理学。应理解，盐形式在本发明的范围内，并且对本发明肽配体的提及包括所述化合物的盐形式。本发明的盐可以通过常规化学方法由含有碱性或酸性部分的母体化合物合成，如pharmaceuticalsalts:properties,selection,anduse,p.heinrichstahl(编辑),camilleg.wermuth(编辑),isbn:3-90639-026-8,hardcover,第388页,2002年8月中描述的方法。通常，可以通过使这些化合物的游离酸或碱形式与适当的碱或酸在水中、或在有机溶剂中、或在两者的混合物中反应来制备这些盐。酸加成盐(单盐或二盐)可以使用多种酸(无机酸和有机酸)形成。酸加成盐的示例包括与选自以下的酸形成的单盐或二盐：乙酸、2,2-二氯乙酸、己二酸、藻酸、抗坏血酸(例如l-抗坏血酸)、l-天冬氨酸、苯磺酸、苯甲酸、4-乙酰氨基苯甲酸、丁酸、(+)樟脑酸、樟脑磺酸、(+)-(1s)-樟脑-10-磺酸、癸酸、己酸、辛酸、肉桂酸、柠檬酸、环拉酸、十二烷基硫酸、乙烷-1,2-二磺酸、乙磺酸、2-羟基乙磺酸、甲酸、富马酸、半乳酸、龙胆酸、葡庚糖酸、d-葡萄糖酸、葡萄糖醛酸(如d-葡萄糖醛酸)、谷氨酸(如l-谷氨酸)、α-氧代戊二酸、乙醇酸、马尿酸、氢卤酸(如氢溴酸、盐酸、氢碘酸)、羟乙基磺酸、乳酸(例如(+)-l-乳酸、(±)-dl-乳酸)、乳糖酸、马来酸、苹果酸、(-)-l-苹果酸、丙二酸、(±)-dl-扁桃酸、甲磺酸、萘-2-磺酸、萘-1,5-二磺酸、1-羟基-2-萘甲酸、烟酸、硝酸、油酸、乳清酸、草酸、棕榈酸、帕莫酸、磷酸、丙酸、丙酮酸、l-焦谷氨酸、水杨酸、4-氨基水杨酸、癸二酸、硬脂酸、琥珀酸、硫酸、丹宁酸、(+)-l-酒石酸、硫氰酸、对甲苯磺酸、十一烯酸和戊酸、以及酰化氨基酸和阳离子交换树脂。一组具体的盐由自以下酸形成的盐组成：乙酸、盐酸、氢碘酸、磷酸、硝酸、硫酸、柠檬酸、乳酸、琥珀酸、马来酸、苹果酸、羟乙基磺酸、富马酸、苯磺酸、甲苯磺酸、硫酸、甲磺酸(甲磺酸盐)、乙磺酸、萘磺酸、戊酸、丙酸、丁酸、丙二酸、葡萄糖醛酸和乳糖酸。一种具体的盐是盐酸盐。另一种具体的盐是乙酸盐。如果化合物是阴离子化合物，或具有可以是阴离子的官能团(例如，-cooh可以是-coo-)，则可以与有机或无机碱形成盐，产生合适的阳离子。合适的无机阳离子的示例包括但不限于碱金属离子如li+、na+和k+，碱土金属阳离子如ca2+和mg2+，和其他阳离子如al3+或zn+。合适的有机阳离子的示例包括但不限于铵离子(即nh4+)和取代的铵离子(例如nh3r+、nh2r2+、nhr3+、nr4+)。一些合适的取代铵离子的示例是衍生自以下的那些：甲胺、乙胺、二乙胺、丙胺、二环己胺、三乙胺、丁胺、乙二胺、乙醇胺、二乙醇胺、哌嗪、苄胺、苯基苄胺、胆碱、葡甲胺和氨丁三醇，以及氨基酸，如赖氨酸和精氨酸。常见的季铵离子的示例是n(ch3)4+。当本发明化合物含有胺官能团时，这些可以形成季铵盐，例如通过根据本领域技术人员熟知的方法与烷化剂反应。这样的季铵化合物在本发明的范围内。根据本发明，几种缀合的肽可以一起并入到相同的分子中。例如，具有相同特异性的两种这样的肽缀合物可以通过分子支架连接在一起，增加衍生物对其靶标的亲合力。或者，在另一个实施方案中，组合多种肽缀合物以形成多聚体。例如，组合两种不同的肽缀合物以形成多特异性分子。或者，可以组合三种或更多种可以相同或不同的肽缀合物以形成多特异性衍生物。在一个实施方案中，可以通过将分子支架连接在一起来构建多价复合物，所述分子支架可以相同或不同。本发明的肽配体可通过包括以下的方法来制备：提供合适的肽和支架分子；以及形成肽和支架分子之间的硫醚(当半胱氨酸存在时)和烷基氨基键。可以使用常规的固相合成从氨基酸起始材料制备用于制备本发明的肽配体的肽，其可以包括如本文所述的适当保护基团。这些制备肽的方法是本领域熟知的。合适地，肽在除-sh和用于形成烷基氨基键的胺基之外的亲核基团上具有保护基团。针对氨基酸侧链的亲核性已经进行了多项研究，按降序列出：半胱氨酸中的硫醇酯(thiolate)、赖氨酸中的胺、组氨酸和色氨酸中的仲胺、精氨酸中的胍基胺、丝氨酸/苏氨酸中的羟基、以及最后是天冬氨酸和谷氨酸中的羧酸盐。因此，在一些情况下，可能需要将保护基团应用于肽上的更亲核的基团以防止与这些基团的不希望的副反应。在实施方案中，方法包括：合成这样的肽，其在除了用于形成烷基氨基键的胺基之外，在亲核基团上具有保护基团，并且在用于形成烷基氨基键的胺基上具有第二保护基团，其中可在不同于用于其他亲核基团上的保护基团的条件下，除去用于形成烷基氨基键的胺基上的保护基团，然后在所选条件下处理肽以使用于形成烷基氨基键的胺基脱保护而不使其他亲核基团脱保护。然后进行与支架的偶联反应，然后去除剩余的保护基团，得到肽缀合物。合适地，方法包括在亲核取代反应中使具有反应侧链-sh和胺基的肽与具有三个或更多个离去基团的支架分子反应。本文的术语“离去基团”以其正常的化学意义使用，意指能够通过胺基进行亲核取代的部分。这里可以使用任何这样的离去基团，条件是其易于通过胺的亲核取代而除去。合适的离去基团是pka小于约5的酸的共轭碱。用于本发明的离去基团的非限制性示例包括卤素，如溴、氯、碘、o-甲苯磺酸酯(otos)、o-甲磺酸酯(omes)、o-三氟甲磺酸酯(otf)或o-三甲基硅烷基(otms)。亲核取代反应可以在碱的存在下进行，例如其中离去基团是常规的阴离子离去基团。本发明的发明人发现，通过适当选择用于亲核取代反应的溶剂和碱(和ph)，可以大大提高环化肽配体的产率，此外，优选的溶剂和碱不同于现有技术中仅涉及形成硫醚键的溶剂和碱的组合。具体地，本发明的发明人发现当使用三烷基胺碱时实现了改善的产率，所述三烷基胺碱即为式nr1r2r3的碱，其中r1、r2和r3独立地是c1-c5烷基，合适地是c2-c4烷基，具体是c2-c3烷基。具体合适的碱是三乙胺和二异丙基乙胺(dipea)。这些碱仅具有弱的亲核性的性质，并且认为该性质导致用这些碱观察到的较少的副反应和较高的产率。本发明的发明人进一步发现，用于亲核取代反应的优选溶剂是极性和质子溶剂，具体是含有体积比为1:10至10:1的mecn和h2o的mecn/h2o，该体积比合适地为2:10至10:2，更合适地为3:10至10:3，具体是4:10至10:4。可以将另外的结合或功能活性连接到与分子支架共价连接的肽的n或c末端。该官能团例如选自：能够结合在体内延长肽配体半衰期的分子的基团，和在体内延长肽配体半衰期的分子。这样的分子可以是例如hsa或细胞基质蛋白，并且能够结合在体内延长肽配体半衰期的分子的基团是对hsa或细胞基质蛋白特异的抗体或抗体片段。这种分子也可以是带有高分子量peg的缀合物。在一个实施方案中，官能团是结合分子，其选自包含与分子支架共价连接的肽的第二肽配体，和抗体或抗体片段。2、3、4、5或更多种肽配体可以连接在一起。这些衍生物中任何两种或多种的特异性可以相同或不同；如果它们相同，将形成多价结合结构，与单价结合分子相比，其对靶标具有增加的亲合力。此外，分子支架可以相同或不同，并且可以包夹(subtend)相同或不同数量的环。此外，官能团可以是效应基团，例如抗体fc区。可以在肽与分子支架结合之前或之后进行n或c末端的连接。因此，可以(合成地、或通过生物学衍生的表达系统)产生其中已经存在n或c末端肽基团的肽。然而，优选地，在肽与分子骨架组合形成缀合物之后，进行向n或c末端的添加。例如，芴基甲氧基羰基氯可用于在肽的n-末端引入fmoc保护基。fmoc以高亲和力结合包括hsa的血清白蛋白，并且fmoc-trp或fmoc-lys以增加的亲和力结合。可以在保留fmoc保护基团的情况下合成肽，然后通过烷基氨基与支架偶联。另一种选择是棕榈酰基部分，其也结合hsa并且例如已经用于利拉鲁肽(liraglutide)以延长该glp-1类似物的半衰期。或者，可以制备肽与支架的缀合物，然后在n-末端修饰，例如用胺和巯基反应接头n-e-马来酰亚氨基已酸)琥珀酰亚胺酯(emcs)。通过该接头，肽缀合物可以与其他肽连接，例如抗体fc片段。结合功能可以是与分子支架结合产生多聚体的另一种肽；另一种结合蛋白，包括抗体或抗体片段；或任何其他所需实体，包括血清白蛋白或效应基团，如抗体fc区。此外，额外的结合或功能活性可以直接与分子支架结合。在实施方案中，支架可以进一步包含可以结合额外活性的反应基团。优选地，该基团相对于分子支架上的其他反应基团是正交的，以避免与肽的相互作用。在一个实施方案中，可以保护反应基团，并在必要时脱保护以缀合另外的活性。因此，在本发明的其他方面提供药物缀合物，其包含与一个或多个效应物和/或官能团缀合的如本文所定义的肽配体。效应物和/或官能团可以连接到例如多肽的n或c末端，或连接到分子支架上。适当的效应基团包括抗体及其部分或片段。例如，效应基团可包括抗体轻链恒定区(cl)、抗体ch1重链结构域、抗体ch2重链结构域、抗体ch3重链结构域、或其任意组合，除此之外，还有一个或多个恒定区结构域。效应基团还可以包含抗体的铰链区(通常在igg分子的ch1和ch2结构域之间发现这种区域)。在本发明该方面的其他实施方案中，根据本发明的效应基团是igg分子的fc区。有利地，根据本发明的肽配体-效应基团包含肽配体fc融合体或由其组成，所述肽配体fc融合体具有1天或更长、2天或更长、3天或更长、4天或更长、5天或更长、6天或更长、或7天或更长的tβ半衰期。最有利地，根据本发明的肽配体包含具有1天或更长的tβ半衰期的肽配体fc融合体或由其组成。功能基团通常包括结合基团、药物、用于连接其他实体的反应基团、有助于将大环肽摄取到细胞中的官能团等。肽穿透到细胞中的能力将使肽有效针对细胞内的靶标。可以被具有穿透到细胞中能力的肽所接近的靶标包括转录因子、细胞内信号传导分子如酪氨酸激酶和参与凋亡途径的分子。能够穿透细胞的官能团包括已经添加到肽或分子支架中的肽或化学基团。如衍生自vp22、hiv-tat、果蝇的同源盒蛋白(触角蛋白)等的肽，例如，如chen和harrison,biochemicalsocietytransactions(2007)第35卷,第4部分,第821页；gupta等人，advanceddrugdiscoveryreviews(2004)第57卷9637所述。已显示有效通过质膜易位的短肽的示例包括来自果蝇触角蛋白的16个氨基酸的穿透肽(derossi等人(1994)jbiol.chem.第269卷，第10444页)、18个氨基酸的‘模型两亲性肽’(oehlke等人(1998)biochimbiophysacts第1414卷，第127页)和hivtat蛋白的富含精氨酸的区域。非肽方法包括使用可以容易地附着于生物分子的小分子模拟物或smoc(okuyama等人(2007)naturemethods第4卷第153页)。将胍基团添加到分子中的其他化学策略也增强细胞穿透(elson-scwab等人(2007)jbiolchem第282卷，第13585页)。可以将小分子量分子(如类固醇)添加到分子支架中以增强细胞的摄取。可以与肽配体连接的一类官能团包括抗体及其结合片段，如fab、fv或单结构域片段。具体地，可以使用抗体，其与能够在体内增加肽配体半衰期的蛋白结合。在一个实施方案中，根据本发明的肽配体-效应基团具有选自以下的tβ半衰期：12小时或更长、24小时或更长、2天或更长、3天或更长、4天或更长、5天或更长、6天或更长、7天或更长、8天或更长、9天或更长、10天或更长、11天或更长、12天或更长、13天或更长、14天或更长、15天或更长或者20天或更长。有利地，根据本发明的肽配体-效应基团或组合物将具有12至60小时的tβ半衰期。在其他实施方案中，其具有一天或更长的tβ半衰期。在再其他的实施方案中，其半衰期在12至26小时。在本发明的一个具体实施方案中，与环状肽缀合的官能团选自金属螯合剂，其适于络合药学相关的金属放射性同位素。当与所述放射性同位素络合时，这些效应物可以提供用于癌症疗法的有用试剂。合适的示例包括dota、nota、edta、dtpa、heha、sarar等(targetedradionuclidetherapy,todspeer,wolters/kluverlippincottwilliams&wilkins,2011)。可能的效应基团还包括酶，例如用于酶/前药疗法的羧肽酶g2，其中肽配体取代adept中的抗体。在本发明该方面的一个具体实施方案中，官能团选自药物，如用于癌症疗法的细胞毒性剂。合适的示例包括：烷化剂，如顺铂和卡铂、以及奥沙利铂、二氯甲基二乙胺、环磷酰胺、苯丁酸氮芥、异环磷酰胺；抗代谢剂包括嘌呤类似物硫唑嘌呤和巯嘌呤或嘧啶类似物；植物生物碱和萜类化合物包括长春花生物碱，如长春新碱、长春花碱、长春瑞滨和长春地辛；鬼臼毒素及其衍生物依托泊苷和替尼泊苷；紫杉类，包括紫杉醇，最初称为taxol；拓扑异构酶抑制剂包括喜树碱：伊立替康和拓扑替康，以及ii型抑制剂，包括安吖啶、依托泊苷、磷酸依托泊苷和替尼泊苷。其他药剂可包括抗肿瘤抗生素，其包括免疫抑制剂放线菌素d(用于肾移植)、多柔比星、表柔比星、博来霉素等。在根据该方面的本发明的一其他具体实施方案中，细胞毒性剂选自dm1或mmae。dm1是细胞毒性剂，其是美登素的含巯基衍生物，具有以下结构：单甲基澳瑞他汀e(mmae)是合成的抗肿瘤剂，具有以下结构：在一个实施方案中，细胞毒性剂通过可裂解的键(如二硫键)与双环肽连接。在其他实施方案中，修饰与二硫键相邻的基团以控制二硫键的阻碍，并由此控制细胞毒性剂的裂解和伴随释放的速率。已发表的工作确立了通过在二硫键的任一侧引入空间位阻来修饰二硫键对还原的易感性的潜力(kellogg等人(2011)bioconjugatechemistry,22,717)。更大程度的空间位阻降低了细胞内谷胱甘肽和细胞外(全身)还原剂的还原速率，从而降低了细胞内外由此释放毒素的难易程度。因此，通过仔细选择二硫键任一侧的阻碍程度，可以实现循环中二硫化物稳定性的最佳选择(使得毒素的不期望副作用最小化)与细胞内环境中的有效释放(使得治疗效果最大化)。通过在分子构建体的靶向实体(此处，双环肽)或毒素侧引入一个或多个甲基来调节二硫键任一侧的阻碍。因此，在一个实施方案中，细胞毒性剂选自下式的化合物：其中n代表选自1至10的整数；且r1和r2独立地代表氢或甲基。在上式化合物的一个实施方案中，n代表1，r1和r2均代表氢(即美登素衍生物dm1)。在上式化合物的替代实施方案中，n代表2，r1代表氢且r2代表甲基(即美登素衍生物dm3)。在该化合物的一个实施方案中，n代表2，r1和r2均代表甲基(即美登素衍生物dm4)。应理解，细胞毒性剂可以形成二硫键，并且在具有双环肽的缀合物结构中，通过几种可能的合成方案在硫醇-毒素和硫醇-双环肽之间引入二硫化物连接。在一个实施方案中，缀合物的双环肽组分具有以下结构：其中m代表选自0至10的整数，双环代表如本文所述的任何合适的环状肽结构；且r3和r4独立地代表氢或甲基。其中r3和r4均为氢的上式化合物被认为是不受阻碍的，并且其中r3和r4中的一个或全部代表甲基的上式化合物被认为是受阻的。应理解，上式的双环肽可以形成二硫键，并且在具有细胞毒性剂的上述缀合物结构中，通过几种可能的合成方案在硫醇-毒素和硫醇-双环肽之间引入二硫化物连接。在一个实施方案中，细胞毒性剂通过以下接头与双环肽连接：其中r1、r2、r3和r4代表氢或c1-c6烷基；毒素是指本文定义的任何合适的细胞毒性剂；双环代表如本文所述的任何合适的环状肽结构；n代表选自1至10的整数；且m代表选自0至10的整数。当r1、r2、r3和r4各自为氢时，二硫键受阻最小并且最易于还原。当r1、r2、r3和r4各自为烷基时，二硫键最受阻且最不易还原。氢和烷基的部分取代引起还原耐受性的逐渐增加，以及伴随的毒素裂解和释放。优选的实施方案包括：r1、r2、r3和r4均为h；r1、r2、r3均为h且r4＝甲基；r1、r2＝甲基，r3、r4＝h；r1、r3＝甲基，r2、r4＝h；以及r1、r2＝h，r3、r4＝c1-c6烷基。在一个实施方案中，化合物的毒素是美登素，缀合物包含下式的化合物：其中r1、r2、r3和r4如上所定义；双环代表本文定义的任何合适的环状肽结构；n代表选自1至10的整数；且m代表选自0至10的整数。在我们的公开专利申请wo2016/067035和wo2017/191460中详细描述了用于制备上述双环肽配体与毒素的缀合物的进一步细节和方法。这些申请的全部公开内容明确地并入本文以作参考。毒素和双环肽之间的接头可以包含通过叠氮化物官能化的毒素和炔官能化的双环肽结构之间(或反之亦然)的点击化学反应形成的三唑基团。在其他实施方案中，双环肽可含有通过羧酸官能化的毒素与双环肽的n-末端氨基之间的反应形成的酰胺键。毒素和双环肽之间的接头可以包含组织蛋白酶可裂解的基团，以提供靶细胞内毒素的选择性释放。合适的组织蛋白酶可裂解的基团是缬氨酸-瓜氨酸。毒素和双环肽之间的接头可以包含一个或多个间隔基团以提供所需的功能，例如，对缀合物的结合亲和力或组织蛋白酶可裂解性。合适的间隔基团是对氨基苄基氨基甲酸酯(pabc)，其可位于缬氨酸-瓜氨酸基团和毒素部分的中间。因此，在实施方案中，双环肽-药物缀合物可具有由毒素-pabc-cit-val-三唑-双环组成的以下结构：在其他实施方案中，双环肽-药物缀合物可具有由毒素-pabc-cit-val-二羧酸酯-双环组成的以下结构：其中(alk)是式cnh2n的亚烷基，其中n为1-10，可以是直链或支链的，合适地(alk)是正亚丙基或正亚丁基。用于制备根据本发明的肽配体-药物缀合物的方法的详细描述在我们于2017年12月20日提交的在先申请wo2016/067035和pct/ep2017/083954中给出，其全部内容并入本文以作参考。根据本发明的肽配体可用于体内治疗和预防应用、体外和体内诊断应用、体外测定法和试剂应用等。通常，肽配体的使用可以替代抗体的使用。根据本发明选择的衍生物在通过标准免疫组织化学程序的蛋白印记分析和原位蛋白检测中诊断使用；为了在这些应用中使用，可以根据本领域已知的技术标记所选库的衍生物。此外，当与色谱载体(如树脂)复合时，这些肽配体可以在亲和色谱步骤中用于制备。所有这些技术都是本领域技术人员所熟知的。根据本发明的肽配体具有与抗体相似的结合能力，并且可以在这种测定法中替代抗体。诊断用途包括通常抗体所得以应用的任何用途，包括测试条测定法、实验室测定法和免疫诊断测定法。根据本发明制备的肽配体的治疗和预防用途包括向受体哺乳动物(如人)施用根据本发明选择的衍生物。优选至少90％-95％同质性的基本上纯的肽配体用于施用给哺乳动物，最优选98％-99％或更高同质性用于药物用途，特别是当哺乳动物是人时。一旦纯化、部分纯化或至所需同质性，所选择的肽可用于诊断或治疗(包括体外)或开发和进行测定步骤、免疫荧光染色等(lefkovite和pernis,(1979和1981)immunologicalmethods,volumesiandii,academicpress,ny)。通常，本发明的肽配体将以纯化形式与药理学上合适的载体一起使用。通常，这些载体包括水溶液或醇/水溶液、乳液或悬浮液、包括盐和/或缓冲介质的任何载体。肠胃外运载体(vehicle)包括氯化钠溶液、林格氏右旋糖、右旋糖和氯化钠以及乳酸林格氏液。合适的生理学上可接受的佐剂(如果需要将肽复合物保持在悬浮液中)可选自增稠剂，如羧甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、明胶和藻酸盐。静脉内运载体包括液体和营养补充剂和电解质补充剂，如基于林格氏右旋糖的那些。还可以存在防腐剂和其他添加剂，如抗微生物剂、抗氧化剂、螯合剂和惰性气体(mack(1982)remington'spharmaceuticalsciences,第16版)。本发明的肽配体可以作为分开施用的组合物使用或与其他药剂联合使用。这些药剂可包括抗体、抗体片段和各种免疫治疗药物，如环孢菌素、甲氨蝶呤、阿霉素或顺铂、以及免疫毒素。药物组合物可以包括各种细胞毒性剂或其他药剂联合本发明所选的抗体、其受体或结合蛋白的“混合物”，或甚至具有不同特异性的本发明所选肽的组合，如使用不同的靶标衍生物所选择的肽，无论它们是否在施用前合并。根据本发明的药物组合物的施用途径可以是本领域普通技术人员公知的任何一种。对于治疗，包括但不限于免疫疗法，可以根据标准技术将本发明所选的抗体、受体或其结合蛋白施用至任何患者。施用可以通过任何适当的方式进行，包括肠胃外、静脉内、肌内、腹膜内、经皮、通过肺部途径、或者还可以适当地通过用导管直接输注。施用的剂量和频率将取决于患者的年龄、性别和状况、其他药物的同时施用、禁忌症(counter-indication)和临床医生应考虑的其他参数。可以冻干本发明的肽配体用于储存，并在使用前在合适的载体中重构。已经证明该技术是有效的，并且可以采用本领域已知的冻干和重构技术。本领域技术人员将理解，冻干和重构可导致不同程度的活性损失，并且可能必须向上调整使用水平以进行补偿。可以施用含有本发明肽配体或其混合物的组合物用于预防性和/或治疗性处理。在某些治疗应用中，将实现所选细胞群的至少部分抑制、压制、调节、杀伤或一些其他可衡量参数的足够量定义为“治疗有效剂量”。实现该剂量所需的量将取决于疾病的严重程度和患者自身免疫系统的一般状态，但通常范围为每千克体重0.005至5.0mg所选的肽配体，更通常使用的剂量为0.05至2.0mg/kg/剂量。对于预防性应用，含有本发明肽配体或其混合物的组合物也可以以相似或稍低的剂量施用。根据本发明的方法选择的肽配体可用于体内治疗和预防应用、体外和体内诊断应用、体外测定法和试剂应用等。具有选择的特异性水平的配体可用于涉及在需要交叉反应的非人动物中进行测试的应用中，或者用于需要小心控制与同源物或旁系同源物的交叉反应的诊断应用中。在一些应用中，例如疫苗应用，可以利用对预定范围的抗原引起免疫应答的能力来定制针对特定疾病和病原体的疫苗。优选至少90％-95％同质性的基本上纯的肽配体用于施用给哺乳动物，最优选98％-99％或更高同质性用于药物用途，特别是当哺乳动物是人时。一旦纯化、部分纯化或至所需同质性，所选择的多肽可用于诊断或治疗(包括体外)或开发和进行测定步骤、免疫荧光染色等(lefkovite和pernis,(1979和1981)immunologicalmethods,volumesiandii,academicpress,ny)。本发明的双环肽具有作为cd38结合剂的特定用途。根据本发明的其他方面，提供如本文所定义的肽配体或药物缀合物，其用于预防、抑制或治疗由cd38介导的疾病或病症。根据本发明的其他方面，提供一种预防、抑制或治疗由cd38介导的疾病或病症的方法，其包括向有此需要的患者施用如本文定义的肽配体的效应基团和药物缀合物。在一个实施方案中，cd38是哺乳动物cd38。在其他实施方案中，哺乳动物cd38是人cd38(hcd38)。在一个实施方案中，由cd38介导的疾病或病症选自癌症。可以治疗(或抑制)的癌症(及其良性对应物)的示例包括但不限于上皮起源的肿瘤(各种类型的腺瘤和癌，包括腺癌、鳞状癌、移行细胞癌和其他癌)，例如膀胱和泌尿道癌、乳腺癌、胃肠道癌(包括食管、胃(胃部的)、小肠、结肠、直肠和肛门)、肝癌(肝细胞癌)、胆囊和胆道系统癌、外分泌胰腺癌、肾癌、肺癌(例如腺癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、细支气管肺泡癌和间皮瘤)、头颈部癌(例如舌头、口腔、喉、咽、鼻咽、扁桃体、唾液腺、鼻腔和鼻旁窦癌)、卵巢癌、输卵管癌、腹膜癌、阴道癌、外阴癌、阴茎癌、子宫颈癌、子宫肌层癌、子宫内膜癌、甲状腺癌(例如甲状腺滤泡癌)、肾上腺癌、前列腺癌、皮肤和附属物癌(例如黑素瘤、基底细胞癌、鳞状细胞癌、角化棘皮瘤、发育异常痣)；血液学恶性肿瘤(即白血病、淋巴瘤)和恶变前血液病和边缘恶性肿瘤的疾病包括血液学恶性肿瘤和淋巴系统的相关病症(例如急性淋巴细胞白血病[all]、慢性淋巴细胞性白血病[cll]、b-细胞淋巴瘤如弥漫大b细胞淋巴瘤[dlbcl]、滤泡性淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、t细胞淋巴瘤和白血病、自然杀伤[nk]细胞淋巴瘤、霍奇金氏淋巴瘤、毛细胞白血病、意义未明的单克隆丙种球蛋白血症、浆细胞瘤、多发性骨髓瘤和移植后淋巴细胞增生性疾病)，以及血液学恶性肿瘤和骨髓系相关病症(例如急性髓性白血病[aml]、慢性髓性白血病[cml]、慢性髓性单核细胞白血病[cmml]、嗜酸性粒细胞增多综合征、骨髓增生性疾病如真性红细胞增多症、原发性血小板增多症和原发性骨髓纤维化、骨髓增生综合征、骨髓增生异常综合征和早幼粒细胞性白血病)；间叶细胞源的肿瘤，例如软组织、骨或软骨的肉瘤如骨肉瘤、纤维肉瘤、软骨肉瘤、横纹肌肉瘤、平滑肌肉瘤、脂肪肉瘤、血管肉瘤、卡波西肉瘤、尤因氏肉瘤、滑膜肉瘤、上皮样肉瘤、胃肠道间质瘤、良性和恶性组织细胞瘤、和隆突性皮肤纤维肉瘤；中枢或周围神经系统的肿瘤(例如星形细胞瘤、神经胶质瘤和成胶质细胞瘤、脑膜瘤、室管膜瘤、松果体瘤和神经鞘瘤)；内分泌肿瘤(例如垂体肿瘤、肾上腺肿瘤、胰岛细胞肿瘤、甲状旁腺肿瘤、类癌瘤和甲状腺髓样癌)；眼和附属器肿瘤(例如成视网膜细胞瘤)；生殖细胞和滋养细胞肿瘤(例如畸胎瘤、精原细胞瘤、无性细胞瘤、葡萄胎和绒毛膜癌)；以及儿科和胚胎肿瘤(例如成神经管细胞瘤、成神经细胞瘤、肾母细胞瘤和原始神经外胚层肿瘤)；或先天性或其他的综合症，其使患者易患恶性肿瘤(例如着色性干皮症)。在其他实施方案中，癌症选自造血系统恶性肿瘤，例如选自：非霍奇金氏淋巴瘤(nhl)、伯基特淋巴瘤(bl)、多发性骨髓瘤(mm)、b慢性淋巴细胞性白血病(b-cll)、b和t急性淋巴细胞性白血病(all)、t细胞淋巴瘤(tcl)、急性髓样白血病(aml)、毛细胞白血病(hcl)、霍奇金氏淋巴瘤(hl)和慢性髓样白血病(cml)。本文对术语“预防”的提及涉及在疾病诱发之前施用保护性组合物。“抑制”是指在诱发事件之后但在临床出现疾病之前施用组合物。“治疗”涉及在疾病症状变得明显之后施用保护性组合物。可用于筛选肽配体在保护免于疾病或治疗疾病中的有效性的动物模型系统是可得的。本发明促进动物模型系统的使用，其使得可以开发能与人和动物靶标交叉反应的多肽配体，以允许使用动物模型。参考以下实施例进一步描述本发明。实施例肽合成使用由peptideinstruments制造的symphony肽合成仪和multisyntech制造的syroii合成仪，基于fmoc化学法进行肽合成。采用标准的fmoc-氨基酸(sigma，merck)，其带有合适的侧链保护基：在每种情况下均使用适用的标准偶联条件，然后使用标准方法进行脱保护。通过hplc纯化肽，在分离后用1,3,5-三(溴甲基)苯(tbmb，sigma)进行修饰。为此，将线性肽用h2o稀释至约35ml，加入约500μl的100mmtbmb的乙腈溶液，并用5ml的1mnh4hco3的h2o溶液引发反应。反应在室温下进行约30至60分钟，一旦反应完成(通过maldi判断)时即将其冻干。冻干后，如上所述对修饰的肽进行纯化，同时用geminic18柱(phenomenex)phenomenex代替lunac8，并将酸更改为0.1％三氟乙酸。将含有正确的tmb修饰物质的纯级分合并，冻干并保持在-20℃下储存。或者，使用hplc纯化肽，在分离后用1,3,5-三丙烯酰基六氢-1,3,5-三嗪(tata，sigma)进行修饰。为此，将线性肽用50:50mecn:h2o稀释至约35ml，加入约500μl的100mmtata的乙腈溶液，然后用5ml的1mnh4hco3水溶液引发反应。使反应在室温下进行约30至60分钟，一旦反应完成(通过maldi判断)时即将其冻干。一旦完成后，在室温下向反应中加入1ml1m的l-半胱氨酸盐酸盐一水合物(sigma)水溶液持续约60分钟，以淬灭任何过量的tata。冻干后，将修饰的肽如上所述纯化，同时用geminic18柱(phenomenex)代替lunac8，并将酸更改为0.1％三氟乙酸。将含有正确的tata修饰物质的纯级分合并，冻干并保持在-20℃下储存。除非另有说明，所有氨基酸均以l-构型使用。以下非天然氨基酸前体用于制备dap和n-medap修饰的肽：化合物casmw供应商fmoc-l-dap(boc,me)-oh446847-80-9440.49irisbiotechgmbhfmoc-dap(boc)-oh162558-25-0426.46sigmaaldrichcd38竞争结合测定法使用lea等人(expertopindrugdiscov.20116(1)：17–3)报告的方法，并使用以下荧光标记的肽：对于tbmb衍生物为actpcadfpiwgca-sar6-k(fl)，对于tata衍生物为acywnpftgcytca-sar6-k(fl)(其中fl是荧光素分子)，使用荧光偏振测定法确定各种双环肽化合物对人cd38的亲和力(ki)。参考例1选择用于比较硫醚与烷基氨基支架键的第一个参考双环肽命名为bcy00009245。它是形成硫醚的肽与三亚甲基苯支架的双环缀合物，其中所述肽包含三个半胱氨酸残基。该双环衍生物的结构示意性地示于图1中。缀合之前的线性肽具有序列：[ac]acvpcadfpiwyc通过上述方法将肽与tbmb缀合。所得的命名为bcy00009245的双环衍生物显示出对cd38的高亲和力。测得的衍生物对cd38的亲和力(ki)为35nm。重复测量(n＝2)得出的平均值为27nm。实施例1-7对应于参考例1的肽配体的双环区域，制备根据本发明的双环肽配体，其中一个、两个或三个半胱氨酸残基被n-medap残基取代，其中所述n-medap残基与tbmb支架形成的烷基氨基键。这些衍生物的结构示意性地示于图2至图8中并且如表1所示：表1：cd38dap(me)取代的双环如在2017年12月20日提交的pct/ep2017/083953和pct/ep2017/083954中所更详细描述的，在作为碱的dipea的存在下，在乙腈/水的混合物中进行与tbmb的环化反应1至16小时。与参考例1的环化不同，当使用常规的nahco3作为碱时产率相对较低。测得的对cd38的亲和力(两次测量的平均值)表明，对于末端半胱氨酸ci和ciii中的一个或两个处的dap(me)取代，亲和力在很大程度上得以保留，但对于中部cii处的dap(me)取代，亲和力大大降低。其他参考例：如我们在2018年1月15日提交的在先申请gb1800610.6中所详细描述的，制备以下参考肽配体并评估其对cd38的亲和力，所述参考肽配体具有以三个硫醚键键合至指定肽序列的半胱氨酸残基的tbmb支架。表2：参考双环配体的生物测定数据预期根据本发明的上述其他参考例的衍生物(即以烷基氨基键代替参考例中的硫醚键中的一个、两个或三个)也将表现出对cd38的亲和力。因此，所有这类对cd38具有亲和力的衍生物均包括在本发明的范围内。以上说明书中提及的所有出版物均并入本文以作参考。在不脱离本发明的范围的情况下，本发明所述方面和实施方式的各种修改和变化对本领域技术人员将是显而易见的。尽管已结合具体的优选实施方式对本发明加以描述，但应理解，所主张的发明不应不适当地局限于这些具体的实施方式。实际上，对于本领域技术人员显而易见的对所描述的用于实施本发明的模式的各种修改都在所附权利要求的范围内。当前第1页12