细胞工程平台的制作方法
相关申请的交叉引用
本申请要求2018年6月1日递交的美国临时专利申请第62/679,715号的优先权，该专利的全部内容通过引证在此并入本文。
这里所述的主题内容指的是不利用载体传递的细胞工程平台。
背景技术：
不同细胞类型间细胞转染效率存在差异。悬浮细胞，如非贴壁细胞的转染已被证明是非常困难的使用传统方法，特别是在成规模使用时。
技术实现要素：
本发明主题内容提供了一种细胞工程平台，该平台可将有效载荷/货物化合物和组合物进行无载体传递递送到非粘附细胞中的技术进行缩放。该平台可以实现对大量细胞的快速传送。例如，该平台的一些实施方案可以在一次用于诊断和治疗用途时传送到107到109个或更多个细胞。该平台可以是一个封闭的系统，能够实现无菌转染，可以将mrna和rnp(核糖核蛋白颗粒)传递到原代t细胞，使用方便，可重复传递等。
通过执行以下步骤：提供非粘附细胞群并使细胞群与一定体积的水溶液接触，所述水溶液包括有效载荷和浓度大于2％(v/v)的醇，通过这些步骤本发明的平台可以实现有效载荷在非粘附细胞的质膜上的传递。例如，所述醇包括乙醇，例如大于5％的乙醇。在一些实施例中，水溶液包含5-30％乙醇，例如12％或25％乙醇。其他组合也是可以的。
在一个方面中，这里公开了一种方法，该方法包括用细胞和第一介质的混合物填充细胞工程平台的一个腔室，并从该腔室排出第一培养基以使混合物通过过滤器，从而使细胞沉积在过滤器上。所述细胞工程平台可包括腔室、设置在所述腔室的第一端的盖、设置在所述腔室的第二端的底座以及设置在所述腔室内的过滤器支架。
以下一个或多个特征可以包含在任何可行的组合中。该方法可以包括将含有渗透剂和有效载荷的传递溶液喷洒到沉积在过滤器上的细胞上。所述方法可包括在所述腔室中施加停止溶液。所述方法还可以进一步包括用第二培养基填充所述腔室以使所述细胞从所述过滤器中再悬浮。被排出的第一培养基可重复用作第二培养基。所述方法可以包括搅动所述腔室。所述方法可包括从所述腔室中提取再悬浮细胞。通过泵和控制器可以自动完成对腔室的填充。该方法可包括在腔室中培养细胞。可通过向所述腔室提供正压力来从所述腔室中排出所述第一培养基。作为选择或另外地，可通过重力从腔室中排出第一培养基。此外，可以施加停止溶液来清洗细胞。用第二培养基填充所述腔室可以作为细胞洗涤过程、细胞浓度改变过程和/或细胞培养基改变过程来执行。
在另一方面，一种系统包括一个外壳，该外壳被配置成接收滤板，所述滤板上包含孔；一个压差施加器，其被配置成向所述孔中施加不同的压力；一个传递溶液施加器，其被配置用于向孔中输送雾化的传递溶液；一个停止溶液施加器，其配置为将停止溶液输送至所述孔；以及一个培养基施加器，所述培养基施加器被配置为将所述培养基输送至所述孔中。
以下一个或多个特征可以被包含在任何可行的组合中。所述外壳可以包括腔室、设置在所述腔室的第一端的盖和设置在所述腔室的第二端的底座。所述滤板可设置在所述腔室内。所述压差施加器可以连接到所述壳体的盖上并且包括淋浴头，所述淋浴头在所述淋浴头的端部具有多个孔。所述停止溶液施加器可通过设置在所述外壳盖中的隔膜将所述停止溶液传递至孔中。所述培养基施加器可通过设置在所述壳体盖中的隔膜或通过所述腔室的端口将所述培养基输送至所述孔中。外壳可配置为倾斜滤板。所述传递溶液施加器可包括机械臂和喷头，所述机械臂与所述喷头磁耦合。该系统可以包括一个软弹性屏障，包围过滤板和喷头。软弹性屏障将机械臂和喷头分开。机械臂被配置成将喷头运送到滤板上的多个位置。停止溶液施加器和培养基施加器作为端口在外壳内形成一体，并且所述外壳形成容器。该容器包括一个用于收集废培养基的废培养基出口。
该系统还可以包括一个软弹性体屏障，将滤板和传递溶液施加器包围在外壳内，软弹性体屏障和外壳形成生物反应器。所述外壳可以包括一个滤板底座，所述滤板底座被配置成倾斜、旋转和/或振动所述滤板。
传递溶液施加器可包括机械臂和喷头，喷头为一次性装置。滤板的尺寸可以容纳107个以上的t细胞。该系统可配置为自动向：向培养基中的滤板提供细胞；移除培养基以在滤板顶部形成细胞单层；在细胞单层上施加雾化传递溶液；培养细胞；对培养的单层细胞施加停止溶液；向细胞单层提供新培养基；倾斜、振动和/或旋转滤板从而将细胞重新悬浮在新培养基中。该系统配置为重复应用雾化传递溶液、培养和施用停止溶液。
传递溶液施加器可包括雾化器。传递溶液施加器可被配置为每次驱动输送10-300微升的传递溶液。所述系统还可进一步包括温度控制系统，所述温度控制系统被配置为控制所述传递溶液和/或所述平板(包括孔)的温度。所述传递溶液可包括水溶液、所述水溶液包括有效载荷和浓度大于2％(v/v)的醇。所述醇包括乙醇。所述水溶液可包含大于5％的乙醇。所述水溶液可包括5-30％的乙醇。水溶液可以包括12％或25％的乙醇。水溶液可包括12.5-500mmkcl(氯化钾)。水溶液可包含106mmkcl。
该系统可进一步包括滤板，并且孔可被配置为包含大量非粘附细胞。所述非粘附细胞可包括外周血单核细胞。所述非粘附细胞可包括免疫细胞。所述非粘附细胞可包括t淋巴细胞。其中，有效载荷可以包括信使核糖核酸(mrna)。该mrna可以编码基因编辑组合物。基因编辑组合物可降低pd-1(程序性细胞死亡蛋白1)的表达。mrna可编码嵌合抗原受体。
该系统可用于将货物化合物或组合物递送至哺乳动物细胞。非粘附细胞群可是单层。
在依旧另一方面，一种系统可以包括一个腔室；一个设置在腔室第一端的盖子；一个设置在腔室第二端的底座；以及一个设置在腔室内的过滤器支架。
以下一个或多个特征可以被包含在任何可行的组合中。过滤器支架可以包括以预定图案排列的多个孔。过滤器支架可以包括多个目标，其中多个孔被布置成允许在与多个孔相对应的区域将细胞沉积在过滤器上。该系统还可以包括设置在过滤器支架和底座之间的垫圈。该系统还可以包括位于过滤器支架内的过滤器支架插件，以容纳过滤器支架和过滤器支架插件之间的过滤器。所述过滤器支架插件可包括凹形顶面。所述过滤器支架插件可以包括与所述多个目标相对应的多个开口。过滤器支架可包括三个目标。过滤器支架可包括七个目标。过滤器支架可包括19个目标。所述多个目标可以以方形图案、矩形图案、三角形图案或线性图案排列。
该系统还可以包括控制器，该控制器被配置为操作泵、阀门、加热元件、冷却元件和搅拌装置中的至少一个。泵可以是蠕动泵或容积泵。所述盖还可以包括压力端口和孔。底座可以包括一个用于接收培养基或排出培养基的端口。所述盖还可以包括隔膜。所述压力端口可以包括淋浴头，所述淋浴头在其端部包括多个孔。0.2微米的过滤器可以连接到压力端口。该系统还可以包括夹管阀，该夹管阀配置为通过0.2微米过滤器打开和关闭通向大气的压力端口。该系统的腔室可以包括用于提取处理细胞的端口。该系统的尺寸可以处理大于1×109的t细胞。
所附附图和后续具体实施方案部分阐述了这里描述的主题内容的一个或者一个以上变化形式的细节。从说明书和附图以及权利要求书中，这里描述的主题内容的其他特点和优势变得显而易见。
附图说明
图1示出了涉及细胞工程的处理/过程的示例性实施方式。
图2示出了用于跨细胞膜的无载体有效载荷传递的细胞工程平台的示例性实施方案。
图3示出了图2的细胞工程平台的示例性实施方案，为了说明的目的分解了其中一部分。
图4a-4c显示了所述细胞工程平台示例性实施方案的盖。
图5示出根据单元工程平台的示例性实施例的基底。
图6显示了本发明细胞工程平台示例性的实施方案中的过滤器支架。
图7a-7c显示了本发明细胞工程平台示例性的实施方案中过滤器支架插件的多种结构。
图8a-8c显示了本发明细胞工程平台示例性的实施方案中密封垫的多种结构。
图9a-9c显示了不含载体的有效装载穿过细胞膜的传递的流程图。
图10显示了细胞工程平台的示例性实施方案。
图11a-11c显示了喷雾过程的雾化器的示例性实施方案。图11d显示了细胞沉积过程之后的示例性图像，并且图11e-11g显示了雾化器操作的质量流量调节示意图。
图12是计算机辅助设计(cad)图，显示了安装三个喷头的示例性实施方案。
图13显示了只有一个喷头的cad图。
图14a-14f显示了展示腔室组件的示例性实施方案。
图15a显示了具有支持系统和安装架的细胞工程平台示例性的实施方案的图像，并且图15b显示了移除腔室之后的平台的图像。
图16是一种计算机辅助设计(cad)图，显示了用于细胞疗法的示例性的临床细胞工程平台。
图17是所述平台某一部分的放大视图。
图18是cad图，显示了滤板和过滤器的实施例。
图19是cad图，显示了示例性平台和滤板旋转的横截面图。
图20a-20c显示了一系列图片，显示了所述平台示例性实施方案的各个组分。
图21是示例性平台的功能框图。
图22是示意图，显示了示例性平台的一次性部分和可重复使用部分。
图23是表，显示了示例性平台的一些实验表现能力。
图24是表，显示了可以与本发明示例性平台相整合的可兼容的技术。
图25是流程图，显示了示例性的细胞工程处理步骤。
图26是流程图，显示了该示例性平台可以解决生产过继性细胞疗法过程中遇到的细胞工程问题。
图27是一系列图显示了本平台中使用的其他示例性生物反应器设计。
图28是美国食品和药物管理局(usfda)批准的kymriah(tisagenelecleucel)的图像，用于治疗儿童和年轻成人急性淋巴细胞白血病(all)，后者利用人体自身的t细胞与癌症作斗争。
图29是一种过程流程图，显示了本发明主题内容一些方面的子过程。
图30显示了示例性平台的示例性操作循环，与图29所示类似。
图31显示了分离和激活100万个细胞的处理时间和复杂度的比较。比较了外周血单个核细胞(pbmcs)、分化3细胞簇(cd3+)和pant细胞.
图32显示了处理起始材料(例如，细胞和活化试剂)与循环次数、细胞数量、冷冻瓶数量和冷冻袋数量的比较结果
图33显示了本发明主题内容的其他示例性平台。
图34是cad图显示了一次性生物反应器的实施例.
图35显示了添加停止溶液的滤板容器。
图36显示了添加新培养基的滤板容器。
图37显示了操作过程中生物反应器的倾斜。
图38显示了在细胞培养基“倒出”期间滤板容器，其中将容器(例如反应器)倾斜、旋转和振动，以便于去除培养基中的细胞。
图39显示了膜支架的实施例。
图40显示了示例性系统。这是一个中间系统，其中可装载高达5x107个细胞。该系统与临床系统(全规模，1x109个或者更多的细胞)具有相同的特点，但是不包括平动喷头系统。相反，该系统利用单一喷头或者多头喷头阵列。
在不同的附图中相同的序号表示相同的部件。
具体实施方案
尽管取得了一些进展，但某些粒子和/或分子向细胞的传递仍然是一个挑战。分子的大小或电荷等因素可以限制和/或阻止分子进入细胞。特别是，由于细胞的分子和/或膜，跨细胞膜的传递可能很复杂。细胞膜或质膜是一种半透性的生物膜，起着选择性屏障的作用。细胞膜调节细胞的内部化学成分。例如，选择性分子只能通过细胞膜被动地扩散到细胞膜上。疏水性小分子(如o2、co2和n2)和不带电的小极性分子(如h2o和甘油)可以被动地扩散到细胞膜上。较大的、不带电的极性分子(如氨基酸、葡萄糖和核苷酸)和离子(如h+、na+、k+和cl-)不能被动地在细胞膜上扩散。
图1说明了涉及细胞工程的治疗/过程的示例性实施方案。参考图1，可以从患者身上提取细胞，分离(例如浓缩或富集)，然后用细胞工程方法进行处理。经过细胞工程处理的细胞可以被扩增并返回给病人。对于跨细胞膜传递，可以使用病毒载体的方法。然而，基于病毒载体的方法通常需要高成本和复杂的过程，提供有限的可及性，并产生可变和不一致的结果。也可以使用基于电穿孔的方法。然而，基于电穿孔的方法通常导致更高的细胞损伤，并提供较差的细胞恢复和细胞功能。
本发明的目的是提供一种无载体传递方法，以解决细胞工程技术的成本和复杂性挑战。为了提供一种可靠且一致的细胞治疗方法，本发明主题内容提供了一种细胞工程方法和平台，通过将细胞与传递溶液(例如，载体)相接触将化合物或者化合物的混合物(例如有效载荷)传递穿过细胞膜，其中，所述传递溶液含有有效载荷和可逆渗透或溶解细胞膜的试剂。具体而言，将所述细胞供给悬浮液中的系统，通过排出所述悬浮液形成所述细胞的单层，使用(例如，喷射)所述传递溶液以使其渗透所述细胞，并且所述有效载荷通过被渗透的细胞膜输送。
使用本发明的平台的一些实施方案，在无载体有效载荷传递过程之前和/或之后还可以进行其他的细胞工程化过程，这显著地提高了生产力并使整体过程被简化。此外，无论是非病毒转染方法还是病毒转染方法都可以在单个平台内进行。因此，该平台示例性的实施方案可以比他方法或者系统提供更好的成规模小，并且在单一过程中可以处理1011或者更多的细胞。
在一些实施方案中，用于跨细胞膜传递有效载荷的平台可用于无载体有效载荷传递、病毒有效载荷传递或无载体和病毒的有效载荷传递的组合。例如，通过将含有细胞的培养基通过过滤器排出而将细胞收集到过滤器基板上，之后，可将包含病毒有效载荷的溶液传递到所收集的细胞，从而在平台中进行病毒有效载荷的传递。作为选择或者另外，可在单个装置内对相同细胞执行无载体的病毒有效载荷传递过程，这可以减少处理步骤、时间和/或成本，增加细胞吞吐量、生存能力和治疗的有效性，并且，减少当细胞在多个设备之间传输时可能发生的细胞污染。在2019年5月31日提交的、标题为“向细胞群进行病毒传递的方法及病毒生产”，代理人案卷号为“048831-520p01us”的第62/855241号美国临时专利申请中讨论了病毒有效载荷传递的其他方面，该专利的全部内容通过引证在此全部并入本文。
此外，本发明主题内容的一些实施方案可以提供一个细胞工程平台，该平台可以将有效载荷/货物化合物和组合物的无载体递送技术缩放到非粘附细胞中。该示例平台可以快速实现对大量细胞的传递。例如，平台的一些实施方案可以在一次使用中传递107到109个或更多个细胞。该平台可以是一个封闭的系统，能够进行无菌转染，可以将mrna和rnp传递给原代t细胞，使用方便，能够重复传递等。另外，可使用本发明所述平台处理人类胚胎肾(hek)细胞。
该平台可通过以下步骤实现将有效载荷穿过非粘附细胞的细胞质膜的传递：提供非粘附细胞群并使细胞群与一定体积的水溶液相接触，所述水溶液包括有效载荷和浓度大于2％(v/v)的醇。例如，所述醇包含乙醇，例如大于5％的乙醇。在一些实施例中，所述水溶液包含5-30％乙醇，例如12％或25％乙醇。其他成分也是可以的。
本发明主题内容还提供了一个平台，该平台可以自动化无载体和/或病毒有效载荷的传递过程，并允许在各种规模上执行该过程。当细胞被手动加载到平台和/或从平台上手动卸载时，系统的吞吐量受到限制，从而给临床过程/治疗上的应用带来困难。根据操作员和/或各种环境参数的区别，可能存在污染和不一致的工艺问题。通过过程自动化，可以更一致地执行无载体有效载荷输送过程，可以显著减少对污染的担心，因此，系统可以更容易地缩放。下面，将描述平台的示例性实施例，以执行具有自动化处理的无载体的有效载荷传递过程。
实施例1
图2显示了用于跨细胞膜进行无载体有效载荷传递的细胞工程平台100的示例性实施方案，并且为了说明的目的，图3中显示了图2细胞工程平台100的示例性实施方案中部分分解的部件。参照图2和3，用于细胞工程的平台100包括腔室110、设置在腔室110的第一端的盖120、设置在腔室110的第二端的基座130、过滤器支架140和过滤器支架插件150。所述平台可包括设置在底座130和过滤器支架140之间的垫圈160。平台100还可以包括控制器。
腔室110由腔室壁包围。为了提供光学观察能力，所述腔室壁可包括(例如由以下材料制成)透明塑料材料，例如由聚丙烯、丙烯酸、聚碳酸酯等制成。所述腔室壁可以具有圆柱形壳体的整体形状，其顶部和底部表面是开放的，并且可以基于应用和系统要求来确定腔室110的直径和高度。例如，腔室110的内径可以为110mm。可以选择或者另外地，腔室110可以包括平坦的表面，以便于使用光学成像设备监视和/或控制转染过程。尽管腔室110显示为圆柱形壳体，但本发明不限于此，并且腔室100可以具有各种形状，例如，方形、矩形和三角形，以及其他配置，比如细胞目标以线性配置排列的配置。
图4a-4c是显示盖120的图片。图4a显示盖120的顶面，图4b显示盖120的底面，并且图4c显示盖120的侧面。盖120设置在细胞工程平台100的顶部，从而密封平台100的腔室110。为了密封，盖120可以包括o形环121。盖120可以包括压力端口122。压力端口122允许腔室110连接到压力源。压力源可向平台100的腔室110提供正压力或负压。参照图4a和4c，压力源可连接至压力端口122的顶部，该顶部位于盖120的上方或外侧。压力端口122的底部(位于盖120的下方或内侧)可包括淋浴头，该淋浴头包括多个孔，用于将流体分布在多个孔上，以便将压力更均匀地供应到腔室110中。如图4c所示，淋浴喷头的多个孔可以基本上朝向侧面，以防止通过孔输送的气流(例如，气体或液体)干扰(例如，吹扫)沉积在过滤器上的细胞。
作为选择或者另外，压力端口122可以允许腔室110连接到(例如，暴露于)环境压力中。此外，压力端口122可允许腔室通过过滤器连接到环境压力。例如，过滤器可以是0.2微米的过滤器。过滤器也可以是纳米颗粒过滤器和/或高效微粒空气(hepa)过滤器。当压力端口122通过过滤器连接到环境压力时，腔室110可能由于重力而不是压力源而排放。为了打开或关闭压力端口，可以在过滤器的上游设置一个阀门。例如，阀门可能是夹管阀。
盖120可以包括(例如，由以下材料组成)不锈钢材料，例如ss316、塑料材料等。盖120还可以包括至少一个孔123，以容纳雾化器、传感器等。传感器可以包括温度传感器、湿度传感器和压力传感器中的一个或多个。当雾化器安装在至少一个孔123中时，雾化器可以通过诸如万向节之类的方向调整装置来安装，以允许调整雾化器的方向。在一些实施方案中，盖120可包括至少一个安装孔124，以容纳柱170，以将盖120固定到柱170并支撑平台100。
图5显示了平台100的底座130。底座130设置在腔室110的底部，并安装膜保持器140。底座130可以包括排油口131。作为选择或者另外，底座130可包括一个或多个真空端口、连接到注射器的导管(用于在介质中重新悬浮细胞以提供在不同浓度或不同介质下再悬浮的机会)、加热元件、温度传感器(例如，pt100rtd、热电偶等)，以及在该过程中提供搅拌的振动装置。底座130可包括孔132，以容纳安装在其上的柱170。
图6显示过滤器支架140。过滤器支架140可由缩醛、铝或类似物制成。过滤器支架140设置在腔室110的底部，并固定在底座130上。过滤器支架140可在其上表面容纳至少一个过滤器。过滤器支架140可以包括一个目标，该目标靶点被配置成允许细胞沉积在过滤器上。过滤器支架140可以包括多个目标。过滤器支架140可包括三个目标。在与每个目标相对应的位置，过滤器支架140可以包括多个孔141，以允许细胞悬浮培养基通过孔141被传递。当通过盖120的压力端口122向腔室110施加正压力时，细胞悬浮培养物可通过多个孔141和底座130排出，同时细胞被收集在过滤器表面上，从而形成细胞的单层。作为选择或者另外，可以通过将连接到0.2微过滤器的压力端口122的阀门打开，使之与环境压力联通，从而通过重力排放介质来执行排放。多个孔141可以被布置成具有预定图案。例如，孔141可以围绕过滤器的外径和/或沿着过滤器的多个径向方向对齐排列。过滤器支架140还可包括o形环142，以在过滤器支架140和腔室110之间提供密封。
图7a-7c显示过滤器支架插件150的各种配置。过滤器支架插件150设置在腔室110的底部和过滤器支架140的上表面上，从而将过滤器固定(例如，固定或夹紧)在过滤器支架140和过滤器支架插件150之间。如图7a至7c所示，过滤器支架插件150可具有各种配置。例如，过滤器支架插件150可以具有包括三个目标(图7a)、一个目标(图7b)或开放的内部部分(图7c)的配置。具有三个目标(图7a)的过滤器支架插件150仅在过滤区域151内促进细胞分布和细胞恢复。当需要更小数量的细胞时，可以使用带有一个目标(图7b)的过滤器支架插件150。如图2所示，过滤器支架插件150可包括凹面形状的上表面，以允许细胞沉积在过滤器上以更有效地接收喷雾羽流。凹面形状还可以防止过滤器在填充和排出过程中在靠近中心的地方鼓包，并重新悬浮细胞。目标的配置不限于所示的配置，并且还可以具有多于三个目标，例如，7到19个或更多个目标。所述多个目标可被布置成方形、矩形、三角形和/或线性配置。
在一些实施方案中，平台100可包括垫圈160，例如橡胶垫圈，以在底座130和过滤器支架140的底面之间提供密封。底座130和过滤器支架140之间的密封防止细胞培养基在底座130和过滤器支架140之间流动，允许整个细胞培养基流过过滤器，从而提高细胞收集效率。如图8a-8c所示，垫圈160可具有与过滤器配置相对应的各种形状。图8c示出了适于与如图7c所示的开放式内部结构一起使用的垫圈160的配置。图8a和8b显示了将与图7a所示的三个目标配置一起使用的垫圈160。
在一些实施方案中，平台100包括诸如蠕动泵或容积泵之类的泵以及用于自动控制流体流量的阀门。泵可由控制器控制。控制器还可以控制雾化器、温度/压力传感器、底座的加热元件和振动装置。对于雾化器控制，控制器中可能包括一个人机交互界面(hmi)(例如，欧姆龙nb3q-tw01b5英寸hmi)和可编程逻辑控制器(plc)(例如，欧姆龙nx1nx1p29024dt1plc)硬件平台和一个3通道回转控制器印刷电路板(pcb)。控制器可以包括多个模块，这些模块负责控制平台的各个元件。控制器还可以包括处理器，其被配置为执行程序指令以执行无矢量有效载荷传送处理、操作用于用户接口的输入/输出设备以及操作通信模块以将平台连接到网络。
参考图9a，图9a描述了跨细胞膜的无载体有效载荷传递的示例性方法。在操作中，靶细胞可以在特定浓度的培养基中混合。例如，大约6000万个细胞可以混合在大约60毫升的培养基中。所制备的含细胞培养基可经由一次性管组和/或无菌针/套管引入所述腔室(步骤s11)。含有细胞的培养基可通过隔膜或盖子中的端口(例如，用于接收塑料焊接管的隔板)供应至腔室。添加过程可以手动执行，也可以使用泵(例如蠕动泵或容积泵)和控制器自动执行。将含有细胞的培养基加入腔室后，腔室由关闭阀密封。类似地，可以手动执行阀门操作，也可以使用例如电磁阀和控制器自动执行阀门开关操作。
在阀门关闭并密封腔室后，培养基通过过滤器排出，从而在过滤器表面沉积目标细胞(例如，t细胞)(步骤s12)。例如，正压力可通过盖的中央压力端口供应至腔室。培养基从腔室排出后，可向腔室提供真空压力，以释放腔室中剩余的正压力。可能需要也可能不需要用真空压力消除剩余的正压力。在一些实施例中，正压力和真空压力可在介质排出期间交替地提供给腔室，以调整/重新安排过滤器上的细胞沉积。介质也可以通过打开阀门(例如夹管阀)排出，使盖子的压力端口暴露在环境压力下，并通过重力排放介质。可在压力端口处设置过滤器(例如0.2微米过滤器)，以防止外来颗粒物进入腔室。
图11d示出步骤s12之后的细胞沉积方式的示例性图像。图11d是使用模拟细胞行为的彩色珠子拍摄的图像。由于过滤器支架140中有多个孔141，因此细胞沉积方式基本上对应于多个孔141的图案。对于步骤12，可选择适当孔径的滤膜以进行有效的细胞沉积。滤膜可使液体易于过滤，同时保留细胞，且不影响细胞活力。通过径迹蚀刻技术获得的孔隙具有最高的产量(例如，对活性的影响最小，滤液中细胞的损失最小)。为了避免过滤过程中的变形并促进均匀的细胞分布在目标表面上，可以在过滤器下方设置具有比过滤器更厚的膜的排水盘。例如，过滤器可为9μm至30μm厚，且排水盘可为80μm厚。在过滤过程中，当将悬浮细胞的液体(如细胞培养基)排出时，细胞只均匀地分布在与靶点相对应的过滤区域，而在非过滤区域损失最小。
因此，细胞沉积方式可以被控制并且限制在特定的区域，在此区域中细胞作为单层沉积在过滤器上。在此，细胞的“单层”可指基本上水平分布并形成一个或多个垂直细胞层的细胞。单层可包括一个细胞层、一至两个细胞层、一至三个细胞层、一至五个细胞层或更多。细胞层的数目不限于此，并且在一些实施方案中，单层可指任何数目的细胞层。
随后，通过雾化器喷射含有细胞渗透剂和有效载荷(例如，货物)的传递溶液(步骤s13)。控制器可以控制喷洒量和持续时间。例如，传递溶液可喷洒约300毫秒。对于喷洒传递溶液，货物可经由微绒毛引入喷头或经由可再密封注射口注入。
在喷洒传递溶液后，通过一次性管组和/或无菌塑料针/套管引入停止溶液(步骤s14)。停止溶液可通过隔膜或盖上的端口供应至腔室。停止溶液可以手动供应，也可以使用泵和控制器自动供应。将所需量的停止溶液引入腔室。例如，可在大约20秒内引入约10ml停止溶液。然而，步骤s14不限于停止溶液应用，并且还可提供取决于所应用溶液的组成的细胞清洗过程。
引入停止溶液后，重新悬浮细胞(步骤s15)。对于重新悬浮，可通过注射器或泵引入约60ml的培养基，该培养基可以是新培养基或先前从培养箱中排出的已使用的培养基。新培养基可以通过隔膜或盖上的端口供给到腔室中。作为选择或者另外，新培养基可以通过排水孔从过滤器下方供给到腔室中。可通过以正压力将新培养基注入所述腔室，或通过向所述腔室施加真空压力(例如，通过所述压力端口122)将所述新培养基供给所述腔室，从而允许所述腔室吸收所述新培养基。例如，再悬浮步骤的持续时间可以是大约3秒到大约1分钟。在一些实施方案中，为了改善再悬浮作用，可在再悬浮过程中或再悬浮过程之后使用各种方法，例如平台倾斜、搅拌(例如，平台振动)等。然而，步骤s15不限于再悬浮步骤，并且还可以提供细胞浓度改变过程、细胞洗涤过程和/或细胞培养基改变过程。细胞浓度改变过程、细胞洗涤过程和/或细胞培养基改变过程也可在步骤s11和s12中通过在步骤s12之后重新填充腔室并根据需要重复多次排出/重新填充过程来执行。
在将细胞重新悬浮在培养基中后，收集工程细胞以进行进一步处理(步骤s16)。作为选择或者另外，在收集和/或进一步加工之前，可以在腔室中培养工程细胞。平台可在后续程序处理后进行冲洗或洗涤。作为选择或者另外，整个腔室或腔室的一部分可以制成一次性单元，可以在使用后进行处置并用新单元替换。
图9b和9c显示了具有示范性工艺参数的示范性工艺流程。然而，工艺参数不限于图9b和9c中所示的参数，并且工艺参数，例如培养基的数量(体积)、细胞数量、浓度、每一步骤的持续时间，可根据应用而变化。参照图9b，第一步可以是在30ml培养基中混合6×107个细胞(步骤s21)。通过施加20mbar的正压力，可以移除培养基(步骤s22)，这需要40到60秒。在步骤s23中，100μl传递溶液可经由420ms递送至目标1，且随后可移动雾化器且可在目标2及3上重复传递溶液。传递后，可将细胞培养30秒(步骤s24)，并可将1ml停止溶液传递至每个靶点进行30秒培养(步骤s25)。要重新悬浮细胞，可以从底部的泵中提供新培养基。当使用环插入物时，可使用75ml培养基(步骤s261)，并且当使用3目标插入物时，可使用50ml培养基(步骤s262)。在步骤s27中，重新悬浮的细胞可被冲洗15次(即，每个目标5次)。最后，可将工程细胞转移至t75烧瓶中并储存于培养器中(步骤s28)。
参照图9c，可在30ml培养基中混合6×107至8×107细胞(步骤s31)。可借助重力移除培养基(步骤s32)，所述重力需要40至60秒。在步骤s33中，60-100μl传递溶液可在420ms以上被传递至目标1，并且随后，可移动雾化器并且可在目标2和3上重复传递溶液。传递后，将细胞培养30秒(步骤s34)，并将5ml停止溶液递送至每个目标进行30秒的培养(步骤s35)。要重新悬浮细胞，可以从底部的泵中提供培养基。当使用环插入物时，可使用75ml培养基(步骤s36)。可以添加等待10分钟的步骤(步骤s37)。在步骤s38中，重新悬浮的细胞可被冲洗15次(即，每个目标5次)。最后，可将工程细胞转移至t75烧瓶中并储存于培养器中(步骤s39)。
图10显示了细胞工程平台的示例性实施方案，并且图11a-11c显示了用于喷涂过程的雾化器1100的示例性实施方案。参照图11a-11c，雾化器1100在其下表面(图11a)上包括液体孔板1101和气体孔板1102。在雾化器1100的上表面上，可以形成液体管入口1103和空气管入口1104(图11b)。相应地，液体孔板1101通过液体孔板入口1103连接到储液罐，气体孔板1102通过空气管入口1104连接到储气罐，如图11c所示。
气体(如空气)流量可由质量流量控制器或体积流量控制器控制。通过使用质量/体积流量控制器，可通过雾化器1100供应恒定量(例如，恒定质量和/或恒定体积)的气体，从而确保要喷射的液体量恒定，并且液滴尺寸保持一致，而不考虑腔室内的压力、温度、湿度、开/关定时等等方面的变化。质量/体积流量调节也可使雾化溶液更精确、更可重复地投加到细胞中。通过主动控制驱动气体的质量/体积流量，喷雾羽流对羽流密度、角度、速度、漩涡形成、液滴尺寸、沉积面积等的变化不太敏感，从而产生更可重复和稳定的转染性能。
图11e显示了驱动气体质量/体积流量调节的气动回路的实施例。驱动气体可以从气瓶1110供应，穿过气体供应1111、控制阀1112、孔板1113和背压调节器1114。随后，在通过气体管线1117输送至雾化器1116之前，可由质量/体积流量控制器1115控制气体。要喷雾的溶液可由泵1118供应。泵1118可以是螺杆泵、容积泵、气动射流泵等。因此，可以通过雾化器1116喷射溶液并将其输送到腔室1119中。图11f和11g显示了喷雾操作的控制和流动路径实施例。图11f显示一个喷头的路径，图11g显示三个喷头的路径。
图12是一张计算机辅助设计(cad)图，说明了安装了三个喷头1200的示例性实施例。图13显示其中一个喷头1200的cad图纸。参照图13，喷头1200包括喷嘴1203、局部液体蓄水池1201和局部液体蓄水池1206的盖，支撑在圆柱形基板1202上。螺纹孔1204允许将喷头固定到腔室上。圆柱形基板1202包括阀1205，例如夹管阀，用于启动和/或停止来自储液罐的流体流动。
图14a-14f展示了一次性腔室组件的示例性实施方案。参照图14b，示例性一次性腔室组件1400可包括例如由聚碳酸酯制成的室壁1401、缝焊盖模块1402、带焊接膜的基底模块1403、雾化器安装孔1404、细胞进出口1407和三通阀1408。为了操作雾化器，有效载荷和传递溶液可通过培养基端口1405供应，并且可通过气压端口1406供应压缩空气。图14c显示示例性一次性腔室组件的侧视图，图14d显示示例性一次性腔室组件的剖视图，并且图14e显示示例性一次性腔室组件的前视图。图14f显示了另一个示例性一次性腔室，该腔室由五个目标和五个喷头组装而成。
图15a显示了具有支持系统和安装架的细胞工程平台的示例性实施方案，而图15b显示了移除腔室的平台。
在实施例1部分中描述的示例性实施方案可以在一次转染中从大约107个细胞转染到大约109个细胞或更多个细胞。该平台可使诸如mrna等货物持续地输送到t细胞。该系统可封闭在生物安全柜内进行无菌操作，也可作为封闭系统用于任何环境。平台操作可手动或自动进行。对于自动化操作，可通过控制器和控制软件对流体处理系统进行自动控制。平台可配置为多用途系统，清洗后可重复使用。在一些实施方案中，该平台可以被配置为一次性使用系统，其包括诸如一次性腔室单元之类的一次性部件。在一些实施方案中，该平台可用于跨细胞膜的无载体有效载荷传递和/或跨细胞膜的病毒有效载荷传递。
由于过程自动化，该细胞工程平台可以更稳定地执行无载体有效载荷传递过程，污染可以最小化，因此，系统可以被缩放。因此，细胞工程平台可以提供可靠的无载体传递方法，降低细胞工程技术的成本和复杂性。
实施例2
图16是计算机辅助设计(cad)图，说明了用于细胞治疗的另一个临床细胞工程平台实施例，而图17是该平台一部分的放大视图。平台1700包括带有喷头的机械臂1701、包围过滤器底座1703的软弹性圆顶1702和喷雾头。该平台还包括培养基、试剂、货物和废物端口，从而实现了一个封闭系统。
机械臂1701可将喷头携带到弹性体圆顶1702内的多个位置，以便将溶液喷洒到过滤器底座1703上形成单层的细胞。另外，过滤器底座1703可以进行倾斜和旋转从而使细胞浸泡在试剂中。
图18是说明滤板和过滤器实施例的cad图。为了实现传递，可以在滤板上形成细胞单胞体。向容器施加正压力。在正压期间，输入和输出方向上的夹管阀可以关闭。根据活化程度，该过滤器可以跟踪蚀刻并一次性使用。过滤器支架包括一个孔模式，该孔模式的设计旨在完全和快速地清除培养基。在操作过程中，喷雾可在单层形成后立即进行。
图19是说明示例性平台横截面图和滤板旋转的cad图。平台1700的形状用于收集滤板下的废弃培养基。平台1700可包括软弹性圆顶1702、用于培养基和停止溶液的环形端口1704、过滤器底座1705、废培养基腔室1706和倾斜/旋转单元1707。过滤器底座1705可由聚砜模制而成，当从培养基中加压挤出细胞时，可形成模板。在操作过程中，该装置可以倾斜和旋转以移除悬浮在新培养基中的细胞。
图20a-20c是一系列图片，显示了平台一个示例性实施方案的组件。图20a显示了一个机械臂实施例，图20b显示了一个用于容纳平台的安全外壳的实施例，而图20c显示了一个过滤盘的实施例。过滤盘可以是直径为293mm的聚碳酸酯轨道蚀刻(pcte)过滤器。
图21是示例性平台的功能框图。该平台包括将新培养基、停止溶液、培养基中的细胞和传递溶液中的货物应用到主生物反应器中的模块。此外，该平台可以包括一个0.2微米到大气尺寸的过滤器。该平台可以利用废物和工程细胞的输入和输出来执行传递方案。
图22是说明实施例平台的一次性和可重复使用部分的图。所述机械臂可与所述封闭式滤筒进行磁性耦合，所述封闭式滤筒可包括一个一次性滤筒，该滤筒可保持喷头和过滤器底座之间的局部环境。一次性使用的管道可以把液体带进和流出生物反应器。可以通过注射器或其他方式将货物引入传递溶液中。
图23是表格，显示了示例性平台的一些示例性功能。在一些实施方案中，系统输入可以包括细胞、培养基、分子货物、停止溶液和空气和/或气体。在进行无载体有效载荷传递时，按照操作方案进行相关的调节和标准操作。相关的标准操作包括现行的生产自动化管理规范(goodautomatedmanufacturingpractice(cgamp),astme2500,iso14791,21cfr§211.68,and21cfr§1271.160[d])。
在一些实施方案中，所述细胞可包括粘附细胞或非粘附细胞。粘附细胞可包括原代间充质干细胞、成纤维细胞、单核细胞、巨噬细胞、肺细胞、神经元细胞、成纤维细胞、人脐静脉(huvec)细胞、中国仓鼠卵巢(cho)细胞和人胚胎肾(hek)细胞或永生化细胞(例如细胞系)中的至少一个。在优选实施方案中，细胞群包括非粘附细胞，例如，群中的非粘附细胞％为至少50％、60％、75％、80％、90％、95％、98％、99％或100％非粘附细胞。非粘附细胞包括原代细胞和永生化细胞(例如细胞系的细胞)。示例性非粘附/悬浮细胞包括原代造血干细胞(hsc)、t细胞(例如，(分化群3)cd3+细胞、(分化群4)cd4+细胞、(分化群8)cd8+细胞)、自然杀伤(nk)细胞、细胞因子诱导杀伤(cik)细胞、人脐血cd34+细胞、b细胞或细胞系比如jurkatt细胞系。t细胞的非限制性实施例可包括cd8+或cd4+t细胞。在某些方面，使用cd3+t细胞的cd8+亚群。cd8+t细胞可通过使用抗cd8微球的阳性分离从pbmc群中纯化。
在实施例中，细胞在标准细胞培养基中培养，所述标准细胞培养基例如使用rpmi基础培养基的完整rpmi(罗斯韦尔公园纪念研究所培养基)、热灭活胎牛血清(fbs)，例如约10％v/v青霉素链霉素和l-谷氨酰胺。在一些实施例中，标准培养基可补充细胞因子，例如白细胞介素-2(il-2)(200u/ml)。
在实施方案中，细胞因子的浓度可为约10u/ml至约500u/ml。在其它实施例中，细胞因子的浓度可为约50u/ml、约100u/ml、约200u/ml、约300u/ml、约400u/ml或约500u/ml。细胞因子浓度可约为200u/ml。
在一些实施例中，在传输方法中使用细胞相容性培养基。例如，primexv(irvinescientific)和x-vivo(lonza)是可以使用的无血清和无动物成分的培养基。)。在一些实施例中，细胞培养基补充了更高浓度的细胞因子。例如，细胞因子可以包括白细胞介素-2(il-2)，以提高增殖率(tumehp,etal.,jimmunother2010.33(6):759-768和bessermj,etal.,cytotherapy2009.11:206-217)。在其它实施例中，培养基可包括immuculttm-xf扩展培养基(stemcelltechnologies)。与primexv一样，它也是一种无血清、无异种t细胞培养基。在一些实施例中，texmacs(miltenyibiotech)可作为t细胞培养的替代无血清培养基。cts-optmizer-t细胞扩增sfm也可作为t细胞培养的无血清培养基。
在实施方案中，分子货物(例如，有效载荷)可包括基因编辑工具、小化学分子、肽或蛋白质或核酸。有效载荷可以包括信使核糖核酸(mrna)。所述mrna可以编码基因编辑组合物。mrna可编码嵌合抗原受体。
在其他实施方案中，要传递的分子货物(例如，有效载荷)可以包括编辑基因组dna的组合物(即，基因编辑工具)。例如，基因编辑组合物可包括一种化合物或者复合物，所述化合物或者复合物能够切割、刻痕、剪接、重排、转位、重组或以其他方式改变基因组dna。作为选择或者另外，基因编辑组合物可包括以下化合物：(i)可包括基因编辑复合物，所述基因编辑复合物切割、刻痕、拼接、重排、移位、重组或以其他方式改变基因组dna；或(ii)所述化合物可经处理或改变为包含在切割、刻痕的基因编辑复合物中的化合物，所述基因编辑复合物剪接、重排、易位、重组或以其他方式改变基因组dna。在各种实施方案中，基因编辑组合物包括(a)基因编辑蛋白；(b)rna分子；和/或(c)核糖核蛋白(rnp)中的一种或多种。
在一些实施方案中，基因编辑组合物包括基因编辑蛋白，并且基因编辑蛋白是锌指核酸酶(zfn)、转录激活物样效应器核酸酶(talen)、cas蛋白、cre重组酶、hin重组酶或flp重组酶。在其他实施方案中，基因编辑蛋白可以是将归巢内切酶与talens(megatal)的模块化dna结合域结合的融合蛋白。例如，megatal可以作为蛋白质被传递，或者，编码megatal蛋白质的mrna被传递到细胞中。
在实施方案中，分子货物(例如，有效载荷)可以包括小化学分子。小分子化学分子可以小于1000da。化学分子可包括
在实施方案中，分子货物可以是肽。所述肽可以为5000da。该肽可以包括商品名为kalbitor的艾卡拉肽(ecallantide)，这是一种60个氨基酸的多肽，用于治疗遗传性血管性水肿和防止心胸外科手术中的失血)、利拉鲁肽(市场上的商标名为victoza，用于治疗ii型糖尿病，商标名为saxenda的用于治疗肥胖症)和icatibant(商品名firazyer，一种治疗遗传性血管水肿急性发作的拟肽制剂)。小干扰核糖核酸(sirna)分子的长度约为20-25个碱基对，或约为10000-15000da。sirna分子可降低任何基因产物的表达，例如，敲除临床相关靶基因或模型基因的基因表达，例如甘油醛-3磷酸脱氢酶(gapdh)sirna、gapdhsirna-fitc、亲环素bsirna和/或laminsirna。蛋白质疗法可包括肽、酶、结构蛋白、受体、细胞蛋白质或循环蛋白质或其片段。蛋白质或多肽约100-500000da，例如1000-150000da。该蛋白质可包括任何治疗性、诊断性或研究性蛋白质或肽，例如β-乳球蛋白、卵白蛋白、牛血清白蛋白(bsa)和/或辣根过氧化物酶。在其它实例中，该蛋白质可包括癌症特异性凋亡蛋白，例如，肿瘤坏死因子相关凋亡诱导蛋白(trail)。
抗体的分子量一般约为150000da。该抗体可包括抗肌动蛋白抗体、抗gapdh抗体、抗src抗体、抗myc抗体和/或抗raf抗体。该抗体可包括绿色荧光蛋白(gfp)质粒和gluc质粒。dna分子可以大于5000000da。在一些实施例中，抗体可以是鼠源性单克隆抗体，例如，依妥莫单抗替酯(ibritumomab-tiuxetin)、托莫单抗-cd3、tositumamab、人源抗体或人源化小鼠(或其他起源物种)抗体。在其它实施例中，抗体可为嵌合单克隆抗体，例如，阿昔单抗、巴昔单抗、西妥昔单抗、英夫利昔单抗或利妥昔单抗。在其它实施例中，抗体可为人源化单克隆抗体，例如，阿伦图扎单抗、贝伐单抗、聚乙二醇结合赛妥珠单抗(certolizumab-pegol)、达利珠单抗(daclizumab)、gentuzumab-ozogamicin、曲妥珠单抗(trastuzumab)、托珠单抗(tocilizumab)、易普利姆玛(ipilimumab)或panitumab。所述抗体可包含抗体片段，例如，阿巴特西普、阿非利塞普、阿来昔普特或依那西普。本发明不仅包含完整的单克隆抗体，而且还包括免疫活性抗体片段，例如fab或(fab)2片段；工程单链抗体分子；或嵌合分子，例如，包含一种抗体的结合特异性的抗体，例如小鼠源性抗体，以及另一种抗体的剩余部分，例如人类来源的抗体。
分子货物(例如有效载荷)可包括治疗剂。所述治疗剂，例如，药物或活性剂”指的是用于治疗或诊断目的的任何化合物，该术语可理解为意指为治疗疾病而施用给患者的任何化合物。因此，治疗剂可以包括蛋白质、肽、抗体、抗体片段和小分子。名为“抗血管内皮生长因子的人源化抗体”的美国专利第7667004号(通过引用并入本文)中描述的治疗剂可用于本文所述的方法中。治疗剂可包括顺铂、阿司匹林、他汀类药物(例如，皮塔瓦他汀、阿托伐他汀、洛伐他汀、普伐他汀、瑞舒伐他汀、辛伐他汀、盐酸异丙嗪(hcl)、盐酸氯丙嗪、盐酸硫立达嗪、硫酸多粘菌素b、氯霉素、盐酸苯氟脲和盐酸非那唑吡啶)和氟西汀中的至少一种。有效载荷可以包括诊断剂。该诊断剂可包括可检测标志或标记，例如亚甲蓝、专利蓝v和吲哚青绿中的至少一种。有效载荷可以包括一个荧光分子。有效载荷可以包括可检测的纳米颗粒。纳米颗粒可以包括一个量子点。
在一些实施方案中，所述货物可包括线性dna或者dna质粒。
在一些实施例中，在传递之后，在加入停止溶液之前对细胞进行培养。在实施例中，所述停止溶液包括磷酸缓冲液(pbs)。磷酸缓冲液的浓度可以是大约0.5xpbs.
在某些实施方案中，传递溶液可由gmp(生产质量管理规范)供应商配制，并可在10毫升的铝箔瓶中提供。单独的药物主文件(dmf)存档，以备交付解决方案。稳定性测试和分析证书(cofa)可由具有当前生产管理规范(cgmps)的供应商提供。
图24是一个表格，说明了示例性平台可以与之集成的兼容技术。例如，可以使用各种选择/隔离/浓缩试剂盒。此外，可以使用各种激活和刺激技术，例如，抗cd3(分化簇3)单克隆抗体(mab)muromonab-cd3(okt3)和白细胞介素2(il-2)、cd3/分化簇28(cd28)
图25是一个过程流程图，说明了示例性细胞工程处理步骤。示例性平台可在dynamagcts和sefia/cobe2991之间使用。在实施例中，dynabead分离和激活大约需要两天时间。激活后，可将样品添加到wave生物反应器/g-rex(气体渗透快速膨胀)中产生免疫细胞，然后使用dynamagcts(thermofisher目录号12102)进一步处理，例如用于分离t细胞、soluporeclinical、sefia/cobe2991，并且可以使用流式细胞仪测量输出
图26是一个过程流程图，说明该示例性平台可以在生产过继细胞疗法中解决细胞工程问题。
实施例3
图27是一系列图像，展示了平台上使用的另一个示例性生物反应器设计。所述示例性生物反应器处理2x107个t细胞，并在效率、生存能力和功能方面实现令人佩服的传递能力。所有吸收都是在直径约30mm的区域内完成的。在这种配置中，单次喷射可获得大于约60％的效率。在一些实施方案中，过滤器可以是具有约1μm至3μm标称孔径的聚碳酸酯轨道蚀刻(pcte)过滤器或聚酯轨道蚀刻(pete)过滤器。1μm至3μm过滤器可用于t细胞应用。在一些实施方案中，过滤器的标称孔径可为约5μm至约10μm或更大。5μm至10μm过滤器可用于hek细胞，其尺寸通常在11μm至15μm范围内。过滤材料和过滤孔径不限于此，可根据靶细胞的类型、靶细胞的大小、靶细胞的浓度等来选择过滤材料和过滤孔径。
图28是美国食品和药物管理局(usfda)批准用于治疗儿童和青年急性淋巴细胞白血病(all)患者的kymriah(tisagenelecleucel)的图像，该产品利用人体自身的t细胞与癌症作斗争。在实施例中，细胞治疗的基本单位是一个单一剂量，它可以从106个细胞到109个细胞不等。在图28中，car-t(嵌合抗原受体t细胞)治疗kimriah的剂量高达2.5×108的car+t细胞。在其他实施例中，lonzanuclearfectorlv封闭/无菌系统在大约10分钟内转染109个细胞。在实施例中，整个处理时间可约小于1小时且小于约20个步骤。
图29是根据当前主题内容的某些方面说明子过程的过程流程图。在第1步中，t细胞通过蠕动泵和1/4英寸pvc管装入培养基中。这个系统可以用试剂、细胞和气体来充注。在步骤2，通过正压力移除培养基。停止培养，添加新的培养基。在某些实施方案中，步骤2可以重复多次以改进传递效果。第三步，将生物反应器轻轻倾斜到一边，以“倾倒”细胞和培养基。第四步，轻轻摇动、旋转生物反应器，使滤膜振动，协助细胞重新悬浮并离开过滤生物反应器。在步骤5，生物反应器返回直立位置，处理重新开始，例如，返回步骤2进行额外处理，或继续将新培养基中的工程细胞泵入下一个单元工艺。
图30说明了示例性平台的一个示例性操作周期，与图29所示类似。示例子流程执行时间以大约3.5分钟的总处理时间进行了说明。
对于一些示例性实施方案，起始材料可能包括分化3(cd3+)t细胞簇或pbmc细胞(外周血单个核细胞)。细胞可通过各种方法激活，包括dynabeads(例如dynabeadscts(细胞治疗系统)微球)、可溶性cd3/cd28(分化群28)抗体，或用于t细胞活化。t细胞transact是一种高分子纳米基质，与人源化重组cd3和cd28激动剂结合，确保血液细胞群(例如pbmcs或富集的t细胞群)中的静止t细胞成功激活，而不涉及cd4(分化群4)或cd8(分化群8)。
图31说明了分离和激活100万个细胞的复杂性比较。比较了外周血单个核细胞(pbmcs)、分化3细胞簇(cd3+)和pant细胞。
图32显示了示例性数量的细胞各种处理方法的比较，例如激活试剂、循环次数、细胞数量、冷冻瓶数量和冷冻袋数量。
在一些实施方案中，所述系统输入可以包括细胞、培养基、分子货物、停止溶液和空气和/或气体。
在一些实施方案中，所述细胞可包括粘附细胞或非粘附细胞。粘附细胞可包括原代间充质干细胞、成纤维细胞、单核细胞、巨噬细胞、肺细胞、神经元细胞、成纤维细胞、人脐静脉(huvec)细胞、中国仓鼠卵巢(cho)细胞和人胚胎肾(hek)细胞或永生化细胞(例如细胞系)中的至少一个。在优选实施方案中，细胞群包括非粘附细胞，例如，群中的％非粘附细胞为至少50％、60％、75％、80％、90％、95％、98％、99％或100％非粘附细胞。非粘附细胞原代细胞和永生化细胞(例如细胞系的细胞)。示例性非粘附/悬浮细胞包括原代造血干细胞(hsc)、t细胞(例如，(分化群3)cd3+细胞、(分化群4)cd4+细胞、(分化群8)cd8+细胞)、自然杀伤(nk)细胞、细胞因子诱导杀伤(cik)细胞、人脐血cd34+细胞、b细胞或细胞系比如jurkatt细胞系。t细胞的非限制性实例可包括cd8+或cd4+t细胞。在某些方面，使用cd3+t细胞的cd8+亚群。cd8+t细胞可通过使用抗cd8微球的阳性分离从pbmc群中纯化。
在实施例中，细胞在标准细胞培养基中培养，例如使用rpmi基础培养基的完整rpmi(罗斯韦尔公园纪念研究所培养基)、热灭活胎牛血清(fbs)，例如约10％v/v、青霉素链霉素和l-谷氨酰胺。在一些实施例中，标准培养基可补充有细胞因子，例如白介素-2(il-2)(200u/ml)。
在实施方案中，细胞因子的浓度可为约10u/ml至约500u/ml。在其它实施例中，细胞因子可为约50u/ml、约100u/ml、约200u/ml、约300u/ml、约400u/ml或约500u/ml。细胞因子浓度可约为200u/ml。
在一些实施例中，在本传递方法中使用细胞相容性培养基。例如，primexv(irvinescientific)和x-vivo(lonza)是可以使用的无血清和无动物成分的培养基。在一些实施例中，细胞培养基补充了更高浓度的细胞因子。例如，细胞因子可以包括白细胞介素-2(il-2)，以提高增殖率(tumehp,etal.,jimmunother2010.33(6):759-768和bessermj,etal.,cytotherapy2009.11:206-217).在其它实施例中，培养基可包括immuculttmxf扩展培养基(stemcelltechnologies)。与primexv一样，它也是一种无血清、无异种t细胞培养基。在一些实施例中，texmacs(miltenyibiotech)可作为t细胞培养的替代无血清培养基。
在实施方案中，分子货物(例如，有效载荷)可包括基因编辑工具、小化学分子、肽或蛋白质或核酸。有效载荷可以包括信使核糖核酸(mrna)。mrna可以编码基因编辑成分。mrna可编码嵌合抗原受体。
在其他实施方案中，要传递的分子货物(例如，有效载荷)可以包括编辑基因组dna的组合物(即，基因编辑工具)。例如，基因编辑组合物可包括切割、刻痕、剪接、重排、转位、重组或以其他方式改变基因组dna的化合物或复合物。作为选择或者另外的，基因编辑组合物可包括以下化合物：(i)可包括基因编辑复合体，其切割、刻痕、拼接、重排、移位、重组或以其他方式改变基因组dna；或(ii)可经处理或改变为包含在切割、刻痕的基因编辑复合体中的化合物，剪接、重排、易位、重组或以其他方式改变基因组dna。在各种实施例中，基因编辑组合物包括(a)基因编辑蛋白；(b)rna分子；和/或(c)核糖核蛋白(rnp)中的一种或多种。
在一些实施方案中，基因编辑组合物包括基因编辑蛋白，并且基因编辑蛋白是锌指核酸酶(zfn)、转录激活物样效应器核酸酶(talen)、cas蛋白、cre重组酶、hin重组酶或flp重组酶。在其他实施方案中，基因编辑蛋白可以是将归巢内切酶与talens(megatal)的模块化dna结合域结合的融合蛋白。例如，megatal可以作为蛋白质传递，或者，编码megatal蛋白质的mrna被传递到细胞。
在实施方案中，分子货物(例如，有效载荷)可以包括小化学分子。小分子化学分子可以小于1000da。化学分子可包括
在实施方案中，分子货物可以是肽。肽分子量约为5000da。该肽可以包括商品名为kalbitor的艾卡拉肽(ecallantide)，这是一种60个氨基酸的多肽，用于治疗遗传性血管性水肿和防止心胸外科手术中的失血)、利拉鲁肽(市场上的商标名为victoza，用于治疗ii型糖尿病，和saxenda用于治疗肥胖症)和艾替班特(icatibant)(商品名firazyer，一种治疗遗传性血管水肿急性发作的拟肽制剂)。小干扰核糖核酸(sirna)分子的长度约为20-25个碱基对，或约为10000-15000da。sirna分子可降低任何基因产物的表达，例如，临床相关靶基因或模型基因的基因表达被降低，例如甘油醛-3磷酸脱氢酶(gapdh)sirna、gapdhsirnafitc、亲环素bsirna和/或laminsirna。蛋白质疗法可包括肽、酶、结构蛋白、受体、细胞蛋白质或循环蛋白质或其片段。蛋白质或多肽约100-500000da，例如1000-150000da。该蛋白质可包括任何治疗性、诊断性或研究性蛋白质或肽，例如β-乳球蛋白、卵白蛋白、牛血清白蛋白(bsa)和/或辣根过氧化物酶。在其它实施例中，该蛋白质可包括癌症特异性凋亡蛋白，例如，肿瘤坏死因子相关凋亡诱导蛋白(trail)。
抗体的分子质量一般约为150000da。该抗体可包括抗肌动蛋白抗体、抗gapdh抗体、抗src抗体、抗myc抗体和/或抗raf抗体。该抗体可包括绿色荧光蛋白(gfp)质粒和gluc质粒。dna分子可以大于5000000da。在一些实施例中，抗体可以是鼠源性单克隆抗体，例如，ibritomomab-tiuxetin、muromomab-cd3、tositumamab、人源抗体或人源化小鼠(或其他起源物种)抗体。在其它实例中，抗体可为嵌合单克隆抗体，例如，阿昔单抗、巴昔单抗、西妥昔单抗、英夫利昔单抗或利妥昔单抗。在其它实施例中，抗体可为人源化单克隆抗体，例如，阿伦图扎单抗、贝伐单抗、聚乙二醇结合赛妥珠单抗(certolizumab-pegol)、达利珠单抗(daclizumab)、gentuzumab-ozogamicin、曲妥珠单抗(trastuzumab)、塔西单抗(tocilizumab)、伊匹单抗(ipilimumab)或panitumab。所述抗体可包含抗体片段，例如，阿巴特西普、阿非利塞普、阿来昔普特或依那西普。本发明不仅包含完整的单克隆抗体，而且还包括免疫活性抗体片段，例如fab或(fab)2片段；工程单链抗体分子；或嵌合分子，例如，包含一种抗体的结合特异性的抗体，例如小鼠源性抗体，以及另一种抗体的剩余部分，例如人类来源的抗体。
分子货物(例如有效载荷)可包括治疗剂。治疗剂，例如，药物或活性剂”可意指用于治疗或诊断目的的任何化合物，该术语可理解为意指为治疗疾病而施用给患者的任何化合物。因此，治疗剂可以包括蛋白质、肽、抗体、抗体片段和小分子。美国专利第no.7667004号，名为“抗血管内皮生长因子的人源化抗体”的专利(通过引用并入本文)中描述的治疗剂可用于本文所述的方法中。治疗剂可包括顺铂、阿司匹林、他汀类药物(例如，皮塔瓦他汀、阿托伐他汀、洛伐他汀、普伐他汀、瑞舒伐他汀、辛伐他汀、盐酸异丙嗪(hcl)、盐酸氯丙嗪、盐酸硫立达嗪、硫酸多粘菌素b、氯霉素、盐酸苯氟脲和盐酸非那唑吡啶)和氟西汀中的至少一种。所述有效载荷可以包括诊断试剂。该诊断剂可包括可检测的标签或标记，例如亚甲蓝、专利蓝v和吲哚青绿中的至少一种。有效载荷可以包括一个荧光分子。可检测的有效载荷包括纳米颗粒。纳米颗粒可以包括一个量子点。
在一个实施例中，在传递后在加入停止溶液之前培养细胞。在实施例中，停止溶液包括磷酸盐缓冲盐水(pbs)。pbs的浓度约为0.5倍的pbs。
图33显示了根据当前主题内容的另一个示例性平台。封闭式系统3300可包括袋或储液罐3301、泵3302、接口滤网3303、货物引入模块3304和倾斜式生物反应器3305。
图34是显示示例性一次性生物反应器的cad图纸。该生物反应器可以从正常角度倾斜15度，可以旋转，同时滴定，可以轻轻摇晃，可以包含振动元件振动滤膜。货物可通过sma01引入。sma01是雾化器，在实施方案中，可包括任何雾化器。在实施方案中，使用雾化器时的值涉及在约10-300μl细胞渗透性溶液之间体积的雾化。美国专利第5411208号或美国专利第6634572号中描述了示例性雾化器，这些专利通过引用全部并入本文。其他雾化器可在市场上买到，例如购买duramisttm雾化器(sigma-aldrichgxarg1dm04-1ea)、雾化器、oneneb、系列2惰性同心型雾化器，或与icp-oes一起使用(安捷伦科技g8010-60293)。在实施方案中，雾化器可以是超声波雾化器，或振动网状雾化器。输入和输出管可以焊接，也可以使用hospira旋压螺旋闭合连接器。其他雾化器可在市场上买到，例如购买duramisttm雾化器(sigma-aldrichgxarg1dm04-1ea)、雾化器、oneneb、系列2惰性同心型雾化器，或与icp-oes一起使用(安捷伦科技g8010-60293)。在实施方案中，雾化器可以是超声波雾化器，或振动网状雾化器。输入和输出管可以焊接，也可以使用hospira旋压螺旋闭合连接器。
图35说明了添加了停止溶液的滤板容器。可通过滤板容器圆周上的一系列孔(如图所示)添加停止溶液。容器的内部歧管设计用于确保每个孔的流量相等。
图36说明了添加了新培养基后的滤板容器。培养后，可通过第二组圆周型孔向其中添加细胞培养基。添加培养基可以在第二时间进行(对于ml体积)。
图37显示了在操作过程中生物反应器的倾斜。整个生物反应器如左图所示，滤板容器如右图所示。这个系统是一个封闭的系统。该生物反应器可从正常角度倾斜15度(生物反应器包括滤板容器)。生物反应器可以在倾斜的同时旋转。生物反应器可以轻轻摇摆并包含振动元件来振动滤膜。
图38说明了细胞培养基“倒出”期间的滤板容器，其中容器(如反应器)倾斜、旋转和振动，以便于去除培养基中的细胞。当含有细胞悬浮在其中的细胞培养基时，滤板容器可以倾斜，根据需要通过倾斜、旋转和振动将其从膜表面倒出。例如，这种方法可以从过滤器中删除细胞“蛋糕”。可以使用不同的振动模式和偏移。
当前主题内容可以包括许多组件，例如，加速产品介绍、声学、添加剂制造、粘合剂、改进的装配、自动化、设备集成、数字样机、动态调谐、流体学、人机界面、光通信、光学、电力电子技术，精密注塑模具、精密机械、印刷电子、传感器、软件应用设计、无线连接和文档记档
图39是一个膜支架实施例。所述示例性膜支架可被植入以与第一示例性平台(参考图16-26的描述)或第二示例性平台(参考图27-38的描述)一起使用。当在滤板上使用正压形成单层膜时，控制滤膜上的细胞沉积模式可能具有挑战性。滤板上的脊孔结构影响悬浮细胞在滤膜上的沉积形态。细胞沉积在过滤器上，但仅限于脊和孔位于底层膜架上的地方(例如，充当模板)。细胞沉积的位置和该区域内的沉积模式可由膜支架设计控制。此外，可以使用包含类似排水管的离散过滤区域的膜支架在连续过滤膜上创建离散细胞单层。
如图39所示，所述膜支架包括一个单一的过滤区域。在本实施例中，将一个44mm的聚碳酸酯径迹蚀刻(pcte)滤膜(表示为“a”并用外虚线圆圈表示)放置在膜支架(b)上。膜支架具有脊和孔，位于中心直径25mm(c)内。为了说明过滤单元的示例性设计的作用，所述膜支架被插入到amicon搅拌细胞压力过滤单元(这里未显示)的底座中。将dynabeads悬浮液添加到腔室中并施加正压力。dynabeads(曾被用作t细胞模型)只沉积在脊和孔所在的位置(用内虚线圆圈表示)。
图40说明了一个中间系统的实施例，该系统最多可处理5x107个单元。该系统具有与临床系统相同的特征(全尺寸，例如，每次过程能处理大于5x107个细胞，例如1x108个，以及109个或更多个细胞)，但该系统不包括可平动的喷头机构，而是使用单喷头或多喷头阵列。
尽管上面已经详细描述了一些变化，但也可以进行其他修改或添加。例如，设计变化可以包括其他几何形状的过滤器基地，例如矩形、正方形或椭圆形。此外，具有不同地形的过滤基底可包括具有微观或宏观特征的凸面、凹面和纹理表面。此外，还考虑了包括圆形目标和环形目标的目标配置。在实施方案中，所述修改或添加可优化喷雾目标下的细胞沉积。
本文描述的主题内容提供了许多技术优势。例如，一次性使用避免了系统灭菌的需要，大大降低了患者样本之间交叉污染的风险，并使验证过程更加简单。此外，一次性使用可以在生物反应器内控制温度和湿度，从而产生更健康的细胞群。另一个优点是，它可以通过单一喷头或安装多个喷头的能力实现共同传递，并通过共同传递过程传递多种货物。此外，本文所描述的主题内容是快速且简单的，并且温和的细胞处理过程能够维持细胞健康并使天然细胞群体的工程化成为可能。过滤基板的温度控制也能更好地控制传递过程，并有助于从系统中回收细胞。膜支架设计和雾化器参数的结合使得系统能够优化，将不同的货物传递到不同的细胞类型。
传递方案实施例
本发明基于一个惊人的发现，即通过将待传递的化合物(例如有效载荷)与溶液(包含可逆渗透或溶解细胞膜的试剂)相接触，来将化合物或化合物(组合物)混合物传递到真核细胞的细胞质中。优选地，所述溶液以喷雾的形式(例如，水粒子)传递到细胞。(例如，参见pct/us2015/057247和pct/ib2016/001895，通过引用将其全部合并)。例如，用喷雾涂覆细胞，但不浸泡或浸没在含有传递化合物的溶液中。渗透或溶解真核细胞膜的典型试剂包括醇和洗涤剂，例如分别是乙醇和tritonx-100。其他示例性清洁剂，例如表面活性剂，包括聚山梨酯20(例如，吐温20)、3-[(3-胆酰胺丙基)二甲基氨]-1-丙磺酸(chaps)、3-[(3-胆酰胺丙基)二甲基氨]-2-羟基-1-丙磺酸(chapso)、十二烷基硫酸钠(sds)和辛基葡糖苷。
实现涂覆细胞群的条件实施例包括提供细颗粒喷雾传递，例如，这些条件不包括在细胞上滴下或用移液管滴入大量溶液，以使大量细胞被一定体积的液体浸湿或浸没。因此，雾或喷雾包括流体体积与细胞体积的比率。或者，所述条件包括雾或喷雾的体积与暴露的细胞面积的比率，例如，当细胞作为汇合层或基本汇合层存在于诸如组织培养血管的底部(例如，组织培养板(例如，微量组织培养板)的孔)上时暴露的细胞膜的面积。
“货物”或“有效载荷”是指通过水溶液穿过细胞质膜进入细胞内部的化合物或组合物。
在一个方面中，通过细胞的质膜传递有效载荷包括提供细胞群，并使细胞群与一定体积的水溶液相接触。水溶液包括有效载荷和大于2％浓度的酒精含量。水溶液的体积可以是细胞群的暴露表面积的函数，也可以是细胞群中细胞数的函数。
在另一个方面，传递有效载荷通过细胞质膜的组合物包括一种水溶液，所述水溶液包括有效载荷、浓度大于2％的醇、大于46mm的盐、小于121mm的糖和小于19mm的缓冲液。例如，所述醇(例如乙醇)的浓度不超过50％。
以下一个或多个特征可以被包含在任何可行的组合中。要传递到细胞中的溶液体积是多个单元，例如喷雾，例如水粒子上的多个液滴。相对于单个细胞或相对于汇合或基本汇合(例如，至少75％、至少80％汇合，例如85％、90％、95％、97％、98％、100％)细胞群的暴露表面积来描述所述体积。例如，所述体积可以在每细胞6.0x10-7微升到每细胞7.4x10-4微升范围内。所述体积可以在每细胞4.9x10-6微升到每细胞2.2x10-3微升范围内。所述体积可以在每细胞9.3x10-6微升到每细胞2.8x10-5微升范围内。所述体积可以是大约每细胞1.9x10-5微升，或是在百分之十范围内。所述体积可以在每细胞6.0x10-7微升到每细胞2.2x10-3微升范围内。所述体积可以在每平方微米暴露面积2.6x10-9微升到每平方微米暴露面积1.1x10-6微升范围内。所述体积可以在每平方微米暴露面积5.3x10-8微升到每平方微米暴露面积1.6x10-7微升范围内。所述体积可以是大约每平方微米暴露面积1.1x10-7微升，大约是指在百分之十范围内。
细胞融合是指细胞在表面上相互接触。例如，它可以表示为估计的(或计算的)百分比，例如，10％的融合意味着10％的表面(例如组织培养血管)被细胞覆盖，100％意味着它被完全覆盖。例如，粘附细胞在组织培养孔、培养皿或培养瓶的表面二维生长。非粘附细胞可以被旋转下来，通过真空或组织培养基从细胞群的顶部抽吸下来，或者通过抽吸或从血管底部移除真空来移除。
通过气体推动水溶液形成喷雾，从而实现细胞群与一定体积的水溶液相接触。气体可以包括氮气、环境空气或惰性气体。喷雾可包括离散的体积单位，其尺寸范围为，1nm至100μm，例如直径为30-100μm。喷雾包括直径约30-50μm的离散体积单位。在一些实施方案中，喷雾包括直径约为5-8μm的离散体积单位。总体积为20μl的水溶液可通过喷雾输送至约1.9cm2的细胞占据区域，例如24孔培养板的一个孔。将总体积为10μl的水溶液输送至约0.95cm2的细胞占据区域，例如48孔培养板的一个孔。通常，水溶液包括要通过细胞膜传递到细胞中的有效载荷，并且第二体积是不包含有效载荷的缓冲液或培养基。作为选择，所述第二体积(缓冲器或介质)也可以包含有效载荷。在一些实施方案中，水溶液包括有效载荷和醇，并且第二体积不包含醇(并且任选地不包含有效载荷)。在添加第二体积的缓冲液或培养基以浸没或悬浮所述细胞群之前，所述细胞群可与所述水溶液接触0.110分钟。缓冲液或培养基可以是磷酸盐缓冲液(pbs)。在添加第二体积的缓冲液或培养基以浸没或悬浮细胞群之前，细胞群可与水溶液接触2秒至5分钟。在添加第二体积的缓冲液或培养基(例如，没有有效载荷)之前，细胞群可与水溶液(例如，含有有效载荷)接触30秒至2分钟，以淹没或悬浮细胞群。在加入第二体积的缓冲液或培养基以淹没或悬浮细胞群之前，细胞群可与喷雾接触约1-2分钟。在喷洒细胞和添加缓冲液或培养基之间的时间段内，细胞通过喷洒的水分层保持水分。
所述水溶液可包含浓度为5％至30％的乙醇。所述水溶液可包括75％至98％h2o、2％至45％乙醇、6至91mm蔗糖、2至500mmkcl、2至35mm醋酸铵和1至14mm(4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸)(hepes)中的一种或多种。例如，所述传递溶液含有106mmkcl和25％乙醇。
细胞群可包括粘附细胞或非粘附细胞。所述粘附细胞可包括原代间充质干细胞、成纤维细胞、单核细胞、巨噬细胞、肺细胞、神经细胞、成纤维细胞、人脐静脉(huvec)细胞、中国仓鼠卵巢(cho)细胞和人胚肾(hek)细胞或永生化细胞(例如细胞系)中的至少一种。所述细胞群也可以包括悬浮在培养基中粘附的细胞。悬浮培养基中粘附的细胞可以包括人胚胎肾(hek)细胞或巨噬细胞。在优选实施方案中，细胞群包括非粘附细胞，例如，细胞群中的非粘附细胞的百分比为至少50％、60％、75％、80％、90％、95％、98％、99％或100％的非粘附细胞。非粘附细胞原代细胞和永生化细胞(例如细胞系的细胞)。示例性非粘附/悬浮细胞包括初级造血干细胞(hsc)、t细胞(例如，cd3+细胞、cd4+细胞、cd8+细胞)、自然杀伤(nk)细胞、细胞因子诱导杀伤(cik)细胞、人脐血cd34+细胞、b细胞或细胞系，例如jurkatt细胞系。
有效载荷可以包括小化学分子、肽或蛋白质或核酸。小化学分子的分子量可以小于1000da。化学分子可包括
抗体的分子质量一般约为150000da。该抗体可包括抗肌动蛋白抗体、抗gapdh抗体、抗src抗体、抗myc抗体和/或抗raf抗体。该抗体可包括绿色荧光蛋白(gfp)质粒、gluc质粒和batem质粒。dna分子量可以大于5000000da。在一些实施例中，抗体可以是鼠源性单克隆抗体，例如，ibritomomab-tiuxetin、muromomab-cd3、tositumamab、人源抗体或人源化小鼠(或其他起源物种)抗体。在其它实施例中，抗体可为嵌合单克隆抗体，例如，阿昔单抗、巴昔单抗、西妥昔单抗、英夫利昔单抗或利妥昔单抗。在依旧其它实施例中，抗体可为人源化单克隆抗体，例如，阿伦图扎单抗、贝伐单抗、聚乙二醇结合赛妥珠单抗(certolizumab-pegol)、达利珠单抗(daclizumab)、gentuzumabozogamicin、曲妥珠单抗(trastuzumab)、塔西单抗(tocilizumab)、伊匹单抗(ipilimumab)或panitumab。所述抗体可包含抗体片段，例如，阿巴特西普、阿非利塞普、阿来昔普特或依那西普。本发明不仅包含完整的单克隆抗体，而且还包括免疫活性抗体片段，例如fab或(fab)2片段；工程单链抗体分子；或嵌合分子，例如，包含一种抗体的结合特异性的抗体，例如小鼠源性抗体，以及另一种抗体的剩余部分，例如人类来源的抗体。
分子货物(例如有效载荷)可包括治疗剂。治疗剂，例如，“药物或活性剂”可意指用于治疗或诊断目的的任何化合物，该术语可理解为意指为治疗疾病而施用给患者的任何化合物。因此，治疗剂可以包括蛋白质、肽、抗体、抗体片段和小分子。美国专利第7667004号，名为“抗血管内皮生长因子的人源化抗体”的专利(通过引用并入本文)中描述的治疗剂可用于本文所述的方法中。治疗剂可包括顺铂、阿司匹林、他汀类药物(例如，皮塔瓦他汀、阿托伐他汀、洛伐他汀、普伐他汀、瑞舒伐他汀、辛伐他汀、盐酸异丙嗪(hcl)、盐酸氯丙嗪、盐酸硫立达嗪、硫酸多粘菌素b、氯霉素、盐酸苯氟脲和盐酸非那唑吡啶)和氟西汀中的至少一种。所述有效载荷可以包括诊断试剂。该诊断剂可包括可检测的标签或标记，例如亚甲蓝、专利蓝v和吲哚青绿中的至少一种。有效载荷可以包括一个荧光分子。可检测的有效载荷包括纳米颗粒。纳米颗粒可以包括一个量子点。
非粘附细胞的细胞群可以基本上融合，例如大于75％的融合。细胞融合是指细胞在表面上相互接触。例如，它可以表示为估计的(或计算的)百分比，例如，10％的融合意味着10％的表面(例如组织培养血管)被细胞覆盖，100％意味着它被完全覆盖。例如，粘附细胞在组织培养孔、培养皿或培养瓶的表面二维生长。不粘附的细胞可以向下旋转，通过真空或组织培养基抽吸从细胞群的顶部拉下，或通过抽吸或真空从血管底部移除。细胞群可以形成单层细胞。
所述醇可选自甲醇、乙醇、异丙醇、丁醇和苯甲醇。盐可选自nacl、kcl、na2hpo4、kh2po4和c2h3o2nh。在优选的实施方案中，盐为kcl。糖可以包括蔗糖。缓冲剂可以包括4-2-(羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸。
本发明主题内容涉及一种通过质膜传递分子的方法。本发明主题内容可以应用于细胞内传递领域，并且已经被应用于例如将分子生物和药理学治疗剂传递到目标部位，例如细胞、组织或器官中。本发明主题内容的方法包括将该分子引入水性组合物以形成基质；将该基质雾化成喷雾；以及使该基质与质膜接触。
本发明主题内容涉及一种用于传递分子通过质膜的组合物。本发明主题内容在细胞内递送领域中发现实用性，并且应用于例如将分子生物和药理学治疗剂递送到目标部位，例如细胞、组织或器官。本发明主题内容的组合物包括酒精、盐、糖和/或缓冲剂。
在一些实施方案中，这里展示了一种渗透技术，该渗透技术促进了独立于分子和细胞类型的分子在细胞内的传递。纳米颗粒、小分子、核酸、蛋白质和其他分子可以有效地在原位传递到悬浮细胞或粘附细胞中，包括原代细胞和干细胞，细胞毒性低，并且该技术与高通量和基于细胞的自动化分析相兼容。
本文所述的示例性方法包括有效载荷，其中有效载荷包括醇。术语“醇”是指一种多原子有机化合物，包括一个连在至少一个碳原子上的羟基(-oh)官能团。醇可以是一元醇，并且可以包括至少一个碳原子，例如甲醇。醇可包括至少两个碳原子(例如乙醇)。在其它方面，醇包含至少三个碳原子(例如异丙醇)。醇可包括至少四个碳原子(例如丁醇)，或至少七个碳原子(例如，苯甲醇)。示例性的有效载荷可包括不超过50％(v/v)的醇，更优选地，有效载荷包括2-45％(v/v)的醇、5-40％的醇和10-40％的醇。有效载荷可包括20-30％(v/v)的醇。
最优选地，有效载荷传递溶液包括25％(v/v)的醇。作为选择，有效载荷可以包括2-8％(v/v)的醇，或者2％的醇。所述醇可以包括乙醇，并且所述有效载荷包括5、10、20、25、30和高达40％或50％(v/v)的乙醇，例如27％。示例性的方法中所述醇是甲醇，且有效载荷可包括5％、10％、20％、25％、30％或40％(v/v)的甲醇。有效载荷可包括2-45％(v/v)的甲醇、20-30％(v/v)或25％(v/v)的甲醇。优选地，所述有效载荷包括20-30％(v/v)甲醇。另外，作为选择，所述醇是丁醇且有效载荷包含2％、4％或8％(v/v)的丁醇。
本发明主题内容的一些方面，所述有效载荷处于溶液或者缓冲液中。
根据本发明的主题内容，所述有效载荷至少包括一个盐。所述盐选自nacl、kcl、na2hpo4、c2h3o2nh4和kh2po4。例如kcl的浓度范围在2mm到500mm之间。在一些优选的实施方案中，所述浓度大于100mm，例如，106mm。
根据本发明主题内容的示例性方法，所述有效载荷可包括糖(例如，蔗糖或双糖)。根据示例性方法，有效载荷包括小于121mm的糖、6-91mm或者26-39mm的糖。此外，有效载荷包括32mm糖(例如蔗糖)。任选地，所述糖为蔗糖并且所述有效载荷包括6.4、12.8、19.2、25.6、32、64、76.8或89.6mm的蔗糖。
根据本发明主题内容示例性的方法，所述有效载荷可以包括缓冲剂(例如弱酸或弱碱)。所述缓冲剂可包括两性离子。根据示例性方法，缓冲剂是4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸。有效载荷可包括小于19mm的缓冲剂(例如，1-15mm、4-6mm或5mm缓冲剂)。根据示例性方法，缓冲剂是4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸且有效载荷包含1、2、3、4、5、10、12、14mm的4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸。进一步优选的，所述有效载荷包括5mm的4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸。
根据本发明主题内容的示例性方法，有效载荷包括醋酸铵。所述有效载荷可包括小于46mm的醋酸铵(例如，在2-35mm、10-15mm或25mm之间的醋酸铵)。有效载荷可能包括2.4、4.8、7.2、9.6、12、24、28.8或33.6mm的醋酸铵。
由气体推动水溶液体积，所述能够推动水溶液的气体可能包括压缩空气(例如环境空气)，其他实施方式可能包括惰性气体，例如氦、氖和氩。
在本主题内容的某些方面，细胞群可包括粘附细胞(例如，肺、肾、免疫细胞，例如巨噬细胞)或非粘附细胞(例如悬浮细胞)。
在本发明主题内容的某些方面中，细胞群可以是基本上融合的，并且所述基本上可以包括大于75％的融合。在优选的实施方案中，细胞群可形成单个单层。
根据示例性方法，要传递的有效载荷具有高达20,000,000da的平均分子量。在一些实施例中，要传递的有效载荷的平均分子量可达2,000,000da。在一些实施方案中，要传递的有效载荷可具有高达150,000da的平均分子量。在进一步的实施方案中，要传递的有效载荷具有高达15000da、5000da或1000da的平均分子量。
通过细胞质膜传递的有效载荷可包括小化学分子、肽或蛋白质、多糖或核酸或纳米颗粒。小化学分子可小于1000da，肽可具有约5000da的分子量，sirna可具有约15000da的分子量，抗体可具有约150,000da的分子量，dna可具有大于或等于5,000,000da的分子量。在优选的实施方案中，有效载荷包括mrna。
根据示例性方法，有效载荷包括3.0–150.0μm的待传递分子，更优选地，6.6–150.0μm的待传递分子(例如，要传递的3.0、3.3、6.6或150.0μm分子)。在一些实施方案中，要传递的有效载荷具有高达15000da的平均分子量，并且有效载荷包括要3.3μm待传递的分子。
根据示例性方法，所述要传递的有效载荷具有高达15000da的平均分子量，并且有效载荷包括要6.6μm传递的分子。在一些实施方案中，要传递的有效载荷具有高达1000da的平均分子量，并且有效载荷包括要150.0μm待传递的分子。
根据本主题内容的进一步方面，提供了一种通过质膜传递一个以上分子量的分子的方法；该方法包括以下步骤：将一个以上分子量的分子引入水溶液；使水溶液与质膜接触。
在一些实施方案中，所述方法包括将具有第一分子量的第一分子和具有第二分子量的第二分子引入有效载荷，其中所述第一分子和第二分子可以具有不同的分子量，或者其中，所述第一分子和第二分子可以具有相同的分子量。根据示例性方法，所述第一和第二分子可以是不同的分子。
在一些实施方案中，要传递的有效载荷可包括治疗剂或诊断剂，包括，例如，顺铂、阿司匹林、各种他汀类药物(例如，皮塔伐他汀、阿托伐他汀、洛伐他汀、普伐他汀、瑞舒伐他汀、辛伐他汀、盐酸丙咪嗪、盐酸氯丙嗪、盐酸硫立达嗪、多粘菌素b硫酸盐，氯霉素、盐酸苯氟醚和盐酸苯唑吡啶)和氟西汀。其他治疗剂包括抗菌剂(氨基环己烷(如庆大霉素、新霉素、链霉素)、青霉素(如阿莫西林、氨苄西林)、糖肽(如阿伏帕林、万古霉素)、大环内酯类(如红霉素、替米考星、泰乐菌素)、喹诺酮类(如沙拉沙星、恩诺沙星)、链霉素(如维吉尼霉素、喹诺普司汀、碳青霉烯类、脂肽类、恶唑烷酮、环丝氨酸、乙胺丁醇、乙氧酰胺、异烟酰胺、对氨基水杨酸和吡嗪酰胺)。在一些实施例中，抗病毒药物(例如，阿巴卡韦、阿昔洛韦、恩富维替啶、恩替卡韦、奈非那韦、奈韦拉平、奈韦、奥司他韦-雷特格拉维、利托那韦、司他夫定和伐昔洛韦)。该疗法可包括用于治疗各种疾病的蛋白质疗法，例如，癌症、传染病、血友病、贫血、多发性硬化症和乙型或丙型肝炎。
其他示例性有效装在可以包括可检测的标记物或者标记，例如，亚甲基蓝、专利蓝v和吲哚青绿。
本文所述方法还可包括一种有效载荷，所述有效载荷包括可检测部分或可检测纳米颗粒(例如量子点)。可检测部分可包括荧光分子或放射性试剂(例如125i)。当荧光分子暴露在适当波长的光下时，它的存在就可以通过荧光检测出来。最常用的荧光标记化合物有异硫氰酸荧光素、罗丹明、藻红蛋白、藻蓝蛋白、别藻蓝蛋白、对苯二甲醛和荧光素。这种分子也可以用荧光发射金属(如152eu)或其它镧系元素进行标记。这些金属可以使用诸如二乙烯三胺五乙酸(dtpa)或乙二胺四乙酸(edta)等金属螯合基团附着到分子上。这种分子也可以通过与化学发光化合物偶联来检测。然后通过检测化学反应过程中出现的发光来确定化学发光标记分子的存在。特别有用的化学发光标记化合物的实例为鲁米诺、异鲁米诺、芳香吖啶酯、咪唑、吖啶盐和草酸酯。
在其他实施方案中，要传递的有效载荷可以包括编辑基因组dna的组合物(即，基因编辑工具)。例如，基因编辑组合物可包括切割、刻痕、剪接、重排、转位、重组或以其他方式改变基因组dna的化合物或复合物。可选地或另外，基因编辑组合物可包括以下化合物：(i)可包括切割、刻痕、剪接、重排、易位、重组或以其他方式改变基因组dna的基因编辑复合物；或(ii)可处理或改变化合物，所述化合物被包括在切割、刻痕、剪接、重排、易位、重组或以其他方式改变基因组dna的基因编辑复合物中。在各种实施方案中，所述基因编辑组合物包括一个或多个(a)基因编辑蛋白；(b)rna分子；和/或(c)核糖核苷蛋白质(rnp)。
在一些实施方案中，基因编辑组合物包括基因编辑蛋白，并且基因编辑蛋白是锌指核酸酶(zfn)、转录激活物样效应器核酸酶(talen)、cas蛋白、cre重组酶、hin重组酶或flp重组酶。在其他实施方案中，基因编辑蛋白可以是将归巢内切酶与talens(megatal)的模块化dna结合域结合的融合蛋白。例如，megatal可以作为蛋白质传递，或者，编码megatal蛋白质的mrna被传递到细胞。
在各种实施方案中，所述基因编辑组合物包括rna分子，并且所述rna分子包括sgrna、crrna,和/或痕迹rna。
在某些实施方案中，所述基因编辑组合物包含rnp，并且rnp包含cas蛋白质和sgrna或crrna和tracrrna。本发明主题内容的一些方面对于控制特定基因编辑化合物在细胞中存在的时间和时间特别有用。
在本发明主题内容的各种实施方案中，(a)在细胞群与水溶液接触后约0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、24、48、60、72、0.5-2、0.5-6、6-12或0.5-72小时，或(b)在细胞群与水溶液接触后小于0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、24、48、60、72、0.5-2、0.5-6、6-12或0.5-72小时，可在细胞群或其后代中检测到基因编辑组合物。
在一些实施方案中，细胞群或其后代中的细胞基因组包含至少一个cre重组酶、hin重组酶或flp重组酶的位点特异性重组位点。
本发明的一些方面涉及细胞群，所述细胞群包括一种基因编辑化合物，并将另一种基因编辑化合物插入到所述细胞群中。例如，可以将rnp的一个成分引入到表达或已经包含rnp另一个成分的细胞中。例如，细胞群中的细胞或其后代可包含sgrna、crrna和/或tracrrna。在细胞群的一些实施方案中，细胞群或其后代表达sgrna、crrna和/或tracrrna。作为选择或者另外，细胞群中的细胞或其子代表达cas蛋白。
在这里本发明主题内容的各种实施方案包括cas蛋白。在一些实施方案中，cas蛋白是cas9蛋白或其突变体。本文描述了示例性cas蛋白质(包括cas9和cas9突变体的非限制性示例)。
在各种方面，cas9蛋白的浓度在大约0.1到大约25微克范围内。例如，cas9蛋白的浓度可以是大约1微克、大约5微克、大约10微克、大约15微克或者大约20微克。作为选择，cas9的浓度在大约10ng/μl到大约300ng/μl范围内，例如在大约10ng/μl到大约200ng/μl范围内；或者在大约10ng/μl到大约100ng/μl范围内，或者在大约10ng/μl到大约50ng/μl范围内。
在某些实施方案中，基因编辑组合物包含(a)第一sgrna分子和第二sgrna分子，其中第一sgrna分子的核酸序列不同于第二sgrna分子的核酸序列；(b)包含第一sgrna的第一rnp和包含第二sgrna的第二rnp，其中，所述第一sgrna分子的核酸序列不同于所述第二sgrna分子的核酸序列；(c)第一crrna分子和第二crrna分子，其中所述第一crrna分子的核酸序列不同于所述第二crrna分子的核酸序列；(d)第一crrna分子和第二crrna分子，其中第一crrna分子的核酸序列不同于第二crrna分子的核酸序列，并且进一步包括tracrrna分子；或(e)包含第一crrna和tracrrna的第一rnp和包含第二crrna和tracrrna的第二rnp，其中第一crrna分子的核酸序列不同于第二crrna分子的核酸序列。
在一些方面，cas9蛋白与向导rna的比率可以是1:1,1:2,1:3,1:4,1:5,1:6,1:7,1:8,1:9,或者1:10。
在实施方案中，增加细胞通过传递过程的次数(或者，增加剂量的数量)，可以增加编辑百分比；其中，在一些实施方案中，剂量的数量可以包括1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个剂量。
在各种实施方案中，第一和第二sgrna或第一和第二crrna分子共同包含一种核酸序列，所述核酸序列与基因、外显子、内含子、染色体外序列或基因组核酸序列的侧链目标序列互补，其中该基因、外显子、内含子、外显子序列，或基因组核酸序列长度约为1、2、3、4、5、6、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、1-100千碱基或长度至少约为1、2、3、4、5、6、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、1-100千碱基。在一些实施方案中，使用包含第一和第二sgrna或第一和第二crrna分子的成对rnp可用于创建包含基因、外显子、内含子、染色体外序列或基因组核酸序列的多核苷酸分子。
在某些实施方案中，sgrna或crrna的目标序列的核苷酸长度约为12至约25，或约为12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、17-23或18-22。在一些实施方案中，目标序列长度为20个核苷酸或大约20核苷酸。
在各种实施方案中，第一和第二sgrna或第一和第二crrna分子与染色体外序列侧脸序列互补，所述染色体外序列也在表达载体内。
本发明主题内容的各个方面涉及基因编辑复合体的多个组分的传递，其中多个组分并不复合在一起。在一些实施方案中，基因编辑组合物包含至少一种基因编辑蛋白质和至少一种核酸，其中基因编辑蛋白质和核酸彼此不结合或不复合。
本发明主题内容可以实现高基因编辑效率，同时保持高细胞活力。在一些实施方案中，与水溶液接触后，至少约10、20、30、40、50、60、70、80、90、95、99％、1-99％或更多的细胞或其后代经基因修饰。在各种实施方案中，至少约10、20、30、40、50、60、70、80、90、95、99％、1-99％或更多的细胞群或其后代在与水溶液接触后是可存活的。
在某些实施方案中，基因编辑组合物诱导细胞内dna中的单链或双链断裂。在一些实施方案中，基因编辑组合物还包括修复模板多核苷酸。在各种实施方案中，所述修复模板包括(a)第一侧链区域，所述第一侧链区域包含与单链或双链断裂一侧约40至约90个碱基对互补的序列的核苷酸，以及第二侧链区域，所述第二侧链区域包含与单链或者双链断裂另一侧大约40至约90个碱基对互补的序列的核苷酸；或(b)第一侧链区域，其包含与单链或双链断裂一侧至少约20、25、30、35、40、45、50、60、70、80或90碱基对互补的序列的核苷酸，以及第二侧链区域，所述第二侧翼区域包含至少与位于单链或双链断裂的另一侧的约20，25、30、35、40、45、50、60、70、80或90个碱基对互补的序列的核苷酸。有关使用crispr-cas系统的基因编辑(包括修复模板)的非限制性说明记载在ranetal.(2013)natprotoc.2013nov；8(11):2281–2308中，该文献的全部内容通过引证在此全部并入本文。涉及修复模板的实施方案不局限在包括crispr-cas系统的实施方案中。
在本发明主题内容的各种实施方案中，水溶液的体积以喷雾的形式被传递到细胞群中。在一些实施方案中，在每个细胞中的体积在6.0x10-7微升到每细胞7.4x10-4微升之间。在某些实施方案中，喷雾包含直径为10nm至100μm的胶体或子颗粒。在各种实施方案中，体积在2.6x10-9微升/平方微米的暴露表面积和1.1x10-6微升/平方微米的暴露表面积之间。
在一些实施方案中，rnp的尺寸约为
例如，通过气体推动水溶液形成喷雾，可以使细胞群与一定体积的水溶液相接触。在某些实施方案中，细胞群与所述水溶液接触0.01-10分钟(例如，0.1-10分钟)，然后添加第二体积的缓冲液或培养基以淹没或悬浮所述细胞群。
在各种实施方案中，细胞群包括原代细胞或永生细胞中的至少一个。例如，细胞群可包括间充质干细胞、肺细胞、神经元细胞、成纤维细胞、人脐静脉(huvec)细胞和人胚胎肾(hek)细胞、原代或永生化造血干细胞(hsc)、t细胞、自然杀伤(nk)细胞、细胞因子诱导杀伤(cik)细胞、人脐血cd34+细胞、b细胞。t细胞的非限制性实例可包括cd8+或cd4+t细胞。在某些方面，使用cd3+t细胞的cd8+亚群。cd8+t细胞可通过使用抗cd8微球的阳性分离从pbmc群中纯化。在某些方面，原发性nk细胞是从pbmcs中分离出来的，而gfpmrna可以通过平台传递技术传递(即24小时表达率为3％，存活率为96％)。在其它方面中，可使用nk细胞系，例如nk92。
细胞类型还包括先前经过修饰的细胞，例如t细胞、nk细胞和msc，以增强其治疗效果。例如：表达嵌合抗原受体的t细胞或nk细胞(分别为cart细胞、carnk细胞)；表达修饰t细胞受体(tcr)的t细胞；经病毒性或非病毒性修饰以过度表达补充其固有特性的治疗性蛋白质的msc(例如，使用慢病毒载体递送epo或使用aav-6递送bmp-2)(在parketal,methods,2015aug；84-16.中描述)；经非肽药物或磁性纳米颗粒预处理以增强疗效和外部稳定性的msc分别调节靶向性(park等人，2015)；利用靶向部分功能化的msc，通过酶修饰(例如岩藻糖基转移酶)，化学偶联(例如，使用n-羟基丁二酰亚胺(nhs)化学修饰msc上的slex)或非共价相互作用(例如，利用棕榈酸化蛋白质对细胞表面进行工程化，其作为随后抗体结合的疏水锚定物)(park等人，2015)增强其对治疗部位的归巢。例如，经修饰以表达嵌合抗原受体(cart细胞)的t细胞(例如，原代t细胞或t细胞系)可根据本发明进一步用基因编辑蛋白质和/或含有针对car编码序列的特异性指导核酸的复合物来处理，以编辑编码car的基因，从而减少或停止car在修饰的t细胞中的表达。
本发明的各方面涉及基因编辑化合物和复合物的无表达载体传递至细胞和组织，例如在原代人类t细胞、造血干细胞(hsc)和间充质基质细胞(msc)中传递用于基因组编辑的cas-grna核糖核蛋白。在一些实施例中，编码这些蛋白质的mrna被传递到细胞中。
本领域已知crispr-cas系统的各个方面。本系统的非限制性方面如2015年5月5日发布的第9023649号美国专利、2015年7月7日发布的第9074199号美国专利、2014年4月15日发布的第8697359号美国专利、2015年1月13日发布的第8932814号美国专利、2005年8月27日公开的第wo2015/071474号pct国际专利申请；choetal.,(2013)naturebiotechnologyvol31no3pp230-232(包括补充信息)；以及jineketal.,(2012)sciencevol337no6096pp816-821，上述所有文献的全部内容通过引用全部并入本文。
cas蛋白非限制性实施例包括cas1,cas1b,cas2,cas3,cas4,cas5,cas6,cas7,cas8,cas9(还叫作csn1和csx12),cas10,csy1,csy2,csy3,cse1,cse2,csc1,csc2,csa5,csn2,csm2,csm3,csm4,csm5,csm6,cmr1,cmr3,cmr4,cmr5,cmr6,csb1,csb2,csb3,csx17,csx14,csx10,csx16,csax,csx3,csx1,csx15,csf1,csf2,csf3,csf4,其同源物或其修饰版。这些酶是已知的；例如，化脓链球菌cas9蛋白的氨基酸序列可以在swissprot数据库中的登录号q99zw2和ncbi数据库中的登录号q99zw2.1下找到。uniprot数据库登录号a0a0g4deu5和cdj55032提供了cas9蛋白质氨基酸序列的另一个示例。另一非限制性实例系嗜热链球菌cas9蛋白质，其氨基酸序列可在uniprot数据库中以登录号q03ji6.1找到。在一些实施例中，未修饰的crispr酶具有dna切割活性，例如cas9。在某些实施例中，crispr酶是cas9，并且可以是来自化脓链球菌或肺炎链球菌的cas9。在各种实施方案中，crispr酶在目标序列的位置(例如在目标序列内和/或在目标序列的补体内)指导一条或两条链的裂解。在一些实施方案中，crispr酶在约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、50、100、200、500或更多碱基对内的一条或两条链进行切割。在一些实施方案中，载体编码相对于对应野生型酶突变的crispr酶，使得突变的crispr酶缺乏切割包含目标序列的目标多核苷酸的一条或两条链的能力。例如，来自化脓链球菌的cas9的ruvcⅰ催化结构域中的天冬氨酸到丙氨酸的取代将cas9从切割两条链的核酸酶转化为nickase(切割单链)。使cas9成为nickase的其它突变实例包括但不限于h840a、n854a和n863a。在本发明的各个方面中，nickase可用于通过同源重组进行基因组编辑。
在某些实施方案中，cas9-nickase可与引导序列组合使用，例如，两个引导序列分别针对dna靶的正义链和反义链。这种组合允许两条线都被切割并用于诱发nhej。
作为进一步的实施例，cas9的两个或多个催化结构域(ruvci、ruvcii和ruvciii)可突变以产生基本上缺乏所有dna切割活性的突变cas9。d10a突变可与h840a、n854a或n863a突变中的一个或多个结合以产生基本上缺乏所有dna切割活性的cas9酶。在某些实施方案中，当突变酶的dna切割活性相对于其非突变形式小于约25％、10％、5％、1％、0.1％、0.01％或更低时，认为crispr酶基本上缺乏所有dna切割活性。其他突变可能是有用的；如果cas9或其他crispr酶来自于化脓链球菌以外的物种，则相应氨基酸的突变可能会产生类似的效果。
在某些实施方案中，所传递的蛋白质(例如cas蛋白质或其变体)可包括亚细胞定位信号。例如，rnp内的cas蛋白可包含亚细胞定位信号。根据上下文，包含例如cas9和核定位信号的融合蛋白在本文中可被称为“cas9”，而不指定包含核定位信号。在一些实施方案中，有效载荷(例如rnp)包括一种融合蛋白，所述融合蛋白包含定位信号。例如，所述融合蛋白可包含核定位信号、核仁定位信号或线粒体靶向信号。这些信号是本领域内已知的，并且非限制性实施例描述在以下文献中：kalderonetal.,(1984)cell39(3pt2):499–509；makkerhetal.,(1996)currbiol.6(8):1025–7；dingwalletal.,(1991)trendsinbiochemicalsciences16(12):478–81；scottetal.,(2011)bmcbioinformatics12:317(7pages)；omurat(1998)jbiochem.123(6):1010-6；rapaportd(2003)emborep.4(10):948-52；andbrocard&hartig(2006)biochimicaetbiophysicaacta(bba)-molecularcellresearch1763(12):1565–1573,这些文件的每个都通过引证在此全部并入本文。在各种实施方案中，cas蛋白质可包含一个以上定位信号，例如2、3、4、5或更多个核定位信号。在一些实施方案中，定位信号位于cas蛋白的n端，而在其他实施方案中，定位信号位于cas蛋白的c端。
在一些实施方案中，对编码crispr酶的酶编码序列进行密码子优化从而用于在特定细胞(例如真核细胞)中表达该编码序列。所述真核细胞可以是特定有机体的细胞或源于特定有机体的细胞，例如哺乳动物细胞，所述哺乳动物包括但不限于人、小鼠、大鼠、兔子、狗或非人灵长类动物。一般而言，密码子优化是指一种修饰核酸序列的方法，该方法通过将天然序列中至少一个密码子(例如大约或者超过1、2、3、4、5、10、15、20、25、50或者更多的密码子)替换为在宿主细胞的基因中使用频率更高或最频繁的密码子来修饰核酸，从而提高在感兴趣的宿主细胞中的表达，同时保持天然氨基酸序列。不同物种对特定氨基酸的特定密码子表现出特殊的偏好。密码子偏好(生物体间密码子使用的差异)通常与信使rna(mrna)的翻译效率相关，而信使rna(mrna)的翻译效率又取决于被翻译的密码子的性质和特定转移rna(trna)分子的可用性。在细胞中所选择的trnas的优势通常反映了肽合成中最常用的密码子。
因此，基于密码子优化，可以针对给定生物体中的最佳基因表达来定制基因。密码子使用表是现成的，例如，在“密码子使用数据库”，这些表可以在许多方面进行调整。参见nakamura,y.,etal.“codonusagetabulatedfromtheinternationaldnasequencedatabases:statusfortheyear2000”nucl.acidsres.28:292(2000).计算机算法优化特定的密码子序列，使其在特定的宿主细胞中表达，例如，可以使用geneforge(aptagen；jacobus,pa.).在一些实施方案中，编码crispr酶的序列中的一个或多个密码子(例如1、2、3、4、5、10、15、20、25、50或更多，或所有密码子)对应于特定氨基酸的最常用密码子。
一般来说，指导序列是与目标多核苷酸序列具有足够互补性的任何多核苷酸序列，以与目标序列杂交，并将crispr复合物直接序列特异性结合到目标序列上。在一些实施方案中，当使用合适的对准算法进行最佳对准时，引导序列与其对应的目标序列之间的互补度约为或大于约50％、60％、75％、80％、85％、90％、95％、97.5％、99％或更大。在一些实施方案中，互补程度为100％。最佳对准可通过使用用于对准序列的任何合适算法来确定，其非限制性示例包括smith-waterman算法、needleman-wunsch算法、基于burrows-wheeler变换的算法(例如，burrows-wheeler对准器)、clustalw、clustalx、blat、novoalign(novocrafttechnologies，eland(加州圣地亚哥illumina)，肥皂(可在soap.genomics.org.cn)和maq(可在maq.sourceforge.net上应用).在一些实施方案中，引导序列长度约为5、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、75或更多核苷酸。在某些实施方案中，引导序列长度小于约75、50、45、40、35、30、25、20、15、12或更少核苷酸。指导序列将crispr复合物的序列特异性结合到目标序列的能力可以通过任何合适的分析来评估。例如，足以形成crispr复合物的crispr系统的组分(包括待测试的引导序列)可提供给具有相应靶序列的宿主细胞，例如通过用编码crispr序列的组分的载体转染，接着评估靶序列内的优先裂解，例如通过本文所述的surveyor分析。类似地，可在试管中通过提供目标序列、crispr复合物的组分(包括待测试的引导序列和不同于测试引导序列的控制引导序列)来评估目标多核苷酸序列的裂解，以及比较测试和控制引导序列反应之间在靶序列处的结合或裂解速率。
crisprcas技术促进了多种细胞类型基因组工程的发展。最近的研究表明，以核糖核蛋白(rnps)的形式提供cas9-grna编辑工具与提供编码cas9和grnas的质粒相比具有一些好处。好处包括更快更有效的编辑，更少的偏离目标的影响，以及更少的毒性。rnps已经通过脂质体转染和电穿孔来传递，但是这些传递方法仍然存在局限性，特别是对于某些临床相关的细胞类型，包括毒性和低效率。因此，需要提供一种无载体(例如，无病毒载体)的方法，用于将生物相关有效载荷(例如，rnps)传递穿过质膜并进入细胞。“货物”或“有效载荷”是一种术语，用来描述通过水溶液穿过细胞质膜进入细胞内部的化合物或组合物。
本发明的主题内容涉及一种传递技术，该传递技术能够加速大范围的有效载荷传递到细胞中并具有较低的毒性。基因组编辑可以通过使用当前主题内容的某些方面将rnp传递给细胞来实现。此后水平下降，直到不再检测到cas9。传递技术本身不会对jurkat和原代t细胞的活性或功能产生有害影响。本发明主题内容是通过cas9-rnps对临床相关细胞类型进行基因编辑，毒性最小。
与表达载体介导的传递相比，crispr/cas组分如cas和/或grna的瞬时和直接传递具有优势。例如，与使用表达载体相比，可以以更精确的定时和有限的时间来添加一定量的cas、grna或rnp。从载体表达的组分可能以不同的数量和不同的时间产生，这使得在没有偏离目标编辑的情况下很难实现一致的基因编辑。此外，cas和grnas的预形成复合物(rnps)不能与表达载体一起被传递。
在一个方面，本主题内容描述了附着于固体载体(例如，条带、聚合物、珠或纳米粒子)上的细胞。支架或脚手架可以是多孔或非多孔固体支架。众所周知的载体包括玻璃、聚苯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、葡聚糖、尼龙、淀粉酶、天然和改性纤维素、聚丙烯酰胺、辉长岩和磁铁矿。就本主题内容而言，载体的性质可以在某种程度上是可溶的，也可以是不可溶的。支架材料几乎可以具有任何可能的结构配置。因此，所述支架构造可以是球形，例如，在磁珠型或者圆锥形，在圆管的外表面，如圆管或圆管的内表面。或者，表面可以是平坦的，如薄板或测试条等。优选的支架包括聚苯乙烯珠。
在其它方面，固体载体包含聚合物，细胞与聚合物化学结合、固定、分散或结合。聚合物载体可以是聚合物网络，并且可以珠状(例如，通过悬浮聚合)形式。这种脚手架上的细胞可以与本发明的含有水溶液的有效装载一起喷雾，以将所需化合物传递到脚手架的细胞质。示范性脚手架包括支架和其他可植入医疗装置或结构。
其他实施方案
在上述说明书和权利要求书中，诸如“至少一个”或“一个或多个”之类的短语可以出现在元素或特征的连词列表之后。术语“和/或”也可以出现在两个或多个元素或特征的列表中。除非与使用该短语的上下文另有隐含或明确矛盾，否则该短语意指单独列出的任何元素或特征，或任何引用的元素或特征与任何其他背诵的元素或特征的组合。例如，短语“a和b中的至少一个”、“a和b中的一个或多个”以及“a和/或b”各自意指“a单独、b单独或a和b一起”。相似的解释还可以意指所述列表包括三项或者更多项。例如，短语“a、b和c中的至少一个”、“a、b和c中的一个或多个”和“a、b和/或c”各自意指“a单独、b单独、c单独、a和b一起、a和c一起、b和c一起、或a和b和c一起”。此外，在权利要求书中使用术语“基于”意指，“至少部分地基于”，这样一个未引用的特征或元素也是允许的。
本文所描述的主题内容可以根据期望的配置在系统、装置、方法和/或物品中实施。上述说明书中阐述的实施方案并不代表与本文所描述的主题内容一致的所有实施方案。相反，它们仅仅是与本发明所描述的主题内容相关的方面一致的一些示例。尽管上面已经详细描述了一些变化，但是可以进行其他修改或添加。特别地，除了本文阐述的那些特征和/或变化之外，还可以提供其他特征和/或变化。例如，上面描述的实施方案可以指上述公开的各个特征的组合或者子组合和/或上面公开的几个进一步特征的组合和子组合。另外，附图中描绘和/或本文中描述的逻辑流不一定需要所示的特定顺序或连续的顺序来实现期望的结果。其他实施方案可以在被包括在以下权利要求的范围内。
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