甜味成分高含有型甜菊植物及其筛选方法与流程

1.本发明涉及甜味成分含量高的甜菊植物及其筛选方法等。


背景技术：

2.为了应对多样化的消费者需求，开发上市了各种饮料。蔗糖等糖类是以赋予甜味等目的而通常配合于饮料中的成分，但已被指出过量摄取对健康的影响，而对于更低卡路里且源自天然的甜味料的需求日益增长。例如专利文献1公开了含有维生素、高甜度甜味料以及甜味改善组合物的机能性甜味料组合物。
3.瑞鲍迪苷(rebaudioside，以下也称“reb”)作为甜菊萃取物中所含的甜味成分已为公知。甜菊萃取物由甜菊干叶萃取、精制而成。甜菊是以南美巴拉圭为原产地的菊科多年生植物，学名为stevia rebaudiana bertoni。因甜菊含有持有约砂糖300倍以上甜味的成分，因而为了萃取该甜味成分用作天然甜味料而被栽培。作为reb，被报道存在reba、rebb、rebc、rebd、rebe、rebm等各种糖苷(日本特表2012
‑
504552)。各种reb中，例如reba被评价为具有高甜度和优质甜味的甜味料而被广泛应用。关于其他的reb也正在判明具有其独特的甜度及附带的味道。
4.在这种情况下，特定的瑞鲍迪苷的含量增高的甜菊植物体已为公知(专利文献2～4)。
5.现有技术文献
6.专利文献
7.专利文献1日本特表2009
‑
517043号说明书
8.专利文献2日本特表2016
‑
515814号说明书
9.专利文献3国际申请公开公报wo2016/090460
10.专利文献4国际申请公开公报wo2018/124142


技术实现要素：

11.对于甜菊植物所含的甜味成分的需求日益增长。
12.本发明在一个方面，提供以下内容。
13.[1]一种方法，其为甜味成分高含有型甜菊植物体的筛选方法，其特征在于，包括从受试甜菊植物体的基因组中检出对应于序列号1的部分中的突变的工序。
[0014]
[2]根据[1]所述的方法，其特征在于，对应于序列号1的部分为使用选自序列号2～8的正向引物及选自序列号9～15的反向引物并由pcr扩增的受试甜菊植物的基因组部分。
[0015]
[3]根据[1]或[2]所述的方法，其特征在于，突变包括由对应于序列号1的49位的位点中的c到a的突变。
[0016]
[4]根据[1]～[3]中任一项所述的方法，其特征在于，检出突变的工序采用dcaps法或taqman pcr法来进行。
[0017]
[5]根据[1]～[4]中任一项所述的方法，其特征在于，进一步包括测定已检出突变的受试甜菊植物组织的甜味成分含量的工序。
[0018]
[6]根据[1]～[5]中任一项所述的方法，其特征在于，受试甜菊植物体属于一种分离群体，该分离群体由至少一方为以杂合形式具有对应于序列号1的部分中的突变的交配亲本获得，且甜味成分高含有型甜菊植物体所含的甜味成分含量比属于前述分离群体的全部个体的甜味成分含量的平均值高。
[0019]
[7]根据[1]～[6]中任一项所述的方法，其特征在于，甜味成分包括甜菊醇糖苷。
[0020]
[8]根据[1]～[7]中任一项所述的方法，其特征在于，甜味成分高含有型甜菊植物体为非基因重组植物体。
[0021]
[9]根据[1]～[8]中任一项所述的方法，其特征在于，受试甜菊植物体包括已进行诱变处理的甜菊植物体及其子代植物体。
[0022]
[10]一种引物对，其特征在于，包括如下正向引物和反向引物：所述正向引物包括位于3’末端的选自序列号47～70的序列和以任意选择的方式附加于前述序列的5’末端的从序列号1的28位向5’端延续的任意连续序列；所述反向引物包括与位于从序列号1的50位向3’端的任意连续的20个碱基以上的序列互补的序列。
[0023]
[11]一种试剂盒，包括[10]所述的引物对和限制酶，其特征在于，当正向引物包括序列号47时，限制酶为ddei；当正向引物包括序列号48时，限制酶为maei或spei；当正向引物包括序列号49时，限制酶为aflii或msei；当正向引物包括序列号50时，限制酶为bce83i；当正向引物包括序列号51时，限制酶为bsemii；当正向引物包括序列号52时，限制酶为bsii；当正向引物包括序列号53时，限制酶为bsphi或hpy178iii；当正向引物包括序列号54时，限制酶为sfei；当正向引物包括序列号55时，限制酶为smli；当正向引物包括序列号56时，限制酶为ecop15i；当正向引物包括序列号57时，限制酶为avai；当正向引物包括序列号58时，限制酶为bcli；当正向引物包括序列号59时，限制酶为bseri；当正向引物包括序列号60时，限制酶为cviri或psti；当正向引物包括序列号61时，限制酶为drdii；当正向引物包括序列号62时，限制酶为eco57i；当正向引物包括序列号63时，限制酶为gsui；当正向引物包括序列号64时，限制酶为hphi；当正向引物包括序列号65时，限制酶为hpy188i；当正向引物包括序列号66时，限制酶为mboii；当正向引物包括序列号67时，限制酶为pfl1108i；当正向引物包括序列号68时，限制酶为psii；当正向引物包括序列号69时，限制酶为taqi或xhoi；当正向引物包括序列号70时，限制酶为styski。
[0024]
[12]一种植物体，其为甜味成分高含有型甜菊植物体，其特征在于，在对应于序列号1的基因组部分具有突变。
[0025]
[13]根据[12]所述的植物体，其特征在于，突变包括由对应于序列号1的49位的位点中的c到a的突变。
[0026]
[14]根据[12]或[13]所述的植物体，其特征在于，其为非基因重组植物体。
[0027]
[15]一种种子、组织、干叶、组织培养物或细胞，其特征在于，为权利要求12～14中任一项所述的植物体的种子、组织、干叶、组织培养物或细胞。
[0028]
[16]根据[15]所述的组织、组织培养物或细胞，其特征在于，选自胚、分生组织细胞、花粉、叶、根、根端、花瓣、原生质体、叶切片及愈伤组织。
[0029]
[17]一种方法，其为培育甜味成分高含有型甜菊植物体的培育方法，其特征在于，
包括使[12]～[14]中任一项所述的甜菊植物体与第2甜菊植物体进行杂交的工序。
[0030]
[18]根据[17]所述的方法，其特征在于，第2植物体为[12]～[14]中任一项所述的甜菊植物体。
[0031]
[19]一种方法，其为培育甜味成分高含有型甜菊植物体的培育方法，其特征在于，包括在甜菊植物体的基因组的对应于序列号1的49位的位点导入由c到a的突变的工序。
[0032]
[20]根据[19]所述的方法，其特征在于，突变的导入通过诱变处理来进行。
[0033]
[21]一种饮食品、甜味组合物、香料或医药品的制造方法，其特征在于，包括提供[12]～[14]中任一项所述的植物体、[15]所述的种子、组织、干叶、组织培养物或细胞、或者[16]所述的组织、组织培养物或细胞的萃取物的工序，以及将前述萃取物添加于饮食品、甜味组合物、香料或医药品的原料中的工序。
[0034]
本发明具有下述1个以上的效果。
[0035]
(1)可以以低成本进行甜味成分含量高的甜菊植物的筛选。
[0036]
(2)可缩短甜味成分含量高的甜菊植物开发所需的时间。
[0037]
(3)可提高甜味成分含量高的甜菊植物开发成功率。
[0038]
(4)可提高源自甜菊植物的甜味成分的生产效率。
[0039]
(5)可降低源自甜菊植物的甜味成分的生产成本。
附图说明
[0040]
图1为表示m1代个体中的甜味成分含量的频率分布的图。纵轴表示个体数，横轴表示干叶中的甜味成分浓度(％)。
[0041]
图2为表示分离群体a的突变c49a阳性个体(c49a
+
)及阴性个体(c49a
‑
)中的甜味成分含量的分布的图。纵轴表示干叶中的甜味成分浓度(％)，虚线表示属于分离群体a的全部个体的甜味成分浓度的平均值。
[0042]
图3为表示分离群体b的突变c49a阳性个体(c49a
+
)及阴性个体(c49a
‑
)中的甜味成分含量的分布的图。纵轴表示干叶中的甜味成分浓度(％)，虚线表示属于分离群体b的全部个体的甜味成分浓度的平均值。
具体实施方式
[0043]
以下详细说明本发明。以下实施方式是用于说明本发明的例示，但本发明的宗旨并非仅限于此种实施方式。本发明在不脱离其主旨的范围内，可以以各种方式实施。
[0044]
另外，本说明书中所引用的所有文献及公开公报、专利公报、其他专利文献将作为参照并入本说明书中。此外，本说明书包含2018年7月31日申请的作为本申请优先权主张基础的日本专利申请(日本特愿2018
‑
144512号)的说明书及附图中所记载的内容。
[0045]
1.甜味成分高含有型甜菊植物体
[0046]
本发明在1个方面，提供一种甜味成分高含有型甜菊植物体(以下有时称“本发明的植物体”)，其在对应于序列号1的基因组部分具有突变。序列号1代表的碱基序列如下。
[0047]
[表1]
[0048]
表1序列号1代表的碱基序列
[0049][0050]
本发明的植物体是由野生种甜菊植物体衍生而来的物种，但发生了甜味成分含量增高的基因突变(以下有时称“本发明的突变”)。
[0051]“在对应于序列号1的基因组部分具有突变”，是指在甜菊植物体的基因组中的由序列号1的碱基序列组成的部分，或在由与序列号1实质上相同的碱基序列组成的部分具有突变。与序列号1实质上相同的碱基序列，例如是指相对于序列号1的碱基序列，具有60％以上、70％以上、75％以上、80％以上、81％以上、82％以上、83％以上、84％以上、85％以上、86％以上、87％以上、88％以上、89％以上、90％以上、91％以上、92％以上、93％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、98.1％以上、98.4％以上、98.7％以上、99％以上、99.2％以上、99.5％以上或99.8％以上的序列同一性的碱基序列。在一部分方式中，在对应于序列号1的基因组部分，含有由以下正向引物和反向引物扩增的甜菊植物体基因组部分：即与从序列号1的5’末端起15～25碱基长的部分进行杂交的正向引物，和与从序列号1的3’末端方向起15～25碱基长的部分的互补序列进行杂交的反向引物。在特定方式中，在对应于序列号1的基因组部分，含有由以下正向引物和反向引物扩增的甜菊植物的基因组部分：即具有选自序列号2～8的碱基序列的正向引物，和具有选自序列号9～15的碱基序列的反向引物。
[0052]“在基因组部分具有突变”，是指相对于甜菊植物体的指定的基因组部分的主要碱基序列(例如序列号1)有1个以上的碱基变得不同。突变包括核苷酸的缺失、取代及/或附加。此外，突变可位于基因的编码区或非编码区，当突变位于编码区时，突变可伴随或不伴随氨基酸的突变。
[0053]
在一部分方式中，突变包括在甜菊植物体的基因组中的以下位点的突变：对应于序列号16的11位的位点，对应于序列号17的21位的位点，对应于序列号18的31位的位点，对应于序列号19的41位的位点，或对应于序列号1的49位的位点。甜菊植物的基因组可具有由与序列号16、17、18、19或1同一的碱基序列所组成的部分，也可具有由对应于序列号16、17、18、19或1的碱基序列所组成的部分。在前一种情况下，突变存在于甜菊植物体的基因组中的由与序列号16、17、18、19或1同一的碱基序列所组成的部分的从5’端起11位、21位、31位、41位、或49位的核苷酸上。另一方面，在后一种情况下，由于甜菊植物体的基因组不具有由与序列号16、17、18、19或1同一的碱基序列组成的部分，所以突变不一定存在于对应于序列号16、17、18、19或1的部分的从5’端起11位、21位、31位、41位、或49位上，但考虑到序列号16、17、18、19或1的11位、21位、31位、41位或49位的前后碱基序列等，可确定甜菊植物的基因组中的对应于序列号16、17、18、19或1的11位、21位、31位、41位或49位的位点。例如，通过甜菊植物的基因组中的对应于序列号16、17、18、19或1的部分的碱基序列与序列号16、17、18、19或1的碱基序列的比对分析，可确定甜菊植物的基因组中的对应于序列号16、17、18、19或1的11位、21位、31位、41位、或49位的位点。
[0054]
在特定的方式中，突变为在甜菊植物的基因组中的以下位点的核苷酸的取代：对应于序列号16的11位的位点，对应于序列号17的21位的位点，对应于序列号18的31位的位点，对应于序列号19的41位的位点，或对应于序列号1的49位的位点。在更具体的方式中，突变为在甜菊植物的基因组中的以下位点的由c(胞嘧啶)到a(腺嘌呤)的取代：对应于序列号16的11位的位点，对应于序列号17的21位的位点，对应于序列号18的31位的位点，对应于序列号19的41位的位点，或对应于序列号1的49位的位点(以下有时将该突变称为“c49a”)。将序列号1的49位由c取代为a的序列示于序列号20。
[0055]
本发明的植物体为甜味成分高含有型。甜味成分高含有型甜菊植物，是指与不具有本发明的突变的甜菊植物相比，甜味成分含量高的甜菊植物。甜味成分含量高，是指如下含义：例如，在至少任一方为以杂合形式具有本发明的突变的2个个体甜菊植物体通过交配得到的分离群体中，本发明的植物体(即具有本发明的突变的甜菊植物体)的群体中的甜味成分的含量的平均值或中位数比不具有本发明的突变的甜菊植物体的群体中的甜味成分含量的平均值或中位数高，及/或本发明的植物体具有分离群体的全部个体的平均值以上的甜味成分含量。在一部分方式中，属于前述分离群体的本发明的植物体的群体中的甜味成分含量的平均值，比属于相同分离群体的不具有本发明的突变的甜菊植物的群体中的甜味成分含量的平均值高约25％以上、约50％以上、约70％以上、约80％以上、约90％以上、约100％以上、约110％以上、约120％以上、约125％以上、约130％以上、约140％以上、约150％以上、约160％以上、约170％以上、约180％以上、约190％以上或约195％以上。此外，在一部分方式中，属于前述分离群体的本发明的植物体的群体中的甜味成分含量的中位数，比属于相同分离群体的不具有本发明的突变的甜菊植物的群体中的甜味成分含量的中位数高约25％以上、约50％以上、约75％以上、约100％以上、约125％以上、约150％以上、约160％以上、约170％以上、约180％以上、约190％以上、约195％以上、约200％以上或约210％以上。
[0056]
作为甜味成分，只要为甜菊植物所含的甜味成分则没有特别限定，例如可列举1种以上的甜菊醇糖苷或其组合。作为甜菊醇糖苷，例如可列举瑞鲍迪苷a、瑞鲍迪苷b、瑞鲍迪苷c、瑞鲍迪苷d、瑞鲍迪苷e、瑞鲍迪苷f、瑞鲍迪苷i、瑞鲍迪苷j、瑞鲍迪苷k、瑞鲍迪苷n、瑞鲍迪苷m、瑞鲍迪苷o、瑞鲍迪苷q、瑞鲍迪苷r、杜尔可苷a、甜茶苷、甜菊醇、甜菊单糖苷、甜菊双糖苷、甜菊苷等。在一部分方式中，甜味成分由选自以下成分的1种以上的成分组成：瑞鲍迪苷a、瑞鲍迪苷b、瑞鲍迪苷c、瑞鲍迪苷d、瑞鲍迪苷e、瑞鲍迪苷f、瑞鲍迪苷i、瑞鲍迪苷j、瑞鲍迪苷k、瑞鲍迪苷n、瑞鲍迪苷m、瑞鲍迪苷o、瑞鲍迪苷q、瑞鲍迪苷r、杜尔可苷a、甜茶苷、甜菊醇、甜菊单糖苷、甜菊双糖苷及甜菊苷。在特定的方式中，甜味成分包括瑞鲍迪苷a、瑞鲍迪苷b、瑞鲍迪苷c、瑞鲍迪苷d、瑞鲍迪苷f、瑞鲍迪苷n、瑞鲍迪苷m及瑞鲍迪苷o或由它们的甜菊醇糖苷组成。
[0057]
本发明的甜菊植物体，是由野生物种的甜菊植物体衍生而来的物种，但在基因上产生了甜味成分含量增高的前述突变。该基因的突变，可通过基因重组的方法产生，也可通过非基因重组的方法产生。此外，本发明的甜菊植物体可以以杂合型或以纯合型具有前述基因突变。
[0058]
前述基因突变可通过以下方法检出：pcr法、taqman pcr法、测序法、微阵列法、invader法(
インベーダー
法)、tilling法、rad(random amplified polymorphic dna)法、
限制酶片段长度多态性(rflp)法、pcr
‑
sscp法、aflp(amplified fragment length polymorphism)法、sslp(simple sequence length polymorphism)法、caps(cleaved amplified polymorphic sequence)法、dcaps(derived cleaved amplified polymorphic sequence)法、等位基因特异性寡核苷酸(aso)法、arms法、变性梯度凝胶电泳(dgge)法、ccm(chemical cleavage of mismatch)法、dol法、maldi
‑
tof/ms法、tdi法、锁式探针(padlock probe)法、分子信标(molecularbeacon)法、dash(dynamic allele specific hybridization)法、ucan法、eca法、pinpoint法、probe(primer oligo base extension)法、vset(very short extension)法、survivor assay、sniper assay、luminex assay、good法、lcx法、snapshot法、mass array法、焦磷酸测序(pyrosequencing)法、snp
‑
it法、熔解曲线分析法等，但检出方法并不限于此。关于基因突变的检出方法详见后述。
[0059]
本说明书中，作为“非基因重组的方法”的例子，可列举在不导入外源基因的情况下诱导宿主细胞(或宿主植物体)的基因突变的方法。作为此种方法，可列举使用植物细胞诱变剂的方法。作为这种诱变剂，可列举甲磺酸乙酯(ems)及叠氮钠等。例如可以以0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1.0％等浓度的ems处理植物细胞。处理时间为约1小时～约48小时、约2小时～约36小时、约3小时～约30小时、约4小时～约28小时、约5小时～约26小时、约6小时～约24小时。处理步骤本身已为公知，可通过将经由吸水过程的吸水种子在以上述浓度含有诱变剂的处理液中浸泡上述处理时间来进行。
[0060]
作为非基因重组方法的其他例子，可列举对植物细胞照射x射线、γ射线、紫外线等放射线和光线的方法。在照射紫外线的情况下，用适当的紫外线照射量(紫外灯强度、距离、时间)照射细胞，并将其用选择培养基等培养后，可选择具有目标性状的细胞、愈伤组织、植物体。此时的照射强度可为0.01～100gr、0.03～75gr、0.05～50gr、0.07～25gr、0.09～20gr、0.1～15gr、0.1～10gr、0.5～10gr、1～10gr，照射距离可为1cm～200m、5cm～100m、7cm～75m、9cm～50m、10cm～30m、10cm～20m、10cm～10m，照射时间可为1分钟～2年、2分钟～1年、3分钟～0.5年、4分钟～1个月、5分钟～2周、10分钟～1周。照射的强度、距离及时间，因放射线和光线的种类和设为照射对象的情况(细胞、愈伤组织、植物体)而不同，本领域技术人员可适当调整。
[0061]
此外，细胞融合、花药培养(单倍体育种)、远缘杂交(单倍体育种)等方法已为公知。
[0062]
一般而言，由于植物细胞在培养期间可能伴随突变，因此为了更稳定的性状维持，优选将其返回到植物个体中。
[0063]
将非基因重组甜菊植物体作为宿主进行随后的基因重组而获得的植物体(例如将本发明的植物体作为宿主进行基因重组而进一步附加了其他性状的植物体)也未超出本发明的范围之外。
[0064]
甜味成分可通过使本发明的植物体的新鲜叶或干叶与适当的溶剂(水等水性溶剂或乙醇、乙醚及丙酮等有机溶剂)进行反应而以萃取液的状态进行萃取。萃取条件等可参照日本特表2012
‑
504552中记载的方法和后述实施例中记载的方法。干叶是指通过使新鲜叶干燥而将含水量减少至10重量％以下、7重量％以下、5重量％以下、4重量％以下、3重量％以下、2重量％以下、1重量％以下。优选本发明的植物体的干叶的含水量为3～4重量％。
[0065]
进而，针对此种方式获得的萃取液，可通过采用以下公知方法来精制甜味成分：乙
酸乙酯或其他有机溶剂∶水的梯度、高效液相色谱(high performance liquid chromatography：hplc)、气相色谱、飞行时间质谱(time
‑
of
‑
flight mass spectrometry：tof
‑
ms)、超高效液相色谱(ultra(high)performance liquid chromatography：uplc)等。
[0066]
本发明所涉及的甜味成分含量可用日本特表2012
‑
504552中记载的方法和后述的实施例中记载的方法测定。具体而言，例如可通过由本发明的甜菊植物体取样新鲜叶并进行lc/ms
‑
ms来测定。
[0067]
本发明的植物体不仅仅是整株植物体，还可包括植物器官(例如叶、花瓣、茎、根、种子等)、植物组织(例如表皮、韧皮部、薄壁组织、木质部、维管束、栅状组织、海绵组织等)或各种形态的植物细胞(例如悬浮培养细胞)、原生质体、叶切片、愈伤组织等。
[0068]
此外，本发明的植物体还可包括组织培养物或植物培养细胞。因为通过培养这种组织培养物或植物培养细胞，可使植物体再生。作为本发明的植物体的组织培养物或植物培养细胞的例子，可列举胚、分生组织细胞、花粉、叶、根、根端、花瓣、原生质体、叶切片及愈伤组织等，但并不限于此。
[0069]
除了本发明的突变，本发明的植物体还包括其他突变，例如也可具有对选自wrky
‑
02
‑
xbai、wrky
‑
08
‑
kpni、wrky
‑
09
‑
aflii、wrky
‑
14及wd40
‑
01
‑
pvui中的至少1个dcaps标记呈阳性的突变。对这些标记呈阳性的植物体与呈阴性的植物体相比rebm的含量高(以下有时也将该突变称为“高rebm含有型突变”)。
[0070]
对于wrky
‑
02
‑
xbai呈阳性，是指对候选植物体的基因组dna用具有序列号21所示的碱基序列的正向引物及具有序列号22所示的反向引物进行pcr扩增，即使对得到的pcr产物(约383bp长：例如序列号23或24)进行xbai限制酶处理也只能得到约383bp长的扩增带(约383bp长：例如序列号23或24)。相反，对上述pcr产物进行xbai限制酶处理时，产生约344bp的限制酶处理产物(例如序列号25)的情况下，该候选植物体则设为wrky
‑
02
‑
xbai阴性。
[0071]
对于wrky
‑
08
‑
kpni呈阳性，是指对候选植物体的基因组dna用具有序列号26所示的碱基序列的正向引物及序列号27所示的反向引物进行pcr扩增，即使对得到的pcr产物(297bp长)(例如序列号28或29)进行kpni限制酶处理也只能得到约297bp长的扩增带(例如序列号28或29)。相反，产生约258bp的限制酶处理产物(例如序列号30)时，该候选植物体设为wrky
‑
08
‑
kpni阴性。
[0072]
对于wrky
‑
09
‑
aflii呈阳性，是指对候选植物体的基因组dna用具有序列号31所示的碱基序列的正向引物及序列号32所示的反向引物进行pcr扩增，即使对得到的pcr产物(约390bp长)(例如序列号33或34)进行aflii限制酶处理也只能得到约390bp长的扩增带(例如序列号33或34)。相反，产生约347bp的限制酶处理产物(例如序列号35)时，该候选植物体设为wrky
‑
09
‑
aflii阴性。
[0073]
对于wrky
‑
14呈阳性，是指对候选植物体的基因组dna用具有序列号36所示的碱基序列的正向引物及序列号37所示的反向引物进行pcr扩增时，只生成约140bp的pcr产物(例如序列号38)，并且当生成140bp(例如序列号38)及158bp(例如序列号39)的pcr产物时，指该候选植物体为阴性。
[0074]
对于wd40
‑
01
‑
pvui呈阳性，是指对候选植物体的基因组dna用具有序列号40所示的碱基序列的正向引物及序列号41所示的反向引物进行pcr扩增，即使对得到的pcr产物
(约288bp长)(例如序列号42或43)进行pvui限制酶处理也只能得到约288bp长的扩增带(例如序列号42或43)。相反，生成约240bp的限制酶处理产物(例如序列号44)时，该候选植物体设为wd40
‑
01
‑
pvui阴性。
[0075]
关于上述bp长度，“约”是指
±
5bp。可根据所使用的各种限制酶的销售商推荐的条件进行限制酶处理。
[0076]
本发明的植物体，除了上述突变及/或dcaps标记阳性的遗传特征外，还可具有序列号45所示的突变，即可具有对应于野生型等位基因的碱基序列(序列号46)的第60位碱基序列由野生型的a到t的突变(专利文献4)。具有该突变的植物体与不具有该突变的植物体相比，rebc含量高(以下有时也称为“高rebc含有型突变”)。
[0077]
具有本发明的突变的植物体，由于具有甜味成分全体含量增高的趋势，所以通过使其与上述其他突变(例如高rebm含有型突变及/或高rebc含有型突变)组合，可增强这些其他突变所产生的效果。
[0078]
2.本发明的植物体的培育方法
[0079]
本发明在其他实施方式中，提供一种培育甜味成分高含有型甜菊植物体的方法(以下称“本发明的培育方法”)，其包括使本发明的甜菊植物体与第2甜菊植物体进行杂交的工序。
[0080]
通过该方法培育的“甜味成分高含有型甜菊植物体”，具有与本发明的植物体相同的表现型和遗传性能。
[0081]
具体而言，通过本发明的培育方法培育的植物体的表现型，为本发明的植物体的项中所记载的甜味成分高含有型的表现型。通过本发明的培育方法培育的植物体的遗传性能，具有本发明的突变。通过本发明的培育方法培育的植物体可以以杂合型或以纯合型具有前述突变。关于这些突变的检出方法，如前及如后所述。
[0082]
本发明的培育方法中，“使杂交”是指通过使本发明的植物体与第2植物体进行交配而获得其子植物体(通过本发明的培育方法培育的植物体)。作为杂交方法优选回交。“回交”是使本发明的植物体与第2植物体之间产生的子植物体与本发明的植物体(即具有本发明的基因突变的植物体)进一步杂交，从而培育本发明的基因突变的纯合型植物体的方法。当本发明的培育方法所使用的第2植物体与本发明的植物体具有相同的表现型和遗传性能时，成为实质性的回交。本发明的基因突变遵循孟德尔定律遗传，与此同时，与该基因突变相关的表现型即甜味成分高含有的表现型也遵循孟德尔定律遗传。
[0083]
或者本发明的植物体也可通过自交进行培育。自交可通过使本发明的植物体的雄蕊的花粉自花授粉给本发明的植物体的雌蕊来进行。
[0084]
由本发明的培育方法培育的植物体，由于其表现型及遗传性能与本发明的植物体相同，所以通过使由本发明的培育方法培育的植物体与第3甜菊植物体进一步杂交，可培育甜味成分高含有型甜菊植物体。
[0085]
作为其他方式，本发明的植物体可通过培养先前所述的组织培养物或植物培养细胞进行植物体再生，从而进行培育。关于培养条件，与培养野生型甜菊植物的组织培养物或植物培养细胞的条件相同，已为公知(protocols for in vitro cultures and secondary metabolite analysis of aromatic and medicinal plants,method in molecular biology,vo.1391,pp113
‑
123.)。
[0086]
进而作为其他方式，本发明的植物体，可通过在甜菊植物体的基因组的对应于序列号1的49位的位点导入从c到a的突变来培育。突变的导入，可通过基因重组的方法进行，也可通过非基因重组的方法进行。非基因重组的方法，包括本发明的植物体的项中所记载的通过诱变剂的处理和通过放射线或光线的照射的处理等诱变处理。
[0087]
3.本发明的植物体的筛选方法
[0088]
本发明的植物体可通过从受试植物体的组织中检出本发明的突变来筛选。在此，“筛选”是指将本发明的植物体与其以外的植物体进行识别进而选择本发明的植物体。
[0089]
因此，在另一方面，本发明提供一种筛选甜味成分高含有型甜菊植物体的方法(以下称“本发明的筛选方法”)，包括从受试甜菊植物体的基因组中检出对应于序列号1的部分中的突变的工序。关于“对应于序列号1的部分中的突变”(本发明的突变)及“甜味成分高含有型甜菊植物体”如以上对本发明的植物体所述。
[0090]
作为本发明的突变的检出方法的具体例子，可列举pcr法、taqman pcr法、测序法、微阵列法、invader法、tilling法、rad法、rflp法、pcr
‑
sscp法、aflp法、sslp法、caps法、dcaps法、aso法、arms法、dgge法、ccm法、dol法、maldi
‑
tof/ms法、tdi法、锁式探针法、分子信标法、dash法、ucan法、eca法、pinpoint法、probe法、vset法、survivor assay、sniper assay、luminex assay、good法、lcx法、snapshot法、mass array法、焦磷酸测序法、snp
‑
it法、熔解曲线分析法等，但并不限于此。
[0091]
pcr法时，优选制作3’末端部分具有与本发明的突变位点互补的序列的引物。采用由此种方式设计的引物时，当作为模板的样本有突变时，由于引物完全与模板杂交，因此聚合酶延伸反应进行；当模板不具有本发明的突变时，由于引物的3’末端的核苷酸与模板发生错配，因此延伸反应不发生。所以，使用此种引物进行pcr扩增，并将扩增产物通过琼脂糖凝胶电泳等进行分析，只要能确认指定大小的扩增产物，即可判断作为样本的模板有突变，而当扩增产物不存在时，即可判断模板没有突变。
[0092]
或者，通过使本发明的突变与引物序列不重叠，且设计引物序列以使本发明的基因突变可pcr扩增，并对扩增的核苷酸片段的碱基序列进行测序，可检出本发明的基因突变。
[0093]
关于pcr及琼脂糖凝胶电泳可参照以下文献：sambrook,fritsch and maniatis,“molecular cloning:a laboratory manual”2nd edition(1989),cold spring harbor laboratory press。
[0094]
taqman pcr法，是利用荧光标记的等位基因特异性的寡聚物和taq dna聚合酶引起的pcr反应的方法(livak,k.j.genet.anal.14,143(1999)；morris t.et al.,j.clin.microbiol.34,2933(1996))。
[0095]
测序法，是通过使含突变的区域用pcr扩增，并用dye terminator等对dna序列进行测序来分析突变的有无的方法(sambrook,fritsch and maniatis,“molecular cloning:a laboratory manual”2nd edition(1989),cold spring harbor laboratory press)。
[0096]
dna微阵列，是将核苷酸探针的一端以阵列状固定于支持体上而成，包括dna芯片、基因芯片、微芯片、珠阵列等。通过使用含有与本发明的基因突变互补的序列的探针，可全面地检出本发明的基因突变的有无。作为dna芯片等dna微阵列检测，可列举genechip检测
(affymetrix公司；参照美国专利第6,045,996号、美国专利第5,925,525号及美国专利第5,858,659号)。genechip技术是利用了贴附于芯片上的寡核苷酸探针的小型化高密度微阵列的技术。
[0097]
invader法，是使2种报告基因探针及1种invader探针与模板dna的杂交和由cleavase酶引起的dna切割进行组合的方法(livak,k.j.biomol.eng.14,143
‑
149(1999)；morris t.et al.,j.clin.microbiol.34,2933(1996)；lyamichev,v.et al.,science,260,778
‑
783(1993)等)，其中，所述报告基因探针和invader探针对snp等基因突变的各等位基因特异；所述cleavase酶具有识别dna结构并进行切割等特殊的核酸内切酶活性。
[0098]
tilling(targeting induced local lesions in genomes)法，是由pcr扩增和cel i核酸酶处理来进行筛选的方法，其中，pcr扩增是将诱变的突变体群体的基因组中的突变错配进行扩增。
[0099]
在一种方式中，本发明的突变，可通过使用以下引物对和限制酶的dcaps法来检出。
[0100]
·
引物对：
[0101]
包括如下正向引物和反向引物的引物对：正向引物包括位于3’末端的选自序列号47～70的序列和任意选择的在前述序列的5’末端附加的从序列号1的28位向5’端延伸的任意连续序列(例如任意长度的连续序列)；反向引物包括与位于从序列号1的50位向3’端的任意连续的20个碱基以上的序列互补的序列(例如序列号15、71)。可在满足上述条件的范围内优化引物序列。关于引物设计的优化，参见例如sambrook and russell，“molecular cloning：a laboratory manual”3rd edition(2001)，cold spring harbor laboratory press等。此外，上述各引物可为15～50碱基长、18～48碱基长、20～45碱基长、30～65碱基长等。
[0102]
·
限制酶：
[0103]
与各序列号47～70对应的限制酶如下所示。另外，下述序列中“r”代表a或g，“y”代表c或t。
[0104]
[表2]
[0105]
表2正向引物所含的序列和对应的限制酶
[0106]
正向引物所含的序列限制酶ttcaggtaataaaaggcctt(序列号47)ddeittcaggtaataaaaggcact(序列号48)maei/speittcaggtaataaaaggctta(序列号49)aflii/mseittcaggtaataaaaggcttg(序列号50)bce83ittcaggtaataaaaggcctc(序列号51)bsemiittcaggtaataaaaggcacg(序列号52)bsiittcaggtaataaaagtcatg(序列号53)bsphi/hpy178iiittcaggtaataaaaggctrt(序列号54)sfeittcaggtaataaaaggcttr(序列号55)smlittcaggtaataaaaggcagc(序列号56)ecop15ittcaggtaataaaaggcycg(序列号57)avai
ttcaggtaataaaagtgatc(序列号58)bclittcaggtaataaaagggagg(序列号59)bserittcaggtaataaaaggctgc(序列号60)cviri/pstittcaggtaataaaaggaacc(序列号61)drdiittcaggtaataaaaggctga(序列号62)eco57ittcaggtaataaaaggctgg(序列号63)gsuittcaggtaataaaaggggtg(序列号64)hphittcaggtaataaaaggtctg(序列号65)hpy188ittcaggtaataaaagggaag(序列号66)mboiittcaggtaataaaaggtcgt(序列号67)pfl1108ittcaggtaataaaagttata(序列号68)psiittcaggtaataaaaggctcg(序列号69)taqi/xhoittcaggcgataaaaggcgtt(序列号70)styski
[0107]
在特定方式中，本发明的突变可通过使用以下引物对和限制酶的dcaps法来检出。
[0108]
[表3]
[0109]
表3引物对和限制酶的组合
[0110]
正向引物序列反向引物序列限制酶序列号72序列号15ddei序列号73序列号15maei/spei序列号74序列号15aflii/msei序列号75序列号15bce83i序列号76序列号15bsemii序列号77序列号15bsii序列号78序列号15bsphi/hpy178iii序列号79序列号15sfei序列号80序列号15smli序列号81序列号15ecop15i序列号82序列号15avai序列号83序列号15bcli序列号84序列号15bseri序列号85序列号15cviri/psti序列号86序列号15drdii序列号87序列号15eco57i序列号88序列号15gsui序列号89序列号15hphi序列号90序列号15hpy188i序列号91序列号15mboii序列号92序列号15pfl1108i序列号93序列号15psii
序列号94序列号15taqi/xhoi序列号95序列号15styski
[0111]
本发明的筛选方法，可进一步包括测定已检出突变的受试甜菊植物组织的甜味成分的含量的工序。甜味成分含量的测定，如本发明的植物体的项中所记载。此外，在该方式中，针对在已检出突变的受试甜菊植物体中选择甜味成分含量高的个体，并将其与其他甜菊植物体进行交配而得到的子植物体也可适用本发明的筛选方法。从而，本发明的筛选方法可包括如下1个以上的工序。
[0112]
(i)从受试甜菊植物的基因组中，检出对应于序列号1的部分中的突变的工序，
[0113]
(ii)测定已检出突变的受试甜菊植物组织的甜味成分含量的工序，
[0114]
(iii)在已检出突变的受试甜菊植物体中选择甜味成分含量高的个体的工序，
[0115]
(iv)将选择的甜味成分含量高的个体与其他甜菊植物体进行交配的工序，
[0116]
(v)从通过交配所得的子植物体的基因组中检出对应于序列号1的部分中的突变的工序，
[0117]
(vi)测定已检出突变的子植物组织的甜味成分含量的工序，
[0118]
(vii)在已检出突变的子植物体中选择甜味成分含量高的个体的工序。
[0119]
例如在已检出突变的受试甜菊植物体中，所选择的甜味成分含量高的个体，可为与甜味成分含量的高度相关的上位达以下程度的个体等：上位达50％、上位达40％、上位达30％、上位达20％、上位达10％、上位达5％、上位达4％、上位达3％、上位达2％或上位达1％。此外，进行交配的其他甜菊植物体，可含有也可不含有本发明的突变。在上述方式中，可多次重复工序(iv)～(vii)。这样，可筛选出甜味成分含量更高的甜菊植物体。
[0120]
本发明的筛选方法中，受试甜菊植物体可以是天然植物体，也可以是非基因重组植物体。关于非基因重组植物体，如本发明的植物体的项中所记载。
[0121]
本发明的筛选方法中，受试甜菊植物体也可包含已进行诱变处理的甜菊植物及其子代植物。关于诱变处理，如本发明的植物体项中所记载，包括通过诱变剂的处理和通过放射线或光线的照射的处理等。
[0122]
在一部分方式中，本发明的筛选方法中的受试甜菊植物体的交配亲本的至少一方以杂合形式具有本发明的突变，且任一受试甜菊植物体的交配亲本都不以纯合形式具有本发明的突变。在这种方式中，受试甜菊植物体属于一种分离群体，其通过至少一方为以杂合形式具有本发明的突变的2个个体甜菊植物体的交配而产生。在更优异的品种例如甜味成分含量更高的品种的开发中，有时通过甜味成分含量高的个体彼此交配或甜味成分含量高的个体与显示其他表现型的个体交配等获得分离群体，再从该分离群体挑选甜味成分含量高的个体，但是针对分离群体的全部个体进行甜味成分含量定量需要大量的时间、成本、劳力。与此相对，遗传突变的检出与甜味成分含量的检出相比，可以用更少的时间、成本、劳力进行。在通过至少一方为以杂合形式具有本发明的突变的2个个体甜菊植物体的交配而产生的分离群体中，本发明的突变包含于具有平均值以上的甜味成分含量的个体中，其可实验性地得到确认(参照实施例)，通过检出本发明的突变，可从前述分离群体中挑选出具有平均值以上的甜味成分含量的个体。由此，可大幅降低作为甜味成分含量测定对象的个体数，从而可提高甜味成分含量高的甜菊植物的育种开发的低成本化、速度化、效率化、成功率等。
[0123]
本发明提供一种可检出本发明的突变存在或不在的探针(以下有时称“本发明的探针”)。本发明的探针可具有适用于本发明的突变的各种检出方法的结构。例如，本发明的探针可含有与含本发明的突变部位的基因组或转录物部分具有互补性的碱基序列。作为该探针的非限定例子，可列举与选自序列号1、16～20、99～102的碱基序列进行特异性杂交的探针。在这些序列中，序列号20、99～102为含本发明的突变的碱基序列，序列号1、16～19为不含本发明的突变的碱基序列。优选的方式中，可检出本发明的突变存在的探针具有如下杂交条件：与选自序列号20、99～102的碱基序列进行杂交，而不与选自序列号1、16～19的碱基序列进行杂交。优选的方式中，可检出本发明的突变不存在的探针具有如下杂交条件：与选自序列号1、16～19的碱基序列进行杂交，而不与选自序列号20、99～102的碱基序列进行杂交。
[0124]
本发明的突变的存在，可通过含有本发明的突变的碱基序列的检出及/或不含本发明的突变的碱基序列的非检出来进行检出，本发明的突变的不存在，可通过含有本发明的突变的碱基序列的非检出及/或不含本发明的突变的碱基序列的检出来进行检出。
[0125]
本发明的探针优选具有标记。作为此类标记的非限定例子，可列举荧光标记、发光标记、放射性标记、色素、酶、淬灭基团、与可检出标记的结合部分等。在特定的方式中，本发明的探针具有与选自序列号1、16～20、99～102的碱基序列特异性杂交的碱基序列和标记。
[0126]
本发明还提供一种引物对及一种试剂盒，其中，所述引物对含有前述的正向引物与反向引物的组合，所述试剂盒含有前述引物对和与其相对应的限制酶。本发明进而提供一种含有引物对和本发明的探针的试剂盒，其中，所述引物对是能够通过pcr扩增而得到含有选自序列号1、16～20、99～102的碱基序列的区域的引物对。这些引物对及试剂盒，可应用于检出本发明的突变及本发明的筛选方法等方面。此外，这些引物对及试剂盒，含有与本发明的突变的检出和本发明的筛选方法相关的说明的指示，例如也可包含使用说明书和记录与使用方法相关的信息的媒体，例如软盘、cd、dvd、蓝光光盘、存储卡、usb存储器等。
[0127]
4.源自本发明的植物体的萃取物及使用其的制品
[0128]
在本发明的另一方面，提供一种含有甜菊甜味成分的萃取物的制造方法(以下称“本发明的萃取物的制造方法”)，其包括从本发明的植物体或该植物体的种子或干叶中获得萃取物的工序。进而提供一种甜菊甜味成分的制造方法(以下称“本发明的甜菊甜味成分的制造方法”)，其包括从通过本发明的萃取物的制造方法所获得的萃取物中精制甜菊甜味成分的工序。由于甜菊甜味成分如上所述包括各种甜菊醇糖苷，因此本发明的甜菊甜味成分的制造方法包括各种甜菊醇糖苷的制造方法。
[0129]
含甜菊甜味成分的萃取物可通过使本发明的植物体的新鲜叶或干叶与适当的溶剂(水等水性溶剂或乙醇、乙醚及丙酮等有机溶剂)进行反应而制得。萃取条件等可参照日本特表2012
‑
504552中记载的方法和后述实施例中记载的方法。
[0130]
此外，针对含有甜菊甜味成分的萃取物，可通过采用以下公知方法来精制甜菊甜味成分：乙酸乙酯和其他有机溶剂∶水的梯度、高效液相色谱(high performance liquid chromatography：hplc)、气相色谱、飞行时间质谱(time
‑
of
‑
flight mass spectrometry：tof
‑
ms)、超高效液相色谱(ultra(high)performance liquid chromatography：uplc)等。
[0131]
通过本发明的萃取物的制造方法所获得的萃取物(以下称“本发明的萃取物”)，其特征在于，与由不含本发明的突变的甜菊植物体通过同样方法获得的萃取物相比，甜味成
分含量高。在此，“甜味成分含量高”如本发明的植物体的项中所记载。
[0132]
将通过本发明的萃取物及/或本发明的甜菊甜味成分的制造方法获得的甜菊甜味成分(以下称“本发明的甜菊甜味成分”)与其他成分混合，由此可制造甜菊甜味成分含量增高的新型医药品、香料或饮食品。因此，本发明在其他方面，提供一种医药品、香料或饮食品的制造方法，其包括将本发明的萃取物及/或本发明的甜菊甜味成分与其他成分混合的工序。进而，本发明提供一种新型医药品、香料或饮食品，其为通过前述制造方法获得的甜菊甜味成分含量增高的产品。在此饮食品是指饮料及食品。因此，在一部分方式中，本发明提供一种新型医药品、香料、饮料或食品，此外提供一种该医药品、香料、饮料或食品的制造方法。
[0133]
5.本发明的植物体所涉及的碱基序列
[0134]
本发明在其他方面，提供一种本发明的甜菊植物体所涉及的碱基序列。具有本发明的突变的甜菊植物体所涉及的碱基序列的特定方式，含有选自序列号20、99～102的碱基序列或由其组成。
[0135]
实施例
[0136]
以下记载与本发明有关的实验例、实施例等，但本发明并不限于这些具体方式。
[0137]
(1)甜味成分高含有个体的分离(m0代)
[0138]
将约2000个(重量换算)野生型甜菊种子(市售品种2014年8月引入)分成3份，分别进行0.1％、0.2％或0.3％的甲磺酸乙酯(ems)处理从而进行基因改造。
[0139]
将这些完成ems处理的种子及未处理的种子在三得利研究中心内的温室中播种，获得ems处理当代(m0代)苗。未发现处理浓度间的发芽率差异。
[0140]
由ems处理当代(m0代)及未处理个体取样适量的新鲜叶，用lc/ms
‑
ms(岛津lcms8050)定量甜味成分的浓度。具体而言，将0.25g新鲜叶冻干干燥，并将0.05g破碎干物质投入到纯水中。用超声波处理20分钟进行萃取，离心、过滤后获得0.33ml的萃取液。对该萃取液用lcms8050离子模式(岛津lcms8050)进行lc/ms
‑
ms分析，定量reba、rebb、rebc、rebd、rebf、rebm、rebn及rebo的浓度，将其合计作为甜味成分的浓度。将甜味成分浓度为约20％的个体作为亲本个体1(p1)。此外，选择源自其他甜菊植物体群体且干叶中的甜味成分浓度为5％的个体作为亲本个体2(p2)。
[0141]
(2)甜味成分高含有型个体的分离(m1代)及基因分析
[0142]
通过亲本个体1(p1)与亲本个体2(p2)的交配来采种处理第一代(m1代)种子，并在三得利研究中心内的温室内播种，获得m1代苗(1603个体的分离群体)。由上述m1代个体取样适量的新鲜叶，与上述(1)同样地用lc/ms
‑
ms(岛津lcms8050)定量甜味成分。将结果示于图1。
[0143]
从甜味成分含量最高的30个个体(甜味成分高含有个体)和甜味成分含量最低的30个个体(甜味成分低含有个体)的新鲜叶提取基因组dna，针对只存在于两个个体组中的任意一方的突变进行调查。在用基因组分析检出的突变中，对基因组信息量充足(序列覆盖为
×
5以上)、突变不连续、没有序列的插入和缺失的306处突变，研究了各突变存在于哪个个体上。其结果，明确了从序列号1的49位中的c到a的突变(c49a)存在于甜味成分高含有个体中，而不存在于甜味成分低含有个体中。
[0144]
(3)突变c49a与甜味成分含量间的关系性的验证
[0145]
将以杂合形式具有突变c49a的甜菊植物体与不具有突变c49a的甜菊植物体进行交配，得到2个分离群体(分离群体a(443个体)及分离群体b(446个体))。调查两个分离群体的各个体中突变c49a的有无和甜味成分含量。突变c49a的有无的调查采用dcaps法。从各个体提取基因组dna，使用以下引物进行pcr，并向pcr产物中添加限制酶(spei)，于37℃进行酶反应。限制酶处理后，通过微芯片型电泳装置labchip gx touch ht(perkinelmer)进行电泳，根据电泳后的扩增带图谱进行标记的识别。
[0146]
正向引物：5
’‑
ttatttaatgatccaatggagggggtgattcaggtaataaaaggcact
‑3’
(序列号71)
[0147]
反向引物：5
’‑
tgagggttctcaattgatttccgattgg
‑3’
(序列号15)
[0148]
对得到的约367bp的pcr产物(例如序列号96或97)进行spei限制酶处理，将产生约321bp的限制酶处理产物(例如序列号98)的设为突变c49a阳性。
[0149]
与(1)同样地进行甜味成分含量的定量。
[0150]
将各分离群体的突变c49a阳性个体及阴性个体中的甜味成分含量的分布示于图2～3。由这些结果可知，突变c49a阳性个体中的甜味成分含量比各分离群体全体的甜味成分含量的平均值高。
[0151]
此外，将各分离群体的突变c49a阳性个体及阴性个体中的甜味成分含量的平均值及中位数汇总如下。
[0152]
[表4]
[0153]
表4各分离群体中的干叶中的甜味成分浓度的平均值及中位数(％)
[0154]